PEMANFAATAN KHITOSAN DARI LIMBAH KRUSTASEA UNTUK PENYEMBUHAN LUKA PADA MENCIT (Mus musculus albinus)
ANDRE MAHESA DJAMALUDIN
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK ANDRE MAHESA DJAMALUDIN. Pemanfaatan Khitosan dari Limbah Krustacea Untuk Penyembuhan Luka pada Mencit (Mus musculus albinus). Dibimbing oleh ANNA P. ROSWIEM dan EKOWATI HANDHARYANI. Sebagian besar limbah krustacea mengandung senyawa kitin, yang secara kimia dapat ditransormasi menjadi khitosan. Limbah yang digunakan merupakan cangkang kepiting. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian khitosan terhadap proses penyembuhan luka pada kulit mencit jantan (Mus musculus albinus) dengan parameter pengamatan makroskopik berupa ukuran luka, kering tidaknya luka, dan jaringan parut yang terbentuk serta beberapa parameter lain dalam pengamatan histopatologi berupa infiltrasi sel radang, neokapilerisasi, re-epitelisasi, dan pembentukan jaringan ikat. Dua puluh tujuh ekor mencit dibagi dalam 3 kelompok. Kelompok I sebagai kontrol negatif, kelompok II sebagai kontrol positif (Betadine®), dan kelompok III sebagai kelompok yang diberikan khitosan. Pembuatan luka dilakukan dengan membuat luka insisi dalam pada punggung mencit berukuran 5x5 mm menggunakan skapel steril. Pemberian Betadine® dan larutan khitosan dilakukan dua kali setiap hari secara topikal selama 6 hari. Pengamatan dan pengambilan sampel kulit dilakukan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 setelah perlukaan pada 3 ekor mencit dari masingmasing kelompok. Secara statistik, khitosan memiliki kemampuan mempercepat proses penyembuhan luka karena menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap kontrol negatif.
ABSTRACT ANDRE MAHESA DJAMALUDIN. Utilization of Chitosan from Crustacean Waste as Wound Healing at Mice (Mus musculus albinus). Under the direction of ANNA P. ROSWIEM and EKOWATI HANDHARYANI. Crustacean shell contain an organic substance called chitin, that can be transform into chitosan. This research used crab shell as the crustacean waste. This research focused on to know the influence of chitosan applied to wound healing process on male mice skin with macroscopic observation parameters such as size of wound, dryness of wound, and condition of granulation tissue also other parameter in histopathology observation such as inflammation cell infiltrate, neocapilarization, re-epitelization, and forming of connective tissue. Twenty seven mice were divided into 3 groups. Groups 1 (negative control), group II (positive control, Betadine®), and group III (chitosan). Wounding done by wounding the back fairish using scapel measuring 5x5 mm2. Betadine® and chitosan solution were applied every two times a day for 6 day. Observation and take skin sample were conducted at 0th, 2nd, 4th, and 6 th day after wounding at 3 mice from each group. Statistically, chitosan have the ability speed up process of wound healing because it s significantly different compared to negative control.
PEMANFAATAN KHITOSAN DARI LIMBAH KRUSTASEA UNTUK PENYEMBUHAN LUKA PADA MENCIT (Mus musculus albinus)
ANDRE MAHESA DJAMALUDIN
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi : Pemanfaatan Khitosan dari Limbah Krustacea Untuk Penyembuhan Luka pada Mencit (Mus musculus albinus) Nama : Andre Mahesa Djamaludin NIM : G44104025
Disetujui
Dr. Anna P Roswiem, MS Ketua
drh. Ekowati Handharyani., M.Si., Ph.D Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT atas segala rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini yang berjudul Pemanfaatan Khitosan dari Limbah Krustacea Untuk Penyembuhan Luka pada Mencit (Mus musculus albinus). Penelitian dilaksanakan pada bulan Januari 2009 sampai
Maret 2009 di Laboratorium Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Anna P. Roswiem, MS dan drh. Ekowati Handharyani, M.Si., Ph.D selaku pembimbing atas segala arahan dan bimbingannya selama penelitian berlangsung. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Pak Soleh, Pak Endang, Pak Kasnadi, dan seluruh staf di Laboratorium Patologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor, Pak Sembada Ganda, serta teman-teman PS Biokimia khususnya Nanda, Dedy, Falakh, Indra, Sidiq, Intan, Hanifah, Safety, Ine, Nophe, dan Navies atas segala bantuan dan motivasinya. Ucapan terima kasih yang tak terhingga kepada Papa, Mama, serta seluruh keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Juli 2009 Andre Mahesa Djamaludin
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Samarinda pada tanggal 23 Oktober 1986 sebagai anak pertama dari pasangan Bapak Ahmad Nopian dan Ibu Denny Handiani. Tahun 2004 penulis lulus dari SMUN 3 Bogor dan pada tahun yang sama penulis diterima masuk di Program Studi Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama menjadi mahasiswa aktif di IPB, penulis pernah menjadi staf Departemen Olahraga Ikatan Mahasiswa Kimia pada periode 2004-2005, ketua Biokimia angkatan 41 pada periode 2005-2007, staf Departemen Kerohanian Community of Research and Education in Biochemistry (CREBs) pada periode 2005-2006, wakil ketua CREBs pada periode 2006-2007, ketua panitia Fieldtrip Biokimia Angkatan 41 pada tahun 2007, ketua acara Silaturahmi Civitas Departemen Biokimia pada 2007, staf badan pengawas CREBs pada periode 2007-2008, serta ketua Buku Angkatan Biokimia Angkatan 41 pada 2008. Penulis juga aktif berpartisipasi dalam perlombaan Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) yang didanai DIKTI, diantaranya PKM-Teknologi dengan judul Pemanfaatan Zeolit dan Khitosan dalam Pengolahan Bahan Baku Air Minum (2007), PKM-Penelitian dengan judul Khitosan sebagai Bahan Antibakteri (2008), PKM-Teknologi dengan judul Kertas Antibakteri Berbasis Khitosan (2008), dan PKM-Teknologi dengan judul Teknologi Desalinisasi Air Laut Menggunakan Campuran Khitosan, Zeolit, dan Arang Aktif (2008). Penulis juga pernah menjadi finalis lima besar Pemilihan Peneliti Remaja Indonesia VII yang diselenggarakan oleh Lembaga Ilmu pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2008 dan pada tahun yang sama penulis berhasil menjadi peserta program Iptek Remaja yang diselenggarakan oleh Kementrian Negara Riset dan Teknologi, Republik Indonesia. Penulis juga pernah melaksanakan Praktik Lapangan (PL) di Laboratorium Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI Cibinong selama periode Juli sampai Agustus 2007, dan menulis karya ilmiah yang berjudul Isolasi Mikroorganisme Hidrokarbanoklastik Pendegradasi Senyawa Poliaromatik Hidrokarbon.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ......................................................................................
vii
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................
vii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... viii PENDAHULUAN .......................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Khitosan .............................................................................................. Struktur Normal Kulit.......................................................................... Penyembuhan Luka .............................................................................
1 2 2
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .................................................................................... Metode Penelitian................................................................................
4 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Khitosan ......................................................................... Hasil Pengamatan Patologi Anatomi.................................................... Hasil Pengamatan Histopatologi .......................................................... Peranan Khitosan dalam Penyembuhan Luka.......................................
5 6 7 10
SIMPULAN DAN SARAN ..........................................................................
12
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................
12
LAMPIRAN ................................................................................................
14
DAFTAR TABEL Halaman 1 Rataan ukuran luka pada pengamatan patologi anatomi ..........................
7
2 Rataan jumlah neutrofil pada pemeriksaan mikroskopis...........................
8
3 Rataan jumlah limfosit pada pemeriksaan mikroskopis............................
8
4 Rataan jumlah makrofag pada pemeriksaan mikroskopis .........................
9
5 Rataan jumlah fibroblast pada pemeriksaan mikroskopis .........................
10
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur khitosan .....................................................................................
2
2 Struktur kulit ...........................................................................................
2
3 Reaksi yang terjadi dalam proses deasetilasi............................................
6
4 Pembuatan khitosan dari kulit kepiting hingga menjadi produk ...............
6
5 Interaksi antara tingkat kekeringan luka terhadap hari perlakuan .............
7
6 Interaksi antara jumlah jaringan parut pada luka terhadap hari perlakuan.
7
7 Interaksi antara jumlah neokapilerisasi pada luka terhadap hari perlakuan
9
8 Interaksi antara persentase re-epitelisasi pada luka terhadap hari perlakuan ................................................................................................
10
9 Pergerakan neutrofil dengan cara kemotaksis menuju daerah jaringan yang rusak (Guyton dan Hall 1997) .........................................................
12
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Alur penelitian ........................................................................................
15
2 Gambaran kondisi luka pada kelompok kontrol negatif pada hari ke-0, 2, 4, dan 6.......................................................................................
17
3 Gambaran kondisi luka pada kelompok kontrol positif (betadine®) pada hari ke-0, 2, 4, dan 6........................................................................
17
4 Gambaran kondisi luka pada kelompok khitosan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 .......................................................................................................
18
5 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan patologi anatomi untuk ukuran luka (mm2)...................................................................................
19
6 Data hasil pengamatan patologi anatomi dengan metode scorring untuk tingkat kekeringan luka ...........................................................................
20
7 Data hasil pengamatan patologi anatomi dengan metode scorring untuk jumlah jaringan parut yang terbentuk.......................................................
21
8 Gambaran histopatologi daerah luka pada kelompok betadine®, kelompok kontrol negatif dan kelompok khitosan...................................
22
9 Gambaran sel radang (neutrofil, llimfosit, dan makrofag) serta sel fibroblast dalam pengamatan histopatologi (hari ke-2 kelompok khitosan) pada perbesaran 40x10.............................................................
24
10 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah neutrofil dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10 .......
25
11 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah limfosit dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10.........
26
12 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah makrofag dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10......
27
13 Data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah neokapilerisasi dengan metode scorring menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 10x10 ....................................................................................
28
14 Data hasil pengamatan histopatologi terhadap persentase re-epitelisasi menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 10x10......................... 15 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah makrofag dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10......
28 29
PENDAHULUAN Para pemakai lensa kontak mungkin tidak menyangka bahwa yang terpasang di matanya bisa jadi berasal dari kulit udang atau kulit kepiting. Tidak banyak yang mengetahui bahwa lensa kontak terbuat dari kitin atau turunannya khitosan, yaitu senyawa polisakarida yang banyak terdapat pada kulit krustasea. Kitin dan khitosan mempunyai kegunaan yang sangat luas, tercatat sekitar 200 jenis penggunaannya, dalam industri pangan, bioteknologi, farmasi dan kedokteran, serta lingkungan. Di industri penjernihan air, kitin dan khitosan telah banyak dikenal sebagai bahan penjernih. Kitin dan khitosan juga banyak digunakan di dunia farmasi dan kosmetik, misalnya sebagai penurun kadar kolesterol darah, membantu penyembuhan luka, dan pelindung kulit dari kelembaban (Bastaman 1989). Limbah padat kulit, kepala, dan kaki krustasea merupakan salah satu masalah yang harus dihadapi oleh pabrik pengolahan krustasea. Selama ini limbah tersebut dikeringkan dan dimanfaatkan sebagai pakan atau pupuk dengan nilai yang rendah. Mengolahnya menjadi kitin atau khitosan akan memberikan nilai tambah yang cukup tinggi. Sebagai bahan utama, kulit krustasea mengandung 14-35% (berat kering) kitin. Diperkirakan limbah kulit krustasea dunia mencapai sekitar 5 juta ton (kering) atau setara dengan 200 ribu ton kitin. Di pasar internasional, harga kitin dapat mencapai US$ 10 per kilogram, sedangkan untuk khitosan US$ 15-40 per kilogram tergantung kualitas dan jenisnya (Departemen Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia 2006). Ekstraksi kitin umumnya melalui tahapan penggilingan, deproteinasi, demineralisasi, dan pengeringan, sedangkan khitosan diperoleh dengan penambahan basa kuat terhadap kitin pada suhu tinggi. Sebagai salah satu negara pengekspor udang, Indonesia tentu saja berpeluang memproduksi kitin atau khitosan. Dengan volume ekspor udang (kupas dan tanpa kepala) sekitar 90 ribu ton setiap tahunnya, maka akan tersedia kulit udang (kering) sebanyak 12 ribu ton/tahun. Ekspor kepiting (dalam kaleng) sekitar 4000 ton per tahun juga berpotensi menghasilkan kulit sebagai limbah sebanyak 1000 ton per tahun. Kedua limbah tersebut berpotensi diolah menjadi kitin, dengan produksi sekitar 1700 ton per tahun. Tentu saja kenyataannya tidak selalu demikian mengingat pengolahan udang dan
kepiting tersebar di beberapa daerah. Survei yang dilakukan oleh Badan Riset Kelautan dan Perikanan (BRKP) menunjukkan bahwa untuk daerah Jabotabek dapat tersedia sekitar 100 ton kulit udang kering setiap bulannya atau setara dengan 13 ton kitin. Apabila ini dikonversikan ke dalam nilai uang, maka setidaknya akan diperoleh devisa sebesar US$ 65 ribu per bulan atau US$ 780 ribu per tahun. Ini belum terrnasuk kepiting dari daerah lain (Departemen Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia 2006). Tentu saja peluang akan tetap menjadi peluang di atas kertas bila tidak direalisasikan. Salah satu pemanfaatan limbah kulit kepiting adalah dengan mengubahnya dalam bentuk khitosan yang dapat diaplikasikan sebagai bahan anti inflamasi. Sejauh ini penelitian di Indonesia mengenai aktivitas khitosan dalam membantu penyembuhan luka (anti inflamasi) belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas khitosan dalam penyembuhan luka. Model percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus albinus). Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat mengenai potensi khitosan dalam mengobati luka. Hipotesis dari penelitian ini adalah khitosan memiliki aktivitas yang dapat membantu penyembuhan luka pada mencit.
TINJAUAN PUSTAKA Khitosan Khitosan merupakan produk deasetilasi kitin dengan basa kuat yang merupakan polimer linier berberat molekul tinggi dari 2-deoksi-2-amino glukosa. Sifat khitosan dapat disamakan dengan sifat polimer kationik, sehingga khitosan tidak larut dalam air atau larutan alkali di atas pH 6,5. Khitosan larut dengan cepat dalam asam organik cair seperti asam formiat, asam sitrat, dan asam mineral lain, kecuali sulfur (Mc Kay, Blair, dan Grant 1987 diacu dalam Nasyirudin 2002). Khitosan aman bagi lingkungan karena dapat mengalami degradasi secara biologis dan tidak beracun. (Rha 1984 diacu dalam Nasyirudin 2002). Kualitas dan nilai ekonomi khitosan dan kitin ditentukan oleh besarnya derajat deasetilasi. Semakin tinggi derajat deasetilasi maka semakin tinggi kualitas dan harga jualnya. Kualitas khitosan berdasarkan penggunaan dapat dibagi ke dalam tiga jenis kualitas yaitu kualitas teknis, pangan dan farmasi.
Sifat dan kegunaan multiguna khitosan tidak terlepas dari sifat alaminya. Sifat alami tersebut dapat dibagi menjadi dua sifat besar yaitu, sifat kimia dan biologi. Sifat kimia khitosan sama dengan kitin tetapi yang khas antara lain merupakan polimer poliamin berbentuk linear, mempunyai gugus amino aktif, mempunyai kemampuan mengkelat beberapa logam. Aplikasi khitosan yang utama adalah sebagai senyawa pengkelat logam dalam instalasi pengolahan air bersih atau limbah, kosmetik, fungisida, dan obat penyembuh luka (Bastaman 1989). Sifat biologi khitosan antara lain bersifat biokompatibel artinya sebagai polimer alami sifatnya tidak mempunyai akibat samping, tidak beracun, mudah diuraikan oleh mikroba (biodegradable) dan bersifat hemostatik, fungistatik, spermisidal, antitumor, serta antikolesterol. Berdasarkan sifat tersebut maka khitosan mempunyai sifat fisik khas yaitu mudah dibentuk menjadi spons, larutan, gel, pasta, membran, dan serat. yang sangat bermanfaat dalam aplikasinya (Bastaman 1989). Khitosan banyak digunakan oleh berbagai industri antara lain industri farmasi, kesehatan, biokimia, bioteknologi, pangan, pengolahan limbah, kosmetik, agroindustri, industri tekstil, industri perkayuan, industri kertas dan industri elektronika. Aplikasi khusus berdasarkan sifat yang dipunyainya antara lain dalam pengolahan limbah cair terutama bahan sebagai bersifat resin penukar ion untuk minimalisasi logam logam berat, mengkoagulasi minyak/lemak, serta mengurangi kekeruhan: penstabil minyak, rasa, dan lemak dalam produk industri pangan (Bastaman 1989). Struktur khitosan dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1 Struktur khitosan. Struktur Normal Kulit Kulit berfungsi untuk melindungi tubuh, regulasi panas tubuh, ekskresi, dan sensasi. Secara histologis, kulit (Gambar 2) memiliki dua lapisan utama, yaitu lapisan epidermis dan dermis (corium). Kulit terbagi pula menjadi kulit yang berbulu dan tidak berbulu
(Hartono 1992 diacu dalam Hapsari 2006). Lapisan epidermis terdiri atas epitel pipih banyak lapis. Secara umum epidermis terbagi menjadi lima lapis utama, yaitu stratum basale, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum, dan stratum corneum. Adapun dermis merupakan sesungguhnya (cutis vera) yang terdiri atas jalinan serabut kolagen pekat tidak teratur, serabut elastis , dan sel jaringan ikat. Tebal tipisnya dermis pada setiap hewan berbeda dan dermis terbagi menjadi 2 lapis, yaitu stratum papillare dan stratum retikulare (Hartono 1992 diacu dalam Hapsari 2006).
Gambar 2 Struktur kulit. Penyembuhan Luka Luka adalah kerusakan morfologi jaringan kulit dan jaringan yang lebih dalam. Penyembuhan luka adalah proses normalisasi integritas kulit dan jaringan dibawahnya melalui berbagai tahap peradangan akut. Penyembuhan erat kaitannya dengan peradangan. Peradangan merupakan proses yang sangat awal dari penyembuhan luka. Sebelum terjadi penyembuhan, produk dari inflamasi seperti eksudat dan sel mati telah bergerak dari wilayah tersebut. Proses ini disertai dengan meleburnya jaringan mati. Peristiwa ini terjadi karena enzim autolitik dari jaringan mati itu sendiri (autolisis) dan juga karena enzim yang dikirim dari leukosit peradangan (heterolisis). Material cair kemudian siap diabsorbsi ke dalam pembuluh limfa dan membuka jalan untuk penyembuhan luka (Vegad 1996). Perbaikan jaringan meliputi dua proses nyata yaitu perbaikan dengan regenerasi dan pergantian dengan jaringan ikat (fibroplasias). Perbaikan dengan regenerasi ditunjukkan dengan tergantinya sel dan jaringan yang rusak dengan yang baru. Perbaikan dengan jaringan ikat terjadi melalui empat tahap yaitu migrasi dan proliferasi fibroblast, dekomposisi ekstraseluler matriks,
pembentukan pembuluh darah baru (angiogenesis), dan pematangan jaringan parut (Vegad 1996). Penyembuhan luka terdiri atas fase peradangan, fase fibroblastik, dan fase pematangan serta fase retraksi jaringan (Jones et al. 1996). Fase Peradangan Peradangan merupakan reaksi kompleks dari vascular dan seluler satu individu terhadap sebuah iritan. Tingkat peradangan umumnya dipengaruhi oleh banyaknya kerusakan jaringan dan kemampuan tubuh untuk mengeliminasi benda asing atau jaringan yang rusak tersebut (Meyer et al. 1992 dan Abbas et al. 1994). Bila terjadi infeksi yang disebabkan oleh bakteri, trauma, bahan kimia, panas, atau fenomena lainnya, maka jaringan yang terinfeksi itu akan melepaskan berbagai substansi yang dapat menyebabkan perubahan sekunder yang dramatis. Perubahan sekunder ini disebut dengan peradangan (Guyton dan Hall 1997). Peradangan menurunkan permeabilitas dinding pembuluh darah sehingga banyak sekali cairan yang keluar meninggalkan pembuluh darah memasuki jaringan yang rusak (Yusup 2003). Reaksi tubuh terhadap suatu iritan dapat dikelompokkan dalam 3 kategori utama yaitu perubahan sirkulasi awal, eksudasi dari leukosit dan cairan, serta perbaikan jaringan. Perubahan pertama yang terjadi adalah hiperemi, yaitu peningkatan jumlah darah di daerah iritan saat pertahanan humoral dan seluler terpusat di daerah tersebut. Eksudasi adalah proses dari mengalirnya sel-sel dan cairan ke dalam area yang terluka. Sel-sel tersebut adalah leukosit dan eritrosit, sedangkan cairan tersebut adalah plasma darah yang berisi pertahanan humoral (Martini et al. 1992). Regenerasi sel merupakan suatu pemulihan jaringan yang rusak menjadi normal kembali. Adanya perlukaan jaringan merangsang sel makrofag untuk mengeluarkan zat-zat kimia yang akan merangsang sel monosit dan fagosit untuk bermigrasi ke dalam jaringan yang rusak, selain itu untuk menarik sel fibroblast bermigrasi ke dalam jaringan yang rusak sehingga membentuk jaringan parut untuk menutupi luka (Martini et al. 1992). Ruang antara sayatan akan dihiasi oleh gumpalan darah dan segera diikuti dengan peradangan akut beberapa saat setelah sayatan dilakukan (Braunstein 1987). Peradangan diawali dengan meningkatnya tekanan
hidrostatik dalam pembuluh darah sehingga keseimbangan terganggu dan menyebabkan lebih banyak cairan yang keluar meninggalkan pembuluh darah dan kemudian memasuki jaringan (Spector dan Spector 1989). Dalam waktu 24 jam cairan eksudat dari peradangan akut terlihat membasahi luka. Cairan tersebut kemudian berkoagulasi dengan produknya yaitu fibrin dan serum (Russel 1984). Fase Fibroblastik Kehadiran fibroblast dalam jumlah besar berasal dari fibroblast lokal yang sudah ada sebelumnya. Fibroblast merangsang pembentukan kolagen. Myofibroblast merupakan fibroblast yang mempunyai sifat kontraksilitas. Myofibroblast bertanggung jawab untuk berkontraksi dan mengurangi ukuran luka. Tepi-tepi luka akan tertarik sehingga menutupi daerah yang terluka (Thomson 1978). Fase Retraksi Jaringan Proliferasi sel epitel terjadi disertai dengan penampakan jaringan ikat. Sel epitel kulit keluar dari tepi luka dengan gerakan amuboid. Sel-sel epitel menggunakan pita-pita fibrin sebagai pemandu perjalanannya. Restorasi epitel permukaan pada kulit dicapai dengan meningkatnya aktivitas miosis epitel ditepi luka terutama pada lapisan yang lebih dalam. Aktivitas miosis epitel luka terutama pada lapisan yang lebih dalam. Aktivitas miosis terjadi dari sel yang sudah rusak atau terpapar oleh pengaruh lingkungan yang tidak menyenangkan (Spector and Spector 1989). Faktor-Faktor yang Penyembuhan Luka
Mempengaruhi
Penyembuhan luka dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adalah terjadinya inflamasi aktif yang terus-menerus yang disebabkan oleh bakteri. Inflamasi ini dapat menimbulkan eksudat baru yang lebih cepat daripada daya ambil makrofag. Makrofag juga dapat rusak oleh toksin bakteri, atau mengganggu proses fagositosis terhadap reruntuhan dengan cara memblokade lokasi reseptor fagositik pada permukaan (Spector and Spector 1989). Ini merupakan faktor penghambat penyembuhan luka. Suplai darah yang cukup baik esensial bagi penyembuhan luka karena lokasi metabolisme yang aktif butuh oksigen dan substrat untuk menyediakan energi baginya. Penyembuhan luka juga dapat dihambat oleh adanya gerakan
yang berlebihan pada lokasi yang rusak. Selain faktor-faktor diatas, Penyembuhan luka juga dipengaruhi oleh faktor kimiawi, diantaranya kekurangan asam askorbat yang dapat mengganggu pembentukan kolagen.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah kulit kepiting, NaOH, HCl, asam laktat, air destilata, Betadine®, BNF (Buffer Neutral Formaline) 10%, alkohol absolut, xylol, parafin, lithium karbonat, parafin, perekat permount, zat pewarna Mayer s Hematoksilin, eosin, Masson Trichome, larutan perekat (albumin), mencit, pakan, ketamin, dan eter. Alat-alat yang digunakan adalah kandang mencit, syringe, sarung tangan, penangas air, Tissue-Tek® TEC, kaset tissue, lemari pendingin, cetakan blok paraffin, mikrotom, gelas objek, gelas penutup, mikroskop cahaya, dan mikroskop video. Metode Penelitian Pembuatan Khitosan (Masduki 1996) Pembuatan dibagi menjadi tiga tahap. Tahap pertama disebut demineralisasi, yaitu perendaman kulit kepiting dalam larutan HCl 1 N dengan perbandingan 1:7 selama 8 jam. Tahap kedua adalah deproteinasi, yaitu perendaman hasil demineralisasi dalam NaOH 3,5 % selama 1 jam pada suhu 90°C. Tahap terakhir adalah deasetilasi, yaitu perendaman hasil deproteinasi dalam NaOH 50% pada suhu 100°C untuk memutus gugus asetil pada kitin sehingga menjadi khitosan. Pembuatan Larutan Khitosan Khitosan sebanyak 8 gram dilarutkan dalam asam laktat 1% hingga menjadi 200 mL. Larutan asam laktat 1% dibuat dengan air sebagai pelarutnya. Larutan khitosan yang dihasilkan memiliki konsentrasi 4% (b/v). Perlukaan pada Mencit Perlukaan dilakukan pada punggung mencit dengan cara membuat sayatan berukuran 0.5 cm x 0.5 cm menggunakan skapel yang steril. Sayatan dibuat sejajar dengan tulang belakang. Sebelum melakukan perlukaan pada mencit, dilakukan pembiusan dengan eter dan ketamin serta pencukuran bulu di daerah punggung (daerah yang akan dilukai). Dosis ketamin yang digunakan adalah 0.02 mL per 20 gram bobot badan. Penyayatan dilakukan setelah daerah yang
akan disayat tersebut dioles dengan larutan antiseptik. Pemberian Larutan Khitosan Pemberian larutan khitosan dilakukan secara topikal pada luka yang dibuat. Pada uji lanjutan, pemberian larutan khitosan dilakukan dua kali sehari selama 6 hari dengan jumlah mencit sebanyak 9 ekor setiap kelompok. Kelompok tanpa perlakuan digunakan sebagai kontrol negatif, sedangkan kelompok yang diberi Betadine® sebagai kontrol positif.
. Pengamatan Patologi Anatomi Pengamatan ini dilakukan pada waktu sore setiap hari setelah perlakuan pada pagi harinya menggunakan metode scoring pada masing-masing kelompok uji. Nilai yang digunakan berkisar antara nol (0) sampai positif sepuluh (+4) dibandingkan dengan beberapa parameter seperti kekeringan luka dan pembentukan jaringan parut. Pengukuran luas luka dilakukan dengan membuat gambaran luka di atas plastik yang kemudian diukur luasnya menggunakan kertas milimeterblok sebagai pembanding. Pembuatan Sediaan (Putriyanda 2006)
Histopatologi
Bagian mencit yang digunakan dalam pembuatan sediaan histopatologi adalah kulit. Pengambilan sampel kulit dilakukan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 setelah perlakuan. Sampel kulit diambil dari 3 ekor mencit pada setiap kelompok uji, namun berbeda untuk hari ke-0 karena sampel kulit diambil dari 3 mencit di luar kelompok uji. Pengambilan sampel kulit diawali dengan proses nekropsi pada mencit menggunakan ketamin dengan dosis 0.05 mL per 20 gram bobot badan melalui intra-peritonial. Potongan sediaan kulit dimasukkan ke dalam kaset tissue kemudian dilakukan tindakan dehidrasi dengan merendam sediaan tersebut secara berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 90%, alkohol absolut I, alkohol absolut II, xilol I, xilol II, parafin I, dan terakhir ke dalam parafin II. Lama perendaman pada setiap bahan tersebut dilakukan selama 2 menit. Jaringan dimasukkan ke dalam alat pencetak berisi parafin cair dimana letak jaringan diatur agar tetap berada ditengah blok parafin. Setelah parafin mulai membeku, ditambahkan kembali parafin cair hingga alat
pencetak penuh dan dibiarkan sampai parafin membeku dan mengeras. Pemotongan jaringan menggunakan mikrotom dilakukan dengan ketebalan 3 mikron setelah sebelumnya dimasukkan ke dalam lemari pendingin. Hasil pemotongan yang berbentuk pita diletakkan diatas permukaan air hangat (45°C) dengan tujuan menghilangkan lipatan objek. Objek diletakkan di atas gelas objek yang kemudian dikeringkan dalam inkubator suhu 60°C selama 1 malam. Sediaan dimasukkan ke dalam xilol empat kali selama 2 menit, selanjutnya memasuki proses rehidrasi yang dimulai dari alkohol absolut sampai alkohol 80% masing-masing selama 2 menit. Kemudian sediaan di cuci dengan air mengalir lalu dikeringkan. Setelah itu, sediaan di warnai dengan Mayer s Hematoksilin selama 1 menit kemudian dibilas lagi dengan air dan akhirnya diwarnai dengan pewarna Eosin selama 2 menit. Untuk menghilangkan warna Eosin yang berlebihan, sediaan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Kemudian sediaan dicelupkan ke dalam alkohol 90% sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut I sebanyak 10 kali celupan, alkohol absolut II selama 2 menit, xilol I selama 1 menit, dan xilol II selama 1 menit. Akhirnya sediaan ditetesi perekat permount dan ditutup dengan gelas penutup dan siap diamati menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan Sediaan Histopatologi Pengamatan secara hispatologi dilakukan pada sediaan sampel kulit. Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop cahaya. Pengamatan ini menggunakan parameterparameter seperti jumlah sel radang, jumlah neokapilerisasi, proses re-epitelisasi, dan pertumbuhan jaringan ikat. Jumlah Sel Radang. Perhitungan sel radang dilakukan dengan menghitung jumlah sel neutrofil, limfosit, dan makrofag pada sediaan histopatologi menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x10. Perhitungan dilakukan sebanyak 5 lapang pandang. Jumlah Neokapilerisasi. Pengamatan terhadap neokapilerisasi dilakukan dengan metode scorring berdasarkan jumlah neokapiler pada sediaan hispatologi menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 40x10. Nilai yang digunakan berkisar antara nol (0) sampai positif sepuluh (+4). Persentase Re-epitelisasi. Pengamatan reepitelisasi dilakukan dengan mengukur
persentase proses re-epitelisasi berdasarkan kondisi jaringan epitel pada daerah luka menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 10x10. Pertumbuhan Jaringan Ikat. Pengamatan terhadap pertumbuhan jaringan ikat dilakukan dengan menghitung jumlah sel fibroblastik pada daerah luka menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x10. Perhitungan dilakukan sebanyak 5 lapang pandang. . Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap (RAL). Percobaan ini terdiri atas 3 perlakuan dan 3 kali ulangan. Model percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut : Yij=µ + αi + εij keterangan : Yij = pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum αi = pengaruh perlakuan ke-i εij = pengaruh acak pada perlakuan ke-i, ulangan ke-j Analisis data dilakukan dengan uji beda nyata terkecil (BNT) dengan selang kepercayaan 95% (Mattjik 2002).
HASIL DAN PEMBAHASAN Karakteristik Khitosan Khitosan merupakan turunan dari kitin. Khitosan didapat dari kitin yang telah melalui proses deasetilasi dengan menggunakan NaOH. Kitin diperoleh dari ekstraksi limbah kulit kepiting yang telah melalui proses demineralisasi dengan menggunakan HCl 1 N dengan perbandingan 1:7. Ekstrak yang diperoleh kemudian dihilangkan proteinnya dengan NaOH 3,5 % selama 1 jam pada suhu 90°C dengan perbandingan 1:10. Untuk mendapatkan khitosan, kitin dihilangkan gugus asetilnya, sehingga yang tertinggal hanya gugus hidroksil dan amino (Gambar 3). Gugus amino inilah yang membedakan khitosan dengan kitin (Masduki 1996). Kulit kepiting digunakan karena mengandung kadar protein yang lebih rendah dibandingkan dengan kulit udang, sehingga membuat masa simpan kulit kepiting lebih panjang dibandingkan dengan kulit udang. Tentunya selama penyimpanan, limbah kulit kepiting akan menghasilkan bau yang lebih ringan dibandingkan dengan yang akan
dihasilkan limbah kulit udang. Limbah kulit kepiting yang digunakan berasal dari daerah Muara Angke. Jumlah keseluruhan limbah kulit kepiting yang diproses sebanyak 38 kg. Setelah kulit kepiting melalui proses demineralisasi, deproteinasi, dan deasetilasi, kulit kepiting akan berubah menjadi khitosan (Gambar 4). Rendemen khitosan yang dihasilkan adalah 15.79% (Djamaludin et al. 2008). Sebelum dilakukan perlakuan, khitosan yang ada dilarutkan dalam larutan asam laktat 1% (v/v) dalam air hingga dihasilkan larutan khitosan 4% (b/v). Asam laktat dipilih karena sifatnya yang relatif aman terhadap kulit bila dibandingkan dengan asam organik lainnya. Hasil Pengamatan Patologi Anatomi Pengamatan terhadap penyembuhan luka berdasarkan gambaran patologi anatomi (PA) terhadap kelompok negatif, kelompok Betadine®, dan khitosan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 setelah perlakuan dengan parameter ukuran luka, kering tidaknya luka, serta jumlah jaringan parut yang terbentuk pada luka. Berdasarkan pengamatan patologi anatomi pada luka terlihat bahwa pada hari ke-0, kelompok perlakuan khitosan sudah menunjukkan adanya perbaikan. Kondisi luka pada kelompok khitosan terlihat lebih kering dibandingkan kedua kelompok lainnya (Gambar 5). Diduga kemampuan khitosan sebagai koagulan menjadi pemicu keringnya luka yang lebih cepat bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Pengamatan pada hari ke-2 belum menunjukkan perbedaan kondisi luka antara kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif, namun perbedaan ditunjukkan pada kelompok khitosan. Kondisi luka terlihat lebih kering dengan pembentukkan jaringan parut yang lebih banyak (Gambar 6). Bahkan ukuran luka pada kelompok khitosan sama dengan ukuran luka pada kedua kelompok lainnya di hari ke-4.
(kitin) + NaOH
(khitosan) + CH3 COOH
Gambar 3 Reaksi yang terjadi dalam proses deasetilasi.
Gambar 4 Pembuatan khitosan dari kulit kepiting hingga menjadi produk. Pengamatan pada hari ke-4 menunjukkan kondisi yang tidak berbeda dengan kondisi luka pada hari ke-2. Kondisi luka pada kelompok khitosan tetap terlihat lebih kecil secara nyata bila dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Perbedaan yang signifikan pun juga sudah mulain ditunjukkan antara kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif (Tabel 1). Jaringan parut adalah salah satu tanda bahwa penyembuhan luka sedang berjalan. Dalam prosesnya, jaringan parut yang terbentuk dari hasil pembekuan darah akan menutupi area luka. Saat kondisi luka sudah membaik, penyembuhan luka masuk ke tahap berikutnya, yaitu tahap fibroblastik dan retraksi jaringan. Jaringan parut akan hilang atau hancur dengan sendirinya sementara selsel fibroblast akan masuk ke area luka untuk melakukan proses re-epitelisasi. Pengamatan pada hari ke-6 menunjukkan kondisi luka pada kelompok Betadine® pun mulai menunjukkan kondisi yang lebih baik bila dengan kelompok kontrol negatif. Untuk
kelompok khitosan, menunjukkan kondisi luka yang lebih baik dengan mulai tidak terlihatnya bekas luka. Luka yang lebih kering dan jaringan parut yang sudah mulai berkurang menunjukkan kondisi luka pada kelompok khitosan lebih baik dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Dengan kata lain penyembuhan luka pada kelompok khitosan berjalan lebih cepat. Hasil Pengamatan Histopatologi Pengamatan secara histologi terhadap penyembuhan luka dilakukan dengan membandingkan gambaran histopatologi dari kelompok kontrol negatif, kelompok Betadine®, dan kelompok khitosan. Pengamatan ini dilakukan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 setelah perlakuan. Perbandingan gambaran histopatologi yang diamati dapat dilihat pada Lampiran 9. Parameter yang digunakan adalah jumlah sel radang (neutrofil, limfosit, dan makrofag), pembentukan kapiler baru (neokapilerisasi), pembentukan jaringan ikat berdasarkan jumlah sel fibroblas, dan kondisi re-epitelisasi.
Tabel 1 Rataan ukuran luka pada pengamatan patologi anatomi Kontrol Kontrol + Khitosan (mm2) (mm2) (mm2) e e 0 25.0000 25.0000 25.0000e d d bc 2 15.3333 14.3333 8.3333 c b a 4 10.3333 6.3333 4.0000 ab ab a 6 4.6667 4.3333 3.6667 Keterangan: huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0.05) H
Sel Radang Pengamatan sel radang dilakukan dengan menghitung jumlah dari 3 jenis sel radang, yaitu neutrofil, limfosit, dan makrofag pada 5 lapang pandang yang berbeda. Secara umum, hasil pengamatan menunjukkan adanya perubahan jumlah sel radang pada hari-hari tertentu.
0 ----------------- semakin kering ------------------ 4
Gambar 5 Interaksi antara tingkat kekeringan luka terhadap hari perlakuan.
0 ----------------- semakin banyak ------------------ 4
Gambar 6 Interaksi antara jumlah jaringan parut pada luka terhadap hari perlakuan. Sel Neutrofil. Neutrofil merupakan salah satu sel radang yang diamati. Peradangan pada luka akan mengundang datangnya neutrofil di daerah luka. Peningkatan jumlah neutrofil juga dapat disebabkan adanya respon neutrofil terhadap infiltrasi bakteri pada luka. Pengamatan di hari ke-2 setelah perlakuan menunjukkan adanya kenaikkan jumlah neutrofil. Kelompok khitosan menunjukkan adanya kenaikan jumlah sel neutrofil yang signifikan bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Perbedaan jumlah neutrofil kelompok khitosan pada hari ke-2 memang tidak dinyatakan berbeda nyata dengan kelompok Betadine®, namun dinyatakan berbeda nyata secara statistik bila dibandingkan kelompok kontrol negatif. Neutrofil dalam jumlah yang banyak dapat mempercepat penyembuhan luka karena dapat mengeliminasi benda-benda asing serta sisa-sisa jaringan yang terdapat pada luka lebih cepat sehingga proses regenerasi sel-sel baru menjadi lebih cepat terjadi. Diduga khitosan mempunyai kemampuan sebagai
imunomodulator dalam membantu penyembuhan luka. Kondisi pada kelompok khitosan ini pun dapat terjadi karena adanya pengaruh dari kemampuan khitosan sebagai antibakteri. (Hapsariyani et al. 2008). Aktivitas antibakteri pada khitosan ini dapat menurunkan jumlah mikroba pada luka sehingga dapat mengurangi terjadinya peradangan yang diakibatkan oleh bakteri dan pada akhirnya dapat mempercepat penyembuhan luka. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa jumlah neutrofil pada kelompok khitosan dan kelompok Betadine® sudah mengalami penurunan setelah hari ke-2, sedangkan kelompok kontrol negatif baru mengalami penurunan setelah hari ke-4. Penurunan jumlah sel neutrofil menandakan bahwa penyembuhan masuk ke tahap berikunya. Walaupun perbedaan jumlah neutrofil antara ketiga kelompok dinyatakan tidak berbeda nyata secara statistik (Tabel 2), kondisi ini menunjukkan bahwa khitosan mempunyai pengaruh baik pada penyembuhan luka karena mengalami penurunan lebih cepat. Sel radang yang bekerja di area peradangan bukan hanya neutrofil. Saat penyembuhan oleh neutrofil telah selesai, keberadaan neutrofil akan digantikan oleh makrofag yang kemudian merangsang proses inisiasi sel fibroblast. Tabel 2
Rataan jumlah neutrofil pemeriksaan mikroskopis
kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif, walau perbedaan jumlahnya tidak dinyatakan berbeda nyata secara statistik (Tabel 3). Pengaruh jumlah limfosit sama dengan pengaruh jumlah neutrofil di area peradangan. Semakin banyak limfosit dapat mempercepat penyembuhan luka. Jumlah limfosit mulai mengalami penurunan di kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif sebelum hari ke-4, sedangkan kelompok khitosan baru mengalami penurunan antara hari ke-4 dan ke-6. Jumlah limfosit kelompok khitosan pada hari ke-4 tidak berbeda nyata dengan kelompok Betadine®, namun dinyatakan berbeda nyata bila dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif. Jumlah limfosit yang menurun diduga karena kondisi luka yang mulai mengalami penyembuhan sehingga peradangan juga mulai berkurang. Pengamatan pada hari ke-6 menunjukkan adanya penurunan yang signifikan bila dibandingkan dengan hari sebelumnya, bahkan lebih rendah bila dibandingkan dengan kelompok lainnya. Perubahan ini menunjukkan bahwa keberadaan khitosan di area peradangan membuat kerja limfosit menjadi lebih efektif sehingga mempercepat penyembuhan luka. Tabel
3
Rataan jumlah limfosit pemeriksaan mikroskopis
pada
pada
Kontrol Kontrol + Khitosan (butir) (butir) (butir) a a a 0 0.0 0.0 0.0 a ab b 2 50.6 74.6 163.8 a a a 4 55.2 48.8 47.8 a a a 6 14.4 3.2 0.4 Keterangan: huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0.05) H
Sel Limfosit. Selain neutrofil, sel radang yang diamati adalah limfosit. Limfosit merupakan salah satu sel yang berperan dalam kekebalan tubuh. Limfosit biasanya terlihat pada jaringan sebagai sel yang kecil dengan inti yang jelas dan sitoplasma yang sangat sedikit (Tighe dan Davies 1984 diacu dalam Hapsari 2006). Pengamatan di hari ke-2 menunjukkan adanya kondisi kenaikkan jumlah limfosit yang sama dengan hasil perhitungan pada jumlah sel neutrofil. Kenaikan jumlah sel limfosit pada kelompok khitosan terlihat lebih signifikan bila dibandingkan dengan
Kontrol Kontrol + Khitosan (butir) (butir) (butir) 0 0.6a 0.6a 0.6a ab ab 2 16.2 14.6 25.0b a ab 4 5.6 8.8 26.6b a a a 6 3.8 3.8 1.6 Keterangan: huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0.05) H
Sel Makrofag. Makrofag adalah salah satu jenis sel fagosit utama yang memiliki daya hidup yang lebih panjang bila dibandingkan dengan neutrofil. Fagositosis oleh makrofag terhadap sel-sel yang mati merupakan salah satu cara membuang sisasisa sel yang rusak (Spector dan Spector 1989). Makrofag terdapat dalam dalam darah perifer. Akumulasi makrofag merupakan syarat pertama bagi reparasi jaringan pengikat (Spector dan Spector 1989). Pengamatan di hari ke-2 menunjukkan adanya kondisi kenaikkan jumlah makrofag signifikan pada kelompok khitosan bila dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Namun,
perbedaan jumlah makrofag pada kelompok khitosan belum dapat dinyatakan berbeda nyata secara statistik bila dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Jumlah makrofag mulai mengalami penurunan di ketiga kelompok pada setelah hari ke-4. Bila dilihat dari jumlahnya, makrofag kelompok khitosan pada hari ke-4 tidak berbeda nyata secara statistik dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Martini et al (1992) menyatakan bahwa adanya perlukaan jaringan merangsang sel makrofag mengeluarkan zat-zat kimia yang akan merangsang sel monosit dan fagosit lainnya untuk bermigrasi ke dalam jaringan yang rusak. Selain itu, makrofag pun dapat menarik sel fibroblast untuk bermigrasi ke dalam jaringan yang rusak untuk membentuk jaringan parut yang akan menutup luka. Pengamatan makrofag pada hari ke-6 memperlihatkan hasil yang juga tidak berbeda nyata antara kelompok khitosan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Namun, kelompok khitosan menunjukkan adanya penyembuhan yang lebih cepat dengan adanya penurunan jumlah makrofag yang signifikan bila dibandingkan pada hari sebelumnya dan ini tidak terjadi pada kelompok lainnya (Tabel 4). Kondisi ini menunjukkan bahwa penyembuhan luka berupa pembuangan sel-sel mati pada daerah luka yang dilakukan oleh makrofag lebih cepat selesai sehingga berujung pada pengurangan makrofag di daerah luka. Kondisi yang berbeda ditunjukkan pada kelompok kontrol negatif. Jumlah makrofag justru meningkat kembali pada hari ke-6. Diduga hal ini terjadi karena adanya infeksi sehingga makrofag kembali mengalami peningkatan. Tabel 4 Rataan jumlah makrofag pada pemeriksaan mikroskopis Kontrol Kontrol + Khitosan (butir) (butir) (butir) a a a 0 0.2 0.2 0.2 ab ab b 2 9.8 10.2 15.4 ab ab b 4 4.8 8.8 13.6 ab a a 6 5.2 1.6 0.4 Keterangan: huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0.05)
pembuluh darah baru akan membantu mempercepat proses regenerasi sel dan normalisasi jaringan (Mayasari 2003). Pembentukkan neokapiler adalah akibat aktivitas mitosis sel-sel endotel pembuluh darah yang sudah diikuti oleh migrasi ke daerah luka. Pembentukan neokapiler berfungsi untuk menyuplai vitamin, mineral, glukosa, dan asam amino ke fibroblast untuk memaksimalkan pembentukkan kolagen serta membebaskan jaringan dari nekrosis, benda asing, dan infeksi sehingga mempercepat penyembuhan luka (Pavletic 1992 diacu dalam Hapsari 2006). Hasil pengamatan pada hari ke-2 menunjukkan adanya neokapilerisasi walau jumlahnya masih sedikit. Kelompok khitosan menunjukkan proses neokapilerisasi yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif. Pengamatan hari ke-4 sampai ke-6 menunjukkan adanya peningkatan jumlah neokapilerisasi pada ketiga kelompok. Kelompok khitosan menunjukkan perkembangan terbaik bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Secara keseluruhan, proses neokapilerisasi terjadi lebih cepat pada kelompok khitosan bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya (Gambar 7). Pembentukan neokapilerisasi yang lebih cepat tentunya akan mempercepat penyembuhan luka karena dapat meningkatkan penyaluran suplai darah. Suplai darah diperlukan dalam metabolisme aktif sel sehingga mempercepat terjadinya regenerasi jaringan. Kapiler-kapiler pada jaringan parut muda sangat diperlukan karena proliferasi sel memerlukan banyak energi dan bahan yang berasal dari darah (Rukmono 1996).
H
Jumlah Neokapilerisasi Penyembuhan luka sangat ditunjang oleh suplai darah ke daerah luka. Pembentukkan
0 ----------------- semakin banyak ------------------ 4
Gambar
7
Interaksi antara kondisi neokapilerisasi pada luka terhadap hari perlakuan.
Persentase Re-epitelisasi Restorasi epitel permukaan pada kulit dicapai dengan meningkatkan aktivitas mitosis epitel di dekat tepi luka, terutama pada lapisan yang lebih dalam. Epitel merupakan salah satu komponen yang berperan dalam penyembuhan luka. Regenerasi lapisan epitel merupakan serangkaian peristiwa yang sangat terkoordinasi dan terstruktur (Spector dan Spector 1989). Lapisan epitel yang terbentuk sangat tipis dan rapuh, sehingga mudah kambuh lagi apabila ada tekanan atau jilatan hewan (Pavletic 1992 diacu dalam Hapsari 2006). Pengamatan pada hari ke-2 terhadap pembentukan epitel menunjukkan hasil bahwa pada kelompok khitosan mengalami proses reepitelisasi yang lebih cepat bila dibandingkan dengan kelompok kontrol negatif (Gambar 8). Pembentukan epitel pada hari ke-4 dan ke6 terjadi lebih cepat pada kelompok khitosan dan lebih lambat pada kelompok kontrol negatif. Terutama pada hari ke-6, kondisi jaringan epitel sudah hampir sempurna pada kelompok khitosan. Banyak faktor yang membantu dan mempercepat terjadinya proses re-epitelisasi. Beberapa diantaranya adalah jumlah sel-sel mati yang sedikit, tidak adanya penyebab infeksi, dan adanya suplai darah yang cukup. Kondisi ini ditunjukkan pada kelompok khitosan. Diduga faktor ini yang berperan penting kenapa kondisi luka pada kelompok khitosan lebih cepat membaik.
Fibroblast adalah sel mesenkim dasar jaringan dewasa yang sifat utamanya ialah mensintesis komponen-komponen jaringan pengikat, yaitu kolagen dan mukopolisakarida (Spector dan Spector 1989). Fibroblast-fibroblast ini kemudian membentuk kolagen hingga terjadi jaringan ikat yang menghubungkan dengan erat tepi-tepi luka. Jaringan ini dinamakan jaringan parut (Rukmono 1996). Pengamatan jaringan ikat dilakukan dengan mengamati jumlah fibroblast yang ada di sekitar daerah luka. Jumlah fibroblast dianggap setara dengan terbentuknya jaringan ikat pada daerah luka. Pengamatan pada hari ke-2 menunjukkan adanya sedikit fibroblast yang berperan dalam penyembuhan luka pada ketiga kelompok. Kelompok khitosan mengalami kenaikan jumlah fibroblast yang tinggi pada hari ke-4, sedangkan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif baru mengalami kenaikan yang signifikan pada hari ke-6. Namun begitu, pengamatan pada hari ke-6 menunjukkan bahwa jumlah fibroblast pada kelompok khitosan tidak berbeda nyata bila dibandingkan dengan kelompok Betadine® dan kelompok kontrol negatif (Tabel 5). Aktifitas dari pertumbuhan sel fibroblast yang tinggi akan membuat proses reepitelisasi pada daerah luka menjadi lebih cepat. Dengan kata lain, kondisi yang ditunjukkan pada kelompok khitosan menunjukkan bahwa penyembuhan luka berjalan lebih cepat bila dibandingkan kedua kelompok lainnya. Tabel 5 Rataan jumlah fibroblast pada pemeriksaan mikroskopis. Kontrol Kontrol + Khitosan (butir) (butir) (butir) 0 4.6a 4.6a 4.6a a a 2 5.0 8.6 10.0a a a 4 5.4 10.0 26.4ab ab ab 6 20.8 28.0 40.4b Keterangan: huruf yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (P>0.05) H
Gambar
8
Interaksi antara persentase re-epitelisasi pada luka terhadap hari perlakuan.
Pembentukan Jaringan Ikat Ciri khusus jaringan ikat yang mengalami rekonstruksi ialah aktivitas sel fibroblastnya.
Peranan Khitosan dalam Penyembuhan Luka Penyembuhan luka merupakan suatu proses kompleks yang melibatkan banyak sel dan jaringan. Proses ini terdiri atas beberapa tahap yang saling tumpang tindih dan saling berkaitan. Setiap sel yang terlibat dalam proses ini memiliki peranan yang berbeda-
beda. Penyembuhan luka diawali dengan fase peradangan. Sel-sel yang berperan dalam tahap ini adalah sel-sel leukosit seperti neutrofil, makrofag, dan limfosit. Ketiganya memiliki peranan masing-masing, bahkan memiliki waktu yang berlainan untuk menginfiltrasi daerah luka. Tentunya, semakin banyak sel leukosit (sel radang) yang muncul di daerah luka akan membuat penyembuhan luka menjadi lebih cepat. Banyak bahan kimia dalam jaringan yang dapat menyebabkan neutrofil dan makrofag bergerak menuju sumber bahan kimia tersebut. Fenomena ini, seperti yang tampak pada Gambar 9 dikenal sebagai kemotaksis (Guyton dan Hall 1997). Bila suatu jaringan mengalami radang, sedikitnya terbentuk produk-produk yang dapat menyebabkan kemotaksis ke arah area yang mengalami radang. Bahan-bahan ini adalah beberapa racun yang dikeluarkan oleh bakteri, produk degeneratif dari jaringan yang meradang itu sendiri, dan beberapa produk reaksi yang disebabkan oleh pembekuan plasma dalam area peradangan. Jumlah neutrofil yang menginfiltrasi daerah luka mengalami penurunan pada hari ke-4. Keberadaan sel neutrofil mulai digantikan oleh sel makrofag. Jumlah neutrofil berkurang karena daerah luka telah bebas dari infiltrasi mikroba sehingga dapat dilanjutkan dengan fase berikutnya yaitu fase proliferasi jaringan. Sifat antibakteri yang dimiliki khitosan diduga sebagai penyebab proses ini berlangsung lebih cepat bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Selain neutrofil dan makrofag, terdapat jenis sel radang lain pada daerah luka pada hari ke-2 yaitu limfosit. Sel limfosit-T merupakan sel limfosit dengan jumlah tertinggi yang berperan dalam perekrutan makrofag ke daerah luka dengan mengeluarkan limfokin berupa macrophage aggregating factor (MAF) dan macrophage chemotatic factor (MCF). MAF merangsang agregasi dari makrofag, sedangkan MCF berfungsi sebagai chemoattractant bagi makrofag (Banks 1993 diacu dalam Handayani 2006). Data yang dihasilkan menunjukkan adanya kolerasi sesuai antara limfosit dan makrofag. Tingginya jumlah limfosit pada kelompok khitosan pada hari ke2 diduga karena sifatnya yang memicu terjadinya kemotaksis seperti yang terjadi pada neutrofil. Makrofag mengalami emigrasi setelah neutrofil dan tiba di daerah luka setelah
neutrofil bekerja memfagosit partikel asing. Makrofag adalah sel radang yang berfungsi untuk mengeliminasi partikel asing dan jaringan mati. Jumlah makrofag di awal fase proliferasi akan meningkat karena keberadaanya yang diperlukan untuk mensekresi senyawa yang merangsang pertumbuhan jaringan lain seperti basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF), dan transforming growth factor- (TGF- ) yang menginisiasi proliferasi sel fibroblast untuk membentuk serabut kolagen di daerah luka (Vegad 1996). Kemampuan khitosan dalam membantu penyembuhan luka semakin terbukti dengan proses inisiasi sel fibroblast di area luka yang lebih cepat dan banyak bila dibandingkan kelompok lainnya. Dalam proses reparasi jaringan, keberadaan pembuluh darah memiliki peranan penting untuk memberikan asupan nutrisi bagi jaringan yang sedang beregenerasi. Untuk menunjang fungsi tersebut, pembuluh darah akan membentuk tunas-tunas pembuluh baru yang nantinya akan menjadi percabangan baru pada jaringan luka yang biasa disebut dengan neokapilerisasi. Proses neokapilerisasi dimulai dengan pembekuan darah. Lebih dari 50 macam zat yang mempengaruhi pembekuan darah, beberapa diantaranya mempermudah terjadinya pembekuan yang disebut prokoagulan, dan yang lain menghambat pembekuan, disebut antikoagulan. Pembekuan darah akan terjadi bergantung dengan keseimbangan antara kedua golongan zat tersebut (Guyton dan Hall 1997). Pembekuan darah itu sendiri terjadi dalam tiga langkah utama. Langkah pertama adalah terbentuknya rangkaian reaksi kimiawi yang kompleks yang melibatkan selusin faktor pembekuan darah sebagai respon terhadap rusaknya pembuluh darah untuk menghasilkan suatu senyawa yang disebut aktivator protombin. Langkah kedua adalah perubahan protombin menjadi trombin yang dikatalisis oleh aktivator protombin. Langkah ketiga adalah mengubah fibrinogen menjadi benang fibrin yang merangkai trombosit, sel darah, dan plasma untuk membentuk bekuan dengan trombin sebagai enzimnya (Guyton dan Hall 1997). Benang-benang fibrin ini yang akan menutup pembuluh darah yang rusak untuk kemudian membentuk tunas-tunas pembuluh baru. Khitosan memiliki beberapa sifat dan fungsi yang khas, diantaranya sebagai koagulan. Larutan khitosan pun akan menjadi
suatu membran yang akan menutup daerah luka selama penyembuhan berjalan. Diduga, khitosan ini bekerja sebagai katalis pembekuan darah atau sebagai pengganti peranan dari trombosit dalam pembekuan darah. Dugaan ini diperkuat dengan kondisi luka pada kelompok khitosan yang cenderung lebih halus karena sedikitnya jaringan parut yang terbentuk. Terbentuknya bekuan darah akan memicu proses berikutnya yaitu pembentukan jaringan ikat. Proses ini melibatkan fibroblast yang menginvasi daerah bekuan darah membentuk jaringan ikat (Guyton dan Hall 1997). Data pengamatan menunjukkan bahwa kelompok khitosan mengalami kenaikan jumlah sel fibroblast lebih cepat bila dibandingkan dengan kedua kelompok lainnya. Kondisi ini menunjukkan bahwa pembekuan darah pada kelompok khitosan berjalan lebih cepat. Suatu luka dapat dikatakan sembuh apabila daerah luka tersebut telah mengalami epitelisasi secara menyeluruh dan tidak lagi membutuhkan perawatan (Schimdt dan Greenspoon 1991 diacu dalam Handayani 2006). Hingga hari ke-6 setelah perlakuan, proses re-epitelisasi cenderung lebih cepat jika dibandingkan dengan kelompok lainnya. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa pemberian khitosan dapat memperbaiki proses re-epitelisasi jaringan luka lebih baik jika dibandingkan dengan kelompok lainnya.
mikroskopik pun khitosan dapat mempercepat infiltrasi sel radang seperti neutrofil, limfosit dan makrofag pada hari ke-2 serta meningkatkan pertumbuhan jaringan ikat pada setelah hari ke-4, sedangkan untuk neokapilerisasi dan re-epitelisasi khitosan juga ikut memberikan pengaruh sejak hari ke-2 setelah perlakuan dengan mempercepat prosesnya. Khitosan pun diduga memiliki kemampuan sebagai katalis dan membantu peranan trombosit dalam pembekuan darah. Perhitungan jumlah bakteri dan dan pengaruh asam laktat sebagai pelarut dalam penyembuhan dapat manambah data pelengkap dari penelitian ini. Lanjutan penelitian penggunaan khitosan dengan konsentrasi atau tingkat deasetilasi serta jenis pelarut yang berbeda dapat dilakukan untuk mengetahui efektifitas dari khitosan dalam penyembuhan luka.
DAFTAR PUSTAKA Abbas AK, Lichtman AH, Pubes JS. 1994. Cellular and Molecular Immunology. Philadelphia: WB Saunders. Bastaman, S. 1989. Studies on degradation and extraction of chitin and chitosan from prawn shell ( Nephrops norvegicus ) [Thesis]. The Department of Mechanical, Manufacturing, Aeronautical and Chemical Engineering, The Faculty of Engineering, The Queen s University of Belfast. Braunstein H. 1987. Outlines and Review of Pathology. 2nd Ed. Toronto: The Mosby. Departemen Kelautan dan Perikanan Republik Indonesia. 2006. Industri Kitin: Dari Limbah Menjadi Bernilai Tambah. [terhubung berkala]. http://teknologi-dkp. go.id. [23 Okt 2008].
Gambar 9 Pergerakan neutrofil dengan cara kemotaksis menuju daerah jaringan yang rusak (Guyton dan Hall 1997)
SIMPULAN DAN SARAN Larutan khitosan (dari limbah kepiting) 4% (b/v) dalam asam laktat 1% (v/v) secara nyata mampu membantu penyembuhan luka pada kulit mencit. Secara makroskopik khitosan dapat mempercepat pengeringan luka di hari ke-0, penyempitan luka pada hari ke-2, dan mempercepat pelepasan jaringan parut di hari ke-4 setelah perlakuan. Secara
Djamaludin AM, Habibie MS, Hartanti, Sari RF. 2008. Teknologi desalinisasi air laut dengan menggunakan campuran khitosan, zeolit, dan arang aktif [PKMT-DIKTI]. Bogor: IPB Pr. Guyton CA, Hall JE. 1997. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Setiawan I, Tengadi KA, Santoso A, penerjemah; Setiawan I, editor. Jakarta: ECG. Terjemahan dari: Textbook of Medical Physiology. Handayani I. 2006. Aktivitas sediaan gel dari ekstrak lidah buaya (Aloe barbadensis Miller) untuk proses persembuhan luka pada mencit (Mus musculus) [skripsi].
Hewan,
Thomson RG. 1978. General Veterinary Pathology. Philadelphia: WB Saunders.
Hapsari NM. 2006. Aktivitas ekstrak etanol kulit batang singkong (Manihot esculenta Crantz) dalam proses persembuhan luka pada mencit (Mus musculus albinus) [skripsi]. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Vegad JL. 1996. A Textbook of Veterinary General Pathology. 1st Ed. New Delhi: Vikas Publishing.
Bogor: Fakultas Kedokteran Institut Pertanian Bogor.
Hapsariyani et al. 2008. Potensi khitosan sebagai bahan antibakteri [PKMP-DIKTI]. Bogor: IPB Pr. Jones TJ, Hunt RD, King NW. 1996. Veterinary Pathology. 6th Ed. London: Williams and Wilkins. Martini F, et al. 1992. Fundamental of Anatomy Physiology. 2nd Ed. New Jersey: Prentice Hall. Masduki. 1996. Mempelajari efektivitas chitosan dari limbah udang untuk penjernihan air sungai [skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan, Institut Pertanian Bogor. Mattjik AA, Sumertajaya IM. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Jilid I. Bogor: IPB Pr. Meyer DJ, Cole EH, Rich LJ. 1992. Veterinary Laboratory Medicine Interpretation and Diagnosis. Philadelphia: WB Saunders. Nasyirudin. 2002. Penggunaan khitin dan khitosan dalam pengolahan bahan baku air minum [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Pakuan. Rukmono. 1996. Patologi. Kumpulan Kuliah Patologi. Jakarta: Bagian Patologi Anatomik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Putriyanda N. 2006. Kajian patologi aktifitas getah batang pohon pisang tanduk (Musa paradisiaca forma typica) dalam proses persembuhan luka kulit pada mencit (Mus musculus albinus) [skripsi]. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Russel AD. 1984. The Revival of Inflamation Microbes. New York: Academica Pr. Spector WG, Spector TD. 1989. An Introduction General Pathology. 3th Ed. London: Churchill Livingston.
Yusup M. 2003. Gambaran persembuhan luka jahitan kulit pasca laparotomi medianus pada kucing lokal (Felis dominica) dengan berbagai macam jahitan [skripsi]. Bogor: Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Alur penelitian 1.
Pembagian kelompok
2.
Pengamatan patologi anatomi
Lampiran 1 (Lanjutan) 3.
Pengamatan histopatologi
Lampiran 2 Gambaran kondisi luka pada kelompok kontrol negatif pada hari ke-0, 2, 4, dan 6 d
hari ke-0
hari ke-2
hari ke-4
hari ke-6
Lampiran 3 Gambaran kondisi luka pada kelompok kontrol positif (Betadine®) pada hari ke-0, 2, 4, dan 6
hari ke-0
hari ke-2
hari ke-4
hari ke-6
Lampiran 4 Gambaran kondisi luka pada kelompok khitosan pada hari ke-0, 2, 4, dan 6
hari ke-0
hari ke-2
hari ke-4
hari ke-6
Lampiran 5 ANOVA dan uji BNT data pengamatan patologi anatomi untuk ukuran luka (mm2) Hari ke-
Kontrol Negatif 25 25 25 25.0000 13 16 17 15.3333 10 11 10 10.3333 5 5 4 4.6667
Ulangan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan
0
2
4
6
Kontrol Positif 25 25 25 25.0000 16 13 14 14.3333 8 5 6 6.3333 5 4 4 4.3333
SK
db
JK
KT
Perlakuan
11
2452.306
222.9369
Obat Hari Obat*Hari Galat Total
2 3 6 24 35
78.72222 2303.194 70.38889 35.33333 2487.639
39.36111 767.7315 11.73148 1.472222
Khitosan 25 25 25 25.0000 6 8 11 8.3333 5 4 3 4.0000 4 4 3 3.6667
Fhitung 26.73585 521.478 7.968553
F
Simpulan
=0.05
0.951328 0.984853 0.999381
terima H1 terima H1 terima H1
K-O 25.0
CO 25.0
K+O 25.0
e
e
e
Faktor koreksi : 5353.3611 Galat Baku 2 nilai tengah untuk kombinasi 0.990697472 BNT kombinasi 2.011115868 C6 3.7 a
C4 4.0 a
keterangan: C : khitosan;
K-6 4.7 a b
K+6 5.0 a b
K+4 6.3
C2 8.3
K-4 10.3
b
b c
c
K + : kontrol positif;
K+2 14.3
K-2 15.3
d
d
K - : kontrol negatif
Lampiran 6 Data hasil pengamatan patologi anatomi dengan metode scorring untuk tingkat kekeringan luka Hari ke-
0
2
4
6
Ulangan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan
Kontrol Negatif 0 0 0 0.0000 3 2 2 2.3333 3 3 3 3.0000 4 3 3 3.3333
Kontrol Positif 0 0 0 0.0000 2 2 2 2.0000 3 3 2 2.6667 4 4 3 3.6667
Khitosan 2 2 1 1.6667 3 3 3 3.0000 3 3 4 3.3333 4 3 4 3.6667
keterangan:
0 (basah)
4 (kering)
Lampiran 7 Data hasil pengamatan patologi anatomi dengan metode scorring untuk jumlah jaringan parut yang terbentuk Hari ke-
Ulangan
0
2
4
6
1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan 1 2 3 Rataan
Kontrol Negatif 0 0 0 0.0000 2 1 1 1.3333 3 3 3 3.0000 4 3 3 3.3333
Kontrol Positif 0 0 0 0.0000 1 2 2 1.6667 3 3 2 2.6667 3 2 2 2.3333
Khitosan 0 0 0 0.0000 2 3 3 2.6667 3 3 3 3.0000 2 3 1 2.0000
keterangan:
0 (tidak ada)
4 (banyak)
Lampiran 8 Gambaran histopatologi daerah luka pada kelompok Betadine®, kelompok kontrol negatif dan kelompok khitosan a.
Hari ke-0 Perbesaran: 4x10
b.
c.
d.
e.
10x10
40x10
Hari ke-2 kelompok Betadine® Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-2 kelompok kontrol negatif Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-2 kelompok khitosan Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-4 kelompok Betadine® Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Lampiran 8 (Lanjutan) f.
g.
h.
i.
j.
Hari ke-4 kelompok kontrol negatif Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-4 kelompok khitosan Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-6 kelompok Betadine® Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-6 kelompok kontrol negatif Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Hari ke-6 kelompok khitosan Perbesaran: 4x10
10x10
40x10
Lampiran 9 Gambaran sel radang (neutrofil, llimfosit, dan makrofag) serta sel fibroblast dalam pengamatan histopatologi (hari ke-2 kelompok khitosan) pada perbesaran 40x10
Makrofag
Limfosit
Fibroblast
Neutrofil
Lampiran 10 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah neutrofil dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10 Hari ke-
0
2
4
6
Ulangan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan
Kontrol Negatif 0 0 0 0 0 0 59 45 41 48 60 50.6 71 30 61 47 67 55.2 16 21 15 9 11 14.4
Kontrol Positif 0 0 0 0 0 0 120 68 49 57 79 74.6 45 49 48 50 52 48.8 4 5 2 2 3 3.2
KT
Fhitung
F
Khitosan 0 0 0 0 0 0 168 150 187 187 127 163.8 54 52 47 46 40 47.8 0 0 1 1 0 0.4
SK
db
JK
Perlakuan
11
211213.2
19201.2
Obat
2
10945.39
5472.694
1.937637
0.951328
terima H1
Hari Obat*Hari Galat Total
3 6 48 59
150733 49534.83 -135572 75641.22
50244.33 8255.806 2824.417
17.78928 2.923013
0.984853 0.999381
terima H1 terima H1
=0.05
Simpulan
Faktor Koreksi : 146178.8 Galat Baku 2 nilai tengah untuk kombinasi 43.39291 BNT kombinasi 88.0876 K-0 0 a
K+0 0 a
keterangan:
C0 0 a
C6 0.4 a
K+6 3.2 a
K-6 14.4 a
C4 47.8 a
K+4 48.8 a
K-2 50.6 a
K-4 55.2 a
K+2 74.6 a b
C2 163.8 b
C : khitosan; K + : kontrol positif; K - : kontrol negatif Lampiran 11 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah limfosit dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10 Hari ke-
0
2
4
6
Ulangan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan
Kontrol Negatif 3 0 0 0 0 0.6 22 16 14 17 12 16.2 5 4 5 8 6 5.6 5 3 4 4 3 3.8
Kontrol Positif 3 0 0 0 0 0.6 15 12 20 14 12 14.6 8 7 9 8 12 8.8 6 5 3 2 3 3.8
SK
db
JK
KT
Fhitung
Perlakuan
11
8175.639
743.2399
Obat Hari Obat*Hari Galat
2 3 6 48
1000.222 5492.528 1682.889 -5930.67
500.1111 1830.843 280.4815 123.5556
Total
59
2244.972
4.047662 14.81797 2.270084
F
Khitosan 3 0 0 0 0 0.6 22 25 17 21 40 25 33 20 27 25 28 26.6 2 3 2 1 0 1.6 =0.05
0.951328 0.984853 0.999381
Simpulan terima H1 terima H1 terima H1
Faktor Koreksi : 8070.028 Galat Baku 2 nilai tengah untuk kombinasi 9.075812 BNT kombinasi 18.4239 K-0 0.6 a
K+0 0.6 a
keterangan: C : khitosan;
C0 0.6 a
C6 1.6 a
K-6 3.8 a
K+6 3.8 a
K + : kontrol positif;
K-4 5.6 a
K+4 8.8 a b
K+2 14.6 a b
K - : kontrol negatif
K-2 16.2 a b
C2 25
C4 26.6
b
b
Lampiran 12 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah makrofag dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10 Hari ke-
0
2
4
6
Ulangan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan
Kontrol Negatif 0 0 1 0 0 0.2 15 12 5 6 11 9.8 7 7 2 2 6 4.8 6 4 7 5 4 5.2
Kontrol Positif 0 0 1 0 0 0.2 12 11 9 9 10 10.2 8 12 7 6 11 8.8 1 5 0 0 2 1.6
SK
db
JK
KT
Fhitung
Perlakuan
11
2829.556
257.2323
Obat Hari Obat*Hari Galat
2 3 6 48
118.2222 2239.333 472 -2275.33
59.11111 746.4444 78.66667 47.40278
Total
59
554.2222
1.246997 15.74685 1.659537
F
Khitosan 0 0 1 0 0 0.2 14 17 17 16 13 15.4 18 9 16 10 15 13.6 1 0 1 0 0 0.4 =0.05
0.951328 0.984853 0.999381
Simpulan terima H1 terima H1 terima H1
Faktor Koreksi : 3441.778 Galat Baku 2 nilai tengah untuk kombinasi 5.621552 BNT kombinasi 11.41175 K-0 0.2 a
K+0 0.2 A
keterangan:
C0 0.2 a
C6 0.4 a
K+6 1.6 a
K-4 4.8 a b
K-6 5.2 a b
K+4 8.8 a b
K-2 9.8 a b
K+2 10.2 a b
C4 13.6
C2 15.4
b
b
C : khitosan; K + : kontrol positif; K - : kontrol negatif Lampiran 13 Data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah neokapilerisasi dengan metode scorring menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 40x10 Hari ke0 2 4 6
Kontrol Negatif 0 0 1 2
Kontrol Positif 0 1 2 3
Khitosan 0 1 2 4
keterangan:
0 (tidak ada)
4 (banyak)
Lampiran 14 Data hasil pengamatan histopatologi terhadap persentase re-epitelisasi menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 10x10 Hari ke-
Kontrol Negatif
Kontrol Positif
Khitosan
0
0
0
0
2 4 6
10 25 50
20 45 70
35 65 95
Lampiran 15 ANOVA dan uji BNT data hasil pengamatan histopatologi terhadap jumlah fibroblast dengan mikroskop cahaya pada perbesaran 100x10 Hari ke-
0
2
4
6
Ulangan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan 1 2 3 4 5 Rataan
Kontrol Negatif 4 6 4 5 4 4.6 7 5 4 5 4 5 5 6 5 4 7 5.4 26 21 15 18 24 20.8
Kontrol Positif 4 6 4 5 4 4.6 8 9 11 8 7 8.6 11 14 10 7 8 10 15 23 43 28 31 28
SK
db
JK
KT
Perlakuan
11
13117.89
1192.535
Obat Hari Obat*Hari
2 3 6
2242.056 9337.889 1537.944
1121.028 3112.63 256.3241
Galat Total
48 59
-12191.3 926.5556
253.9861
Khitosan 4 6 4 5 4 4.6 4 8 11 15 12 10 28 21 39 20 24 26.4 43 45 39 35 40 40.4
Fhitung
F 0.05
Simpulan
4.413737 12.25512 1.009205
0.951328 0.984853 0.999381
terima H1 terima H1 terima H1
Faktor koreksi : 19693.44 Galat Baku 2 nilai tengah untuk kombinasi 13.01246 BNT kombinasi 26.41529 K-0 4.6 a
K+0 4.6 a
keterangan:
C0 4.6 a
K-2 5 a
K-4 5.4 a
K+2 8.6 a
K+4 10 a
C2 10 a
K-6 20.8 a b
C4 26.4 a b
K+6 28 a b
C6 40.4 b
C : khitosan;
K + : kontrol positif;
K - : kontrol negatif
