p._hlion donPcng.mbongonAphkasrlsotopdan RadiMi. 1999
STUDI REAKSI SILANG ANTIBODI TOKSIN BOTULINUM TIPE A YANG DRNAKTIV ASI DENGAN IRADIASI GAMMA M. Indarwatmi, H.M. Soewarsono,daDAdria P.M. Hasibuan PusatAplikasi lsotop Uan Radiasi, HAT AN
ABSTRAK STUDI REAKSI SILANG ANTmODI TOKSIN BOTUUNUM TIPE A YANG DIINAKTIV ASI DENGAN IRADIASI GAMMA. Alltibodi poliklonal tidak hanya berikatan dengan antigen spesifiknya, tempi mungkin pula berikatan dengaJ1 sekelompok antigen yang strul..1\U"kimianya seru~ dengan antigen spesifik pembentuk antibodi tersebut. Untuk pengujian reaksi silang antibodi toksin botulinum tipe A yang diproduksi pada kelinci dat1 mencit yang diimunisasi toksin botulinum tipe A yang diinaktivasi dengan imdiasi gamma dosis 20 kGy terl1adap toksin botulinwn tipe A aktif, telah dilakukan penelitian reaksi antigen-antibodi secara kualitatif dengan metode Irnunodifusi ~da lempeng agar Ouchter/olry. Hasil talnpak pada lempeng imunodifusi presipitat ikatan Ab (T. inak.) dan Ab (T. inak-BSA) dengan wltigen spesifiknya masing-masing dan toksin botulinum tipe A aktif. Antibodi (T. inak-BSA) aviditasnya lebih tinggi dibandingkwi dengan AB (T. inak.) dat1 reaksi silang terjadi antara antibodi toksin botulinum tipe A yang diproduksl dengan antigen toksin aktifterhadap toksin botulinum tipe A aktif, dan koplu1g antiget1 toksin inaktif (T. inak.) kepada BSA dapat met1ingkatkan antigenesitas antigen toksin inaktif hasil iradiasi gaJrunadosis 20 kGy.
ABSTRACT mE CROSS-REACTION STUDY OF TYPE A BOTULINUM TOXIN ANTIBODY INACTIVATED BY GAMMA IRRADIATION. The antibodies (polyclonal)do react not only to the spesifict antigen,but also they are possibleto reactto a group of antigen that has similarity in chemical structureto the speSitictantigenwich is the 81ltibodyproducedwith. To studythe cross-reactionof antibody that was producedby multiple ilrunwuzation of rabbit and 11!!ce using inactivatedtype A botululum toxin antigenby ganuna imdiation with the doseof20 kGY havebeenreactedthe antibodiesto spesificmIdnonspesificantigensusing hnmunodiffusion method on auchter/OIlYagar plates.The resultsshowedthe precipitationbound of Ab (T. inak) and Ab (T. inakBSA) to spesiticantigenmIdto active toxin either. The conclusion of this experimentwas theantibodyproduced using the inactivated type A botulinum toxin by gammairradiation with the dose of 20 kGy (coupling and not coupling to BSA) to do cross-reaction to active typeA botulinwntoxin, and coupling the inactive toxin to BSA can increasethe antigenesityof irrndiatedtoxin
PENDAHULUAN Reaksi silang mWlgkin akan terjadi aIltarn antibodi (poliklonal) yang diproduksi dari antigen yang tidak munu dengaJlbeberapa antigen yang berbeda. Pacta antigen bemlolekul relatif besar terdapat berbagai detenninaIl atau disebut juga detennilk1n aIltigenik yaitu sekelornpok kecil asam amino atau residu karbohidrat yang rnenempel di pennukaan antigen berpotensi sebagai penentu spesifisitas dan aviditas antibodi , dan ternpat berikatan antibodi dengan antigen spesifiknya. Suatu antisern (poliklonal) tidak hanya rnengandWlg antibodi terhadap bebernpa detenninan, juga antibodi yang mernpWlyai struktur dan aviditas berbeda, selungga akan terjadi persaingan Wltuk berikataIl dengan setiap individu detenninan (I). BerdasarkaIl stnlkulr dan susunan kilnianya. antibodi adalah sekelompok protein, disebut juga irnWloglobulin (Ig) terdiri alas 5 kelas yaitu Ig G, 19 M, Ig A, Ig D, dan Ig E. Semuakerns imWloglobulin mempWlyai struktur dasar saJll3. terbentuk dari sepasallg rantai polipeptida palljang (lleavy chains = H-cllains) tersusun dari 446 asaIn aInino yang masing-lnasing rantainya berhubWlgan dengan sepasang rantai pendek (light cllains = L-cI1ains) yang tersusun dari 214 asaJn alnino. Jadi
bentuk imunoglobulin menyerupai huruf Y, rantai L sebagai tangkai mempunyai dua cabang rantai H yang masing-masing ujungnya terbuka sebagai tempat pengikatan (binding site) terltadap antigen spesifiknya, sensitivitas (aviditas) antibodi ini ditentukaJl oleh susunan kirnia binding site (3,4). Salall salu penentu spesifisitas aJuibodi ialall kemumian antigen pembentuknya. Untuk mendapatkan antigen yang murni sangat sukar, diperlukan bahan atau sediaan yang banyak, melode separasi dan purifikasi yang sering digunakan ialah krornatografi kolom-sepbadex secarn bertingkat. Suhadi (5) telah me1akukan pemumian toksin Clostridium botulinum tipe B basil isolasi melalui krornatografi kolom Sepbadex G.50 dan Sepbadex G.200, uji elektroforesis fraksi protein toksik, dan uji spesifisitas antigen (protein toksik) dengan metode imunodifusi. Kesimpulan penelitian ini ialah telah diperoleh sejumlah kecil (nukrogram) toksin botulinwn tipc B yang dapat berikatan-'rlengan antiloksin B. tetapi pada penelitian ini tidak dilakukan uji reaksi silang dengan tipe antitoksin lairulya. Pada saat ini untuk mengatasi terjadinya reaksi silaJlg digunakan antibodi monoklonal yang dibuat dengan metode lubridoma (6), yaitu hibridisasi (fusi) Ijrnfosit spesifik mencit balb/C yang diimunisasi antigen yang
367
Pene/i/iandon PengembanganAp/ikasi ls%p dan Radiasi,/999
kurang mumi dengansel-selmielomamencitspesiesyang salua.Hibrid-llibrid yang terbentukdalron kultur jaringan diseleksi (kloning) Ulltuk mendapatkanklon terpilih yang memproduksi antibodi monoklonal yang hanya dapat berikatandenganantigenspesifiknya.UmuDUlyaantibodi monoklonal memiliki sensitivitas rendah. makin murni antibodi monoklonal maka sensitivitasnyaakan makin rendah. Padapenelitian ini digunakanantiserakelinci dan mencit yang telah diimunisasi dengan toksin botulinum tipe A (tanpa pemurnian, dengan pengenceran 10.2) yang diinaktivasi dengan iradiasi gamma dosis 20 kGy untuk diuji reaksisilangnyadengantoksin botulinumtipe A yang aktif (toksik).
terakhir dikurnpulkan untuk dianalisis mengenai ikatan antibodi dengan antigen spesifiknya dan reaksi silang terhadap toksin botulinwn tipe A aktif, menggunakan metodeimunodifusidi alaslempengagarouchterlony. lmunisasi pada lempeng agar ouchterlony (5). Di alaslempengagarose(0,8%)denganketebalan:t 1 mm dibuat surnuran(ID=2 mm), surnurandi tengah diisi 5 IJ.I antigentoksin, clan5 buah surnurandi sekitarnyamasingmasing diisi antisera (NS) toksin yang akan diuji spesifitasnyaclanreaksisilangnya(SkemaGarnbar1).
BAHAN DAN METODE Untuk pembuatan antibodi (poliklonal) toksin botulinum tipe A diperlukan bal1an-ballansebagaiberikut : Produksi toksin botulinum tipe A. Stok strain Clostridimn botulinum tipe A (A-1323 isolasi lokal) diinokulasi untuk pembiakan dalam media Coocked Meat (CM). Biakan C. botulinum A dipindallkan ke dalam media TPGYT (tripton, pepton, glukose, yeast extract, daD thioglycolat) untuk memproduksi toksin. Toksin diisolasi dan disimpan sebagai stok. Toksisitas toksin iill diuji pada mencit, dipilih tokSUl dengan pengenceran terendah (10"1 atau kadar protein tertinggi setelah pengenceran.
Pembuatan antigen toksin. Toksin pengenceran 10-2diinaktivasi dengan iradiasi gamma dosis 20 kGy, maka akan diperoleh toksin inaktif sebagaistok antigen. Mengingat bahwa toksin inaktif ini merupakanfragmenfragIuen protein toksin aktif yang diradiasi maka berat molekulnya menunm sehingga antigenesitasnyapun menunm.Untuk meningkatkanantigenesitastoksin radiasi ini menjadi imunogen, dilakukan kon~gasi (coupling) toksin illaktif (T. illak.) kepada protein albumin bovine (BSA) dengall metode EDAC [1-Etilyl-3(3-Dimetllyl Aminopropyl Carbodiimide»)(SigIlli'!)atau Morpho CD! [1-cyclohexyl-3(2-morpholinoethyl)]carbodiimidemetllop-toluene sulfonate (Aldrich) lnaka akan terbentuk imunogenT. inak-BSA. SeparasiT.inak-BSA daTiballaD daD sisa-sisa reagen yang tidak terpakai digw1akan krolnatografikolom sephadexG.200,dan dianalisisdalaru kantong selofan yang direndalu dalanl air mengalir. Prinsip dasarkopling metodeCarbodiimide ialah dengan oksidasicarbodiimide akan terjadi pengikatanBSA pacta gugusreaktif protein antigen(-NH2 atau -COOH)menjadi
R-CONH-BSA. Produksi antibodi (poliklonal). Enmn ekor kelinci, tiga ekor diimuniSc'\si denganTinak dan tiga ekor lainnya diimunisasi T. inak-BSA dengan dosis 0,5 mg/ekor,dan 10 ekor mencit,masing-masingkelompok5 ekor diimunisasi T.inak. daD5 ekor laimlya diimunisasi T.inak-BSA dengandosis 0,2 mg/ekor. Suntikall booster diberikan setiap21 11ari(pad.'\kelinci) dan 10 lwi (pada rnencit) dilakukan 4 kaii booster. PenyuntikaniInunisasi dan boostersecarasubkutan (kelinci) dan intraperitoneal (mencit). Serum kelillci d.'Ul mencit setelah booster 368
---~ Ketemngan
Gambar
Ag: Antigen A/S:Antisera I. Lempengagarose,tebaInya lnun 2. Lubangagar,diameter2nun 3. Gelasobjek
Skemaimunodifusilempengouchterlony.
Prosedur Imunodifusi. Sumuran lempeng agarose setelah diisi antigen dan antisera diinkubasi selama48 jam pada suhu 4°C, setelah inkubasi selesai kemudian lempeng agar direndam berturut-turnt dalam larutangaramfisiologis (NaCl 0,85%) dan larutan 0,1% Na-azide masing-masingselama 12 jaIn. Lempeng agar dicuci dengan air leding, dikeringkan dalam oven pada subu37°40°C selaInatiga jam. Lempengagar kering ini direndaIndalam larutan 5% zat WarDaamidoblack lOB, dicuci, maka akan tampak presipitat ikatan Ag.Ab di antarasumuranantigendanantisera.
HASILDANPEMBAHASAN Hasil pengukuran dengan spektrofotometer SillMADZU-201 dengankerapatanoptik 280 om terhadap fraksi-fraksi toksin inaktif dan konyugat toksin inaktif kepadaBSA setelahseparasimelalui Kromatogrnfi kolom SephadexG-25 dilukiskandengankurva yang ditunjukkan pada gambar2. Puncakpertamaterdiri atas fraksi-fraksi proteinantigenyang bobotmolekulnyabesartampak lebih tinggi dari fraksi-fraksi berikutnya yang puncakpuncaknyajauh lebih rendah yang merupakanpengotor protein. Fraksi-fraksidengan kerapatanoptik yang lebih tinggi (fraksi konyugat No. 2-5) menunjukkan bahwa protein toksin inaktif teiall terikat protein BSA sehingga bobot molekulnya menjadi lebih besar dan antigenesitasnyateiall meningkat, dibandingkan dengan proteintoksin inaktif yang tidak dikonyugasi.Padaproses konyugasiini, pengikatanBSA hanya terjadi pada gugus
Pene/itian dan Pengembangan Ap/ikasi Isotop don Radiasi, /999
reaktif protein toksin sehingga dengal1 krol1mtografi kolom bagian pengotor dapat dipisal1kan (pemurnian protein
toksin),
Analisis imunodifusiantisera (poliklonal) mencit terhadapantigen toksin botulinum inaktif (f .inak. dan T.inak-BSA)ditampilkanpactaGambar4.
Serummencit
If;;'
~..~ e
A
Keterangan
C A£. T.inak-BSA
"'" ~ -;" "'\I ., In d.,
AQ: T,al.1if
I, AlS T .inak-BSA 2, AlS T.inak K, Serumnonnal
Tabel2. Pembacaan nilai kualitatif Gambar4 secaravisual Gambar 2. Fraksi-fmksi toksin inaktif dan konyugat toksin illaktif kepada BSA setelah separasi melalui Kromatografi kolom Sephadex G-25 diukur dengan Spektrofotometer pada 280 run.
Antigen Antibodi T.lllak.-BSA (I)
T .aktif.
T.inaktif
+++
+++
T.inak-
BSA +++
T.inak (2)
Hasil analisis reaksi aIltisera(poliklonal) kelinci dengan antigen spesifik (T. inak. dan T. inak-BSA) dan toksin botulinum tipe A tampak presipitatikatan komplek Ag.Ab pada lempeng agar berupa strip llitam seperti diperlilmtkanpadaganlbar3.
Antiserakelinci
ft.
~.;::a"~lt Keteratlgatl:
C
5 Ag'ii:1ak
Ag Trnak-BSA
1&2, AlS T. inak-BSA 3, AlS T.il13k K, Serumnonnal
Gambar3. Presipitatikatan Ab (NS kelinci) denganAg spesifik daD toksin botulinwn tipe A aktif padalempengagarose. Tabell. Pembacaanltilai kualitatif garnbar3 secaraViSllai AIltigen Atuibodi
T.Ulak-
T.aktif
T.inaktif
T.Ulak.-BSA(1&2)
+++
+++
+++
T.inak (3)
+++
+++
+++
K =SerulnNomlal
BSA
K=SerumNonnal (3)
Pada lempeng agarose lmnya tampak jelas presipitat ikatan antibodi yang dibuat dengan imunogen T.inaktif-BSA, hal ini membuktikanbahwa responimun mencit terlmdap antigen Tinaktif yang diimunisasikan kurnng sensitif sehingga antibodinya tidak rnampu berikat.1fidengan antigen T.inaktif, T.inaktif-BSA, dan T. aktif pada tabel 1 tampak bahwa antibodi yang diproduksi padc1kelinci baik dengan antigen T.inaktif maupun T.inaktif-BSA selalu berikatan dengan ketiga jenis antigen,11alini membuktikanballwa respon imun kelinci lebihsensitifsehinggadapatmemproduksiantibodi denganaviditasyangberbeda. Antibodi yang diproduksidenganantigen Toksin inaktif baik pada mencit (T.inaktif-BSA) maupun pada kelinci dc1patberikatan silang dengan toksin aktif, jadi reagen antibodi ill dapat digunakan untuk mendeteksi toksin botulinum tipe A yang terdapatpada rnakanandan darahpasienyang terkontaminasltoksin botulinumtipe A. PembuataIlantiserapada mencit bertujuan untuk mendapatkanliJnfosit speisifik sebagaidonor yang akan dihibridisasi dengan sel-sel mieloma dalam rangka pembuatanantibodimonoklonal.
KESIMPULAN Antisera(polik1onaI)yang dapatmengikattoksin botulinwn tipe A yang toksik tidak perlu dibuat dengan toksin botulinumtipe A yang dilemal1kan(toksoid), tetapi dapat dibuat dengaI1 toksin botulinum tipe A yang toksisitasnyadilulaI1gkandenganiradiasigammadosis 20 kGy (toksindiencerkaI110-1. Antiserayang dibuatdengan 369
Pene/iliandan Pengembangan Ap/ikasi J.,otopdan Radiasi,/999
toksin botulinum tipe A non-toksik atau inaktif dapat beraksi silang dengan toksin botulinum tipe A toksik (aktif) yang mungkin terdapatpada ballaDmakananatau darahpasienyang terkontalninasitoksinbotulinumtipe A. Toksin botulinwn tipe A yang diinaktivasi dengan iradiasi gamlnadosis 20 kGy (pengenceran10-2) adalall benar antigenisitasnya rendall, tetapi antigenesitasnyayang rendall ini dapat ditingkatkan dengancaradikopling kepadaprotein albulninyang bobot molekulnya besar, misalnya albumin bovin (BSA) atau manusia (HSA) dengan teknik EDAC atau morpho CDI. Separasillasil kopling denganteknik kromatografikolom SephadexG-25 dismnping untuk separasitoksin inaktif yang terkonyugat BSA, tetapi mungkin pula digunakan untukpemurniantoksin kasar.
3. THORELL, J.I. AND LARSON, S.M. Radioimmunoassay and Related Techniques (Methodologyand Clinical Application), the CV. Mosby Company,SaintLouis (1978) p.ll, 258. 4. EDWARD, R., Immunoassay, An Introduction, William Henemann, Medical Books, London (1985)55. 5. SUHADI, F., Aspek Clostridium botulinum pada Pengawetan Ikan dengan Iradiasi dan Pengembangan metodePenentuanToksin Secarain vitro, Desertasifakultas Pascasarjana,universitas Indonesia,jakarta (1990)p. 95. 6. GODING, J.W., Monoclonal Antibody: Principle and Practice,2 nd. Ed. Acad. Press(1986).
UCAPANTERIMA KASm
7. Komunikasi pribadi denganDr. J. Kosowics, Expert Ucapan terillla kasih ini terntama ditujukan kepada Sdr. Arief Djmlakmn yang tela11menyediakan stok toksin botulinmn tipe A, preparasi toksin' untuk diinaktivasi dengan iradiasi gm11l11a. Terinta kasih ilU kmui sampaikan pula kepada selurnh teknisi yang terlibat daJmu penelitian ini.
lAEA, Jakarta (1989). 80 ROI1T, 10, Essensial Immunology, Blackwell Scio Publ., Oxford. london Edinbrgho Melbourne (1973) 790
9. SKULBERG,A., Toxin Producedby C. botulinumand Tlleir Radiosensitivity, IAEA-PL-334/3, IAEA, Vielma (1971)19
DAFTARPUSTAKA CAMBELL, A.M., Monoclonal Antibody Teclmology (laboratory techniques in Biochemistry and molecular biology), Elsevier, Amsterdam. new York. Oxford (1987)p.4.101.
10. SKALKA, M.and ANTONY, F., Effect on the Biological Propertiesof Proteins, lAEA-PL-344/1, lAEA, Vienna(1971) I.
2. BHANDARKHAN, S.D. mId PILLAI, M.R.A., RadioimmWloassay a laboratory Manual, BARC., Bombay (1982) 8.
DISKUSI IKA ROOSTIKA 1. Sara masih belum jelas tentang lnaksud dari reaksi silang antara antibodi toksin botulinum tipe A dengan toksin botulinum tipe A ? Mohondijelaskan. 2. Apa manfaat dari diketahuinya reaksi silang antara antibodi toksin botulinwn tipe A dengan toksin botulinwn tipe A ? 3. Toksin botulinum tipe A merupakaIl penyebab penyakitapa ? Seberapabesararti pentingnya? M. INDARWATMI Reaksi Sil3l1g ditujukan terhadap Ab yang diproduksi toksin botulinum A- illaktif terhadap toksin aktif.
370
2. Jadi untuk memproduksiAb-toksin botulinum A tidak perlumenggunakantoksin butolinum A aktif dan tidak mungkinkarenahewancobaakanmati. 3. Peracunantoksin botulinum meskipun sedikit (Jig)akanmenyebabkan kematian. MARIALINA 1. Apakah tujuan penelitian ini untuk membuat kit, jika demikian aplikasinya diterapkan untuk produk apa ? 2. Oalam penelitian Anda, toksin botulinum type A di isolasi dari kultur Clostridium botulinum. Apakah dilakukan uji wltuk mengetahui kemumian basil isolasi ? Bagaimana caranya ? 3. Stand.1f apakah yang digunakan untuk uji tersebut ? Bagaintana llasilnya di bandingkan dengan toksin basil isolasi?
Peneliliandon Pengembangan Aplikasi IsotopdanRadiasi. 1999
M. INDARWATMI
ZUBAIDAH IRAWATI
I. Tujuan penelitiaI1 : Untuk membuat reagen atau kit untltk mendeteksi in vitro secara cepat toksin botulinwll. Aplikasinya diterapkaI1 pt1da produk ik.1ll yang diawetkan. 2. Kami menggw1akaI1 toksin kasar yang diencerkan 10-1 daD diiradiasi dengan dosis 20 kGy. Kami tidak meiakukaI1 lyi kemumian Imsil isolasi toksu]. karena untltk memurnikan diperlukan pengujian yang pat1jang. Tetapi dengan konyugasi (coupling) dengan BSA dan dilakUkan dalaIll krolnatografi kolom splmdex, dapat memumikan toksin C. botulinum karelm dapat dipisaltkan toksin inaktif-BSA dengan pengotor pengotomya. Untuk pembuatan kitlreagen lebih baik digunakan toksin yang mumi (dapat dibeli) daripada memumikan toksin sendiri. 3. Kami tidak/belum membandingkan antara toksin isolasi dengan toksin munu.
Kami merniliki sarnpel yang terbuat dari ikan yang di prosessebelumnya.Mengingatproduk perikanan rowanuntukC. botulinumapabila disimpandalam kondisi vakum. Apakall Anda bersediamembantukami menguji ada/tidaknyaC. botulinum di dalam ballaD tersebut ? Kemungkinanpertanyaansaya ini menyimpang dari isi makatahAnda. M. INDARWATMI Pengujiall ada/tidaknya C. Botulinum dapat dilakukandi lab. Biologi PAIR-BATAN.
371
