ISOLASI FUNGI PENDEGRADASI HIDROKARBON MINYAK BUMI DARI SAMPEL TANAH TERCEMAR TUMPAHAN MINYAK BUMI Gustia Ningsih1, Atria Martina2, Rodesia Mustika Roza2 1
Mahasiswa Program S1 Biologi
2
Dosen Bidang Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Kampus BinaWidya Pekanbaru, 28293, Indonesia
[email protected] ABSTRACT Bioremediation is a technique that can be used to solve the environment from oil spill. The purpose of this research is to isolate fungi from soil that contaminated with oil spill, and to test its ability in degrading crude oil. The ability of fungi to grow on the Bushnell Haas that containing crude oil was done by growing fungi in Bushnell Haas agar. The ability of fungi in degrading crude oil was tested with culturing it in Bushnell Haas broth that contain crude oil for 25 days. Twelve fungi isolates had been isolated from contaminated crude oil soil in Minas and Lirik. The growth test result indicated that isolate LL-A05 had the largest diameter colony (4.83 cm), while isolate LL-A06 had the smallest diameter colony (0.87 cm). All isolate have the ability in degrading crude oil. Isolate LL-A07 had the highest ability of degradation (86%) and isolate LL-A06 had the smallest degradation (69%). Keywords : Bioremediation, crude oil, indigenous fungi. ABSTRAK
Bioremediasi merupakan salah satu teknik yang dapat digunakan untuk mengatasi masalah lingkungan yang tercemar oleh tumpahan minyak bumi. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi fungi dari tanah yang tercemar minyak bumi dan menguji kemampuan isolat tersebut dalam mendegradasi minyak bumi. Kemampuan fungi untuk tumbuh di dalam medium Bushnell Haas yang mengandung minyak bumi dilakukan dengan cara menumbuhkan fungi dalam medium Bushnell Haas padat. Untuk uji daya degradasi fungi ditumbuhkan dalam medium Bushnell Haas cair yang mengandung minyak bumi dan diinkubasi selama 25 hari. Dua belas isolat fungi diisolasi dari sampel tanah yang tercemar tumpahan minyak bumi di lokasi Minas dan lokasi Lirik. Hasil tes pertumbuhan Isolat LL-A05 memiliki diameter koloni terbesar (4,83) cm, sedangkan isolat LL-A06 memiliki diameter koloni terkecil (0,87 cm). Semua isolat memiliki kemampuan dalam mendegradasikan minyak bumi. Isolat LL-A07 memiliki kemampuan degradasi tertinggi (86%) dan isolat LL-A06 memiliki kemampuan degradasi terendah (69%). Kata kunci : Bioremediasi, minyak bumi, fungi indigenus. Repository FMIPA
1
PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara yang memiliki kelimpahan sumber daya alam yang sangat tinggi. Salah satu sumber daya alam yang terdapat di Indonesia adalah minyak bumi. Provinsi Riau merupakan daerah penghasil minyak bumi terbesar di Indonesia khususnya di daerah Minas, Duri dan Langgak (Purnomo 2008). Perkembangan kegiatan eksplorasi, produksi dan transportasi minyak bumi akan menimbulkan masalah lingkungan yaitu terjadinya tumpahan dari pengeboran dan pipa pengaliran minyak. Hal tersebut dapat menimbulkan pencemaran dan terganggunya pelestarian lingkungan (Tuhuloula 2012). Menurut USEPA 2003, minyak bumi terdiri dari campuran senyawa organik komplek yang tersusun dari 1 hingga 60 atom karbon dan hidrogen. Minyak bumi terdiri atas campuran hidrokarbon dan non-hidrokarbon. Pada umumnya minyak bumi memiliki kandungan senyawa hidrokarbon yang lebih tinggi dari pada senyawa nonhidrokarbon. Minyak bumi memiliki kandungan berupa senyawa hidrokarbon Alifatik, Sikloalkana, Hidrokarbon Aromatik, dan Hidrokarbon PoliAromatik (Munawar 2007). Tumpahan minyak bumi yang luas dapat merusak, terutama dalam skala besar berbahaya bagi mahkluk hidup karena memiliki Polisiklik Aromatis Hidrokarbon (PAH) yang dapat menyebabkan kanker dan penyakit lainnya (Dave et al. 2011). Penanggulangan masalah tumpahan minyak bumi sudah banyak dilakukan dengan berbagai metode seperti secara Repository FMIPA
fisika dan kimia. Akan tetapi metode tersebut tidak efektif baik dari segi biaya maupun keamanan. Oleh karena itu, pada saat ini para peneliti mulai melakukan penanggulangan masalah tumpahan minyak bumi secara biologi yang biasa disebut dengan bioremediasi. Teknik bioremediasi memiliki kelebihan yaitu metode yang sederhana, murah dan ramah lingkungan apabila dibandingkan dengan teknik fisika dan kimia. Menurut Damisa et al. 2013, bioremediasi dapat dilakukan dengan memanfaatkan mikroba indigenus (biostimulasi), atau dapat juga dengan proses bioaugmentasi yaitu memasukkan mikroba eksogenus ke daerah yang terkontaminasi. Penelitian fungi sebagai agen mikoremediasi belum banyak dilakukan. Fungi memiliki potensi yang lebih baik dalam mendegradasikan hidrokarbon karena mampu menghasilkan enzim untuk mendegradasikan selulosa, lignin dan senyawa komplek seperti senyawa aromatik (Santos 2008). Berdasarkan penelitian Al-Nasrawi (2012), beberapa fungi seperti Aspergillus niger, Penicillium documbens dan Cochliobolus lunatus yang diisolasi dari daerah yang tercemar tumpahan minyak memiliki kemampuan dalam mendegradasi minyak bumi. Penggunaan fungi untuk mendegradasi tanah yang terkontaminasi memiliki beberapa keuntungan diantaranya memiliki hifa yang dapat mengalami perpanjangan sehingga fungi dapat menjangkau senobiotik. Selain itu, fungi mampu tumbuh dibawah kondisi lingkungan 2
yang stress dengan pH dan aktivitas air yang rendah (Potin et al. 2004). Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan isolat fungi indigenus di daerah Riau yang berpotensi dalam degradasi minyak bumi dari tanah yang tercemar tumpahan minyak bumi. METODE PENELITIAN Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2014-Maret 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau. a. Pengambilan Sampel Tanah Pengambilan sampel tanah dilakukan di kelurahan Minas Jaya Kec. Minas Kab. Siak dan Desa Gudang Batu Kec.Lirik Kab. Indragiri Hulu. Sampel tanah diambil dengan menggunakan metode purposive sampling. Lokasi pengambilan sampel tanah di tempat yang terdapat tumpahan minyak bumi. Pengambilan sampel tanah menggunakan sekop dan dilakukan pada titik lokasi yang berbeda dengan kedalaman 0-15 cm. Setiap lokasi pengambilan sampel tanah, diambil tanah dari 3 titik, kemudian di dekompositkan. Dari setiap lokasi tanah diambil sebanyak ± 500 g dan dimasukkan ke kantong plastik kemudian dibawa ke laboratorium. b. Pembuatan Medium Medium Bushnell Haas padat dibuat dengan melarutkan 0,2 g MgSO4, 0,02 g CaCl2, 1 g KH2PO4, 1g K2HPO4, 0,05 g FeCl3, 1 g NH4NO3 dan 0,1% tween 80 kedalam 1000 ml akuades. Setelah homogen ditambahkan 15 g Repository FMIPA
agar kemudian dipanaskan hingga larut. Sebanyak 50 ml minyak bumi dimasukkan ke dalam medium Bushnell haas. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121oC tekanan 15 psi selama 15 menit. Pembuatan medium Bushnell Haas cair dilakukan dengan cara dan komposisi yang sama dengan medium Bushnell Haas padat namun tanpa penambahan agar (AlNasrawi 2012). Medium PDA dibuat dengan komposisi : 250 ml ekstrak kentang, 20 g dekstrosa dilarutkan kedalam 1000 ml akuades kemudian ditambahkan 15 g agar dipanaskan hingga larut. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan suhu 121oC tekanan 15 psi selama 15 menit (Gandjar 1999). c. Pembuatan Garam Fisiologis Sebanyak 0,85 g NaCl dilarutkan kedalam 100 ml akuades untuk pembuatan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisiologis sebanyak 9 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. d. Isolasi Fungi sebagai Agen Mikoremediasi Sampel tanah yang diambil dari daerah Minas dan Lirik dilakukan isolasi secara pour plate. Satu gram tanah dimasukkan kedalam larutan garam fisiologis steril dan dilakukan pengenceran hingga 10-4, dari -3 -4 pengenceran 10 dan 10 diambil sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet volume, lalu diinokulasikan pada medium Bushnell Haas padat yang
3
mengandung 50 ml minyak bumi yang dilarutkan dalam 1000 ml medium dan diinkubasi selama 3 hari pada suhu ruang. Koloni yang tumbuh dipilih berdasarkan warna dan ukuran koloni kemudian dipurifikasi untuk mendapatkan isolat fungi yang murni. Isolat fungi yang telah murni dapat diinokulasikan ke dalam medium PDA miring sebagai stok kultur yang dapat digunakan untuk pengukuran tingkat degradasi. e. Pertumbuhan Fungi pada Medium Padat Bushnell Haas Tahap ini dilakukan untuk melihat pertumbuhan isolat fungi di dalam medium Bushnell Haas yang mengandung minyak bumi. Masingmasing isolat ditotolkan ke dalam medium padat Bushnell Haas kemudian diinkubasi selama 5 hari. Pertumbuhan diamati dengan mengukur diameter koloni dengan menggunakan jangka sorong. f. Uji Daya Degradasi Minyak Bumi Uji daya degradasi minyak bumi dilakukan untuk menguji kemampuan degradasi fungi. Isolat fungi yang sudah ditumbuhkan di dalam medium PDA diambil pada bagian pinggirnya dengan diameter sebesar 5 mm dan potongan kultur sebanyak 4 potong diinokulasikan kedalam 50 ml Bushnell Haas cair. Kemudian ditambahkan 0,1% tween 80, dan 10 ml minyak bumi. Isolat diinkubasi pada suhu ruangan dengan menggunakan shaker orbital dengan kecepatan 180 rpm selama 25 hari. Setelah 25 hari isolat didiamkan selama interval waktu 1 Repository FMIPA
minggu. Kemampuan degradasi fungi terhadap minyak bumi dilihat melalui perhitungan total hidrokarbon. g. Pengukuran Total Petroleum Hidrokarbon (TPH) Pengukuran degradasi dilakukan dengan cara ekstraksi dan gravimetri berdasarkan metode 1664 EPA (2007) dan Latha et al. (2012). Setelah interval 1 minggu dari masa terakhir inkubasi aktivitas isolat dihentikan dengan penambahan 1% HCl 1N. Ekstraksi dilakukan dengan menambahkan 5 ml n-heksan ke kultur. Kultur dipindahkan ke funnel pemisah dan diekstraksi. Funnel dikocok sehingga akan terbentuk fase air dan fase organik. Fase organik yang terdapat dilapisan atas digunakan untuk tahap selanjutnya. Ekstrak ditambahkan 0,4 g natrium sulfat untuk mengeluarkan kelembaban dan dievaporasi hingga kering. Analisis gravimetri dilakukan untuk mengukur residu minyak bumi yang terdapat setelah ekstraksi minyak dari medium dan dievaporator supaya kering. Residu minyak yang tinggal setelah mikoremediasi diketahui dengan menimbang jumlah minyak yang terdapat pada beaker yang telah diketahui beratnya. Persentase degradasi dihitung dengan rumus menurut Al-Jawhari (2014) % degradasi = a-b / a x 100 dimana : a = berat minyak pada kontrol ( tanpa pemberian jamur ) b = berat minyak pada perlakuan
4
h. Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan Analisis of Variance (ANOVA), jika terdapat pengaruh yang nyata antar perlakuan diuji lanjut dengan DMRT (Duncan’s Multiple Range Test). HASIL DAN PEMBAHASAN a. Isolasi dan Pertumbuhan Fungi pada Medium Bushnell Haas Padat
Diameter koloni (cm)
Isolasi fungi dari sampel tanah yang tercemar minyak bumi pada lokasi Minas dan Lirik didapatkan 12 isolat. Isolat fungi ini dapat tumbuh pada medium Bushnell Haas padat yang diberi minyak bumi karena isolat-isolat tersebut memanfaatkan minyak bumi sebagai sumber karbonnya. Lotfinasabasl et al. (2012) mengisolasi fungi dari tanah di daerah hutan mangrove Alibaug dan Tarball yang terkontaminasi oleh minyak mentah dan
didapatkan 4 strain fungi yaitu Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Rhizopus sp. dan Penicillium sp. Isolat ditumbuhkan pada medium Bushnell Haas padat yang diberi minyak bumi untuk melihat diameter pertumbuhan setiap isolat sampai hari ke-5. Isolat yang memiliki diameter pertumbuhan tertinggi adalah LM-A05 yaitu 4,83 cm dan terendah adalah LLA06 yaitu 0,87 cm (Gambar 1). Hasil penelitian ini tidak jauh berbeda dengan yang didapatkan oleh Al-Jawhari (2014), pertumbuhan fungi Aspergillus fumigatus yang ditumbuhkan pada medium PDA yang mengandung minyak bumi pada hari ke 7 menghasilkan diameter sebesar 4,5 cm. Pertumbuhan isolat pada medium Buhsnell Haas padat yang diberi minyak bumi menunjukkan perbedaan dengan isolat yang ditumbuhkan pada medium Bushnell Haas padat tanpa pemberian minyak bumi (Kontrol) dapat dilihat pada Gambar 2.
7 6 5 4 3 2 1 0
Bushnell Haas diberi minyak Bushnell Haas tanpa minyak
Isolat
Gambar 1. Diameter koloni isolat pada medium Bushnell Haas padat waktu Inkubasi 5 hari.
Repository FMIPA
5
Isolat yang ditumbuhkan pada medium Bushnell Haas padat dengan pemberian minyak bumi secara makroskopik akan terlihat memiliki warna miselium yang lebih gelap, tebal dan memiliki diameter pertumbuhan lebih besar dibandingkan dengan kontrol. Pada kontrol terlihat memiliki warna miselium yang lebih tipis dan diameter pertumbuhan isolat lebih kecil apabila dibandingkan dengan yang diberi perlakuan.
Perbedaan pertumbuhan isolat ini diduga isolat tersebut mampu memanfaatkan minyak bumi sebagai sumber karbon sehingga pertumbuhannya lebih baik dari kontrol. Hal ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Delira et al. (2012), 11 strain Trichoderma yang ditumbuhkan pada medium PDA yang diberi minyak bumi pada hari ke-3 menunjukkan pertumbuhan yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol. Perbedaan yang dapat diamati antara fungi yang diberi perlakuan dengan kontrol adalah terdapatnya perbedaan pada diameter pertumbuhan, kelimpahan miselium, pertumbuhan koloni dan sporulasi dari strain Trichoderma. b. Uji Daya Degradasi Minyak Bumi
A
B
Gambar 2. Pertumbuhan isolat LM-A05 pada medium Bushnell Haas padat masa inkubasi 5 hari (A) pemberian minyak bumi (B) tanpa pemberian minyak bumi.
Repository FMIPA
Isolat fungi yang didapatkan dari sampel tanah yang tercemar minyak bumi dilakukan juga uji daya degradasi dalam medium Bushnell Haas cair. Dua belas isolat fungi yang didapatkan memiliki kemampuan degradasi hidrokarbon paling rendah 69% . Hasil analisis ANOVA menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan kemampuan antara masing-masing isolat dalam mendegradasikan hidrokarbon yang terdapat pada minyak bumi (Gambar 3). Isolat LL-A07 yang memiliki kemampuan degradasi tertinggi daya degradasinya tidak berbeda nyata terhadap 11 isolat lain. Isolat LL-A07 memiliki kemampuan degradasi tertinggi yaitu
6
Daya degradasi ( % )
86%. Kemampuan degradasi hidrokarbon minyak bumi pada penelitian ini lebih rendah dari pada hasil penelitian yang dilakukan oleh AlJawhari (2015), kemampuan Aspergillus niger yang diisolasi dari tanah yang tercemar minyak bumi dalam mendegradasikan hidrokarbon minyak bumi sebesar 95%. Menurut Al-Jawhari (2014) & AlNasrawi (2012), terjadinya penurunan berat minyak bumi pada medium Busnell Haas cair disebabkan fungi mampu beradaptasi terhadap senyawa polutan yang terdapat pada minyak bumi dan memanfaatkan senyawa karbon pada minyak bumi sebagai sumber karbon. Fungi dengan bantuan enzim ekstraselulernya dapat memutuskan rantai ikatan hidrokarbon yang terkandung dalam minyak bumi. Pada umumnya urutan degradasi hidrokarbon adalah n-alkana, alkana rantai bercabang, senyawa aromatik dan alkana ikatan siklik (Atlas & Bragg 2009).
Pada penelitian ini terjadi perubahan struktur hifa fungi berupa miselia clumps (rumpun) dan mates (kusut). Isolat LL-A07 yang memiliki kemampuan degradasi hidrokarbon tertinggi membentuk struktur miselia clumps dapat dilihat Gambar 4. Proses degradasi senyawa alifatik seperti alkana dibantu oleh enzim oksigenase. Oksigen masuk pada hidrokarbon dengan bantuan enzim oksigenase. Enzim tersebut menyerang terminal gugus metil dan mengubahnya menjadi alkohol. Alkohol dioksidasi menjadi aldehid dan kemudian menjadi asam karboksilat. Asam karboksilat akan didegradasi lebih lanjut melalui oksidase beta (Munawar 2007). Menurut Singh (2006) proses metabolisme Polisiklik Aromatis Hidrokarbon (PAH) oleh fungi melibatkan enzim intraseluler sitokrom P450 dan ekstraseluler lignin peroksidase (LiP), Mangan Peroksidase (MNP) dan Lakase.
120 100 80 60 40 20 0
Gambar 3. Kemampuan degradasi minyak bumi pada uji daya degradasi selama 25 hari masa inkubasi. Repository FMIPA
7
A
B
C
Gambar 4. Isolat LL-A07 yang memiliki kemampuan daya degradasi hidrokarbon minyak bumi tertinggi, (A) Kontrol, (B) dan (C) miselia clumps, Pada fungi non-ligninolitik proses degradasi dimulai dengan terjadinya oksidasi dengan pemberian satu senyawa molekul oksigen yang akan membentuk senyawa oksida yang akan dikatalisis oleh sitokrom P450 monooksigenase. Hal ini menyebabkan terlepasnya cincin benzen menjadi molekul-molekul lain yang akan digunakan oleh fungi sebagai sumber karbon. KESIMPULAN Isolasi fungi dari sampel tanah yang tercemar tumpahan minyak bumi di kelurahan Minas Jaya Kec. Minas Kab. Siak dan Desa Gudang Batu Kec.Lirik Kab. Indragiri Hulu. Isolasi fungi dari sampel tanah yang tercemar oleh minyak bumi dari Minas dan Lirik didapatkan 12 isolat fungi. Isolat LMA05 mempunyai diameter pertumbuhan tertinggi yaitu 4,83 cm dan LL-A06 dengan diameter terendah yaitu 0,87 cm. Pada uji daya degradasi minyak bumi, isolat yang memiliki kemampuan degradasi tertinggi yaitu LL-A07 sebesar 86% sedangkan kemampuan degradasi terkecil pada LL-A06 sebesar 69%. Repository FMIPA
DAFTAR PUSTAKA Al-Jawhari IFH. 2015. Ability of Some Fungi Isolated from Sediment of Sug-Al Shykyukh Marshes on Biodegradation of Crude Oil. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences.4(1): 19-22. Al-Jawhari IFH. 2014. Ability of Some Soil Fungi in Biodegradation of Petroleum Hydrocarbon. Journal of Applied & Environmental Microbiology 2(2): 46-52. Al-Nasrawi.H. 2012. Biodegradation of Crude Oil by Fungi Isolated from Gulf of Mexico. J Bioremed. Biodegrad 3(4). 1000147. Atlas R, Bragg J. 2009. Bioremediation of Marine Oil Spills. Microbiology Biotechnology 2(2): 213-221. Damisa D, Oyegoke TS, Ijah UJJ, Adobara NU, Bala JD, Abdulsalam R. 2013. Biodegradation of petroleum by fungi isolated from unpolluted tropical soil. International Journal of Applied
8
Biology and Pharmaceutical Technology (4)2:136-140.
Pantai Surabaya Timur. Berk. Penel. Hayati. 13:6-7.
Dave D, Ghaly A.E. 2011. Remediation Technologies for Marine Oil Spills: A Critical Review and Comparative Analysis. American Journal of Environmental Sciences. 7(5): 423440.
Potin O, Rafinc C, Veigner. 2004. Bioremediation of an aged polyciclic aromatic hydrocarbon (PAH) contaminated soil by Filamentous Fungi Isolated from International the soil. Biodeterior.Biodegradation. 54:4552. Purnomo S. 2008. Peranan Sumber Daya Alam Berbasis Fosil Bagi Kehidupan Manusia & Cara Mengatasi Kekurangannya dengan Enhanched Oil Recovery[Thesis]. Program Pasca Sarjana. Fakultas Teknik. Universitas Gadjah Mada.
Delira RA, Alarcon A, Ferrera Cerrato R, Jose J. 2012. Tolerance and Growth of 11 Trichoderma Strains to Crude Oil, Naphtalene, Phenanthrene and Benzo[a]pyrene. Journal of Environment Management. 95: 5291-5299. EPA. 2007. Method 1664, Revision A : N-Hexane extractable Material (HEM: Oiland Grease) and Silica Gel Treated N-Hexane Extractable Material (SGTHEM: Non-polar Material) by Extraction Gravimetry. United State Environmental Protection Agency. Washington. Gandjar I, Samson RA, TweeVermeulen KVN, Oetari A, Santoso I. 1999. Pengenalan Kapang Tropik Umum. Jakarta : Yayasan Obor Indonesia. Lotfinasabasl S, Gunale VR, Rajurkar NS. Assesment of Petroleum Hydrocarbon Degradation from Soil and Tarball by Fungi. Bioscience Discovery 3(2): 186192. Munawar. 2007. Bioremediasi Tumpahan Minyak Mentah dengan Metode Biostimulasi Nutrien Organik di Lingkungan
Repository FMIPA
Santos EOD, Celia Fransisca CR, 2008. Pre-screening of Filamentous Fungi Isolated from A Contaminated Site in Southern Brazil for Bioaugmentation Purposes. African Journal of Biotechnology 7(9):1314-1317. Singh H. 2006. Mycoremediation Fungal Bioremediation. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken. New Jersey. Tuhuloula A. 2012. Bioremediasi Lahan Terkontaminasi Minyak Bumi dengan Menggunakan Bakteri Bacillus cereus pada Slurry Bioreactor[Thesis]. Institut Tiga Puluh September. USEPA. 2003. Aerobic Biodegradation of Oily Wastes. A Field Guidance Book for Federal on-scene Coordinator. United State Environmental Protection Agency.
9
