Pemilihan Bahan Methoksi Aromatik Sebagai Induser Pada Proses Kulturisasi Acetobacterium woodii DSM 1030 Muhammad Zaki Jurusan Teknik Kimia, Fakultas Teknik Universitas Syiah Kuala Jalan Tgk. Syech Abdul Rauf No.7, Darussalam, Banda Aceh 23111, Telp. 52222 E-mail:
[email protected] ABSTRAK Pemilihan induser telah berhasil dilakukan pada kulturisasi bakteri anaerob Acetobacterium woodii DSM 1030 pada berbagai bahan methoksi aromatik. Penelitian ini bertujuan untuk memilih substrat organik terbaik untuk membangunkan sistem kultur anaerobik pada produksi enzim demetilase A woodii. Pemilihan substrat sebagai induser untuk pertumbuhan Acetobacterium woodii telah diuji terhadap sebelas substrat masingmasing: anisol, 2-methoksifenol, 3-methoksifenol, asam vanili, asam siringig, 2.3.4trimethoksi asam benzoat, 2.4.5-trimethoksi asam benzoat, 3.4.5-trimethoksi asam benzoat, 2.3.4-trimethoksi benzil alkohol, 2.4.5-trimethoksi benzil alkohol dan 3.4.5trimethoksi benzil alkohol. Hasil penelitian menunjukkan dari sebelas substrat yang diuji, diperoleh substrat yang terbaik untuk mendukung pertumbuhan Acetobacterium woodii yaitu 2-methoksifenol dengan laju pertumbuhan spesifik () mencapai 0.141 per jam. ABSTRACT Screening inducers have been successfully conducted by using Acetobacterium woodii . Selection of the most suitable substrate for demethylation has been done by testing several substrates, including the ability of A.woodii to grow on anisole, 2methoxyphenol, 3-methoxyphenol, vanillic acid, syringic acid, 2.3.4-trimethoxy benzoic acid, 2.4.5- trimethoxy benzoic acid, 3.4.5-trimethoxybenzoic acid, 2.3.4-trimethoxy benzyl alcohol, 2.4.5- trimethoxy benzyl alcohol, and 3.4.5- trimethoxy benzyl alcohol as the organic carbon source. Experimental results showed that Acetobacterium woodii grew better on 2-methoxyphenol compared to other substrates tested. The best growth was obtained when 2-methoxyphenol was used whice the specific growth rate () was 0.141 per hours.
PENDAHULUAN Biotransformasi adalah suatu reaksi yang dapat merubah senyawa organik menjadi senyawa organik yang berbeda dengan menggunakan biokatalis. Misalnya, dengan menggunakan bakteri anaerob Acetobacterium woodii DSM 1030, bahan methoksi aromatik dapat ditransformasikan kepada hidroksi aromatik (Bache & Pfennig, 1981). Transformasi ini sangat dipengaruhi oleh pertumbuhan bakteri. Penggunaan induser untuk merangsang pertumbuhan bakteri pada produksi enzim demetilase masih sangat kurang dikaji. Bakteri Acetobacterium woodii pertama kali diisolasi oleh Schorberth dan Balch pada tahun 1975, bakteri ini mempunyai persamaan dengan bakteri metana (Mayer et al., 1977). Seperti bakteri metana (Wolfe, 1971), Acetobacterium woodii juga dapat tumbuh dengan kehadiran H2, CO2 dan C1 dari ikatan metil pada kumpulan methoksi aromatik sebagai sumber karbon untuk menghasilkan energi. Bakteri A.woodii termasuk dalam kelompok homoasetogenik yang dapat tumbuh secara anaerob dengan proses oksidasi pada berbagai sumber karbon (Fuch, 1986). Dalam hal ini sebagai penerima electron dengan melibatkan oksidasi CO2 menjadi asam asetat, apabila CO2 tidak tersedia maka reaksi penerima elektron tidak terjadi (Drake, 1994). Reaksi demetilasi juga dapat dilakukan oleh bakteri aerob lainnya seperti Pseudomonas fluorescens (Andreoni et al., 1995) tetapi produk yang dihasilkan akan mengalami penguraian menjadi CO2. Proses ini dapat juga dilakukan oleh fungi seperti Cunninghamella elegans (Smith & Davis, 1978), tetapi akan mengambil waktu yang agak lama. Oleh karena itu, bakteri anaerob Acetobacterium woodii sesuai digunakan untuk kajian reaksi demetilasi karena produknya dapat langsung diperoleh dan tidak terurai. Dewasa ini penelitian tentang penggunaan induser untuk merangsang pertumbuhan bakteri pada produksi enzim demetilase masih sangat kurang dipelajari. Oleh sebab itu, penelitian ini difokus pada pemilihan substrat terbaik yang dapat digunakan sebagai induser untuk proses demetilasi dengan menggunakan bakteri Acetobacterium woodii. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkaji kespesifikan substrat sebagai induser untuk reaksi demetilasi oleh Acetobacterium woodii dan kemampuan bakteri menggunakan substrat uji sebagai sumber karbon. METODE PENELITIAN Stok Kultur Acetobacterium woodii diperoleh secara komersial dari Deutche Sumlong Microbiology (DSM 1030) dalam bentuk murni dan diaktifkan secara anaerobik di dalam Atmosbag (Aldrich Co., USA), kemudian dikulturisasikan pada media agar yang mengandung 11,10 mM fruktosa. Pengkulturan dan penyimpanan dilakukan di dalam Chamber Anaerobik (Oxoid Co., USA). Untuk pensubkulturan, koloni tunggal dipindahkan pada petri dish yang baru setiap dua minggu. Kulturisasi Acetobacterium woodii dikulturisasikan secara anaerobik dalam medium ‘Balch’ (Balch et al., 1977). Bahan untuk medium adalah; NH4Cl (1,0 g/l), MgSO4. 7H2O (0,1 g/l), K2HPO4 (0,4 g/l), KH2PO4 (0,4 g/l), Cysteine HCl (1,0 g/l), yeast ekstrak (2,0 g/l), indikator resazurin
(1,0 ml/l) dan komponen medium yaitu; NaHCO3 (20.0 ml/l), Na2S.9H2O (10,0 ml/l), Wolin B vitamin (10,0 ml/l), Wolin B trace elemen (10,0 ml/l), larutan selenit tungstat (1,0 ml/l). Jenis Substrat Sumber karbon untuk pertumbuhan awal adalah fruktose (27,75 mM) dan sumber karbon tunggal (5 mM), atau campuran kedua substrat. Substrat yang dipilih adalah anisol, 2methoksifenol, asam vanili, asam siringig, 2.3.4-trimethoksi benzil alkohol, 2.4.5-trimethoksi benzil alkohol, 3.4.5-trimethoksi benzil alkohol, 2.3.4-trimethoksi asam benzoik, 2.4.5trimethoksi asam benzoat, 3.4.5-trimethoksi asam benzoat dan 3-methoksifenol. Teknik Penyediaan medium Medium akan digunakan untuk stok kultur, inokulum, pertumbuhan, dan pemilihan substrat sebagai inducer. Medium ini disiapkan secara anaerobik mengikuti metode Hungate (1969) dalam tabung Erlenmeyer berpenutup subaseal yang diikat dengan kawat tembaga. Melalui tutup subaseal, dimasukkan dua jarum masing-masing dengan panjang 8 inci dan 4 inci. Jarum panjang diletakkan pada dasar medium dan jarum pendek diletakkan di atas permukaan medium. Jarum panjang berfungsi sebagai saluran pemasukan gas nitrogen dan jarum pendek berfungsi sebagai pengeluaran gas. Sebelum dipanaskan, oksigen dalam medium diusir dengan gas nitrogen selama 10 menit. Kemudian, larutan dididihkan selama 3 menit di atas Hot Plate dan diaduk dengan pengaduk magnet. Selanjutnya, gas nitrogen dialirkan selama 10 menit. Semasa aliran gas dihentikan, jarum pendek dikeluarkan lebih awal kemudian diikuti jarum panjang. Untuk menjaga kelebihan tekanan, gas pada permukaan medium dikeluarkan dengan jarum suntik. Kemudian, medium disterilkan dalam Autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit dan didinginkan pada suhu 70oC, sebelum dimasukkan ke dalam Chamber Anaerobik. Di dalam chamber, medium dicampurkan dengan komponen medium dan substrat. Kemudian, medium dimasukkan ke dalam tabung uji sesuai dengan volume yang diperlukan (20 dan 30 ml) dan diinokulasi dengan 1% inokulum. Selanjutnya, tabung uji ditutup dengan subaseal dan dikeluarkan dari Chamber Anaerobik. Di luar chamber, kultur dialirkan lagi dengan gas nitrogen steril melalui subaseal selama 5 menit. Pertumbuhan Acetobacterium woodii diukur setiap selang waktu tertentu dengan mengukur nilai OD pada 660 nm dengan menggunakan Spektrofotometer Shimadzu UV-VIS 265.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penelitian ditabulasikan pada Tabel 1 dan diilustrasikan pada Gambar 1. Hasil penelitian menunjukkan bahwa substrat yang terbaik untuk pertumbuhan Acetobacterium woodii adalah 2-metoksifenol dengan nilai OD maksimum mencapai 0.204 dan laju pertumbuhan sepesifik () sebesar 0.141 per jam. Jika dibandingkan dengan standard (medium tanpa inducer), masing-masing nilai OD 660 nm untuk; 2-methoksifenol naik 11 kali, 3-methoksifenol naik 9 kali, anisol naik 5 kali, asam vanili naik 5 kali, asam siringig naik 4 kali, 2.3.4-trimethoksi benzil alkohol naik 2 kali, 2.4.5-trimethoksi benzil alkohol naik 2 kali, 3.4.5-trimethoksi benzil alkohol naik 2 kali, 2.3.4-trimethoksi asam benzoat naik 2 kali, 2.4.5-trimethoksi asam benzoat naik 3 kali dan 3.4.5-trimethoksi asam benzoat naik 6 kali. Berdasarkan nilai OD, tidak semua substrat dapat digunakan untuk inducer pada penghasilan biokatali demetilase, kecuali 2-metoksifenol. Dari sebelas substrat yang diuji, hanya 2-metoksifenol dapat mendukung pertumbuhan A.woodii dengan baik. Berdasarkan laju pertumbuhan sepesifiknya yang mencapai 0,141 per jam (), 2-metoksifenol lebih baik dibandingkan 3-metoksifenol. Hal ini berhubungan dengan jumlah methoksi, hidroksi dan kedudukan ikatan aromatic. Kedudukan ikatan aromatik berpengaruh terhadap pertumbuhan A.woodii (Bache & Pfennig. 1981; Tscheh & Pfennig. 1984). Dengan menggunakan mono methoksi aromatik (2-metoksifenol) melebihi 5 mM akan mengalami penghambatan produk.
Pertumbuhan Acetobacterium woodii (OD 660 nm)
0,210 0,180 0,150 0,120 0,090 0,060 0,030 0,000 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120
Waktu (Jam)
Gambar 1 Pertumbuhan Acetobacterium woodii pada medium yang mengandung berbagai jenis inducer Pertumbuhan A.woodii dilakukan pada 20 ml medium secara anaerob di dalam tabung uji yang ditutup dengan subaseal, dengan konsentrasi substrat (5 mM). Sebanyak 1.5 sampel diambil dengan jarum suntik kemudian dibaca OD pada 660 nm, 2-methoksifenol (), 3-
methoksifenol (), 3.4.5-trimethoksi asam benzoat (), asam vanili (), anisol (), asam siringig (), 2.4.5-trimethoksi asam benzoat (), 2.3.5-trimethoksi benzil alkohol (), 2.4.5-trimethoksi benzil alkohol (), 2.3.4-trimethoksi asam benzoat (), 3.4.5trimethoksi benzil alkohol (). Tabel 1 Pengaruh Jenis Substrat Pada Pertumbuhan Acetobacterium woodii (Jam1 ) 0.020 24 Jam Standar (-) Anisol 0.102 103 Jam 0.036 2- methoksifenol 0.204 72 Jam 0.141 Asam vanili 0.097 72 Jam 0.029 Asam siringig 0.087 79 Jam (-) 2.3.4- trimethoksi benzil alkohol 0.063 72 Jam 0.011 2.4.5- trimethoksi benzil alkohol 0.057 55 Jam 0.021 3.4.5- trimetoksi benzil alkohol 0.045 48 Jam 0.005 2.3.4- trimethoksi asam benzoat 0.049 72 Jam 0.018 2.4.5- trimethoksi asam benzoat 0.071 72 Jam 0.019 3.4.5- trimethoksi asam benzoat 0.129 79 Jam 0.107 3- methoksifenol 0.184 72 jam 0.137 Acetobacterium woodii ditumbuhkan pada medium 20 ml secara anaerobik dengan konsentrasi substrat 5 mM. Pembacaan OD pada 660 nm dilakukan setiap selang waktu. Maksimum OD dibandingkan dengan OD standar Jenis Substrat
Nilai OD660 nm
Waktu
KESIMPULAN Pemilihan induser telah berhasil dilakukan pada kulturisasi bakteri anaerob Acetobacterium woodii DSM 1030 pada berbagai bahan methoksi aromatik. Berdasarkan hasil penelitian inducer yang paling baik untuk membantu pertumbuhan Acetobacterium woodii adalah 2-methoksifenol dengan laju pertumbuhan spesifik () mencapai 0.141 per jam dibandingkan dengan substrat lainnya seperti: anisol, 3-methoksifenol, asam vanili, asam siringig, 2.3.4-trimethoksi asam benzoat, 2.4.5-trimethoksi asam benzoat, 3.4.5trimethoksi asam benzoat, 2.3.4-trimethoksi benzil alkohol, 2.4.5-trimethoksi benzil alkohol dan 3.4.5-trimethoksi benzil alkohol.
DAFTAR PUSTAKA Andreoni, V., Bernasconi, S., and Bestetti, G., 1995. Biotransformation of ferulic acid and related compounds by mutant strains of Pseudomonas fluorescens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42 : 830-835. Bache, R., and Pfennig, N., 1981. Selective isolation of Acetobacterium woodii on methoxylate aromatic acids and determination of growth yields. Arch. Microbiol. 130 : 255-261. Balch, W.E., Schorberth, S.,Tanner, R.S., and Wolfe, R.S., 1977. Acetobacterium, a new genus of hidrogen-oxidizing, carbon dioxide-reducing, anaerobic bacteria. Int. J. Syst Bacteriol. 27 : 358-361.
Drake, H.L., 1994. Acetogenesis, Acetogenic bacteria, and the Acetyl-CoA “ Wood/Ljungdahl ” Pathway : Pas and Current Perspectives In : Acetogenesis (Drake, H.L, Eds), pp 1-60 Chapman & Hall Newyork, London. Fuchs, G., 1986. CO2 fixation in acetogenic bacteria : variations on theme. FEMS Microbiol. Rev. 39 : 181-213. Hungate, R.E., 1969. A roll Tube Method for Cultivation of strict Anaerobes In : Methods in Microbiology (Norris, J.R. dan Ribbons, D.W., Eds), vol. 3B. pp. 117132. London. Mayer, F., Lurz, R., and Schorberth, S., 1977. Electron Microscopic investigation of the hidrogen-oxidizing Acetate forming anaerobic bacterium Acetobacterium woodii. Arch. Microbiol. 115 : 207-213. Smith, R.V., and Davis, P.J., 1978. Regiospective synthesis of isoapocodein from 10,11 dimethoxyaporphine by using Cunninghamella elegans. Appl. Env. Microbiol. 35: 738-742. Tsceh, A., and Pfennig, N., 1984. Growth yield increase linked to caffeate reduction in Acetobacterium woodii. Arch. Microbiol. 137 : 163-167. Wolfe, R.S. 1971. Microbiol formation of methane, Adv. Microbiol. Physiol. 8 : 107-146.
