Pécsi Tudományegyetem Kémia Doktori Iskola
Mannich-ketonok antifungális hatásának vizsgálata és antimikotikum-érzékenység meghatározása chip-alapú módszerekkel Phd értekezés
Bouquet Orsolya
Témavezetők: Dr. Lóránd Tamás, Dr. Kocsis Béla egyetemi docensek
PÉCS, 2014
KIVONAT Munkám során Candida törzsek analitikai, elválasztás-technikai módszerekkel való vizsgálata volt a célom. Két fő vizsgálati irányt céloztam meg mikrofluidikai áramlási citometriás rendszer és chip-alapú kapilláris gélelektroforézis technika használatával. Az áramlási citometriát régóta használják Candida sejtek vizsgálatára, antimikotikumérzékenység meghatározására, chip-alapú rendszer ilyen célú felhasználását eddig nem írták le. Irodalmi adatok alapján áramlási citometriás vizsgálatokban élő/elölt sejtek elkülönítésére alapozva antimikotikum-érzékenység meghatározását végeztem el. A módszert két terápiában használt antifungális szerre (amphotericin B, fluonazol), valamint Candida albicans mellett különböző non-albicans törzsekre is teszteltem. Ezen kísérleteim során nyert adatok alapján, elsőként dolgoztam ki Candida sejtek antimikotikum-érzékenységének mikrofluidikai módszerrel történő meghatározását. A mikrofludikai áramlási citometria egy egyszerű, gyors, automatizálható alternatívát kínál a hagyományos készülékek mellett. Ezzel a technikával megvalósítottam különböző antimikotikumok különböző törzsekkel szembeni minimális gátló koncentráció (MIC) értékeinek meghatározását. Ezt követően egy bizonyítottan citotoxikus és antimikrobiális hatással rendelkező vegyületcsalád, a Mannich-ketonok Candida albicans-ra gyakorolt hatásának vizsgálatára tértem rá. Először azt vizsgáltam, hogy a fent leírt mikrofluidikai rendszer alkalmas-e egyes telítetlen Mannich ketonok MIC értékének meghatározására. Ezeknél a vizsgálatoknál továbbfejlesztettem
a
vizsgálati
rendszert,
több
fluoreszcens
jelölőt
használtam
párhuzamosan. A MIC értékek meghatározása ebben az esetben is sikerült, habár a két festékes módszer előnyei mellett sem váltotta be előzetes várakozásaimat. A Mannich-ketonok gombaellenes hatása valószínűleg több összetevő eredménye, a tiol-depléciós képesség mellett a gombák fehérje-összetételét is befolyásolhatják. A kondenzált vázas Mannich-ketonok egy csoportjának (15 vegyület) vizsgálatával a Candidák fehérje-összetételére gyakorolt hatását elemeztem, a vegyületek ezen csoportját részletesen, ilyen céllal még nem vizsgálták. A mérésekhez egy mikrochip-alapú kapilláris gélelektroforézis rendszert használtam. Bár általános szerkezet-hatás összefüggéseket nem vonhattam le eredményeim alapján, de megvalósítottam a Mannich-ketonokkal kezelt Candida minták fehérjekivonatainak vizsgálatát, ahol néhány Mannich-ketonnal történt kezelésnél változást tapasztaltam a fehérjeprofilban.
1
TARTALOMJEGYZÉK 1. Rövidítések jegyzéke…………………………………………………………………. 4 2. Bevezetés……………………………………………………………………………... 5 3. Irodalmi összefoglaló………………………………………………………………… 6 3.1. Candida gombák és az antifungális terápia, antimikotikumok áttekintése, diagnosztikai módszerek 3.1.1. A Candidákról általában……………………………………………………… 6 3.1.2. Az antifungális terápia általános megfontolásai, diagnosztikai módszerek….. 8 3.1.3. Antifungális szerek…………………………………………………………… 9 3.1.3.1. Amphotericin B………………………………………………………... 11 3.1.3.2. Azolok…………………………………………………………………. 12 3.1.3.3. Echinocandinok………………………………………………………... 16 3.1.3.4. Kitinszintézist gátló szerek…………………………………………..... 18 3.1.3.5. Sordarinok……………………………………………………………... 19 3.1.3.6. Egyéb antifungális hatású vegyületek…………………………………. 20 3.2. Mannich-reakció és Mannich-vegyületek………………………………………. 22 3.2.1. A Mannich-reakció jelentősége…………………………………………..… 22 3.2.2. Mannich-bázisok szintézise, enantioszelektív szintézis…………………….. 23 3.2.3. Mannich-reakció felhasználása bioaktív vegyületek szintézisében………… 26 3.2.3.1. α-metilén ketonok szintézise Mannich-bázis intermediereken keresztül………………………………………………………………. 26 3.2.3.2. Mannich-reakció használata gyógyszervegyületek előállításában….... 26 3.2.3.3. Mannich-reakció természetes vegyületek szintézisében……………… 29 3.2.4. Mannich-bázisok biológiai hatásai…………………………...……………. 30 3.3. Módszerek……………………………………………………………………… 34 3.3.1. Áramlási citometria………………………………………………………..... 34 3.3.2. Chip-alapú áramlási citometria………………………………………….…… 36 3.3.3. Chip-alapú kapilláris gélelektroforézis………………………………………. 38 4. Célkitűzések………………………………………………………………………… 40
2
5. Kísérleti rész………..……………………………………………………………..... 41 5.1. Candida törzsek és tenyésztési körülmények………………………….………. 41 5.2. Fluoreszcens festékek …………………………………………………………. 41 5.3. Antimikotikumok…..………………………………………………………….. 42 5.4. Áramlási citometria és mikrofluidikai áramlási citometria (sejt-chip)………... 45 5.4.1. Candida minták előkészítése áramlási citometriás és sejt-chip vizsgálatokhoz ……………………………………………………………. 45 5.4.2. Áramlási citometria ……………………………………………………….. 45 5.4.3. Sejt-chip – chip-alapú citometriás módszer………………………………... 46 5.5. Fehérjeösszetétel vizsgálatok…………………………………………………... 47 5.5.1. Mintaelőkészítés…………………………………………………………….. 47
6.
5.5.2. Chip-alapú elektroforézis…………………………………………………
49
Eredmények………………………………………………………………………...
51
6.1. Áramlási citometria és sejt-chip……………………………………………….. 51 6.1.1. Candida sejtek detektálása, élő és elölt sejtek megkülönböztetése………..
51
6.1.2. Candida törzsek megkülönböztetése………………………………………. 55 6.1.3. Antimikotikum-érzékenység vizsgálatok…………………………………… 57 6.1.3.1.
Klasszikus antifungális szerek………………………………………. 57
6.1.3.2.
Mannich-ketonok…………………………………………………… 65
6.2. Mannich-ketonok hatásának vizsgálata Candida albicans fehérjeprofiljára….. 67 7. Eredmények megvitatása…………………………………………………………..
70
7.1. Áramlási citometriás és sejt-chipes életképesség-vizsgálatok………………..
70
7.2. Áramlási citometriás és sejt-chipes antimikotikum-érzékenység meghatározás……………………………………………………………..........
70
7.2.1. Egy fluoreszcens festékes vizsgálatok…………………………………….
70
7.2.2. Két fluoreszcens festékes vizsgálatok……………………………………..
72
7.3
Fehérje-vizsgálatok……………………………………………………………
73
8. Összefoglalás………………………………………………………………………. 74 9. Irodalomjegyzék…………………………………………………………….……..
75
10. Köszönetnyilvánítás………………………………………………………………
88
3
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ADME = adsorption (felszívódás)-distribuiton (megoszlás)-metabolism (metabolizmus)excretion (kiválasztás) ATCC = American Type Culture Collection CFU = colony forming unit (telep képző egység) CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute COST = color-space-time (adatgyűjtési mód) CYP = citokróm P (enzimcsalád) CZE = kapilláris zóna elektroforézis DTT = ditiotreit EDTA = etilén-diamin-tetraecetsav EOF = electroosmotic flow (elektroozmotikus áramlás) EUCAST = European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing FSC = forward light scatter (előre irányuló fényszórás) GDP = guanozin-difoszfát LED = light-emitting diode MALDI = matrix-assisted laser desorption/ionization MIC = minimum inhibitory concentration (minimális gátló koncentráció) MOPS = 3-[N-morfolin]-propánszulfonsav MS = tömegspektrométer NCCLS = National Committee for Clinical Laboratory Standards PAS = perjódsav-Schiff (reakció) PCR = polymerase chain reaction (polimeráz láncreakció) PI = propidium-jodid PMSF = fenil-metil-szulfonil-fluorid QSAR = quantitative structure–activity relationship (kvantitaív szerkezet-hatás összefüggés) rpm = rotation per minute RPMI = Roswell Park Memorial Institute SDS = nátrium-dodecil-szulfát SSC = side light scatter (oldal irányú fényszórás) TAMA = N-metilanilin-trifluoracetát 4
2. BEVEZETÉS Az életet veszélyeztető, invazív gombás fertőzések számának növekedése világszerte probléma. A leggyakoribb kórokozó továbbra is a Candida albicans, de egyre több a nonalbicans Candida fertőzés, valamint növekszik az Aspergillus sp. okozta megbetegedések száma is. A rendelkezésre álló antifungális szerek között évtizedek óta használt, klasszikus szerek mellett a legutóbbi évtizedben bevezetésre került hatóanyagcsalád is található. Mégis a fertőzések növekvő száma, a rezisztencia terjedése, a kedvezőbb farmakokinetikai és mellékhatás-profil kialakítása miatt a gomba-ellenes szerek kutatása továbbra is aktuális terület. Ugyanezen okok miatt a hagyományos kimutatási módszerekhez képest gyorsabb, kisebb idő – és munkaigényű diagnosztikai és anitmikotikum-érzékenységi vizsgálatok fejlesztése is időszerű kérdés. Az áramlási citometriát már régebb óta használják mikrobiológiai vizsgálatokra, baktériumok, gombák, antimikrobiális szerekkel szembeni érzékenység vizsgálatára, de ilyen jellegű chip vizsgálatokra kevesebb adat állt rendelkezésre. Napjainkban egyre jellemzőbb a lab-on-a-chip rendszerek terjedése. Ezeknél a rendszereknél chip-alapon, mikroméretben, kis mintaigénnyel, gyorsan valósíthatók meg különböző analitikai feladatok. Munkám során Candida sp. antimikotikum-érzékenységének vizsgálatát valósítottam meg hagyományos és mikrofluidikai áramlási rendszerben. A klasszikus antimikotikumok mellett potenciális citotoxikus, antibakteriális és antifungális hatással rendelkező Mannichvegyületek Candida-ellenes hatását vizsgáltam chip-alapú áramlási citometriás és chip-alapú kapilláris gélelektroforézis módszerek felhasználásával. Az eredményeimet a munkához tartozó, általános irodalmi háttér rövid ismertetését követően mutatom be.
5
3.
IRODALMI ÖSSZEFOGLALÓ
3.1. Candida gombák és az antifungális terápia, antimikotikumok áttekintése, diagnosztikai módszerek
3.1.1.
A Candidákról általában
A Candida fajok a mikroszkopikus gombák közé tartozó, eukarióta sejtfelépítésű élőlények. Sarjadzó gombák, azaz egysejtűek, a gombasejtek mérete 3-6 µm, gömb vagy ovális alakúak. A Candida sejtek is képesek un. pszeudohifákat képezni, itt az utódsejtek nem válnak szét teljesen, hanem kolbászfüzér-szerű láncokat alkotva együtt maradnak [Ádám É. 2001]. A pszeudohifa képzés a biofilmekben való megtelepedés és a patogenitás szempontjából fontos, a környezeti tényezők, például az oxigén-ellátottság is befolyásolják [Watanabe T. 2006]. A gombasejtek vázlatos felépítése: sejtfal, sejtmembrán, sejtmag, mitokondriumok, Golgi-szerű részecskék. Az 1. ábrán mutatom be, kiemelve a gombák legjellegzetesebb sejtalkotójának, a sejtfalnak szerkezetét. A sejtfalat főképp β-1,3-glukán- és β-1,6-glukánmolekulák, valamint N-acetil-glükózamint tartalmazó hexóz-polimer, azaz kitin, alkotják. Az ezek alkotta szilárdabb hálózathoz kapcsolódik egy fehérjékkel asszociált mannózpolimer, a gliko(manno)-proteinek rétege. Emellett egyéb fehérjék és kisebb mennyiségben lipidek alkotják a sejtfalat. A sejtfal glikoproteinjeinek nagy része a β-1,6-glukán molekulákhoz kapcsolódik a gliko-foszfatidil-inozitol részen keresztül, a fehérjék másik része direkt módon kötődik a β-1,3-glukán molekulákhoz [Chaffin 2008.]. A mannoprotein-réteg jelentős szerepet játszik a sejt adhéziójában, a vas megkötésében, a biofilm-képződésben, a gazdaszervezet immunrendszerével való küzdelemben [Heilmann és mtsai. 2012]. Fontos látnunk, hogy a sejtfal proteomja egy dinamikusan változó rendszer, aminek összetételét nagyban befolyásolják a környezeti hatások. A Candidák sejtmembránja koleszterin helyett ergoszterint tartalmaz, ezért több gombaellenes szer támadáspontja az ergoszterin-bioszintézis és maga az ergoszterin.
6
1. ábra – A Candida sejtfal vázlatos felépítése [1] A Candida genusba közel 100 faj tartozik, ezek közül a legjelentősebb humán kórokozó a Candida albicans. A C. albicans mellett egyre gyakoribbak az un. non-albicans törzsek okozta fertőzések, ezek közül a legfontosabbak a Candida krusei, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis [Dóczi és mtsai. 2012, Sandven és mtsai. 2006, Tragiannidis és mtsai. 2012]. A Candida albicans a normál flóra tagja, a légutak, a gastrointesztinális traktus és a női nemi szervek nyálkahártyáján fordul elő. A Candidák opportunista kórokozók, azaz egészséges egyéneknél csak enyhébb lefolyású megbetegedéseket okoznak, általában akkor, ha valamilyen átmeneti, lokális tényező hatására felborul az egyensúly a C. albicans és a normál flóra többi tagja közt. A leggyakoribb ilyen megbetegedések a soor („szájpenész”), az interdigitális candidiasis (kéz- és lábujjközök megbetegedése), az intertriginális candidiasis (a hajlatok érintettek), a paronychia (fájdalmas körömfertőzés) és a vulvovaginitisszel járó fluor. Ezen kórképek prognózisa elég jó, bár gyakran hosszadalmas, ismétlődő kezelést igényelnek. Legyengült immunrendszerű betegeknél a Candidák gyakran súlyos – életveszélyes, szisztémás fertőzések okozói, mint a generalizált orális candidiasis, oesophagitis, nephritis, pneumonia, endocarditis és a Candida – szepszis [Gergely L. 2003]. Mivel a különböző okok miatt, pl. HIV-fertőzés, daganat-ellenes terápia, szervtranszplantációk, immunszupresszált állapotban levő betegek száma világszerte növekszik, ezen betegségek diagnosztikája és kezelése egyre jelentősebb.
7
3.1.2.
Az antifungális terápia általános megfontolásai, diagnosztikai módszerek
A fertőzést okozó gombák gyors, pontos diagnosztikája és gombaellenes szerekkel szembeni érzékenységének meghatározása a fentebb vázolt okok miatt fontos feladat. A diagnosztika első lépése a direkt mikroszkópos vizsgálat. A gombák többsége a baktérium-kimutatáshoz használt Gram-festéssel is festődik, így történik a Candida fajok direkt mikroszkópos vizsgálata különböző vizsgálati anyagokból. A mintákban 3-4 µm méretű sarjadzó gombasejtek láthatók szeptált hifákkal (5-20 µm), vagy nélkülük, végükön esetleg chlamydospórákkal. A C. albicansra igen jellemző még a csíratömlőképzés, azaz néhány órás, szérumtartalmú táptalajon történő tenyésztés után a gombasejtek mikroszkópban jól látható jellegzetes nyúlványokat képeznek. Gombakimutatásra használhatók más festési eljárások is, mint calcofluor-, PAS- és meténamin-ezüst-festés (szövettani metszetekben). A gombák tenyésztésére sokféle táptalajt dolgoztak ki, legelterjedtebb a Sabouraud-féle glükózagar, amely szénforrásként 5% glükózt, nitrogénforrásként peptont tartalmaz és enyhén savas kémhatású (pH=5,6), vagy az RPMI 1640 tápfolyadék. Candida speciesek elkülönítésére szolgál az ún. chrom-agaron történő tenyésztés. Ennek lényege, hogy különböző Candida fajok szelektív (baktériumokat kizáró) táptalajon tenyésztve a kromogén szubsztrátokat különböző színnel inkorporálják. A tenyésztés mellett biokémiai reakciókat is használnak a gombák identifikálására, ilyen például a szénhidrát –asszimiláció vagy a szénhidrát-fermentáció vizsgálata. A Candida-bőrpróba gyakorlatilag minden egészséges felnőttnél pozitív, negatív eredmény inkább az immunválasz elégtelenségét jelzi. A szerológiai vizsgálatok jelentősek, főleg, ha a tenyésztés negatív (fennálló klinikai tünetek ellenére), illetve candidiasisok esetén, de kiértékelésük nehezebb, mint a baktérium- vagy vírusdiagnosztikában. A PCR alapú gyorsdiagnosztikai eljárások is egyre elterjedtebbek, ezek időigénye a klasszikus módszerekéinél jóval rövidebbek [Avni és mtsai. 2011]. A gombák identifikálása mellett a másik fontos feladat az antifungális szerekkel szemben tanúsított rezisztencia/érzékenység megállapítása. Ez azért is jelentős, mert az antifungális szerek egyre gyakoribb használata miatt növekszik a rezisztens törzsek előfordulása. A rezisztencia főbb mechanizmusai: az antifungális szer csökkent felvétele a sejtbe, illetve fokozott kiürülése efflux-pumpákon keresztül; a célmolekula módosulása vagy a célenzim mennyiségének növekedése [Loeffler és Stevens, 2003]. Az antimikotikum-érzékenységi vizsgálatok eredményét a vizsgálati körülmények nagyban befolyásolják, így a módszerek standardizálására több ajánlás is létezik, legelterjedtebbek a 8
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, korábban NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards) szabványok. Az európai standardizálási törekvéseket az European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ajánlások jelzik, a két rendszer átfedést mutat, de például a CLSI rendszer határértékei, azaz azon koncentrációk, amik nem csak a laboratóriumi tesztben, de a terápiában is hatékonyak, nem használhatók az EUCAST méréseknél [Espinell-Ingroff és mtsai. 2005]. Az antimikotikum-érzékenységet vizsgáló módszerek közé tartozik a hagyományos csőhígítási-sor [M27-A3 CLSI, 2008], vagy másnéven makrodilúciós eljárás, illetve ennek plateken kivitelezett mikrodiluciós változata. Az előző esetben az antimikotikumból a megfelelő médium 1 – 1 ml-ével, a mikrodilució esetében 100 – 100 µl-ével hígítási sort készítünk. Beoltás után a minimális gátló koncentráció (MIC) meghatározása vizuálisan történik, eredmény minimum 24, jellemzően 48 óra múlva jelenthető ki. A rutin labordiagnosztikában a fenti módszernél egyszerűbben alkalmazhatók az agar-diffúziós tesztek, mint a korong-diffúziós módszer vagy az E-teszt, illetve használják még a VITEK® félautomata rendszereket [Arendrup 2013]. Ezek
mellett
számos alternatív,
gyorsdiagnosztikai
módszert
is fejlesztettek
érzékenység-vizsgálatokra. Ilyen például a MIC meghatározása fluoreszcens próbákkal [Peter és mtsai. 2005] vagy az a kolorimetriás próba, ahol az antimikotikumok fonalas- és élesztőgombákra gyakorolt, sejtek lízisét okozó hatását határozták meg [Jewell és mtsai. 2002]. Az áramlási citometriát specifikus fluoreszcens jelölők használatával szintén alkalmasnak találták antimikotikum-érzékenység vizsgálatára [Ramani és mtsai. 1997]. Az antifungális terápia megválasztásában fontos az időfaktor, gyakran a pontos diagnosztikai és érzékenység-vizsgálat eredménye előtt szükséges az empirikus terápia megkezdése. A nem-szisztémás, dermatológiai kórképek esetén is általában empirikus módon,
valamilyen
azol-származékkal
mielőbb
megkezdik
a
terápiát.
Az
anitmikotikumokat többnyire monoterápiában alkalmazzák, a különböző antifungális hatóanyagok kombinált használata még nem kiforrott terület [Johnson és Perfect 2010]. A következőkben a fontosabb antifungális gyógyszervegyületeket részletesebben tárgyaljuk.
3.1.3.
Antifungális szerek
Az antifungális szereket több szempont alapján is csoportosíthatjuk. Először beszélhetünk természetes antifungális hatású és szintetikusan előállított vegyületekről. Előbbiek közé például a griseofulvin, a polién makrolidok, illetve részben az 9
echinocandinok, míg az utóbbi csoportba az allilaminok, azolok, a flucitozin és a fenilmorfolin-vázas vegyületek tartoznak. Hatás szempontjából beszélhetünk fungicid, azaz gombaölő, illetve fungisztatikus, azaz a
gomba
szaporodását
gátló
szerekről,
bár
ez
a
tulajdonság
igen
gyakran
koncentrációfüggő. Kémiai szerkezet alapján is feloszthatjuk az antifungális szereket, mint: - polién makrolidok (amphotericin B, nystatin) - azolok: ezen belül is di – és triazolok - echinocandinok - egyéb: sordarinok, nikkomycinek, allilaminok (pl.:terbinafin), stb. Leggyakrabban azonban hatásmechanizmus alapján csoportosítják az antifungális szereket (ld. 2. ábra). Így beszélhetünk: - a sejtfal-dezintegráló szerekről, mint az amphotericin B - a gomba szterin-szintézisét gátló szerekről, mint az azolok, allilaminok - a sejtfal-szintézis egyéb gátlóiról, mint az echinocandinok (glukán-szintáz gátlása) vagy a nikkomycinek (kitin-szintáz gátlása) - fehérje és/vagy nukleinsav szintézis gátló szerekről, pl. sordarinok, flucytosin
2. ábra – Leggyakoribb antimikotikumok hatásmechanizmusának vázlata [2] 10
A klinikai gyakorlatban régóta használt, illetve az újabb típusú antifungális szerek közül néhányról részletesebben is érdemes beszélnünk.
3.1.3.1. Amphotericin B Az amphotericin B (3. ábra) a Streptomyces nodosus által termelt heptaén makrolid antibiotikum. Amfoter, amfipatikus bot-alakú molekula, amely hidrofób és hidrofil oldallal is rendelkezik. Fungicid, alacsony koncentrációnál fungisztatikus hatású. Vízben oldhatatlan, 37 oC-on labilis, 4 oC-on hetekig stabil. A gastrointestinalis traktusból alig szívódik fel, orálisan adva csak a béllumenben levő gombákra hat. Szisztémás fertőzések esetén intravénásan adagolandó, farmakokinetikája azonban kérdéses, a szérumszint nem emelkedik párhuzamosan a dózissal. Plazmafehérjékhez erősen (>90%) kötődik, a szövetekben felhalmozódik, kis mennyisége bejut a liquorba, átjut a placentán. Eliminációjában a biliáris excretio jelentős, a vizeletben kis koncentrációban sokáig kimutatható.
3. ábra – Az amphotericin B szerkezeti képlete Az amphotericin B a membrán ergoszterin komponenséhez kötődik, pórusokat képez, így metabolikus zavarokat, K+ és más ionok, kis molekulák elvesztését okozza, ezeken keresztül pedig a sejt pusztulását eredményezi. Egyes vizsgálatok szerint antifungális hatásában más folyamatok is, mint például az oxidatív stressz indukálása, jelentős szerepet játszanak. Az amphotericin B erős immunmoduláló hatását kimutatták a gazdaszervezet sejtjein is, ennek szerepe azonban egyelőre nem tisztázott [Mesa-Arango és mtsai. 2012]. Emellett az amphotericin B kisebb mértékben az emlős sejtek koleszterinjéhez is kötődik, ezért erős mellékhatásai vannak, úgy mint a nephrotoxicitás, láz, fejfájás, máj- és csontvelő-károsodás, helyileg vénagyulladás. 11
Egyes tanulmányok vizsgálták, hogy az amphotericin B különböző funkciós csoportjait érintő kovalens kémiai módosítások hogyan befolyásolják a hatását, de nem találtak egyértelmű összefüggéseket, bár úgy a protonált amino-csoport pozitív töltésű Natomja szükséges az ergoszterinhez való kötődéshez. Érdekes lehetőség a szén nanocsövekkel, vagy különböző poliszacharidokkal való konjugált komplexképzés is, bár ezek klinikai felhasználása kétséges [Sedlák 2009]. A lipidekkel kapcsolt, illetve a liposzomális amphotericin B klinikai gyakorlatban használt, nálunk is elérhető a liposzomális amphotericin B (Ambisome), az amphotericin B lipid-komplex (Abelcet), és az amphotericin B kolloidális diszperzió (Amphocil). A liposzomális amphotericin B liofilizált formában tartalmazza a hatóanyagot, amelyet kisméretű (<100nm) egyrétegű lipid-kettősréteg (ezt főleg foszfatidilkolin, koleszterin és diszteroil-foszfatidilglicerin alkotja) burkol. Ezek a formák hatékonyak, és csökkentik a mellékhatások, elsősorban a vesekárosodás mértékét [Moen 2009]. Az amphotericinnel szembeni rezisztencia ritka, non-albicans törzseknél írtak le ilyet néhány esetben.
3.1.3.2. Azolok Az azolok antifungális terápiában leggyakrabban használt szerek, köszönhetően széles hatás-spektrumuknak,
kémiai
stabilitásuknak
és
orális
alkalmazhatóságuknak.
Mellékhatásaik a poliénekhez képest jóval enyhébbek, pl. hányinger, hányás, bőrkiütések. Azonban mivel potenciális inhibitorai a citkróm P450 (CYP) 3A4 enzimnek, mely számos gyógyszer metabolizmusában részt vesz, a gyógyszer-kölcsönhatásokra figyelni kell. Két nagy csoportra bonthatók: az imidazolokra és a triazolokra. Hatásukat az ergoszterin-szintézis gátlásával fejtik ki, megakadályozzák a lanoszterin 14-α-demetileződését ergoszterinné, és a poszt-szkvalén szintézis további elemeit, az oxidoszkvalén-ciklázt és a C-24-metiltranszferázt is gátolhatják. Ezen kívül néhány gomba törzsnél a ∆22-deszaturáz enzimet, a szintézis utolsó lépését is gátolhatják. A ketokonazol az egyik legrégebb használt diazol vegyület. A ketokonazol, ahogy a 4. ábrán is látható, királis vegyület, 2 kiralitáscentrummal rendelkezik, gyógyszerként a racém elegyet használják, mindkét enantiomer cis konfigurációjú. A cisz konfiguráció itt azt jelenti, hogy a gyűrű 4-es számú szénatomjához fűződő hidrogén és a 2,4-diklórfenilcsoport az öttagú dioxolán-gyűrű azonos oldalán található. Az enantiomerek reszolválása HPLC-vel és szuperkritikus folyadékkromatográfiával is lehetséges [Thienpont és mtsai. 1999]. 12
(+)-(2R, 4S)
(+)-(2S, 4R)
4. ábra – Ketokonazol-enantiomerek Imidazol-vázas antifungális hatású vegyületek még a klotrimazol, azaz az 1-[(2klórfenil)(difenil)metil]-1H-imidazol
és
az
ekonazol,
vagyis
az
(RS)-1-{2-[(4-
klórfenil)metoxi]-2-(2,4-diklórfenil)etil}-1H-imidazol. Ezeket főleg külsőleg, lokális gombaellenes készítményekben használják. Az imidazol-vázas vegyületek antifungális hatását vizsgáló tanulmányok szerint két vagy három aromás gyűrű jelenléte szükséges az antifungális hatáshoz, az aromás gyűrűhöz kapcsolt halogénatom vagy apoláris funkciós csoport, valamint 2- vagy 2,4- helyzetű szubsztitúció szintén növeli a hatásosságot [Rani és mtsai. 2013]. A flukonazol (5. ábra) már a triazolok közé tartozik, molekulájában diklórfenil csoport helyett difluorofenil-csoport található. Ez az egyik leggyakrabban használt azol, hatását szintén az ergoszterin-szintézis gátlásával fejti ki. C. glabrata és C. krusei fajok primer rezisztenciával rendelkeznek flukonazolra. Szerzett rezisztencia kialakulása jelentős probléma, a rendszeres, profilaktikus flukonazol-szedéshez kapcsolódva írták le, C. albicans és non-albicans törzsek esetében is. Flukonazol-rezisztens törzsek előretörésében a korábbi antibiotikum-kezelés szerepét is kimutatták [Ben-Ami és Giladi 2012]. A rezisztencia mechanizmusai: a C14-lanoszterin-demetiláz enzimet kódoló Erg11p gén mutációja, az enzim fokozott expressziója, valamint a flukonazol sejtből való eltávolítását segítő efflux-pumpák mennyiségének növekedése [Espinel-Ingroff 2008, White és mtsai. 1998]. 13
5. ábra - Flukonazol
Az itrakonazol (6. ábra) is az orálisan alkalmazható azolok közé tartozik, bőr- és körömfertőzések kezelésében a flukonazol mellett használják. Érdekesség, hogy az azolok gyógyszerformulázása során ciklodextrin-származékokat is kipróbáltak, így készülhet itrakonazolból orális szuszpenzió és intravénás oldat is [Mallié és Bastide, 2001].
6. ábra - Itrakonazol Bőrfertőzések kezelésére külsőlegesen használt diazol-származék a bifonazol is (7. ábra), antifungális hatása mellett Gram-pozitív coccusok ellen is hatékony. Bifonazol-származékok enantioszelektív szintézisével Botta és mtsai foglalkoztak [2000]. A szintézisek a megfelelő (S)- vagy (R)-1-fenil-2-propinilaminból indultak ki. A szerzők a tiszta enantiomerek antifungális hatását is megvizsgálták. Várakozásaikkal ellentétben, egyetlen esetben sem volt különbség a vizsgált enantiomer pár tagjainak antifungális aktivitásában. Ezt nem az anyagok kísérlet közbeni racemizációja okozza, és nem is azt jelenti, hogy a célmolekula, a lanoszterin-14α-demetiláz érzéketlen lenne a gátló anyag sztereokémiai felépítésére. A jelenség oka valószínűleg a hatásmechanizmus más pontján van, valahol a sejtbe való felvétel és a célenzim gátlása közt.
14
7. ábra – Bifonazol
Az újabb típusú antifungális vegyületek mind triazolok. A vorikonazol (8. ábra) szerkezete a flukonazollal rokon, ahol az egyik triazol-gyűrűt fluorpirimidin-gyűrűre cserélték és a propanol-vázhoz egy metilcsoportot kapcsoltak. Nagyon jó az orális biohasznosulása, fungisztatikus a legtöbb Candida esetében, fungicid hatású egyes Aspergillus és Fusarium törzseknél. Mivel penetrál a vér-agy gáton, központi idegrendszeri aspergillozis esetén is alkalmazható. A májban CYP enzimeken át metabolizálódik, így számos gyógyszer, mint például a ciklosporinok, benzodiazepinek, omeprazol, digoxin plazmaszintjét emelheti, ezt fontos figyelembe venni alkalmazásakor [Odds és mtsai. 2003]. A metabolizáló-képesség eltérő erősséget mutat a humán populációban, így esetenként nagyobb dózisok alkalmazása szükséges, ami a mellékhatásokat, például a látási zavarokat, a májfunkció csökkenését, erősítheti.
9. ábra - Ravukonazol
8. ábra - Vorikonazol
A ravukonazol (9. ábra) is hatékony patogén Candida és Aspergillus törzsekre, előnye hosszabb plazmafelezési ideje és enyhébb mellékhatásprofilja. A posakonazol (10. ábra) az itrakonazollal rokon szerkezetű vegyület, fungicid hatású C. albicans, C. krusei, Aspergillus, Fusarium törzsek esetén, valamint zygomycosisok esetén is használható. 15
10. ábra - Posakonazol
Az azolok részletesebb bemutatásával kívántam szemléltetni azt az antifungális szereknél is igaz tényt, hogy a gyógyszermolekulákon végrehajtott viszonylag nem nagy módosítások jelentősen befolyásolhatják ezek farmakokinetikai tulajdonságait és felhasználhatóságukat.
3.1.3.3. Echinocandinok Az echinocandinok a klinikai gyakorlatban használt antifungális szerek újabb képviselői. A 2000-es évektől kezdve kerültek forgalomba; a caspofungin mellett már a micafungin és az anidulafungin is elérhető a világ nagy részén. Az echinocandinok nagy molekulatömegű (~1200kDa) lipopeptidek, kémiailag ciklusos hexapeptidek, amelyek nagy szénatomszámú zsírsavakkal vannak acilezve. Félszintetikus lipopeptidek, azaz például a caspofungint a Glarea lozoyensis által termelt pneumoncandin B, míg az anidulafungint az Aspergillus nidulans által termelt echinocandin B módosításával állították elő. Az egyes vegyületek főleg farmakokinetikai tulajdonságaikban, illetve egyéb gyógyszerekkel
való
interakciók
területén
különböznek.
Részletes
vizsgálatok
megmutatták, hogy például egy aminoprolin-csoport beépítése azon túl, hogy a vízoldékonyságot javítja, növeli az in vivo hatékonyságot is [Klein és mtsai. 2000]. Az echinocandin B, mint alapvegyület, valamint a caspofungin és a micafungin képletét a 11. ábra mutatja be. Ez utóbbi molekula egy hosszú optimalizáció eredménye, a félszintetikus micafungin acilcsoportja a természetes zsírsavaktól meglehetősen eltérő acil-oldallánc. Ez a csoport a molekulának megfelelő logP értéket ad, amely optimális az antifungális hatás szempontjából. A micafungin igen hatékony antifungális szer, mely alacsony hemolitikus aktivitással rendelkezik. [Fujie 2007].
16
megj.: DMM=dimetilmerisztoil
11. ábra – Néhány echinocandin vegyület felépítése
Hatásmechanizmus: az echinocandinok a β-1,3-glukán-szintáz nem kompetitív inhibitorai, mivel a β-1,3-D-glukán a gomba sejtfalának alapvető komponense, hiánya a sejtek lízisét okozza. Az érzékenységi vizsgálatok alapján a hatáshoz valószínűleg más, egyelőre nem tisztázott folyamatok is hozzájárulnak [Chen és mtsai. 2011]. Szelektivitásuk alapja, hogy az emberi sejtek nem tartalmaznak β-1,3-D-glukánt. Előnyük még, hogy nem szubsztrátjai és nem is befolyásolják CYP 450 enzimeket, így a gyógyszerkölcsönhatások is ritkábbak. Az echinocandinok hatékonyak a legtöbb Candida és Aspergillus törzzsel szemben, különösen C. albicans és A. fumigatus ellen. Csak parenterálisan alkalmazhatók, infúzió formájában, terápiás felhasználásuk a candidaemia, invazív és oesophagalis candidiasis, különösen, ha egyéb szerek mellékhatás vagy rezisztencia miatt nem jöhetnek szóba. Vizsgálták hatékonyságukat szervtranszplantációt és kemoterápiát követő gombaprofilaxisban is [Scott 2012]. Az echinocandinokkal szemben rezisztencia nem jellemző, mellékhatásaik a többi antifungális szerhez képest enyhék (bőrvörösség, kiütések), felhasználásukat korlátozza még, hogy elég drágák [Kaufmann 2006].
17
3.1.3.4. Kitinszintézist gátló szerek A kitin, bár kisebb mennyiségben van jelen, a sejtfal esszenciális alkotóeleme, a glukán rétegtől elkülönül, de ahhoz kovalensen kapcsolódik, így adva meg a sejtfal szilárdságát. A kitinszintézis gátlói közé tartoznak a nikkomycinek és a polyoxinek, melyeket különböző Streptomyces fajokból izolálták. A nikkomycinek családjából a leghatékonyabb vegyületek a nikkomycin X és a nikkomycin Z, a 12. ábrán ez utóbbi képlete látható.
12.ábra – Nikkomycin Z
13.ábra – UDP-GlcNAc
A hatásmechanizmus azon alapul, hogy szerkezete hasonló a kitin-szintáz szubsztrátjához, az uridin-difoszfát N-acetil-glükózaminéhoz (UDP-GlcNAc, 13. ábra), így ennek kompetitív inhibitora. Elsősorban a kitin-szintáz I. és III. típusát képes gátolni. Általában nem hatékony C. albicans, C. tropicalis és Aspergillus törzsek elllen, míg Blastomyces dermatitidis vagy Histoplasma capsulatum esetén hatásosnak bizonyult [Lóránd és Kocsis 2007]. Az új típusú nikkomycinek fejlesztésénél cél a kitin-szintáz inhibitor hatás erősítése, illetve a sejtbe való bejutás hatékonyságának növelése. Így vizsgálták például a terminális aminosav-rész módosításait [Obi és mtsai. 2000]. Ezeknek a vegyületeknek klinikai felhasználása még nem valószínű, de alapot adhatnak a további fejlesztésekhez [Behr és mtasi. 2003]. A polyoxinek szerkezete a nikkomycinekhez hasonló, néhány polyoxin felépítését a 14. ábra mutatja.
18
14. ábra – Néhány polyoxin felépítése
A polyoxinek in vitro hatékonyak a kitin-szintáz gátlásában, de Candida ellenes hatásuk erősen kérdéses. Hatékonyságuk függ a gombasejt növekedési állapotától és a tenyésztési körülményektől is, a sejtekbe való bejutásukhoz a peptid-transzport utakat veszik igénybe [Mehta és mtsai. 1984].
3.1.3.5. Sordarinok A sordarint (15. ábra) a Sordaria araneosa egy metabolitjaként izolálták az 1970-es években. Kémiailag a sordarinok tetraciklusos diterpén glikozidok.
15. ábra – Sordarin
Az alapvegyület a sordaricin, itt R=H (lásd 15. ábra). A sordarinok a fehérje-szintézis befolyásolásával fejtik ki hatásukat. Az elongációs fázisban az eEF2 elongációs faktorhoz kötődnek, valamint stabilizálják az eEF-2 –GDP-riboszóma komplexet. A sordarin hatásos többek közt C. albicans, C. tropicalis törzseken, ugyanakkor számos non-albicans törzs primer rezisztenciát mutat [Shastry és mtsai. 2001]. A természetes sordarinok mellett, mint a zofimarin vagy az újabb moriniafungin (amely non-albicans törzsek ellen is hatékony), számos szintetikus sordarin származékot is 19
előállítottak [Liang 2008]. Például sordaricin analógokat szintetizáltak ciklohexil gyűrű beépítésével, itt a tioéter- és az oxim-származék bizonyultak hatékonynak (ld. 16. ábra) [Kaneko és mtsai. 2002].
16. ábra - Antifungális hatású sordarin vegyületek: tioéter- és oxim-származék
Néhány módosított vegyület candidiasis, aspergillosis és pneumocystosis ellen állatkísérletekben is hatékonynak bizonyult [Martinez és mtsai. 2000]. Nagy előrelépést jelentett a (-) –sordarin totál szintézisének megvalósítása is [Chiba és mtsai. 2006]. Ezek az eredmények bíztatóak a jövőbeni klinikai felhasználás szempontjából.
3.1.3.6. Egyéb antifungális hatású vegyületek A flucytosin, az uracil antimetabolitja, egy fluor tartalmú pirimidin-vázas vegyület, a nukleinsav-szintézis gátlásán keresztül fejti ki hatását. Antifungális spektruma korlátozott, vizsgálják kombinációban való alkalmazását egyéb szerekkel. Az amorolfin fenilmorfolin-vázas vegyület, az ergoszterin-bioszintézisre gyakorol hatást [Carillo-Munozés mtsai. 2006]. A terbinafin az allilaminok közé tartozik, az ergoszterin-bioszintézisbe a szkvalén-epoxidáz szintjén avatkozik bele. Magyarországon is forgalomban van, helyileg és orálisan alkalmazzák bőr- és körömfertőzések, esetenként vulvovaginális candidiasis kezelésére [Rodriguez és Patrick, 2001]. A nystatin egy tetraén-dién tíusú makrolid, szerkezete az amphotericin B -hez nagyon hasonló, külsőleg, valamint a száj-, garat- és a gasztrointestinális-traktus gombás fertőzéseinél használják. A Nyotran® a nystatin liposzómális formája, melyet az amphotericin B példájára intravénás alkalmazásra fejlesztettek [Johnson és mtsai. 1998]. A griseofulvin egy benzfuranon-származék, a spirociklusos vegyületek közé tartozik, a Penicillium griseofulvum másodlagos metabolitja. Régóta használják, ez volt az első 20
gomba által termelt gombaellenes szer. Specifikusan a gombák microtubulusszerveződését befolyásolja, csak az un. dermatophytonokra (Tinea spp.) hat, melyek bőrfertőzéseket okoznak. Mivel szájon át is szedhető és olcsó, ezért egyes országokban napjainkban is használják [Odds 2003]. A felsoroltak mellett sok más anyag, például gyantasav-származékok [SavluchinskeFeio és mtsai. 2006], polikationos vegyületekkel módosított felületek is potenciális antifungális hatásúak. Ez utóbbi esetben különböző felületek (papír, pamut, selyem, gyapjú) szabad primer hidroxil-csoportjait funkcionalizálták lipofil-láncot is hordozó dikationos vegyületekkel. Az így módosított felületeken élesztő- és penészgombák megtelepedése és szaporodása is akadályozott volt [Cohen és mtsai. 2004]. Antifungális hatású vegyületek szerkezet-hatás összefüggéseinek vizsgálatával számos, egyéb célra használt gyógyszermolekula gombaellenes hatását is feltételezik. Ilyen szerek például az antidepresszáns szertralin, amely feltételezett támadáspontja a gomba fehérjeszintézise vagy az ösztrogén-receptor antagonista tamoxifen [Butts és Krysan 2012]. Figyelmet érdemelnek azok a vizsgálatok, melyek kisméretű fehérjék szerepét vizsgálják különböző fertőzések elleni védekezésben. Hatásuk lehet a kórokozók direkt elpusztítása, immunmodulátor hatás, vagy a patogének virulencia faktorainak gátlása. Néhány ilyen antifungális hatású peptid, illetve proteináz-inhibitor az RNáz-7, lizozim, lactoferrin, calprotectin, defensinek, dermcidin [Mehra és mtsai. 2012]. Bizonyos vaskelátoroknak ugyancsak lehet terápiás szerepe a gombás fertőzések kezelésében, például a mucormycosis terápiájában a desferoxamin-származékok szerepet kaphatnak [Ibrahim és mtsai. 2008] A fenti felsorolás korántsem teljes, csupán egy vázlatos áttekintése az antifungális hatású vegyületeknek.
21
3.2. Mannich-reakció és Mannich-vegyületek
3.2.1. A Mannich-reakció jelentősége. Mannich-reakciónak
nevezzük
az
α-helyzetű
hidrogénatomot
tartalmazó
karbonilvegyületek aminometilezését formaldehiddel és primer vagy szekunder aminokkal, vagy ammóniával. Oxovegyületként aktív hidrogént tartalmazó vegyületeket, elsősorban aldehideket vagy ketonokat, valamint észtereket vagy egyéb CH-savas vegyületeket (nitroalkánokat és nitrileket) használhatunk, aminként primer vagy szekunder aminok sóit, esetleg amidokat alkalmazhatunk [Faigl és mtsai 2011].
Klasszikus értelemben vett Mannich-reakcióban egy enolizálható aldehidet vagy ketont hevítünk formaldehiddel és amin-hidrokloriddal savas közegben. A reakció általános egyenletét a 17. ábra mutatja.
I 17. ábra – Klasszikus sav-katalizált Mannich-reakció egyenlete
A Mannich-reakcióval szintetizálható β-amino-ketonok és -aldehidek (Mannichbázisok), számos jól használható és értékes vegyület építőkövei, legfontosabb felhasználási területük különböző gyógyszervegyületek szintézise. Emellett növényvédőszerek, festékek előállításánál és a polimerkémiában is fontosak, mint szilárdságot fokozó, keresztkötő és reakció-gyorsító anyagok [Tramontini és mtsai. 1988; Rotaru és mtsai. 2007].
22
3.2.2. Mannich-bázisok szintézise, enantioszelektív szintézis A klasszikus Mannich-reakciónak (17. ábra) számos korlátja van. A drasztikus reakciókörülmények és a hosszú reakcióidő miatt nem kívánatos termékek is képződnek, probléma az alacsony szelektivitás és a kompetitív aldol-reakciók fellépése. Így primer aminnál vagy ammóniánál a reakció addig folytatódhat, míg a nitrogén valamennyi H-atomja helyettesítődik. Ezt megelőzendő a két reaktív α-helyzetű hidrogénatomot tartalmazó ketonokat nagy feleslegben használják. A hagyományos reakciónál általában csak formaldehid, illetve ketonok vagy aldehidek használhatók. Ez a típusú reakció általában nem megfelelő a Mannich-bázisok enantioszelektív szintézisére, a termék racém elegy [Arend és mtsai. 1998]. Az enantioszelektív, megfelelő termelést biztosító Mannich-típusú reakciók a gyógyszervegyületek szintézise szempontjából kiemelkedően fontosak, ezért számos módszert kidolgoztak ezen problémák megoldására. A reagensek megfelelő megválasztásával biztosítható az elektrofil részecskék magasabb koncentrációja, így a reakcióidő és a reakció hőmérséklete csökkenthető. A hagyományosan használt karbonil-származékok (aldehidek, ketonok) helyett reaktívabb megfelelőik, pl. enolátok vagy szilil-enol-éterek is használhatók. A reakcióval nem csak aminometilezés, de aminoalkilezés, illetve a sztereoszelektív szintézis is megvalósítható. Ilyen reagensek lehetnek még az enolizálható iminek, amelyeket felhasználnak karbonsavszármazékok sztereoszelektív aminoalkilezésére. Az eddigi reakciók intermolekuláris Mannich-reakciók voltak. Az intramolekuláris Mannich-reakció az azaheterociklusok szintézisében használható fel legsokoldalúbban. Ezekben a reakciókban aciklusos kiindulási anyagokból képződnek gyűrűs termékek; jellemző rájuk a nagyfokú kemoszelektivitás.
Az intramolekuláris Mannich-reakciók
felhasználhatók természetes vegyületek - pl. alkaloidok szintézisére [Davis és mtsai. 2009]. A 3.2.3 fejezetben több konkrét példát is mutatok intramolekuláris Mannich-reakcióra. Egy további fejlesztése ennek a reakciónak az ún. vinilóg típusú Mannich-reakció. Ennél egy α, β-telítetlen ketont γ-helyzetben aminoalkileznek [Tanino és mtsai. 1992]. Enantioszelektív
szintézisre
ad
lehetőséget
a
direkt,
prolin-katalizált
háromkomponensű Mannich-reakció. Aceton, p-nitrobenzaldehid és p-anizidin kiindulási anyagokból DMSO oldószerrel prolin jelenlétében 90% feletti enantiomer-felesleggel képződött a Mannich-bázis megfelelő enantiomere (II - 18. ábra). A reakció előnyei az enantioszelektivitás mellett, az olcsó, a reakcióelegyből visszanyerhető katalizátor (prolin), a
23
p-metoxifenil amin védőcsoport, amely oxidatív körülmények közt könnyen eltávolítható [List 2000].
II (S)-4-((4-metoxifenil)amino)-4-(4-nitrofenil)bután-2-on 94 ee% 18. ábra - Direkt, prolin-katalizált Mannich-reakció
A prolin-katalizált
Mannich-reakcióval
nukleofil
donorként
nem
módosított
aldehideket használva is leírtak enantioszelektív szintéziseket. A reakció speciális aminosavak, β-laktám-antibiotikumok és szerin proteáz inhibitorok szintézisében játszhat szerepet.
A
katalizátort
(S)-2-metoxi-metilpirrolidinre
cserélve
a
megfelelő
anti-
diasztereomerek direkt szintézisét valósították meg [Notz és mtsai. 2003]. A prolin-mediált, aszimmetrikus, három-komponensű Mannich-reakciót nikkomycin B totálszintézisében is felhasználták [Hayashi és mtsai. 2005].
Jó hatásfokú enantioszelektív szintéziseket
valósítottak meg Zn- , Cu-, vagy Pd-katalizátorokkal is. Katalizátorként pirrolidin-2-karbonsavat (prolint) és származékait használva ketonok direkt aszimmetrikus Mannich-reakcióját írták le, ahol termékként Mannich-bázisok képződtek igen jó enantio- és diasztereoszelektivitással, itt a főtermékek a syn-izomerek. Pirrolidin-3-karbonsavnak és származékainak katalizátorként való alkalmazásával az antiizomerek sztereoszelektív szintézisét valósították meg. A sztereokontrolban a pirrolidin 2-, ill. 3-helyzetű CH-savas csoportja játszik elsőleges szerepet, ezt a 19. ábrán szemléltetjük [Zhang és mtsai. 2008].
24
syn-III – anti-III
19. ábra – A pirrolidin-karbonsav CH-savas csoportjának szerepe a Mannich-reakció sztereokontroljában.
Érdekes lehetőség Mannich-bázisok diasztereoszelektív „zöld” szintézise vizes közegben. A direkt szintézis adenin katalizátor használatával, 30 %-os hidrogén-peroxid jelenlétében, vizes-etanolos közegben, szobahőmérsékleten zajlik. A reakció egyenletét a 20. ábra mutatja. R
R
R NH2
O +
adenin (20 mol%)/H2O2 CHO
O
O
HN
HN
+
20 oC
R
R
R
R= H, Me, OMe, Br… syn-IV
anti-IV
20. ábra – Adenin-katalizált Mannich-reakció egyenlete, a keletkező syn/anti termékekkel (IV)
A kiindulási vegyületek szubsztituensei alapvető szerepet játszanak a keletkező βaminoketonok diasztereoszelektivitásában. Az amin elektronvonzó szubsztituensei a syn, míg az elektronküldő szubsztituensek az anti formának kedveznek, de maximum 20:80 arányú szelektivitás volt tapasztalható [Goswami és Das 2009].
25
3.2.3. Mannich-reakció felhasználása bioaktív vegyületek szintézisében 3.2.3.1. α-Metilén ketonok szintézise Mannich-bázis intermediereken keresztül Az α-metilén ketonok szintézisét Mannich-bázis intermediereken keresztül a megfelelő ketonból, s-trioxánból és N-metilanilin-trifluoracetátból (TAMA) kiindulva írták le. A 21. ábra egy keton reakcióját mutatja egy s-trioxánnal és TAMA reagenssel száraz aprotikus oldószerben, ami ekvivalens egy formaldehiddel végzett aldol-kondenzációval. A reakció során egy Mannich-bázis képződik, amiből spontán β-eliminációval keletkezik egy irreverzibilis lépésben az α-metilén keton (V) [Gras 1978]. A módszer jelentőségét az adja, hogy az igen reaktív α-metilén ketonok így viszonylag könnyen előállíthatók. H O
CH3 R
+ O
O
O
+ CF3COO
H2N
CH3 C6H5
H
THF
H
R vagy dioxan
O
TAMA
V. 21. ábra – α-Metilén ketonok szintézise
3.2.3.2. Mannich-reakció használata gyógyszervegyületek előállításában A Mannich-reakció használata gyógyszervegyületek előállításá során is nagyon gyakori. Az alábbiakban erre mutatok néhány konkrét példát, a teljesség igénye nélkül [Subramaniapillai 2013]. A Parkinson-kór kezelésében használt osnervan vagy a fájdalomcsillapító hatású tramadol (22. ábra) szintézise Mannich-intermedieren keresztül valósítható meg.
22. ábra – Tramadol
A nemszteroid fájdalomcsillapító-gyulladáscsökkentő hatású ibuprofen triazol-származékának Mannich-bázisát is előállították formaldehid és szekunder amin reagensekkel (lásd 23. ábra),
26
mely szintén erős fájdalomcsillapító-gyulladáscsökkentő hatást mutatott [Sujith és mtsai. 2009].
ibuprofen triazol-számazéka
ibuprofen triazol-származékának Mannich-analóg vegyülete
23. ábra – Ibuprofen triazol-származéka és annak Mannich-származéka
Az altató hatású zolpidem szintézisét Mannich-reakcióval Sumalatha és mtsai. írták le [2009], a reakciót a 24. ábrán szemléltetjük (a köztes lépések kihagyásával).
R1 = 4-MeC6H4
zolpidem
24. ábra – Zolpidem szintézise Mannich-reakcióval
A Mannich-származék képzés gyakran hasznos a vízoldékonyság növelésére. Az echinocandinok közé tartozó mulundocandin in vitro nagyon jól hat különböző Candida törzsekre, de gyenge vízoldékonysága korlátozza alkalmazhatóságát [Lal és mtasi. 2004]. A mulundocandin Mannich-származéka (25. ábra) a kiinduális vegyülethez hasonlóan jó antifungális hatást mutat, míg vízoldékonysága lényegesen jobb annál.
27
H N MM
OCH3
H3 C
O
H NH OH O H NH N O CH3 H O H OH HO N NH H H N O OH H H HO O OH
HO
N N
H
MM = 12-metilmirisztoil
OH
25. ábra – Mulundocandin Mannich-származéka
Egy másik példa a vízoldékonyság növelésére a limeciklin, azaz az N-lizinometil-tetraciklin (26. ábra), ez a tetraciklinek családjába tartozó antibiotikum, mely az alapvegyületnél sokkal jobban oldódik vízben. Súlyos acne kezelésében használják belsőleg is [Bossuyt és mtsai. 2003].
HO
CH 3 H
N(CH 3) 2
H OH
O
OH OH O
OH H N
H N
NH 2 COOH
O
26. ábra - Limeciklin (N-lizinometil-tetraciklin) A
kedvezőbb
ADME
(felszívódás-megoszlás-metabolizmus-kiválasztás)
tulajdonságok kialakítását szem előtt tartva fejlesztettek tovább egy létező maláriellenes hatású vegyületet Guantai és mtsai. [2011]. A 27. ábra mutatja a reakció egyenletét és körülményeit. A kiindulási vegyület triazol-gyűrűjét piperazinra cserélték és egy kalkonszármazékkal vitték Mannich-reakcióba, formaldehides-etanolos közegben. A szintén maláriaellenes hatású termék (VI) farmakokinetikai paraméterei kedvezőbbek, mint a kiindulási anyagé.
28
R=H, OMe VI 27. ábra – Optimalizált karakterű maláriaellenes hatású vegyület előállítása Mannichreakcióval
3.2.3.3. Mannich-reakció felhasználása természetes vegyületek szintézisében A Mannich-reakciót természes vegyületek, pl. alkaloidok szintézisére is használják. A reakciót a 28. ábrán szemléltetjük egy nyílméregbékából izolált alkaloid, az epibatidin szintézisével [Hernandez és mtsai. 1995]. Az intramolekuláris Mannich-reakcióban a karbonsav-származéknak ketocsoportot kell tartalmaznia.
epibatidin 28. ábra – Az epibatidin szintézise
Egy alkaloidszerű vegyület, pontosabban egy furazocin-származék szintézisét Chernov és mtsai. írták le [2003]. Kiindulási anyagnak lambertiánsavat, egy, a szibériai cédrusból (Pinus sibirica J. Mayr.) kinyerhető diterpénsavat használtak. A szintézis egyik intermedierje az intramolekuláris ciklizációban kapott azaciklooktán-származék (29. ábra).
29
Azaciklooktán-származék
Furazocin-származék
29. ábra – Intramolekuláris Mannich-reakcióval szintetizált furazocin-származék, és a köztes Mannich-bázis azaciklooktán-származék képlete 3.2.4. Mannich-bázisok biológiai hatásai Hosszan sorolhatnám a Mannich-vegyületek biológiai hatásait, de a számos lehetőség közül csak két területet szeretnék jobban kiemelni, a citotoxikus és az antimikrobiális hatást. Egyes Mannich-bázisok citotoxikus hatása évtizedek óta ismert. Dimmock és mtsai. [1980] sztiril-ketonok és ezek Mannich-származékainak tumorellenes hatását vizsgálták egereken, ahol is a Mannich-bázisok számottevő tumorellenes aktivitást mutattak, míg a megfelelő sztiril-ketonok nem vagy alig. Az antitumor-hatás jól korrelált a vegyületek tioldepléciós képességével. Ez azt jelenti, hogy a szer a tumorsejt létfontosságú tiol-vegyületeit, mint például a glutationt vagy a ciszteint, képes alkilálni. Az elmélet szerint a tumorsejtek érzékenyebbek a normál sejteknél erre a hatásra, különösen a szekvenciális citotoxicitást mutató vegyületek esetén [Pati és mtsai. 2007].
H2 H2 H2 H2 CH3 N C C C C C N H3C CH3 O H3C
CH3 H2 H2 x HCl N C C C C CH2 + H N H3C H CH3 O H3C
x 2HCl
HSR1
H N
CH3 CH3
x HCl + H2C
C H
H2 H2 C C C SR1 O
H2 H2 H2 H2 N C C C C C SR1 H3C O H3C
HSR2 H2 H2 H2 H2 R2S C C C C C SR1 O
HSR1, HSR2 = celluláris tiol vegyület
30. ábra - Szekvenciális citotoxicitás menete 30
A szekvenciális citotoxicitás két vagy több citotoxikus anyag egymást követő felszabadulását jelenti. Ahogy a 30. ábrán láthatjuk, a látens tioalkilező szerek először dezaminálódnak, azaz 1,2-eliminációban vesznek részt, metilén-ketonokká, melyek reagálnak egy celluláris tiol-vegyülettel. Ezt követően egy addíciós és dezaminációs lépést követően újabb tioalkilezőszer szabadul fel. Cikloalkanonok Mannich-származékainak vizsgálata során erős citotoxikus hatású vegyületeket (VII, VIII) szintetizáltak, ezek közül néhányat a 31. ábra mutat [Dimmock és mtsai. 1993]. Bisz- és mono-származékokat is előállítottak, így vizsgálva a szekvenciális citotoxicitást. A bisz-származékok két helyen is dezaminálódhatnak, így kétszeres alkilálásra képesek. Ezen kísérletek során a bisz-származékok bizonyultak hatékonyabbnak, de a monoszármazékok közt is találtak hatásos vegyületeket.
VII.
VIII.
31. ábra – Citotoxikus hatású cikloalkanon Mannich-származékok.
Kimutatták, hogy 1-aril-3-dialkilamino-1-propanon hidrogénhalogenid-származékai számos egér ill. humán
tumoros-sejtvonalon citotoxikus hatásúak. Ebből kiindulva
Vashishtha és mtsai. [2004] számos további vegyületet előállítottak. Az 1-(4-arilfenoxi)-3dietilamino-1-propanon-hidroklorid és származékai (IX-X, lásd 32. ábra) mind citotoxikus hatásúnak bizonyultak.
R= H, CH3, F,Cl, Br X=O, S
X=N(CH3)2 IX.
X.
32. ábra - Citotoxikus hatású Mannich-bázisok: 1-(4-arilfenoxi)-3-dietilamino-1-propanonszármazékok 31
Citotoxikus hatású a gatifloxacin Mannich-származéka (33. ábra) is. Ez erősebb antitumor-aktivitást mutatott, mint a terápiában használt etoposid. N N
SO2NH H3CO
OCH3
N Br O
F
N
O N
H3C
N H3CO
O N
OH
33. ábra - Gatifloxacin Mannich-származéka
A fenti, potenciális tumorellenes szerek mellett klinikai használatban levő citotoxikus hatású Mannich-származékok közé tartozik például a topotecan, ami a camptotechin vízoldékony származéka [Subramaniapillai, 2013].
Egyes Mannich-bázisokkal konjugált sztiril-ketonok antifungális aktivitása szintén régóta ismert. A 34. ábrán egy Candida albicans ellen hatékony vegyület látható [Dimmock és mtsai. 1994].
34. - ábra C. albicans ellen hatékony Mannich-keton vegyület Kalkon-származékok antifungális hatását és annak mechanizmusát vizsgálva megállapították, hogy ebben a gomba sejtfalára gyakorolt hatás is szerepet játszhat, a kitinszintáz és a β-1,3-D-glukán szintáz befolyásolásán keresztül [Lopez és mtsai. 2001]. Lóránd és mtsai. [2001] telítetlen Mannich-ketonok sorozatát állították elő. A szintézis első lépésében 2-arilidéncikloalkanon köztes termékek keletkeztek bázis-katalizált aldol kondenzációban. A Mannich-ketonokokat a megfelelő 2-arilidéncikloalkanon, szekunder 32
amin és paraformaldehid reakciójából sósavas sóként izolálták. A klasszikus Mannich-reakció során etanolos közegben sósav katalizátort használtak, a szekunder-amint a kompetitív aldolkondenzáció visszaszorítására feleslegben alkalmazva. A vegyületek citotoxicitását, Grampozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben mutatott hatását is vizsgálták. Néhány vegyület számottevő antibakteriális aktivitást mutatott. A hatást feltételezhetőleg a tiolalkilálás mellett egyéb tényezők is befolyásolják. Kondenzált vázas Mannich-ketonok szintézisét is megvalósították. Ez a vegyületcsalád is mutatott antibakteriális hatást [Lóránd és mtsai. 2002]. A telítetlen Mannich-ketonok antifungális hatását Candida, Saccharomyces és Aspergillus törzsekre is vizsgálták [Kocsis és mtsai. 2009]. A penészgomba törzsek ellen nem voltak hatásosak ezek a vegyületek, míg a Candidákkal szemben a legtöbb anyag antifungális hatást mutatott. A Mannich-ketonok ergoszterin-, kitin- és fehérje-szintézisre, valamint a pszeudohifa-képzésre kifejtett hatását is tesztelték. Egyes vizsgált vegyületek befolyásolhatják a C. albicans pszeudohifa-képzését, változásokat okoztak a fehérje-összetételében, illetve befolyásolhatják a kitin-szintáz enzimet is. Munkám során ezekkel a telítetlen és kondenzált vázas Mannich-ketonokkal foglalkoztunk, így ezekről később még szólunk.
33
3.3. Módszerek 3.3.1. Áramlási citometria Az áramlási citometria (= flow citometria) egy eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban önálló részecskék tulajdonságait vizsgálhatjuk. Előnye, hogy 1 µm feletti részecskékről egyedi információkat nyerhetünk. Az áramlási citometria segítségével nemcsak a sejtek méretéről tájékozódhatunk, hanem különböző fluoreszcens festékeket használva speciális tulajdonságokat is vizsgálhatunk. A flow sorting technikával sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztása is lehetséges mért paraméterek alapján. A klasszikus áramlási citométerek vázlatos technikai felépítése: fényforrás, áramlási rendszer, detektáló rendszer, adatgyűjtés – analízis, opcionális sorting-rendszer. Az áramlási citometriás méréseknél a minta szuszpenzió formájában tartalmazza a sejteket, melyeket túlnyomás
segítségével
juttatnak
el
egy
fejhez
vagy
áramlási
cellához.
Az áramlási cellához kerülve a sejtek hidrodinamikai fókuszálással rendeződnek, azaz a nyomásviszonyok megfelelő beállításával lineáris áramlás jön létre, a köpenyfolyadék és a minta nem keverednek, hanem a segédanyag körülöleli a mintát. A fejet a sejteket tartalmazó mintacseppek sorban egymás után hagyják el, megfelelő beállítások mellett egy folyadékcseppbe egy sejt kerül. Ezután a sejteket megvilágítják egy fókuszált fénysugárral, amelyet lézerrel, lámpákkal vagy diódával generálnak, majd detektálják az egyes sejtekről érkező optikai jeleket, úgy mint: -
előre irányuló szórás = forward scatter (FSC): a sejt méretét jellemzi
-
oldalirányú szórás = side scatter (SSC): a sejt belső strukturáltságáról informál
-
fluoreszcencia: a sejtek speciális jellemzőiről adhat tájékoztatást, a mért emissziós intenzitás arányos a sejtekhez kötött fluorofór mennyiségével.
A detektorok elhelyezése függ a készülék optikai elrendezésétől, lézeres fényforrás esetén a detektor merőlegesen helyezkedik el a megvilágító fényhez és a folyadékoszlophoz képest is. Az oldalirányú szórás és a fluoreszcencia detektálására fotoelektron-sokszorozókat (PMT), az előre irányuló szóráshoz fotodiódákat használnak, ezek érzékenysége elmarad a PMT-től, de kisebbek, olcsóbbak, stabilak. A fluoreszcens jel specifikus régióinak detektálásához az emittált fényt hullámhossza alapján szét kell osztani, erre a célra az interferencia elvén alapuló optikai szűrőket és dikroikus tükröket használnak. A jeleket analóg-digitális átalakítók
34
segítségével konvertálják, az adattárolás és analízis természetesen számítógépes programok pr segítségével lehetséges [Lustyik 2008]. A rendszer felépítését az 35. ábra mutatja.
35. ábra – Áramlási citométer vázlatrajza: lézer, optikai rendszer (gyűjtő (gyűjtő lencsék, filterek, dikroikus tükrök), detektorok [3].
Az áramlási citométerek történetében nagy előrelépés el relépés volt a sejtszeparálásra (szortolásra) alkalmas készülékek megjelenése [Mattanovich anovich és Borth, Borth 2006]. Beépített piezoelektromos kristály segítségével a cseppekre bontott folyadékáramban levő lev sejtek töltés alapján szétválaszthatók. A modern készülékek tervezésénél egyik irány a minél összetettebb, több lézert, így több, akár 12 utas utas detektálást használó rendszerek fejlesztése, fejlesztése illetve megjelentek egészen egyszerű, egyszerű rutindiagnosztikai iagnosztikai feladatokra terepen is használható készülékek is. A chip-alapú mikrofluidikai rendszerekről rendszerekr lentebb részletesen szólunk. Napjainkban ainkban az áramlási citometria citometria egy széles körben elterjedt módszer, számtalan immunológiai, immundiagnosztikai, biotechnológiai, rutin labor- és kísérleti felhasználása van, ezeket jelen munkánknak nem célja részletezni. Az egyedi sejtek vizsgálata azonban a mikrobiológiában is fontos, fontos, erre egy lehetséges módszer az áramlási citometria ometria [Brehm-Stecher [ és Johnson, 2004]. Míg kezdetben csak eukarióta sejtek vizsgálatára használták, ma már prokarióták elemzésére is elterjedt. Baktériumok, köztük Staphylococcus aureus, Escherichia Esch coli, Salmonella spp., stb. kimutatását, antibiotikum-érzékenység érzékenység
meghatározását írták le a módszerrel [Comas és
Vives-Rego 1998, Walberg lberg és mtsai. 1997]. 1997
35
Változatos fluoreszcens jelölőket alkalmazva használják életképesség-vizsgálatokra, mely tulajdonság meghatározása nem is mindig olyan egyértelmű [Davey 2011]. Alkalmazható sejtciklus-vizsgálatokban, például élesztőgombák növekedési fázisainak követésében és modellezésében [Porro és mtsai. 2009]. Page és mtsai. [2006] polisztirol gyöngy alapú olgionukleotid próbákkal klinikai mintákból Candida törzsek kimutatását valósították meg. Aspergillus és Candida törzsek antimikotikumokkal, úgymint, amphotericin B, azolok, caspofungin szembeni érzékenységének vizsgálatára sikerrel használtak áramlási citometriát [Kirk és mtsai. 1997, Pina-Vaz és mtsai. 2005]. Az áramlási citometriás eredmények jól korreláltak a nemzetközi standard és rutin diagnosztikai érzékenységvizsgálatokkal [Chaturvedi és mtsai. 2004, Favel és mtsai. 1999].
3.3.2. Chip-alapú áramlási citometria A mikronizálási törekvés napjaink jellemző trendje. A hagyományos áramlási citométerek összetett, ezért drágább rendszereivel szemben jelentkezett igény a kisebb méretű, kisebb minta – és anyagigényű, olcsóbb rendszerek fejlesztésére. A mikrofluidikai áramlási citométer fejlesztések esetében felmerülő alapvető problémák
a
folyadék-áramlási
rendszerek
miniatürizálása,
az
optikai
rendszerek
lekicsinyítése illetve optimalizálása a vizsgálható mintákra. További lehetőség rejlik a mikrosorting rendszerek kidolgozásában. Megoldandó feladatként merült fel különböző feladatok intergálásának megoldása egy felületen. Ezért a különböző, un. lab-on-a-chip rendszerek fejlesztése ma is zajlik, sőt ilyen megoldások már kereskedelmi forgalomban is elérhetők [Lapsley és mtsai. 2013]. A megfelelő folyadékáramlás biztosításánál fontos, hogy például a perisztaltikus pumpáknál gyakran tapasztalható pulzálást elkerüljük, így a csatornák méretét is figyelembe véve a megfelelő áramlási profil alakuljon ki. A mikroflow citométerek többségénél külső, nyomás-vezérelt pumpákkal oldották meg a folyadékáramlást, ide értve a fecskendő-alapú, sűrített gázos vagy vákuum-pumpákat, de gravitáció-hajtott áramlást is leírtak. A nyomásvezérelt áramlás helyett elektrokinetikus fókuszálás is használható, ezek a módszerek az elektroozmotikus áramlás (EOF) és/vagy az elektroforézis elvén alapulnak. Egydimenziós fókuszálás a gyakoribb, de két-dimenziós fókuszálást is alkalmaznak már mikroflows rendszereknél [Ateya és mtsai. 2008]. Az optikai rendszer kivitelezésére szintén számos lehetőség létezik. Mivel mind a gerjesztést, mind a detektálást meg kell valósítania, így a pontszerű (20-60 µm) gerjesztési sugár mellett a fényszórás mérésénél is lokalizált, pontos adatgyűjtés szükséges. 36
Fényforrásnak többnyire LED-et vagy lézert, a detektáláshoz optikai filtereket, szűrőket, mikrolencséket használnak. Alternatív lehetőségként leírták a kizáráson-alapuló optikai rendszerek, illetve a párhuzamosan sok szín detektálását lehetővé tevő COST (color-spacetime) adatgyűjtés használatát is. [Cho és mtsai. 2010]. A mikrosorting, azaz a sejtek szeparálása is elvégezhető már chip-méretű rendszerekben is. Ehhez használhatnak mechanikus csapdázást, ilyen lehetőség a mikrofilterek, pl. vér alakos elemeinek szeparálására [Chen és mtsai. 2008], vagy a sejtfilterek (állati és baktérium sejt elválasztására) alkalmazása, de a sejtek különböző adhéziós tulajdonságait is kiaknázhatják e célra [Andresson és Berg, 2003]. Az elektromos mező által vezérelt szeparálás általában véve jól illeszthető a mikrofluidikai rendszerekbe, előnyei a gyorsaság, kontrollálhatóság, változatos felhasználás. Az elválasztandó részecskék típusa határozza meg az elektromos mező típusát. Cho és mtsai. [2009] fluoreszcencia-aktivált mikro sejt-szorter hatékonyságát bizonyították. A gyakorlatban számos, chip-alapú citometriás rendszert hoztak létre kísérleti céllal, ezek közül több kereskedelmi forgalomban is elérhető, lab-on-a-chip rendszerek részeként is. A 36. ábrán példaképp egy ilyen készülék, az Agilent 2100 Bioanalyzer áramlási citometriás chipjének rajzát mutatom be [Preckel és mtsai. 2002]. Az ábrán kinagyítva látható a chip csatorna-hálózata, a mintafelviteli helyek kék, míg a segédanyagként használt puffer felviteli helye piros színű karikával van jelölve. Az elválasztás nyomásvezérelt rendszerben zajlik, fluoreszcens detektálást alkalmaznak. Közvetlen a detektálás előtt a csatorna adott szegmensébe fókuszálják a sejteket hidrodinamikai fókuszálással. Így a detektálási zónába egymást követően érnek a sejtek, azaz itt is egyedi sejtekről nyerhetők információk.
36. ábra - Az Agilent áramlási citometriás chipének vázlatos rajza, kinagyítva a detektális régió előtti terület, ahol a hidrodinamikai fókuszálás történik. [4]
37
A fentiekből is látszik, hogy a mikroflow rendszerek felhasználása egy dinamikusan fejlődő terület. Csak néhány példa a felhasználásra: Palkova és mtsai. [2004] élesztőgombák, emlőssejtek és gombaspórák kimutatását írták le. Alkalmasnak találták a rendszert baktériumok vizsgálatára [Gerdts és Luedke, 2006], vagy humán sejtek fenotípus-elemzésére [Chien és mtsai. 2003]. Alshareef és mtsai. [2013] tumorsejtek szétválasztását valósították meg elektroforézis - alapú mikrofluidikai chipen.
3.3.3. Chip-alapú kapilláris gélelektroforézis Napjaink leghatékonyabb elválasztási technikái az elektroforézis elvén alapulnak, amely szerint az oldat töltéssel rendelkező molekulái elektromos erőtér hatására elmozdulnak. A poliakrilamid és agaróz gélt alkalmazó elektroforézis technikák alapvető fontosságúak a genomikában és proteomikában. A hagyományos gélelektroforézis egy-, illetve kétdimenziós elválasztási rendszerek alkalmazását is lehetővé teszi. A kapilláris elektroforézis technikákat szintén több évtizede használják, főleg biomolekulák analízisére. A kapilláris zónaelektroforézis (CZE) a leggyakrabban használt kapilláris elektroforetikus módszer, az oldott részecskék különböző elektroforetikus mozgékonyságán alapszik. Ennek megfelelően az elválasztás a tömeg/töltés arány alapján zajlik az elektrolittal töltött kapillárisokban. Fehérjék elválasztására a CZE jól alkalmazható, de figyelembe kell venni a fehérjék és a kapilláris fala közt fellépő, nem kívánatos adszorpciós kölcsönhatásokat. Ezek kiküszöbölésére bevont vagy módosított felületű kapillárisokat használnak, vagy segédanyagként megfelelő puffer-adalékokat [Gáspár 2000]. Kapilláris gélelektroforézis alatt azt értjük, mikor az elektroforézis kivitelezésére géllel vagy polimer-oldattal töltött kapillárisokat használunk. Ennél a módszernél a fehérjéket felületaktív anyaggal kezelik a mérés előtt, a vándorlás a töltésüknek köszönhető, de molekulaméret alapján választódnak el. A technika fehérjék mellett, DNS, illetve komplex szénhidrátok elválasztására is alkalmas [Guttman 2003]. A mikrochip-elektroforézis a kapilláris elektroforézisből fejlődött ki. Napjaink legmodernebb elválasztástechnikai módszerei közé tartozik, alkalmas biológiailag fontos minták, DNS, RNS, fehérjék elválasztására. A molekulák elválasztása kisméretű üveglapba maratott, 10-40 µm mély és 50-200 µm hosszú csatornákban történik, üvegchipek mellett ma már műanyagchipeket is használnak. A csatornák a mikrochip felszínén levő nyílásokban végződnek, melyek a minták és segédanyagok bejuttatására szolgálnak. A tényleges 38
mintaigény néhány nanoliternyi, a mérések időtartama néhány perc nagyságrendű. A detektálás leggyakrabban lézer-indukált fluoreszcencia méréssel történik, de léteznek direkt MS-kapcsolt mikrochip rendszerek is. Egyéb detektális módok, mint az elektrokémiai detektálás vagy a kemilumineszcencia mérése kevésbé elterjedtek [Kustos és mtsai. 2007]. A rengeteg, adott kísérlethez tervezett chip-alapú elektroforézis-rendszer mellett számos, kereskedelmi forgalomban is elérhető változata létezik. Ilyen például a Bio-Rad ExperionTM nevű mikrofluidika-alapú elektroforézis-készüléke vagy az Agilent Bioanalyzer rendszere [Kuschel és mtsai. 2005]. A chip alapú kapilláris gélelektroforézis rendszereket önállóan vagy lab-on-a-chip rendszer formájában használják.
39
4. CÉLKITŰZÉSEK Munkám során Candida törzsek analitikai, elválasztás-technikai módszerekkel való vizsgálata volt a célom. Ezen igen tág témán belül az alábbi vizsgálati irányokat terveztem megvalósítani: •
Candida
sejtek
vizsgálata
áramlási
citometriás
módszerrel,
elsősorban
az
antimikotikum-érzékenység meghatározása (irodalmi adatok alapján). •
Különböző antimikotikumok vizsgálata, Candida albicans és non-albicans törzseken.
•
Ezen eredményekre alapozva hasonló elven működő, de chip-alapú antimikotikumérzékenység meghatározás tervezése, mivel ilyen célú felhasználását nem találtam ezen rendszernek.
•
A hagyományosan használt antimikotikumok mellett más típusú, gombaellenes hatással is rendelkező vegyületek, a Mannich-ketonok vizsgálata.
•
Candida albicans fehérjeprofiljában a Mannich-ketonok hatására bekövetkező minőségi és mennyiségi változások vizsgálata chip-alapú elektroforézises módszer felhasználásával.
•
Különböző típusú Mannich-ketonok vizsgálata, a fehérje összetételre gyakorolt hatás és a vegyületek szerkezete közti összefüggések elemzése.
40
5.
KÍSÉRLETI RÉSZ
5.1. Candida törzsek és tenyésztési körülmények Kísérleteim során nemzetközi standard Candida törzseket használtam: Candida albicans ATCC 90028, Candida tropicalis ATCC 90874, Candida glabrata 90030, Candida krusei 30068. A gombákat Sabouraud-agar (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hants, England) táptalajon tenyésztve tartottam fent, 30 °C-on, hetente átoltva.
5.2. Fluoreszcens festékek Az áramlási citometriás és sejt-chip vizsgálatoknál a gomba sejteket különböző fluoreszcens festékekkel jelöltem. A különböző kísérletek során az alábbi festékeket használtam: •
Propidium-jodid (Sigma, USA). 10 µg/ml-es koncentrációjú oldatát használtam, ez a
vegyület fénytől védve, 4 °C-on tárolható. Nukleinsav festék, az elölt sejtek jelölésére alkalmas. Gerjesztési/ emissziós maximuma 535/617 nm. •
Sytox Green (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 5 mmol/l oldat DMSO-ban, nem
permeábilis nukleinsav festék, az elölt sejtek jelölésére alkalmas. A Sytox Green hozzávetőleges gerjesztési/emissziós maximuma 504/523 nm. •
Syto 60 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) permeábilis nukleinsav festék,
egyaránt festi az élő és az elhalt sejteket, így az összsejtszám jelölésre alkalmas, gerjesztési/emissziós maximuma 652/678 nm. A propidium-jodid és a Sytox Green festékek szerkezeti képletét a 37. ábrán mutatom be (a Syto 60 vegyület szerkezeti képletét/ racionális nevét a gyártó nem tette elérhetővé).
Propidium-jodid
Sytox Green
37. ábra - Fluoreszcens festékek szerkezeti képlete 41
5.3. Antimikotikumok Az áramlási citometriás és sejtchip kísérleteimhez amphotericin B-t (ld. 3.ábra) és flukonazolt (ld. 5. ábra) használtam. Az amphotericin B-t Fungizone® injekcióhoz való por (Bristol-Myers Squibb, Epemon, France) formában használtam, ez porampullánként 50 mg amphotericin B mellett 41 mg nátrium-dezoxikolátot tartalmaz és 20,2 mg nátrium-foszfátot pufferként. A kristályos amphotericin B vízben nem oldódik, a hozzáadott nátrium-dezoxikolát segítségével intravénás használatra alkalmas kolloidális diszperziót tud képezni. A 1 mg/ml-s amphotericin B törzsoldatot desztillált vízzel mindig a kísérletek előtt közvetlenül készítettem el. A flukonazolt Mycosyst® 2 mg/ml infúzióhoz való oldat (Richter-Gedeon Nyrt., Budapest, Magyarország) formájában használtam.
Mannich-ketonok A kísérleteim során használt Mannich-ketonokat témavezetőm, Dr. Lóránd Tamás szintetizálta a PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézetében. A mérésekhez szükséges mennyiségű, por formájú szereket a felhasználásig -20 °C-on tároltuk, ezeket közvetlen az alkalmazásuk előtt oldottam adott mennyiségű steril desztillált vízben. Az antimikotikum-érzékenységi sejt-chip vizsgálatok során néhány telítetlen Mannichketont is teszteltem, ezeket az anyagokat az 1. táblázat mutatja.
Vegyület
n
Ar
R
C. albicans MIC (µg/ml)
1
1
4’ -OCH3-C6H4
4-morfolil
3,125
2
1
2’-OCH3-C6H4
1-piperidil
6,25
3
3
fenil
1-piperidil
50
1. táblázat – Chip alapú áramlási citometriás kísérletek során tesztelt telítetlen vázas Mannich-ketonok 42
Egy rokon vegyületcsoport, a kondenzált vázas Mannich-ketonok Candida albicans fehérjeprofiljára gyakorolt hatását vizsgáltam. A kondenzált vázas Mannichketonok szintézisének vázlatát a 38. ábrán mutatom be. Kiindulási anyagként a megfelelő biciklusos ketont, szekunder amint és paraformaldehidet használva etanolos-vizes közegben klasszikus sav-katalizált Mannich-reakcióval kaptuk a kívánt termékeket. A Mannich-ketonok hidroklorid formában izolálhatók, így is használtam ezeket.
+ O
H2+ ClN
+
CH2
CH2O O
(CH2)n
NH+ Cl(CH2)n
n = 1, 2
38. ábra - Kondenzált Mannich-ketonok szintézisének általános egyenlete
A 2. táblázat sorolja fel a fehérje-vizsgálatok során általam tesztelt, kondenzált vázas Mannich-ketonokat, néhány főbb jellemzőjükkel. Ezekhez a vizsgálatokhoz az előkészített
gomba-szuszpenziókat
a
kísérleti
anyag
0,5xMIC
koncentrációival kezeltük 1 órán át (30 °C, 200 rpm rázótermosztátban).
43
illetve
2xMIC
Vegyület
n
R1
R2
C. albicans MIC (µg/ml)
4
1
H
1-piperidil
3,125
5
1
H
1-pirrolidil
0,8
6
1
5-OCH3
1-piperidil
3,125
7
2
H
1-piperidil
12,5
8
2
H
1-pirrolidil
12,5
9
2
H
4-morfolil
3,125 6,25
10
2
H
2-(1,2,3,4tetrahidro)izokinolil
11
2
5-OCH3
1-piperidil
12,5
12
2
6-OCH3
1-pirrolidil
100
13
2
6-OCH3
4-morfolil
25
14
2
6-OC3H7
4-morfolil
25
15
2
7-OCH3
1-piperidil
6,25
16
2
7-OCH3
4-morfolil
12,5
17
3
H
1-piperidil
6,25
3
H
4-morfolil
12,5
18
2. táblázat – Fehérje-vizsgálatok során tesztelt, kondenzált vázas Mannich-vegyületek
44
5.4. Áramlási citometria és mikrofludikai áramlási citometria (sejt-chip) 5.4.1. Candida minták előkészítése áramlási citometriás és sejt-chip vizsgálatokhoz A szükséges gombatörzseket RPMI 1640 tápfolyadékban (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) tenyésztettem. Ehhez az ionmentes vízben feloldott RPMI 1640 pH-ját MOPS-val (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Germany) 7,1-re állítottuk be és membrán szűrőn (Millipore Millex-GP Filter Unit, Millipore Corporation, Bedford, MA USA, 0.22 µm pórus méret) sterilre szűrtük. A gombatörzseket ebben a tápfolyadékban szuszpendáltam, majd 2 órán át 30 °C-on inkubáltam, míg a sejtszuszpenziók optikai denzitása 600 nm-en A=0.4-t (UV-VIS fotometer, Perkin-Elmer GmbH, Überlingen, Germany) elérte. Az antimikotikumokból felező hígítási sort készítettem, ez egy olyan hígítási sor, ahol az antimikotikum koncentráció a csősorozat minden tagjánál az előző koncentráció fele. Amphotericin B esetén az első csőben az antimikotikum koncentrációja 10 µg/ml volt, flukonazol esetén a 64 µg/ml-es koncentrációtól indult a hígítási sor. A kiindulási koncentrációkat a Candida törzsek MIC értékei alapján tervezett előzetes vizsgálatokkal határoztem meg. Az előkészített gomba-szuszpenzióból 10 µl-t adtam mindegyik csőhöz. A hígítási sor mellett kontrol csöveket is készítettem, a pozitív kontrol cső nem tartalmazott antimikotikumot, míg a negatív kontrol cső nem tartalmazott sem antimikotikumot, sem gombát. A csöveket 30 °C-on 24 órán át inkubáltam, a Candida sejtek növekedését vizuálisan ellenőriztem. Minden csőből 10 µl-t Sabouraud agar lemezekre oltottam ki, majd megfelelő inkubáció (30 °C, 48 h) után a telepképző egységek számát (CFU) leolvastam. A minimális gátló koncentráció (MIC) értékét úgy határoztam meg, mint az antimikotikum azon legkisebb koncentrációja, mely képes meggátolni a gomba sejtek növekedését. A vizsgálatokat mindig legalább háromszor ismételtem.
5.4.2.
Áramlási citometria
Az áramlási citometriás mérésekhez a fentebb leírt módon előkészített, inkubált hígítási sorokat használtam. Minden egyes csőből 350 µl-t gőzsterilizálóba tettem, 100 °Cra, 1 órán keresztül. Ezeket a hőkezelt mintákat és az eredeti szuszpenziókból 350 µl-ket megfelelő fluoreszcens festékkel festettem. Propidium-jodid (PI) festéshez a mintákat Eppendorf-centrifugában centrifugáltam, majd az eredeti térfogattal egyező mennyiségű PI oldatba vettem fel. Sytox Green, illetve Syto 60 festékből 0,5 µl-t adtam mindegyik 45
mintához, majd ezeket 30 percig 30 °C-on inkubáltam. Az így előkészített mintákból 100 µl-t használtam fel az áramlási citometriás vizsgálatokhoz. A festékek tesztelése során különböző koncentrációban próbáltam ki ezeket. Úgy találtam, hogy 0,1 - 0,2 % -os töménységben alkalmazva is hatékonyan jelölnek, ezért használtam a fenti mennyiségeket. Kísérleteimhez a Becton Dickinson FACS Calibur áramlási citométerét használtam (Becton Dickinson, Fraklin Lakes, NJ, USA). A készülék egy 15 mW (488 nm) argonion lézerrel és egy vörös dióda lézerrel (~635 nm) is fel van szerelve. Az adatgyűjtés log/log módban történt, a fluoreszcencia intenzitás mellett az előre, ill. oldalra irányuló fényszórást detektáltam (FSC ill. SSC). Küszöb paraméternek (trigger signal) az FSC -t használtam, a detektálási küszöb érték 52 volt, E = 650 – nél. A Sytox Green-nel jelölt sejteket FL1 tartományban (530/30 nm), a propidiumjodiddal jelölt sejteket FL2 (585/30 nm), míg a Syto 60-val jelölteket FL3 tartományban (661/30 nm) detektáltam. A mérésekhez és a kiértékeléshez a készülékhez elérhető Cell QuestPro szoftvert használtam. 5.4.3. Sejt-chip – chip-alapú citometriás módszer Az Agilent 2100 Bioanalyzer lab-on-a-chip rendszerét használtam chip-alapú áramlási citometriás (továbbiakban sejt-chip). Ebben a rendszerben a chipen 25 x 75 µm-es csatornákban zajlik a mérés, a sejteket vákuum segítségével áramoltatva. A folyadékáramlást perisztaltikus pumpa vezérli, a vákuum 0-140 mbar közti, nyomás szenzorral pontosan szabályozható. Ez biztosítja a rendszerben a stabil folyadékáramlást, a chip és a nyomást kontrolálló egység egy speciális feltéten keresztül kapcsolódik. A készülékbe egy kék LED és egy vörös lézer van beépítve, így fluoreszcens detektálásra képes két tartományban. A mérésekhez a sejteket pufferben szuszpendáljuk, a mérés előtt a chip kapillárisait egy vizes oldattal, míg az egyik csatornát egy fluoreszcens festékkel töltjük fel, a mérés során ez szolgál referenciaként az optikai rendszer számára. A rendszer 2x106 sejt/ml-es koncentrációig ideális. Tehát a sejt-chipes mérések az áramlási citometria elvén alapulnak, de mivel itt csak fluoreszcens jeleket detektálhatunk, így csak festett sejtek vizsgálhatók. A vörös lézer gerjesztési maximuma 630 nm körül van, a detektálási maximum 680 nm, míg a kék LED gerjesztési/detektálási maximuma ~470/525 nm. Ezek alapján chipes vizsgálatokhoz a propidium-jodid nem használható, így itt a másik két festékkel dolgoztam. Az áramlási citometriás méréshez előkészített, festett minták másik részét mértem sejt-chipen.
46
A chip előkészítését a felhasználási kézikönyv alapján végeztem, azaz: a chip felszínén található megfelelő helyre (39. ábra) 10 µl feltöltő oldatot vittem fel, amivel feltöltöttem folyadékkal a chip kapillárisait. 60 másodperc elteltével 10 µl fókuszáló festéket, majd 30-30 µl sejtpuffert pipettáztam a megfelelő oldatfelviteli helyekre. A sejtszuszpenziókból 200-200 µl-t 10 percig 10.000 rpm sebességgel centrifugáltam. A felülúszót leszívtam, majd az üledéket, azaz a gombasejteket, azonos térfogatú (200 µl) sejtpufferbe felvettem és óvatos vortexeléssel reszuszpendáltam. A mintákból 10-10 µl-t késedelem nélkül betöltöttem a már előkészített chip megfelelő mintahelyeire. Az így betöltött chipet az Agilent 2100 Bioanalyzer készülékbe helyeztem, és azonnal elindítottam a mérést. Egy chipen hat mintát mérhetünk meg, a mérés ideje körülbelül 20 perc. A méréshez a készülékkel elérhető Agilent 2100 Expert szoftver Antibody Staining® ill. Generic® programját használtam. A kiértékelést szintén a 2100 Expert program segítségével végeztem.
PS – Feltöltő oldat (Priming Solution) FD – Fókuszáló festék (Focusing Dye) CB – Sejt puffer (Cell Buffer) 1-6 – minta helyek 39. ábra - Sejt-chip [4]
5.5. Fehérjeösszetétel-vizsgálatok
5.5.1.
Mintaelőkészítés
Ezekhez a vizsgálatokhoz Candida albicans ATCC 90028 törzset használtam. Mivel a fehérje-összetétel változásának vizsgálatához nagyobb mennyiségű gombára volt szükségem, így itt az alábbi módszerrel készítettem elő a mintákat: 2 l Mueller-Hinton Broth (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hants, England) húsleves táptalajt 5 egyenlő részre osztottam steril 1l-es infúziós üvegekbe. A táptalajokat ezt követően 47
legalább 1 órára (100C°) gőzsterilizálóba tettem. Kihűlés után a táptalajokhoz 20-20 ml 50 % -os frissen készített, mikrohullámú készülékben 800W-on 5 percig kezelt, steril glukóz oldatot adtam. Az 5-5 ml steril tápfolyadékban szuszpendált gombasejteket 30 °C-on 2 órán át inkubáltam, míg azok optikai sűrűsége az hozzáadtam
a
glukózos
bouillon
A = 0,4 (600 nm) értéket elérte, majd
tápfolyadékhoz.
A
tenyészeteket
30
°C-ra
rázótermosztátba tettem. 24 óra elteltével a gombaszuszpenziók koncentrációját ellenőriztem, szükség esetén steril tápoldattal beállítottam A= 0,4 (600 nm) értékre. A szuszpenziókból 10 µl mintát kioltottam Sabouraud agar táptalajra, ezzel ellenőrizve a CFU számot, és hogy nem fertőződött-e be a tenyészet. Steril infúziós üvegekbe osztottam szét a Candida albicans tenyészeteket, majd kezeltem a kiválasztott antifungális szerrel. Az antimikotikumokat 0,5xMIC és 2xMIC koncentrációban használtam, 1 órás kezelési idővel, 30 °C-on, rázótermosztátban. Antimikotikumot nem tartalmazó kontrol mintát minden esetben készítettem. Az inkubációt követően a szuszpenziókat lecentrifugáltam. A felülúszót eldobva a gomba sejteket fiziológiás só oldattal reszuszpendáltam, majd újra lecentrifugáltam. Ezt a mosási lépést még egyszer ismételtem. Az így nyert, kezelt és kezeletlen, mosott C. albicans sejteket steril üvegekben lefagyasztottam (minimum 1 éjszakán át) és további felhasználásig -20 °C-on tároltam. A Candida sejtek fehérje összetételének vizsgálatához első lépésben ki kellett nyerni a fehérjéket az előzetesen kezelt, fagyasztva tárolt gombasejtekből. Erre a szakirodalomban több módszer található, mely ultrahanggal, üveggyöngyök segítségével vagy extrakciós pufferrel oldja meg a gombasejtek feltörését [Al-Rawi és Kavanagh 1998, Lim és mtsai. 2008]. Mivel az ultrahangos módszer előzetes kísérletek során nekünk nem működött megfelelő hatásfokkal, más módszert választottam. A fagyasztott gombasejtekből 2 grammnyit dörzsmozsárba mértem, kevés folyékony nitrogénnel összetörtem, 2 ml extrakciós puffert mértem minden mintára, majd jégen 45 percig inkubáltam ezeket. Az extrakciós puffer összetétele: 0,37 M tris-HCl (pH=7,5), 1mM EDTA, 5mM 2-merkapto-etanol, 1% Triton X-100, melyhez közvetlen felhasználás előtt adtam még 1mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF; M=174,19 g/mol). Inkubálás után a fel nem tört sejteket centrifugálással eltávolítottam, a kinyert fehérjéket tartalmazó felülúszót vizsgáltam tovább.
48
5.5.2.
Chip-alapú elektroforézis
Méréseimhez itt is az Agilent 2100 Bioanalyzer rendszerét használtam, a Protein 80 ill. Protein 230 reagens készletekkel. A rendszer működése a kapilláris gélelektroforézis elvén alapul. A 10 µm mély és 50 µm széles kapillárisok egy üveg chipbe vannak maratva. Az előkészítés első lépéseként ezeket a kapillárisokat nyomás alkalmazásával egy polimer oldattal töltjük fel. A polimer oldat egy nem keresztkötött poliakrilamid származék, mely lecsökkenti az elektroozmootikus áramlást (EOF-t), ezért használhatunk nem bevont kapillárisokat. A polimer oldathoz előzetesen hozzáadunk egy fluoreszcens festéket, ez fogja majd jelölni a mintában található fehérjéket, tehát a jelölés a chipen történik. A mérés során használunk még egy un. festékmentesítő (destaining) oldatot is, ez valójában festék-mentes polimer oldat, mely a detektálás előtt kihigítja a mintát. A mérés előtt a fehérje-mintákhoz denaturáló oldatot adunk, ez egy nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) is tartalmazó gyári puffer oldat, melyhez még merkaptoetanolt (én ezt használtam) vagy ditiotreitet (DTT) adunk redukálószerként. A denaturáló oldat ezeken kívül tartalmaz egy standard fehérjét, ezt belső standardként használjuk a kiértékelés során, ez lesz a felső marker, alsó markernek az SDS-festék-komplex jelét használja a program. Külső standardként egy fehérjesorozatot használunk (ez is a reagenskészlet része), mely az alsó és felső markeren kívül 6, ill. 7 fehérjét tartalmaz. Ezek mérete a Protein 80as készletnél: 3,5; 6,5; 15; 28; 46; 63 kDa, a Protein 230-as változatnál: 7; 15; 28; 46; 63; 95; 150 kDa. A felső marker 90 ill. 240 kDa. Ezeket a sorozatokat hívják gélképük alapján „létrának” is. Közvetlen mérés előtt a vizsgált minták 4 µl-éhez 2 µl denaturáló oldatot adtam, és 5 percig 100 °C-os termosztátba tettem az Eppendorf-csöveket. Kihűlés és néhány másodperces centrifugálás után a létrát és a mintákat hígítottam 84 µl ill. híg minták esetén 14 µl ionmentes desztillált vízzel. A chipet a gyári leírásnak megfelelően feltöltöttem a polimer oldattal, majd a megfelelő minta-felvivő helyekre felvittem a segédoldatokat és a mintákat (lásd 40. ábra), és haladéktalanul elindítottam a mérést. Minden wellbe egy-egy elektród merül, a minták injektálása feszültség hatására történik, az elválasztás a szeparáló csatornában megy végbe. A detektálási pont előtt történik az SDS kihígítása, ennek következtében csökken a háttérzaj és egy nagyságrenddel megnő a minta csúcsmagassága. A detektálás lézer indukált fluoreszcens detektorral történik. Egy chipen 10 minta futtatható, a mérés 49
időigénye 25 perc, az alkalmazott programtól függően 5-80, illetve 15-230 kDa méretű fehérjéket választhatunk el.
G – polimer oldat DS – festékmentesítő oldat 1-10 - minták létra – külső standard-sor
40. ábra - Protein chip vázlatos felépítése [4].
A fehérjemintákat hagyományos akrilamid gélelektroforézissel is elválasztottuk. A gélekből a PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézetében tömegspektrometriás vizsgálatokat végeztünk, azaz: a gélelektroforézist követően a fehérjéket tartalmazó gél-darabkákat kivágtuk és NH4HCO3 puffer jelenlétében 5 ng/µl koncentrációjú tripszin-oldattal megemésztettük. A fehérjék triptikus emésztményének 1–1 µl-ét Bruker rozsdamentes acél mintatartó tálcára cseppentettük. A vizsgálatok során mátrixként α–ciano–4–hidroxi–fahéjsav (CHCA) telített 0,1%-os trifluor-ecetsav (TFA) – acetonitril (2/1 V/V) oldatát alkalmaztuk. A minták beszáradása után az elemzéseket Bruker Autoflex II típusú MALDI TOF/TOF tömegspektrométerrel reflektordetektálási módban végeztük el. Az ionizáláshoz 337 nm-es nitrogén lézert alkalmaztunk, a vizsgálatok során 1000 lövés tömegspektrumát összesítettük, a lézer frekvenciája 50 Hz volt. A tömegspektrumokat pozitív ionizációs módban 800 és 5000 m/z tartományban regisztráltuk a gyorsító feszültség 20,0 kV, a késleltetési idő 120 ns volt. A fehérjék azonosítása PMF és MS/MS adatbázis kereséssel történt, amely során Mascot 2.2 kereső szoftvert és NCBInr, Swissprot és MSDB adatbázisokat használtunk.
50
6. EREDMÉNYEK
6.1.
Áramlási citometria és sejt chip
Az áramlási citometriát régóta használják élesztő gombák, Candida törzsek vizsgálatára. A sejt-chip rendszerrel azonban kevés gomba-vizsgálatot végeztek eddig. Kísérleteim során áramlási citometriás eredményekből kiindulva terveztem meg a chipes vizsgálatokat, ezért az eredményeket is így mutatom be.
6.1.1.
Candida sejtek detektálása, élő és elölt sejtek megkülönböztetése
Az élő és elölt gombasejtek megkülönböztetésére propidum-jodid (PI), Sytox Green és Syto 60 nukleinsav-festékeket használtam. A PI, illetve a Sytox Green festék az elölt sejteket jelölik, mivel az élő sejtek membránján nem jutnak át. A Syto 60 az élő és elölt sejteket is megfesti. A 41. ábra antimikotikummal nem kezelt, élő és hővel elölt Candida albicans minták áramlási citometriás elemzéssel nyert képét mutatja. Ezen a különböző tartományban detektált fluoreszcenciát az oldalirányú szórás (SSC) függvényében ábrázolom, az ábrán egy pont egy sejtet jelöl. Az egyes ábrákon látható régiókat a megfelelő kontrol-minták eredményei alapján jelöltem ki. A 41. a, c élő, míg a b,d ábra hővel elölt minták eredményeit mutatja, Sytox Green (a,b), illetve Syto 60 (c,d) festékkel jelölve. Sytox Green festés mellett az élő sejtek a jobb alsó kvadrátban (41. ábra: a), míg az elpuszult sejtek a jobbfelső kvadrátba találhatók (41. ábra: b). Az esetleges sejttörmelékek a bal alsó tartományban jelennek meg. Sytox Green és PI (az eredményeket nem ábrázoltam) festéssel az élő és elölt sejtek egyértelműen elkülöníthetők. A Syto 60 permeábilis nukleinsav festék, így az élő (41. c) és elölt (41. d) sejteket egyformán jelöli. Az élő és elölt C. albicans mintákat sejt-chipen is megmértem, a készülékkel kompatibilis Sytox Green és Syto 60 fluoreszcens festékeket használva. Az eredményeket a 42. és 43. ábrán jelenítem meg, „dot plot”, illetve hisztogram-ábrázolásban. A dot plot (42. ábra) a két fluoreszcens tartományt jeleníti meg, az ábrán egy pont egy detektált eseményt, azaz egy sejtet jelöl. Ezeket az eseményeket mutatja a hisztogram (43.ábra) is, a fluoreszcencia (kék vagy vörös tartományú) függvényében
51
41. ábra – Candida albicans áramlási citometriás képe. Az a, c élő, míg a b,d ábra hővel elölt sejteket mutat, Sytox Green (a,b) és Syto 60 (c,d) festékkel jelölve, a különböző tartományban detektált fluoreszcenciát az SSC függvényében ábrázolva.
52
42. ábra – Candida albicans sejt-chip vizsgálatokkal nyert eredményei, a mért fluoreszcenciát dot plot ábrán bemutatva. Az a, c ábra élő, a b, d ábra hővel elölt sejteket mutat, Sytox Green (a,b) illetve Syto 60 (c,d) festéssel jelölve.
53
A 42. a, c ábra élő, a b, d ábra hővel elölt sejteket mutat, Sytox Green (a,b) illetve Syto 60 (c,d) festéssel jelölve. Az elölt sejtek Sytox Grenn-nel festve a készülék „kék” fluoreszcens detektálási régiójában (525+/-30 nm) észlelhetők. A Syto 60-nal jelölt, élő és elölt sejtek a vörös régióban láthatók (680+/-30 nm). A 43. a hisztogram élő, míg a b elölt, Sytox Green-nel jelölt sejteket ábrázol, az észlelt események (sejtek) számát a fluoreszcencia függvényében mutatva. Az élő és elölt sejtek egyértelműen elkülöníthetők a mért fluoreszcencia-értékek alapján.
43. ábra – Candida albicans sejt-chip vizsgálati eredményei, Sytox Green festéssel. Az a hisztogram élő, míg a b elölt sejteket ábrázol, az észlelt események (sejtek) számát a fluoreszcencia függvényében mutatva. 54
6.1.2.
Candida törzsek megkülönböztetése
Az általam vizsgált Candida albicans, C. tropicalis, C.krusei és C. glabrata törzsek sejtjeinek a mérete, felépítése meglehetősen hasonló, így áramlási citometriásan is hasonló képet mutatnak. A 44. ábra ezen törzsek hagyományos áramlási citometriával nyert képét mutatja, az előre és oldalra irányuló szórást (FSC/SSC) ábrázolva. Az ábrán a gombasejtek a körülkerített régióban jelennek meg.
44. ábra - C. albicans (a), C. tropicalis (b), C. krusei (c) és C. glabrata (d) törzsek áramlási citometriás képe, az előre ill. oldalra mutató fényszórás értékeket (FSC, ill. SSC) ábrázolva. 55
45. ábra - Különböző Candida törzsek sejt-chip vizsgálattal nyert képe, a hisztogram a fluoreszcencia függvényében mutatja az észlelt események (sejtek) számát. Az ábra a C. tropicalis (a), C. krusei (b) és C. glabrata (c) kontrol sejteket mutatja, Sytox Green festést követően. Az ábrákon az 1. görbék az élő, a 2. görbék a hővel elölt sejteket jelzik. 56
A különböző Candida törzseket a sejt-chip rendszerben is megmértem, a Sytox Green festést követő a eredményeket a 45. ábrán prezentálom. A 45. a ábra a C. tropicalis, a 45. b a C. krusei, míg a 45. c a C. glabrata élő (1.görbe) és elölt (2. görbe) kontrol sejteket mutatja. Bár a különböző törzsek egymástól nem voltak elkülöníthetők, az élő és elölt sejtek megkülönböztetése minden esetben egyértelmű volt.
6.1.3.
Antimikotikum-érzékenység vizsgálatok
6.1.3.1.
Klasszikus antifungális szerek
Az élő/elölt sejtek megkülönböztetésére alapozva terveztem meg a Candidák antimikotikum-érzékenységének vizsgálatát. Elsőként a C. albicans törzs amphotericin B- és flukonazol-érzékenységet vizsgáltam. Ezekhez a vizsgálatokhoz fluoreszcens jelölőként Sytox Green festéket használtam, a továbbiakban, ha külön nem jelölöm, Sytox Green-nel festett sejtekről beszélek. A 46. és 47. ábrán C. albicans sejtek antimikotikum-hígítási sorainak áramlási citometriás eredményeit jelenítem meg. Ahogy korábban említettem a hígítási sorok egyes csöveiből vett minták egyik részét közvetlen festés után mértem. A minták másik részét a festés előtt hőkezelésnek vetettem alá, majd így vizsgáltam tovább. A 46. ábrán az amphotericin B hígítási sor hőkezelt mintáinak eredményeit mutatom be a fluoreszcenciát az oldalirányú szórás függvényében megjelenítve. Az amphotericin B koncentráció a 46. a ábrán 0.625 µg/ml, a b ábrán 0.312 µg/ml, míg c ábránál 0.156 µg/ml. A 47. ábra a flukonazol kezelt minták áramlási citometriás eredményeit mutatja, itt szintén a hőkezelt minták diagramjait láthatjuk. A flukonazol koncentrációja a 47. a ábrán 1 µg/ml, a b ábrán 0.5 µg/ml, míg a c ábránál 0.25 µg/ml. A 48. és 49. ábrákon a párhuzamos sejt-chip vizsgálatok eredményeit mutatjuk be. Itt is a hőkezelt minták eredményeit látjuk, Sytox Green festést követően, de az Agilent Bioanalyzer chipes áramlási rendszerén mérve. A 48. ábra az amphotericin B-vel kezelt minták sejt-chipes eredményeit demonstrálja, az amphotericin B koncentrációja: a - 0.625 µg/ml, b - 0.312 µg/ml, c - 0.156 µg/ml. A 49. ábra a flukonazollal kezelt minták eredményeit mutatja, a flukonazol koncentrációja: a - 1µg/ml, b - 0.5 µg/ml, c - 0.25 µg/ml.
57
46. ábra – C. albicans amphotericin B hígítási sor áramlási citometriás képe, Sytox Green festéssel, hőkezelt minták, a fluoreszcenciát az SSC függvényében megjelenítve. Az amphotericin B koncentráció az a ábrán 0.625 µg/ml, b ábrán 0.312 µg/ml, míg c ábránál 0.156 µg/ml. 58
47. ábra – C. albicans flukonazol-hígítási sor áramlási citometriás képe, Sytox Green festéssel, hőkezelt minták, a fluoreszcenciát SSC függvényében megjelenítve. A flukonazol koncentráció az a ábrán 1 µg/ml, b ábrán 0,5 µg/ml, míg c ábránál 0,25 µg/ml. 59
48. ábra – C. albicans amphotericin B-hígítási sor sejtchip eredményei, hőkezelt minták, Sytox Green jelöléssel. Az amphotericin B koncentrációja: a 0.625 µg/ml, b 0.312 µg/ml, c 0.156 µg/ml.
49. ábra – C. albicans flukonazol-hígítási sor sejtchip eredményei, hőkezelt minták, Sytox Green jelöléssel. A flukonazol koncentrációja a 1µg/ml, b 0.5 µg/ml, c 0.25 µg/ml.
60
Non-albicans Candida törzsek amphotericin B- és flukonazol-érzékenységi vizsgálatát is elvégeztem. Az áramlási citometriás és sejt-chip vizsgálatokat mindenben a C. albicans törzsnél alkalmazott módon végeztem, a hígítási sorok kiindulási koncentrációját előzetes MIC meghatározások alapján állapítottam meg. Az áramlási citometriával sikerült mindhárom törzsnél meghatározni a MIC értéket (ld. 3. táblázat) amphotericin B esetében. Flukonazolra, az előzetes várakozásainknak megfelelően, gyakorlatilag nem voltak érzékenyek ezek a törzsek. A non-albicans Candida törzsek áramlási citometriás eredményeit az 50. ábrán demonstrálom, a C. glabrata amphotericin B-hígítási sorának különböző koncentrációjú, hőkezelt mintáinak bemutatásával. Az amphotericin B koncentrációja az 50. a ábrán 1, 25 µg/ml, a b ábrán 0,625 µg/ml, míg a c ábrán 0,312 µg/ml. Ezt követően a mikrofluidikai módszert teszteltem ugyan erre a célra. Az 51. ábrán a 3 különböző Candida törzs amphotericin B érzékenységi vizsgálatának sejt-chip eredményét mutatom be. Az 51. a ábra C. tropicalis, a b ábra C. krusei, míg a c ábra C. glabrata eredményeit demonstrálja. Az 51. ábra is hőkezelt, Sytox Green-nel festett minták eredményeit mutatja be. Az amphotericin B koncentrációja az ábrákon szereplő számozott görbéknél részletesen: -
C. tropicalis (a): 1. 0,312 µg/ml; 2. 0,156 µg/ml; 3. 0,078 µg/ml
-
C. krusei (b): 1. 0,312 µg/ml; 2. 0,156 µg/ml; 3. 0,078 µg/ml
-
C. glabrata (c): 1. 1,25 µg/ml; 2. 0,625 µg/ml; 3. 0, 312 µg/ml.
A flukonazol-érzékenység vizsgálatok során itt is egyértelműen kiderült, hogy ez a szer nem hatásos ezen törzsek ellen. A gombasejtek a kontrolhoz hasonló eredményeket adtak, mindegyik mintában sok, erősen fluoreszkáló eseményt mértem (az adatokat nem mutatom be külön).
61
50. ábra – C. glabrata amphotericin B-hígítási sor áramlási citometriás képe, Sytox Green festéssel, hőkezelt minták, a fluoreszcenciát SSC függvényében megjelenítve. Az amphotericin B koncentráció az a ábrán 1,25 µg/ml, b ábrán 0,625 µg/ml, míg c ábránál 0,312 µg/ml.
62
51. ábra – C. tropicalis (a), C. krusei (b), C. glabrata (c) amphotericin B-hígítási sorának sejt-chip vizsgálati eredményei (hőkezelt minták, Sytox Green jelöléssel). Az amphotericin B koncentrációja: a és b ábra: 1. 0,312 µg/ml; 2. 0,156 µg/ml; 3. 0,078 µg/ml. c ábra: 1. 1,25 µg/ml; 2. 0,625 µg/ml; 3. 0,312 µg/ml. 63
A különböző Candida törzsek 3 módszerrel meghatározott MIC értékeit (µg/ml) a 3. táblázatban foglalom össze.
Amphotericin B Csőhígítás FC Sejt-chip
Flukonazol Csőhígítás FC Sejt-chip
0,312
0,3120,625
0,3120,625
1
1
0.5
C. glabrata ATCC 90030
0,625
0,625
0,625
>64
>64
>32
C. krusei ATCC 30068
0,312
0,312
0,156
>64
>64
>64
C. tropicalis ATCC 90874
0,156
0,156
0,156
>64
>64
>64
C. albicans ATCC 90028
3. táblázat - Különböző Candida törzsek csőhígítással, áramlási citometriával és sejt-chip módszerrel meghatározott MIC értékei (µg/ml).
64
6.1.3.2. Mannich-ketonok Néhány, előzetesen gombaellenes hatást mutató telítetlen Mannich-keton sejtchipes antimikotikum-érzékenységi vizsgálatát is megkíséreltem, a vizsgált anyagokat a 1. táblázat mutatja. Ezeknél a vizsgálatoknál párhuzamosan Sytox Green és Syto festést is használtam a C. albicans sejtek jelölésére, a többi vizsgálati körülmény megegyezett az eddigiekkel. A két festékes vizsgálat, ezen belül is az 1 vegyület eredményeit az 52. ábrán demonstrálom. Az 52. a ábra Syto 60, míg a b ábra Sytox Green festést követően ábrázolja a mintákat. Az 1 vegyület koncentrációja az egyes görbéknél: 1. 3,125 µg/ml, 2. 1,56 µg/ml, 3. 0,78 µg/ml. A vizsgált telítetlen Mannich-ketonok sejt-chip vizsgálattal, és csőhígítással meghatározott MIC értékeit, az irodalmi adatokkal [*Kocsis és mtsai. 2009] összevetve a 4. táblázatban mutatjuk be.
Vegyület
Irodalmi adat (µg/ml)*
Csőhígítás (µg/ml)
Sejt-chip (µg/ml)
1
3,125
3,125
3,125
2
6,25
6,25
6,25
3
50
100
100
4. táblázat – Telítetlen Mannich-vegyületek különböző módszerekkel meghatározott MIC értékei C. albicans ATCC 90028 törzsre. *[Kocsis és mtsai. 2009]
65
1
52. ábra – 1 Mannich-keton MIC meghatározása C. albicansra sejt-chippel, Syto 60 (a ábra) és Sytox Green (b) festéssel. Az 1 vegyület koncentrációja: 1. 3,125 µg/ml, 2. 1,56 µg/ml, 3. 0,78 µg/ml.
66
6.2. Mannich-ketonok hatásának vizsgálata Candida albicans fehérje-profiljára
Méréseim során az 2. táblázatban felsorolt 15 kondenzált vázas Mannich-keton hatását vizsgáltam
C.
albicans
fehérje-profiljára.
A
Mannich-ketonokat
két
különböző
koncentrációban alkalmaztam, 1 órás kezelési idővel. Párhuzamosan minden anyaghoz készítettem antimikotikum-mentes kontrolt. A tenyésztést, kezelést és a méréseket többször ismételtem. A fehérje mintákat, a szokványos poliakrilamid-gélelektroforézis mellett, a kapilláris gélelektroforézis elvén működő chip-alapú rendszerrel teszteltem. Az elválasztás itt méret alapján történik, köszönhetően a felhasznált redukálószernek és az SDS-nek. A rendszerben fluoreszcens detektálást alkalmazunk, a kapott elektroferogramokon a fluoreszcenciát a migrációs idő függvényében ábrázoltam. Az eredmények kiértékelését a készülékhez elérhető 2100 Expert programmal végeztem. Az alkalmazott program segítségével a migrációs időből számítva a fehérjék méretét (kDa) közvetlen meghatározhatjuk. A méret meghatározást és a mérések összehasonlítását külső és belső standardok használata is segíti. A kvalitatív meghatározás mellett szemikvantitatív analízisre is alkalmas a mérés, ehhez a felső marker koncentrációját használja standardnak a program. A fehérje mintákat a Protein 230 és Protein 80 elválasztási protokollokkal vizsgáltam. Ezek olyan futtatási programok, melyekkel 15-230 kD, illetve 5-80 kDa mérettartományba eső fehérjéket választhatunk el. A vizsgált fehérjemintáknál jelentősebb változásokat a 30 - 90 kDa közötti régióban detektáltam, ezért a Protein 80 protokol szerint folytattam a további méréseket. Példaképp az 53. és 54. ábrán a 11 vegyülettel kezelt minta elektroferogramját mutatom be. A kontrol fehérje minta elektroferogramja zöld, a 0,5xMIC koncentrációval kezelt mintát kék, a 2xMIC mintát piros szín jelöli. A két marker belső, gyári standard (1,6 kDa és 95 kDa), meghatározzák a méret-tartományt, melyet vizsgálhatunk (53. ábra). A 54. ábrán ezen elektroferogram kinagyított részlete látható. Az ábrán jelöltem azon csúcsok számított molekulatömegét, melyekre valószínűleg hatást gyakorolt a vizsgált vegyület. Az 55. ábrán az 5, 13 és 15 Mannich-ketonok fehérje-chip méréssel nyert eredményeit mutatom be, kiemelve a régiót, ahol a fehérjemennyiség-változás jellemző. Az ábra a kontrol mintákat (kék színnel) és az adott Mannich-keton 2xMIC koncentrációjával kezelt minták eredményeit (piros szín) demonstrálja. 67
OCH3 *
O
N
53. ábra – C. albicans 11 Mannich-ketonnal kezelt minta elektroferogramja chip-alapú gélelektroforézissel mérve (a keretes rész nagyítva a 49.ábrán)
54. ábra - 11 Mannich-ketonnal kezelt minta elektroferogramjának részlete. Zöld szín: kontrol, kék: 0,5xMIC, piros: 2xMIC.
68
5
13
15
55. ábra – C.albicans fehérjevizsgálati eredményei. A kék elektroferogram a kontrol, míg a piros az 5, 13 ill. 15 Mannich-keton 2xMIC koncentrációjával kezelt minták eredményeit mutatja. 69
7. EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA
7.1.
Áramlási citometriás és sejt-chipes életképesség-vizsgálatok
Áramlási citometriás kísérleteim során Candida törzsek antimikoitkum-érzékenységének meghatározásával foglalkoztam. Elsőként hagyományos áramlási citometriás vizsgálatokat végeztem, irodalmi adatokra alapozva. Majd ezeket az eredményeket felhasználva a Candida törzsek vizsgálatára az áramlási citometria elvén alapuló chip-alapú rendszert (sejt-chip) próbáltam ki. Először egy standard C. albicans törzs élő, és hőkezeléssel elölt tenyészeteit vizsgáltam. Áramlási citometriával nem csak fluoreszcensen jelölt, hanem festetlen sejtek is vizsgálhatók. Fluoreszcens jelölők közül PI, Sytox Green és Syto 60 festéket használtam. A Syto 60 mind az élő, mind az elölt sejteket jelöli, így ezek elválasztására nem alkalmas, összsejtszám vizsgálatra használható. A PI és Sytox Green csak az elölt sejteket festi meg, mivel az élő sejt membránján nem jut át. Mindkét festékkel megkülönböztethetők voltak az élő, ill. elölt minták. A sejt-chipen csak fluoreszcens jeleket detektálunk, így itt csak festett sejtek vizsgálhatók. Az általam tesztelt festékek közül a PI nem kompatibilis a rendszerrel, ezért Syto 60 és Sytox Green festéket használtam a mérésekhez. A Syto 60 itt is az összes sejt jelölésére volt jó, Sytox Green festékkel sikerült elkülöníteni az élő, illetve az elölt gombasejteket. Ezt követően különböző Candida törzseket vizsgáltam azonos módon. Mindkét módszer esetében, az összes törzsnél egyértelműen elkülöníthetőek voltak az élő és elölt sejteket tartalmazó tenyészetek. Ugyanakkor a fentebb felsorolt festékekkel jelölve a különböző törzsek egyik módszerrel sem voltak megkülönböztethetők.
7.2. Áramlási citometriás és sejt-chipes antimikotikum-érzékenység meghatározás 7.2.1. Egy fluoreszcens festékes vizsgálatok Az antimikotikum-érzékenységi vizsgálatokat az élő/elölt sejtek megkülönböztetésére alapozva terveztem meg és végeztem el. Ezeknél a vizsgálatoknál a célom annak meghatározása volt, hogy egy adott törzs mennyire érzékeny az adott antimikotikumra. Ennek jellemzésére a MIC értéket használtam, mely az a legkisebb koncentrációja az antifungális szernek, mely képes gátolni a gomba növekedését.
70
A hagyományos áramlási citometriával különböző antibiotikumokra és antifungális szerekre is leírtak érzékenységi vizsgálatokat [Mason és mtsai. 1994, Wenisch és mtsai. 1997, 2001]. Ezeknél a MIC meghatározására többféle módszert ajánlanak, például: - definiálják úgy, mint az antimikotikumnak az a legalacsonyabb koncentrációja, mely 50%os emelkedést produkál az átlag fluoreszcencia értékben a kontrolhoz képest [Ramani és Chaturvedi 2000]. - más megközelítésben a MIC az antifungális szer azon koncentrációja, mely a sejtek szignifikáns (50%) elmozdulását okozza az élő sejtek régiójából vagy szignifikáns csökkenést okoz az 1 másodperc alatt mért sejtszámban [Mitchell és mtsai. 2005]. Jelen munkámban a MIC értéket az élő és elhalt sejtek arányából határoztam meg. Az
antimikotikum-érzékenységi
vizsgálatokhoz
Sytox
Green
festéket
használtam
fluoreszcens jelölőnek. Az antimikotikum-hígítási sor minden egyes koncentrációjánál a minta felét megfestettem, a minták másik felét festés előtt hőkezelésnek vetettem alá, majd mindegyik mintát azonos módon megmértem. Így meg tudtam határozni az eredeti mintákban levő elpusztult sejtek mennyiségét, a hővel kezelt mintákból pedig (mivel itt az összes gombasejtet elöltem) megkaptam az össz-sejtszámot az adott antimikotikum-koncentrációhoz. Az élő sejtek mennyisége ezek különbségéből számítható. Ez alapján MIC értéknek azt a koncentrációt határoztam meg, ahol az élő sejtek aránya szignifikánsan (min.50%) csökkent az antimikotikummal nem kezelt, pozitív kontrolhoz képest. Ezeket az eredményeket a 46. és 47. ábrákon szemléltettem. Az antimikotikum nagyobb koncentrációjánál a gombák növekedése akadályozott, a mintában viszonylag kevés sejt látható, azok nagy része nem élő. MIC alatti koncentrációnál a gombák növekedése nem akadályozott, a mintákban sok sejt található, ezek jó része élő sejt, Sytox Green festésnél ezért láthatók hőkezelés után. A MIC érték az a koncentráció, amelynél a váltás történik.
Az áramlási citometriás eredményekre alapozva a módszert a mikrofluidikai, chipes rendszerre is kiterjesztettem. Ezt korábban, ilyen célra nem használták. A sejt-chipes mérés előnye a minimális mintaigény, egyszerűség, automatizált mérés, mely egy diagnosztikai módszernél hasznos lehet. A MIC meghatározás az áramlási citometriás kiértékelésnek megfelelően történt.
71
A hagyományos és a mikrofludikai áramlási citometriával 4 különböző, nemzetközi standard Candida törzs amphotericin B-vel és flukonazollal szembeni érzékenységét vizsgáltam meg. A MIC értékeket minden esetben sikerült meghatározni, az így nyert eredmények jól korreláltak egymással és a standard csőhígításos módszer eredményeivel (ld. 3. táblázat). Az amphotericin B-, illetve a flukonazol-érzékenység vizsgálata során (48., ill. 49. ábra) a sejt-chipes vizsgálatok egy érdekes eredményt is szolgáltattak. Az amphotericin B magasabb koncentrációinál csupán néhány sejtet észleltem, alacsony fluoreszcenciával. A flukonazol esetében még a szer magas koncentrációi mellett is detektálhattam néhány fluoreszcens sejtet. Itt a MIC-et jelző váltás sem volt olyan éles, mint az amphotericin B esetében, bár a flukonazol-érzékenység is egyértelműen meghatározható volt. A különbség egyik lehetséges oka, hogy az amphotericin B fungicid szer, azaz elpusztítja a sejteket, míg a flukonazol fungisztatikus hatású, a gombasejtek növekedését gátolja.
7.2.2. Két fluoreszcens festékes vizsgálatok A két festékes atimikotikum-érzékenységi vizsgálatoknál Sytox Green mellett Syto 60 festést is használtam. Néhány, korábban antifungális hatást mutató telítetlen Mannich-keton érzékenységi vizsgálatát végeztem el. Ez a módszer mutatott némi előnyt az egy festék használatával szemben, de nem felelt meg teljesen a várakozásaimnak. A két festék használata leegyszerűsítette az előkészítés folyamatát, azaz a hőkezeléses lépést, az elölt kontrol készítés kivételével, el tudtuk hagyni. Sikerült észlelni a MIC értékeket, ezek az eredmények megfeleltek az irodalmi adat alapján vártnak, de a MIC érték pontos meghatározása ebben az esetben jóval nehezebb. Nem sikerült megvalósítani, hogy a sejteket egyszerre jelöljem a két festékkel, habár számos ilyen előzetes kísérletet végeztem. Ennek oka valószínűleg az, hogy mindkét festék a nukleinsavakhoz kapcsolódik, és a Sytox festéket részben leszorítja a hozzáadott Syto. Így minden mintát kettéosztottam és külön-külön mértem. A Syto festék használata miatt egy desztillált vizes mosási lépést is be kellett iktatni, hogy a háttérzajt csökkentsem. Ez növelte a módszer anyag és időigényét, ezzel együtt a költségeit is, ezért ezeket a vizsgálatokat nem folytattam tovább.
72
7.3.
Fehérje-vizsgálatok
A fehérje vizsgálatok során azt vizsgáltam milyen változást okoz 1 órás Mannich-keton kezelés a C. albicans fehérjeprofiljában. A Mannich-ketonokat 0,5xMIC és 2xMIC koncentrációkban alkalmaztam. Korábbi hasonló vizsgálatok kimutatták, hogy a telítetlen vázas Mannich-ketonok közt van, amely, hasonlóan a flukonazolhoz, jelentős változásokat képes indukálni [Kustos és mtsi. 2006]. Ezekre a vizsgálatokra alapozva én a kondenzált vázas Mannich-ketonok vizsgálatára fókuszáltam. A kondenzált Mannich-ketonok vizsgálata alapján kijelenthető, hogy egyes vegyületek hatással vannak a C. albicans fehérjéire. Változásnak értékeltem új fehérje-csúcs megjelenését az elektroferogramon, meglevő fehérje mennyiségének növekedését vagy csökkenését (a kontrolhoz képest min. 20 %). Az általam vizsgált 15 anyag közül 4: az 5, 11, 13, 15 anyagok okoztak értékelhető változást. Új fehérje megjelenését nem sikerült kimutatnom egyik mintánál se, a hatás adott fehérjék mennyiségének növekedésében jelentkezett, a 30-70 kDa közti tartományban. A számított
fehérjetömegek
azért
hozzávetőlegesek,
mivel
összetett
fehérje-mintákat
vizsgáltunk és az fehérjék elválasztása nem volt teljes, az elektroferogramon egy csúcsként jelentkező fehérje nem feltétlen jelent valóban egyetlen fehérjét. A fehérjék identifikálására MS vizsgálatokat végeztünk, melynek során egy- és kétdimenziós elektroforézis eredményeképp nyert gélekből is vettünk mintát. Egyelőre nem sikerült azonosítani a fehérjéket, sem új-fehérje megjelenését igazolni a kezelés hatására, további vizsgálatok szükségesek. Itt kell megemlítenem, hogy a chip-alapú elektroforézis-eredmények reprodukálhatósága sem volt minden esetben tökéletes. Ennek számos oka lehet, például, hogy az extrakció során kis mennyiségű mintát sikerült kinyerni, illetve az esetleges puffermaradványok is befolyásolhatják a mérést. A 15 vizsgált kondenzált Mannich-keton fenti eredményei alapján általános összefüggéseket a vegyületek szerkezete és a C. albicans fehérjéire gyakorolt hatás között nem tudtam levonni. Az eredményeim és a vegyületek logP értéke között professzor Prókai László (Department of Pharmacology & Neuroscience, University of North Texas, Health Science Center at Fort Worth, USA) által végzett QSAR számítások (atom-típuson alapuló elemzés [Ghose és mtsai.1988]) alapján úgy tűnik, hogy a fehérjeprofilra gyakorolt hatás szempontjából ideális logP érték 1,8-2,5 közt van, míg a túl lipofil (logP > 2,5) vegyületeink nincsenek hatással a fehérjeprofilra [Prókai L. nem publikált eredmények].
73
8. ÖSSZEFOGLALÁS
Kísérleteim során Candida sejtek áramlási citometriás antimikotikum-érzékenységi meghatározását valósítottam meg.
A vizsgálatban két klinikai gyakorlatban használt
antimikotikumot, egy fungicid és egy fungisztatikus hatású szert is bevontam. Az érzékenység-vizsgálatot Candida albicans és non-albicans törzseken teszteltem. Ezen eredményeket adaptáltam egy hasonló célra eddig nem használt, mikrofluidikai áramlási rendszerre. Így elsőként sikerült kifejlesztenem egy gyors, könnyen kivitelezhető chip-alapú
áramlási
citometriás
diagnosztikai
módszert
antimikotikum-érzékenység
meghatározására. Ezt követően a klasszikus antifungális szerek mellett egy érdekes, gombaellenes hatással is rendelkező vegyületcsalád, a Mannich-ketonok vizsgálatára koncentráltam. A kifejlesztett mikrofludikai módszer egy változatával meghatároztam néhány telítetlen Mannich-keton standard C. albicans törzs elleni hatékonyságát (MIC).
A Mannich-ketonok citotoxikus és
antimikrobiális hatása több tényezőre vezethető vissza. Elsődleges a célsejt tiol-csoportjainak alkilálása, emellett azonban más tényezők, mint a fehérje-szintézis gátlása és gombáknál az ergoszterin- és kitin-bioszintézis gátlása is fontos lehet. Ezek közül a mechanizmusok közül a fehérje-összetétel megváltoztatását választottam ki. Ennek monitorozására egy korszerű, chip-alapú gélelektroforézis technikát használtam. A mikrochip elektroforézis alkalmasnak bizonyult Candida albicans fehérjéinek elválasztására. Célom volt a C. albicans fehérjeprofiljában Mannich-keton kezelés hatására fellépő minőségi és mennyiségi változások megfigyelése; és ilyen értelmű szerkezet-hatás összefüggések felállítása. A Mannich-ketonok közül a kondenzált vázas vegyületek egy csoportját (15 vegyület) teszteltem. Megállapítottam, hogy a vegyületcsalád egyes tagjai az alkalmazott egy órás kezelési idő mellett is befolyásolták a fehérjeprofilt, a hatás egyes fehérjék mennyiségének növekedésében jelentkezett. Szerkezet-hatás összefüggések levonásához egyelőre nem sikerült elég eredményet gyűjtenem. Vizsgálataim alapján megállapítható, hogy a mikrofluidikai citometriás és elektroforézis rendszerek alkalmasak egyes élesztőgombák vizsgálatára. Kiterjedtebb mikrobiológiai felhasználásuk a jövőben várható.
74
9.
IRODALOMJEGYZÉK
MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK Az értekezés alapjául szolgáló publikációk Bouquet O, Kocsis B, Kilár F, Lóránd T, Kustos I.: Amphotericin B and fluconazole suscepitibility of Candida species determined by cell-chip technology. Mycoses 2012, 55 (3): e90-96.
IF: 1,278
Bouquet O, Kocsis B, Kilár F, Kustos I.: Application of chip-based flow cytometry for amphotericin B and fluconazole susceptibility testing on Candida strains. Methods in Molecular Biology 2013, 968: 149-154. Rossignol T, Kocsis B, Bouquet O, Kustos I, Kilár F, Nyul A, Jakus PB, Rajbhandari K, Prókai L, d’Enfert C, Lóránd T.: Antifungal activity of fused Mannich ketones triggers an oxidative stress response and is Cap1-dependent in Candida albicans. PLoS One 2013, 8(4): e62142.
IF: 3,73
Az értekezés témájában készült nem referált konferencia absztraktok Bouquet O, Kustos I, Kocsis B, Lóránd T, Kilár F.: Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry and cell-chip method. 7th International Symposium and Summer School on Bioanalysis, CEEPUS project. 10-15 June, 2007, Pécs, Hungary. Abstract Book, p.16. Bouquet O, Kustos I, Lórand T, Kilár F, Kocsis B.: Determination of amphotericin B susceptibility of Candida albicans by cell-chip method. ISAAC XXIV International Congress. 17-21 May, 2008. Budapest, Hungary. Abstract Book p.253.
75
Bouquet O, Kustos I, Lórand T, Kilár F, Kocsis B: Application of cell-chip method to rapid susceptibility testing. 9th International Symposium on Instrumental Analysis. 29 June – 2 July, 2008, Pécs, Hungary. Abstract Book p.55. Bouquet O, Kustos I, Kocsis B, Kilár F, Lórand T.: Effect of fused Mannich ketones on the protein profile of Candida albicans. The Fungal Cell, Annual Scientific Meeting of the British Mycological Society, 1-4 September, 2009, Dundee, UK. Abstract Book p.25. Bouquet O, Kustos I, Kocsis B, Kilár F, Lóránd T.: Examination of the protein profile of Candida albicans - effect of fused Mannich ketons. 6th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis. 5-8 November, 2009, Pécs, Hungary. Abstract Book p.41. Bouquet O.: Különböző antifungális vegyületek hatása Candida albicans fehérjeprofiljára. Biológus Doktoranduszok Konferenciája, Pécsi Akadémiai Bizottság Biológiai Tudományok Szakbizottságának rendezvénye, Pécs, 2009. november 12-13. előadás
76
FELHASZNÁLT IRODALMAK: Ádám É. Gyógyszerészi mikrobiológia; egyetemi tankönyv. Semmelweis kiadó, Budapest 2001. Al-Rawi N, Kavanagh K. A rapid method for the extraction of whole cell proteins from Candida species. J. Microbiol. Meth. 1998; 34: 107-112. Alshareef M, Metrakos N, Juarez-Perez E, Azer F, Yang F, Yang X Wang G. Separation of tumor cells with dielectrophoresis-based microfluidic chip. Biomicrofluidics. 2013; 7: 011803. Andresson H, van den Berg A. Microfluidic devices for cellomics: a review. Sensor. Actuat. B-Chem. 2003; 92: 315-325. Arend M, Westermann B, Risch N. Modern variants of the Mannich reaction. Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 1044-1070. Arendrup MC. Candida and candidaemia. Susceptibility and epidemiology. Dan. Med. J. 2013; 60: B4698. Ateya AD, Erickson JS, Howell PB, Hilliard LR, Golden JP, Ligler FS. The good, the bad, and the tiny: a review of microflow cytometry. Anal. Bioanal. Chem. 2008; 391: 1485-1498. Avni T, Leibovici L, Paul M. PCR diagnosis of invasive candidiasis: systematic review and meta-analysis. J. Clin. Microbiol. 2011; 49: 665-670. Behr JB, Gourlain T, Helimi A and Guillerm G. Design, synthesis and biological evaluation of hetaryl-nucleoside derivatives as inhibitors of chitin synthase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003; 13: 1713-1716. Ben-Ami R, Giladi M. Fluconazole-resistant Candida: collateral damage associated with prior antibacterial exposure? Future Microbiol. 2012; 7: 1029-31. Bossuyt L, Bosschaert J, Richert B, Cromphaut P, Mitchell T, Al Abadie M, Henry I, Bewlwy A, Polyner T, Mann N, Czernielewski J. Lymcycline in the treatment of acne: an efficacious, safe and cost-effective alternative to minocycline. Eur. J. Dermatol. 20013; 13: 130-135.
77
Botta M, Corelli F, Gasparrini F, Messina F, Mugnaini C. Chiral azole derivatives. 4. Enantiomers of bifonazole and related antifungal agents: synthesis, configuration assignment and biological evaluation. J. Org. Chem. 2000; 65: 4736-4739. Brehm-Stecher BF, Johnson EA. Singel-cell microbiology: tools, technologies, and applications. Microbiol. Mol. Biol. R. 2004; 68: 538-559. Butts A, Krysan DJ. Antifungal drug discovery: something old and something new. PLOS Pathogens 2012; 8: e1002870. Carillo-Munoz AJ, Giusiano G, Ezkurra PA, Quindós G. Antifungal agents: mode of action in yeast cells. Rev. Esp. Quim. 2006; 19: 130-139. Chaffin W Lajean. Candida albicans cell wall proteins. Microbiol. Mol. Biol. R. 2008; 72: 495-544. Chaturvedi V, Ramani R, Pfaller MA. Collaborative study of the NCCLS and flow cytometry methods for antifungal susceptibility testing of Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 2004; 42: 224-2251. Chen SCA, Slavin MA, Sorrell TC. Echinocandin antifungal drugs in fungal infections – a comparison. Drugs 2011; 71: 11-41 Chen X, Cui DF, Liu CC, Li H. Microfluidic chip for blood cell separation and collection based on crossflow filtration. Sensor. Actuat. B-Chem. 2008; 130: 216-221. Chernov SV, Shults EE, Makhmut MS, Bagrjanskaja IY, Gatilov YV, Tolstikov GA. Synthetic transformations of natural diterpenes. Synthesis of alkaloid-like compounds from lambertianic acid. Arkivoc 2003; 13: 172-183. Chiba S, Kitamura M, Narasaka K. Synthesis of (-)-sordarin. J. Am. Chem. Soc. 2006; 128: 6931-7. Chien CM, Cheng JL, Chang WT, Tien MH, Wu WY, Chang YH, Chang HY, Chen ST. Cell phenotype analysis using a cell fluid-based microchip with high sensitivity and accurate quantitation. J. Chromatogr. B 2003; 795: 1-8.
78
Cho SH, Chen CH, Tsai FS, Lo YH. Micro-fabricated fluorescence-activated cell sorter. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. 2009; 1075-1078. Cho SH, Godin JM, Chen CH, Qiao W, Lee H, Lo YH. Review article: Recent advancements in optofluidic flow cytometer. Biomicrofluidics. 2010; 4: 43001. Cohen JI, Abel T, Burkett D, Engel R, Escalera J, Filshtinskaya M, Hatchett T, Leto M, Melgar Y, Melkonian K. Polycations. 15. Polyammonium surfaces – a new approach to antifungal activity. Lett. Drug. Des. Discov. 2004; 1: 88-90. Comas J, Vives-Rego J. Enumeration, viability and heterogenity in Staphylococcus aureus cultures by flow cytometry. J. Microbiol. Meth. 1998; 32: 45-53. Davey HM. Life, death and in-between: meanings and methods in microbiology. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77: 5571-5576. Davis FA, Theddu N, Gaspari PM. Assymetric synthesis of substituted tropinones using the intramolecular Mannich cyclization reaction and acyclic N-sulfinyl β-amino ketone ketals. Org. Lett. 2009; 11: 1647-1650. Dimmock JR, Kumar P, Manavathu EK, Obedeanu N, Grewal J. Activity of some Mannich bases of conjugated styryl ketones against Candida albicans. Pharmazie. 1994; 49: 909-912. Dimmock JR, Sidhu KK, Chen M, Reid RS, Allen TM, Kao GY, Truitt GA. Evaluation of Mannich bases of cycloalkanones and related compunds for cytotoxic activity. Eur. J. Med. Chem. 1993; 28: 313-322. Dimmock JR, Smith LM, Smith PJ. The reaction of some nuclear substituted acyclic conjugated styryl ketones and related Mannich bases with ethanethiol. Can. J. Chemistry 1980; 58: 984-991. Dóczi I, Pető Z, Fodor E, Bereczki L, Nagy E, Hajdú E. Evaluation of fungaemia infections in a Hungarian university hospital between 1996 and 2009. Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2012; 59: 29-41. Espinel-Ingroff A. Mechanisms of resistance to antifungal agents: yeasts and filamentous fungi. Rev. Iberoam. Micol. 2008; 25: 101-106.
79
Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Cuenca-Estrella M, Pfaller MA, Rinaldi M, Rodriguez-Tudela JL, Verwij PE. International and multicenter comparison of EUCAST and CLSI M27-A2 broth microdilution methods for testing susceptibilities of Candida spp. to fluconazole, intraconazole, posaconazole and voricaonazole. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 3884-3889. Faigl F, Kovács E, Mátravölgyi B, Thurner A. Gyógyszerkémiai alapfolyamatok – egyetemi jegyzet. 2011 Typotex kiadó. Favel A, Peyron F, De Méo M, Michel-Nguyen A, Carriere J, Chastin C, Regli P. Amphotericin B susceptibility testing of Candida lusitaniae isolates by flow cytofluorometry: comparison with Etest and the NCCLS broth macrodilution method. J. Antimicrob. Chemother. 1999; 43: 227-232. Fujie A. Discovery of micafungin (FK463): a novel antifungal drug derived from a natural product lead. Pure Appl. Chem. 2007; 79: 603–614. Gáspár A. Kapilláris zónaelektroforézis. Kossuth egyetemi kiadó, Debrecen, 2000. Gerdts G, Luedke G. FISH and chips: Marine bacteria communities analyzed by flow cytometry based on microfluidics. J. Microbiol. Method. 2006; 64: 232-240. Gergely L. Orvosi mikrobiológia; egyetemi tankönyv második, átdolgozott kiadás. Alliter Kiadói és Oktatásfejlesztő Alapítvány, Budapest 2003. Ghose AK, Pritchett A, Crippen GM. Atomic physicochemical parameters for three dimensional structure directed quantitative structure-activity relationships III: Modeling hydrophobic interactions. J. Comput. Chem. 1988, 9, 80-90. Goswami P, Das B. Adenine as aminocatalyst for green sythesis of diastereoselective Mannich products in aqueous medium. Tetrahedron Lett. 2009; 50: 2384-2388. Gras JL. A direct synthesis of α – methylene ketones. Tetrahedron Lett. 1978 April; 19: 21112114. Gras JL. A facile entry to vinyl ketones. Tetrahedron Lett. 1978 June; 19: 2955-2958. Guantai EM, Ncokazi K, Egan TJ, Gut J, Rosenthal PJ, Bhampidipati R, Kopinathan A, Smith PJ, Chibale K. Enone- and chalcone-chloroquinoline hybrid analogs: in silico-guided design,
80
synthesis, antiplasmodial activity, in vitro metabolism and mechanistic studies. J. Med. Chem. 2011; 54: 3637-3649. Guttman A. Gel and polymer-solution mediated separation of biopolymers by capillary electrophoresis. J. Chromatogr. Sci. 2003; 41: 449-459. Hayashi Y, Urushima T, Shin M, Shoji M. The stereoselective synthesis of α-substitued βamino secondary alcohols based on the proline-mediated, assymetric, three-component Mannich reaction and its application to the formal total sythesis of nikkomycins B and Bx. Tetrahedron 2005; 61: 11393-11404. Heilmann CJ, Sorgo AG, Klis FM. News from the fungal front: wall proteome dynamics and host-pathogen interplay. PLoS Pathog.s 2012; volume 8, issue 12 Hernandez
A,
Marcos
M,
Rapoport
H.
Synthesis
of
(+)-
and
(-)-N-BOC-7-
azabicyclo[2.2.1]heptan-2-ones, versatile intermediates for the enantiospecific synthesis of (+)- and (-)-epibatidine and analogs. J. Org. Chem. 1995; 60: 2683-2691. Ibrahim A, Spellberg B, Edwards J. Prospective on mucormycosis pathogenesis and treatment. Curr. Opin. Infect. Dis. 2008; 21: 620-625. Jewell SN, Waldo Rh, Cain CC, Falkinham JO. Rapid detection of lytic antimicrobial activity against yeast and filamentous fungi. J. Microbiol. Method. 2002; 49: 1-9. Johnson EM, Ojwang JO, Szekely A, Wallace TL, Warnock DW. Comparison of in vitro antifungal activities of free and liposome-encapsulated nystatin with those of four amphotericin B formulations. Antimicrob. Agents Ch. 1998; 42: 1412-1416. Johnson MD, Perfect JR. Use of antifungal combination therapy: agents, order and timing. Curr Fungal Infect Rep. 2010; 4: 87-95. Kaneko S, Uchida T, Shibuya S, Honda T, Kawamoto I, Harasaki T et al. Synthesis of sordaricin analogues as potent antifungal agents against Candida albicans. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002; 12: 803-806. Kauffmann CA. Clinical efficacy of new antifungal agents. Curr. Opin. Microbiol. 2006; 9: 483-488.
81
Kirk SM, Callister SM, Lim LCL, Schell RF. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. J. Clin. Microbiol 1997; 35: 358-363. Klein LL, Li L, Chen HJ, Curty CB, DeGoey DA, Grampovnik DJ, Leone CL, Thomas SA, Yeung CM, Funk KW, Kishore V, Lundell EO, Wodka D, Meulbroek JA, Alder JD, Nilius AM, Lartey PA, Plattner JJ. Total synthesis and antifungal evaluation of cyclic aminohexapeptides. Bioorgan. Med. Chem. 2000; 8: 1677-1696. Kocsis B, Kustos I, Kilár F, Nyul A, Jakus PB, Kerekes Sz, Villarreal V, Prókai L, Lóránd T. Antifungal unsaturated cyclic Mannich ketones and amino alcohols: study of mechanism of action. Eur. J. Med. Chem. 2009; 44: 1823-1829. Kuschel M, Buhlmann C, Preckel T High-throughput protein and DNA analysis based on microfluidic on-chip electrophoresis. JALA 2005; 10: 319-326. Kustos I, Kocsis B, Kilar F. Bacterial outer membrane protein analysis by electrophoresis and microchip technology. Expert. Rev. Proteomics. 2007; 4: 91-106. Kustos I, Nyul A, Lóránd T, Kocsis B, Kilár F. Effect of antifungal agents on protein composition of Candida albicans studied by capillary electrophoresis and chip technology. J. Biochem. Biophys. Methods 2006; 69: 57-65. Lal B, Gund VG, Bishe NB, Gangopadhyay AK. Mannich reaction: an approach for the synthesis of water soluble mulundocandin analogues. Bioorg. Med. Chem. 2004; 12: 17511768. Lapsley MI, Wang L, Huang TJ. On-chip flow cytometry: where is it now and where is it going ? Biomark Med. 2013; 7: 75-78. Liang H. Sordarin, an antifungal agent with a unique mode of action. Beilstein J. Org. Chem. 2008; 4: 1-14. Lim CSY, Tung CH, Rosli R, Chong PP. An alternative Candida spp. cell wall disruption method using a basic sorbitol lysis buffer and glass beads. J. Microbiol. Meth. 2008; 75: 576578. List B. The direct catalytic asymmetric three-component Mannich reaction. J. Am. Chem. Soc. 2000; 122: 9336-9337 82
Loeffler J, Stevens DA. Antifungal drug resistance. Clin. Infect. Dis. 2003; 36(suppl 1): S3141. Lopez SN, Castelli MV, Zacchino SA, Domnguez JN, Lobo G, Charris-Charris J, Cortes JC, Ribas JC, Devia C, Rodirguez AM, Enriz RD. In vitro antifungal evaluation and structureactivity relationships of a new series of chalcone derivatives and synthetic analogues, with inhibitory properties against polymers of the fungal cell wall. Bioorgan. Med. Chem. 2001; 9: 1999-2013. Lóránd T, Kocsis B. Recent advances in antifungal agents. Mini-Rev. Med.Chem. 2007; 7: 900-911. Lóránd T, Kocsis B, Sohár P, Nagy G, Kispál Gy, Krane HG, Schmitt H, Weckert E. Synthesis and antibacterial study of unsaturated Mannich ketones. Eur. J. Med. Chem. 2001; 36: 705-717. Lóránd T, Kocsis B, Sohár P, Nagy G, József P, Kispál Gy, László R, Prókai R. Synthesis and antibacterial activity of fused Mannich ketones. Eur. J. Med. Chem. 2002; 37: 803-812. Lustyik György: Az áramlási citometria és a konfokális mikroszkópia alapelvei és alkalmazásuk az orvos-biológiai kutatásban. PTE ÁOK Doktori Iskola Ph.D. kurzusának anyaga, 2004.november, 2008.január Mattanovich D, Borth N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb. Cell. Fact. 2006; 5:12. M27-A3 - Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast; Approved Standard - Third Edition. 2008; Vol. 28. No.14. Mallié M, Bastide JM. Les nouveaux antifongiques et leur stratégie de recherché. Revue Francaise des Laboratoires 2001; N° 332: 63-70. Martinez A, Aviles P, Jimenez E, Caballero J, Gargallo-Viola D. Activities of sordarins in experimental models of candidiasis, aspergillosis and pneumocytosis. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44: 3389-3394. Mason DJ, Allman R, Stark JM, Lloyd D. Rapid estimation of bacterial antibiotic susceptibility with flow cytometry. J. Microsc.1994; 176: 8-16. 83
Mehra T, Köberle M, Braunsdorf C, Mailänder-Sanchez D, Borelli C, Schaller M. Alternative approaches to antifungal therapies. Exp. Dermatol. 2012; 21: 778-782. Mehta RJ, Kingsbury WD, Valenta J, Actor P. Anti-Candida activity of polyoxin: example of peptide transport in yeasts. Antimicrob. Agents Chemother. 1984; 25: 373-374. Mesa-Arango AC, Scorzoni L, Zaragoza O. It only takes one to do many jobs: Amphotericin B as antifungal and immunomodulatory drug. Front. Microbiol. 2012; 3: 286 Mitchell M, Hudspeth M, Wright A. Flow cytometry susceptibility testing for the antifungal caspofungin. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 2586–2589. Moen DM, Lyseng-Williamson KA, Scott LJ. Liposomal Amphotericin B: a review of its use as empirical therapy in febrile neutropenia and in the treatment of invasive fungal infections. Drugs 2009; 69: 361-392. Notz W, Tanaka F, Watanabe SI, Chowdari NS, Turner JM, Tahyumanavan R, Barbas CF. The direct organocatalytic asymmetric Mannich reaction: unmodified aldehydes as nucleophiles. J. Org. Chem. 2003; 68: 9624-9634. Obi K, Uda JI, Iase K, Sugimoto O, Ebisu H, Matsuda A. Novel nikkomycin analogues: inhibitors of the fungal cell wall biosynthesis enzyme chitin synthase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000; 10: 1451-1454. Odds FC. Antifungal agents: their diversity and increasing sophistication. Mycologist 2003; 17: 51-55. Odds FC, Brown AJP, Gow NAR. Antifungal agents: mechanisms of action. Trends Microbiol. 2003; 11: 272-279. Palkova Z, Vachova L, Valer M, Preckel T. Single-cell analysis of yeast, mammalian cells, and fungal spores with a microfluidic pressure-driven chip-based system. Cytometry Part A. 2004; 59A: 246-253. Page BT, Shields CE, Merz WG, Kurtzman CP. Rapid identification of ascomycetous yeasts from clinical specimens by a molecular method based on flow cytometry and comparison with identifications from phenotypic assays. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 3167-3171.
84
Pati HN, Das U, Sharma RK, Dimmock JR. Cytotoxic thiol alkylators. Mini. Rev. Med. Chem. 2007; 7: 131-139. Peter J, Armstrong D, Lyman CA, Walsh TJ. Use of fluorescent probes to determine MICs of amphotericin B and caspofungin against Candida spp. and Aspergillus spp. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 3788-3792. Pina-Vaz C, Costa-de-Oliveira S, Rodrigues AG, Espinel-Ingroff A. Comparison of two probes for testing susceptibilities of pathogenic yeasts to voriconazole, itraconazole, and caspofungin by flow cytometry. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4674-4679. Porro D, Vai M, Vanoni M, Alberghina L, Hatzis C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry A 2009; 75: 114-120. Preckel T, Luedke G, Chan SDH, Wang BN, Dubrow R, Buhlmann C. Detection of cellular parameters using of a microfluidic chip-based system. JALA 2002; 7: 85-89. Ramani R, Chaturvedi V. Flow cytometry antifungal susceptibility testing of pathogenic yeasts other than Candida albicans and comparison with the NCCLS broth microdilution test. Antimicrob. Agents Chemother. 2000; 44: 2752-2758. Ramani R, Ramani A, Wong SJ. Rapid flow cytometric susceptibility testing of Candida albicans. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 2320-2324. Rani N, Sharma A, Gupta GK, Singh R. Imidazoles as potential antifungal agents: a review. Mini. Rev. Med. Chem. 2013; 13: 1626-55. Rodriguez CA, Patrick CC. New therapeutic options for invasive fungal diseases. Semin. Pediat. Infect. Dis. 2001; 12: 301-308. Rotaru I, Ionescu M, Donescu D, Vuluga M, Purcar V. Synthesis of new aromatic Mannich polyols for rigid polyurethane foams. U.P.B. Sci. Bull., Series B. 2007; 69: 35-42. Sandven P, Bevanger L, Digranes A, Haukland HH, Mannsaker T, Gaustad P, Norwegian Yeast Study Group. Candidemia in Norway (1991 to 2003): results from a nationwide study. J. Clin. Microbiol. 2006; 44: 1977-81.
85
Savluchinske-Feio S, Curti MJM, Gigante B, Roseiro JC. Antimicrobial activity of resin acid derivatives. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006; 72: 430-436. Scott LJ. Micafungin – a review of its use in the prophylaxis and treatment of invasive Candida infections. Drugs 2012; 72: 2141-2165. Sedlák M. Amphotericin B: from derivatives to covalent targeted conjugates. Mini-Rev. Med.Chem. 2009; 9: 1306-16. Shastry M, Nielsen J, Ku T, Hsu MJ, Liberator P, Anderson J, Schmatz D, Justice MC. Species-specific inhibition of fungal protein synthesis by sordarin: identification of a sordarinspecificity region in eukaryotic elongation factor 2. Microbiology 2001; 147: 383-390. Subramaniapillai SG. Mannich reaction: a versatile and convenient approach to bioactive skeletons. Chem. Sci. J. 2013; 125: 467-482. Sujith KV, Rao JN, Shetty P, Kalluraya B. Regioselective reaction: synthesis and pharmacological study of Mannich bases containing ibuprofen moiety. Eur. J. Med. Chem. 2009; 44: 3697-3702. Sumalatha Y, Reddy PP, Reddy R, Satyanarayana B. Sythesis and spectral characterization of process-realeted substances to the hypnotic agent zolpidem. Arkivoc 2009; vii: 143-149. Tanino K, Takahashi M, Murayama K, Kuwajima I. Generation of a Lewis acid activated formaldimine and its reaction with enol silyl ethers. N-unsubstituted aminomethylation. J. Org. Chem. 1992; 57: 7009-7010. Thienpont A, Gal J, Aeschlimann C, Félix G. Studies on stereoselective separations of the „azole” antifungal drugs ketoconazole and itraconazole using HPLC and SFC on silica-based polysaccharides. Analysis 1999; 27: 713-718. Tragiannidis A, Fegeler W, Rellensmann G, Debus V, Muller V, Hoering –Franz I, Siam K, Pana ZD, Jurgens H, Groll AH. Candidaemia in a European Paediatric University Hospital: a 10-year observational study. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18: E27-30. Tramontini M, Angiolini L, Ghedini N. Mannich bases in polymer chemistry. Polym. 1988; 29: 771-788.
86
Vashishtha SC, Zello GA, Nienaber KH, Balzarini J, De Clercq E, Stables JP, Dimmock JR. Cytotoxic and anticonvulsant aryloxyaryl Mannich bases and related compunds. Eur. J. Med. Chem. 2004; 39: 27-35. Walberg M, Gaustad P, Steen HB. Rapid assessment of ceftazidime, ciprofloxacin, and gentamicin suscepitibility in exponentially-growing E. coli cells by means of flow cytometry. Cytometry 1997; 27: 169-178. Watanabe T, Ogasawara A, Mikami T, Matsumoto T. Hyphal formation of Candida albicans is controlled by electron transfer system. Biochem. Bioph. Res. Co. 2006; 348: 206-211. Wenisch C, Linnau KF, Parschalk B, Zedwitz-Liebenstein K, Georgopoulos A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. J. Clin. Microbiol. 1997; 35: 5-10. Wenisch C, Moore CB, Krause R, Presterl E, Pichna P, Denning DW. Antifungal susceptibility testing of fluconazole by flow cytometry correlates with clinical outcome. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 2458-2462. White TC, Marr KA, Bowden RA. Clinical, cellular and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 1998; 11: 382-402. Zhang H, Mitsumori S, Utsumi N, ImaiM, Garcia-Delgado N, Mifsud M, Albertshofer K, Cheong PH, Houk KN, Tanaka F, Barbas CF. Catalysis of 3-pyrrolidinecarboxylic acid and related pyrrolidine derivatives in enantioselective anti-Mannich-type reactions: Importance of the 3-acid group on pyrrolidine for stereocontrol. J. Am. Chem. Soc. 2008; 130: 875-886. ÁBRÁK FORRÁSAI: [1] http://www.medschool.lsuhsc.edu/pharmacology/docs/Fox_2009.pdf [2] Lóránd T, Kocsis B. Recent advances in antifungal agents. Mini-Rev. Med.Chem. 2007; 7: 901.o. [3] http://www.abdserotec.com/flow-cytometry-signal-processing.html [4] Preckel T, Luedke G, Chan SDH, Wang BN, Dubrow R, Buhlmann C. Detection of cellular parameters using of a microfluidic chip-based system. JALA 2002; 7: 86.o. [5] http://www.chem.agilent.com/
87
10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm témavezetőimnek, Dr. Lóránd Tamásnak és Dr. Kocsis Bélának, hogy hosszú évek óta, kitartóan segítették kutatási munkám; ötleteikkel, javaslataikkal támogattak. Külön köszönöm Kocsis tanár úrnak, hogy a munkámhoz nélkülözhetelen mikrobiológiai alapokkal megismertett, Lóránd tanár úrnak pedig, hogy fáradhatatlanul terelt a kémiai gondolkodásmód és szemlélet felé. Köszönöm Dr. Kilár Ferencnek, volt témavezetőmnek, hogy szakmai javaslataival és gyakorlati tanácsaival mindvégig figyelemmel kísérte tevékenységem. Köszönettel tartozom dr. Kustos Ildikónak, aki ezen a kutatási vonalon elindított, később is mindig segített és készséggel javította munkáim. Köszönöm Dr. Prókai László professzor úrnak a logP számításokat. Köszönöm a PTE TTK Kémia Intézet Analitikai és Környezeti Kémia Tanszék, a PTE ÁOK Orvosi Mikrobiológiai és Immunitástani Intézet, a PTE ÁOK Bioanalitikai Intézet, a PTE ÁOK Biokémiai és Orvosi Kémiai Intézet, és a PTE ÁOK Biofizikai Intézet valamennyi munkatársának, akik munkámban bármilyen formában segítségemre voltak. Külön köszönöm Sajtiné Pintér Krisztinának a képletek, ábrák szerkesztését, Kocsis Bélánénak a mikrobiológiai előkészítést, Jámbor Évának az MS mérésekben nyújtott segítségét. Végül pedig köszönöm családomnak és barátaimnak, hogy mindig támogattak, bátorítottak, bíztattak és elviseltek.
88
