ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
BAS IV
MElODE PENELITIAN
IV.I. Tempat Penelitian Pcnelitian ini dilakukan di laboratorium Analisis
Far
musi Fakultas Farmasi Unair dan d, I&boratorium Dasar Bersama Unair.
IV.2. Alat yang Digunakan GC-380 Gas Chromatograph GL Sciences. kolom kapiler fu sed silica. St. phase TC-I ID
= 0,25
min.
(setar~
nengan OV-I). df=O.25
panjang 30 m. dctektor
riD
(kondisi
analisis
dicantumkan pada sub bab IV.7.). Hamilton microsyringe 10 ujung jarum runcing. Spectrofotometer
Shimadzu
260.
~m.
~l
Neraca
analitis Mettler-Toledo ABI04, d 0,1 mg. Pengaduk ultrasonik. Alat gelas yang biasa digunakan untuk analisis kimia.
IV.3. Bahan yang Diperlukan Squalan pro GC (E.Merck), (sigma), Cholesterol(Sigma), CHCl
Squalen (Sigma), Progesteron 3
(RDH) , n Hexane (E.Merck).
metanol (E.Merck).
LAPORAN PENELITIAN
,
ANALISIS KUANTITATIF ...
DARMAWATI, ASRI
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
22 Sedlaan Squalen yang bcredar dl pasar dengan nomor gistrasi TR922361771
(kode
Vel,
MDI62709002147
re
(kode
"1),
"1D262710029168 (kode Va).
]V.4. Tahap-tahpp Penelitian 1.
Pc mbu a t a n
l a r u t a n b a k u Zp e r e a k s i
Optlmasi pemisahan squalan 1ari squalen J. Uji
limit d e t e ks i dan limit kua n t i t a s i
4. Uj i I i n i e r i tas S. Penentuan akurasi dan presisi 6. Penentuan Kadar squalan dan squalen dalam sampel
IV.S. pembuatan larutan baku IV.5.1. Pembuatan larutan baku Squalan Ditimbang teliti Squalan 50 mg lalu dilarutkan dalam hexane samrai volume 10,0 mL. Larutan induk dipipet bermacam-macam volume, dalam l a bu
t
a ka r 10,0 ml ,
masing-masing
d i t amba h
dengan
iniselanjutnya dimasukkan 2.0
sampal volume 10,0 mL. Macam-macam konsentrasi akhlr Squalan baku In! bervarlasl antara 50 ppm-1500 ppm,
n
hexane Jarutan dan
masing-masing mengandung Progesteron baku ± 600 ppm. ANALISIS KUANTITATIF ...
ke
larutan
ml
Induk Progesteron 3000 ppm, lalu diencerkan dengan
LAPORAN PENELITIAN
n
DARMAWATI, ASRI
ma
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
IV.5.2. Pembuatan larutan baku Squalen Larutan-Iarutan baku squalen dibuat
dengan
eara
sama
dengan pembu a t a n l a r u t a n baku squalan (IV.5.1.). IV.5.3. Pembuatan larutan baku Progesteron Ditimbang teliti Progesteron 80 mg, lalu dimasukkan dalam labu takar 25 mi. Tambahkan ke dalam tabu takar but n hexane ± 20 ml kemudian
digetarkan
dengan
ke
lerse
ultrnsonik
selama IS menit. Setelah itu ditambah n hexane sampai
tanda.
Larutan ini mengandung Progesteron 3200 ppm. Selanjutnya
tambahkan
larutan
ini
sebagai
internal
standar ke dalam larutan yang akan diinjeksikan ke
dalam
GC
sebanyak 2,0 ml/lO,O ml larutan sampel.
IV.6. Optimasi pemisahan Squalan dari squalen Diinjeksikan 2
~I
larutan n hexane yang mengandung cam
puran squalan dan squalen baku (masing-masing dengan trasi ± 700 ppm) ke dalam GC dengan kondisi
suhu
konsen
oven
yang
divariasi. sehingga diperoleh ·suhu oven yang dapat memisahkan squalan dari squalen secara optimal. Pekerjaan tersebut di atas
diulangi
terhadap
larutan
squalan dan squalen dalam n hexane yang juga mengandung inter nal standar Cholesterol atau Progesteron (± 600 ppm) LAPORAN PENELITIAN
ANALISIS KUANTITATIF ...
DARMAWATI, ASRI
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
24
IV.?
Uji Limit deteksi dan limit kuantitasi Diinjeksikan 2
~l
n hexane ke dalam GC, dengan
kondisi
alat yang diatur sarna dengan kondisi pada waktu analisis sam pel, yaitu, suhu injector port 2S0oC, suhu oven detektor/ FlO 280
oC,
laju udara
2
2,1
2
240°C, laju
kgf/em ,
suhu
.H 2
2
kgf/em , l a j u N 2,6 kgf/em . 2 Kondisi rekaman sbb.: Attenuation = 1. minimum area= ~volt/
detik, minimum width = 0.5 menit, minimum height
~volt.
keeepatan kertas 2 em/menit, selama 30
=
0 5
Selan
menit,
jutnya diinjeksikan 2 ul larutan squalan atau squalen masing masing dengan konsentrasi (4 maeam) antara 80 ppm-600 ppm. Limit
de t
e ks i (LaD) dan limit kuantitasi (LOQ) dihitung
berdasarkan area noise
terbesar
dan
besarnya
lereng/slope
kurva kalibrasi squaJan atau squalen pad a rentang konsentrasi tersebut di atas ,menggunakan be r i
ku t
LaD
dan
LOQ
sebagai
(Indrayanto, 1994). N
LOQ
LaD = 3'5,51. ppm (N
rumus
= area
noi~e
terbesar. sl
=
slope
kurva
kalibrasi
pada
konsentrasi dekat limit deteksi) dari squalan atau squalen
IV.8. Uji Jinieritas Dibuat larutan squalan (atau squalen) dalam
pelarut
n
LAPORAN PENELITIAN KUANTITATIF ... sampai 2000 DARMAWATI, hexane dengan konsentrasiANALISIS mulai 80 ppm ppm ASRI dari
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
25
baku induk masing2. Ke dalam masing-masing ditambahkan larutan
indu~
progesteron
larutan
(sehingga
tersebut
,
konsentrasi
akhir progesteron ± 600 ppm). Berturut-turut sebanyak 2
~l
larutan-Iarutan
tersebut
diinjeksikan
pada kondisi alat yang diatur sarna dengan
sub.
bab. IV.7. Kondisi rekaman sbb: 200~voltl
5
~volt,
Attenuation
=1,
minimum
area=
detik, minimum width = 0.5 menit; minimum height
=
kecepatan kertas 2 cm/menit.
Dari data yang diperoleh dibuat kurva kalibrasi
an tara
perbandingan konsentrasi squalan atau squalen dengan internal standar (sebagai sumbu x) terhadap perbandingan area
squalan
atau squalen dengan internal standar (sebagai sumbu y), meng gunakan rumus berikut (Day R.A, 1991). Untuk mengetahui adanya korelasi linier antara x dengan y dilihat profil posisi titik/data yang
diperoleh,
kemudian
dihitung koefisien korelasi r dengan rumus berikut : r
=
(rx .ry) In
rXY -
2 2 ;'[Zx -(rx) In]. [ry -Cry) In]
--I
2
2
Bila harga r yang diperoleh lebih besar dari harga r tebel untuk n data yang diperoleh, berarti ada korelasi linier
antara
x dengan y. Selanjutnya
dengan
~.
~ihitung
persamaan garis regresi
metode least squares be r i ku t (Day.R.A. 1991). LAPORAN PENELITIAN
ANALISIS KUANTITATIF ...
DARMAWATI, ASRI
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
26
y = b X + a
b =
LXY
Zx
a
=
-
,
(LXLY) In ?
2
(Zx)-/n
Iy - bIx n
standar deviasi dari y = Sy =
yfo - b 2C n - 2
Standar deviasi dari slope
C
(n
= Ix 2
= jumlah
data)
Koefisien variasi fungsi
garis
regresi
(Vxo)
(Indrayanto,
19'.i4) adalah :
Sv
Vxo = - ' b
x
X
100~%
Pustaka tersebut mensyaratkan Vo harus lebih keeil dari 5 %.
IV.9. Penentuan akurasi dan presisi Akuras I dan presi si squal an
Oitimbang teliti sampel Ve sebanyak ± 280 mg, kan ke dalam labu takar 10,0 ml,
ditambah
tanda. Larutan ini dipipet masing-masing 2,0
n
dimasuk
hexane ml,
sampai
dimasukkan
ke dalam 3 labu takar 10 mi. Ke dalam labu takar tersebut
di
masukkan masing-masing (0 ml; 1,0 ml; 2,0 ml) larutan squalan LAPORAN PENELITIAN
baku 1200 ppm, dan
2,0
ANALISIS KUANTITATIF ...
ml
larutan
DARMAWATI, ASRI
progesteron
3000
ppm.
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
27
Akhirnya ditambah n hexane sampai tanda. Larutan-larutan
ini
diinjeksikan ke dalam GC pada kondisi yang
sub
bab
sarna
dengan
IV.S.
AkUl'asi dan pr es i s L squal.en
Ditimhang teliti sampel Ve ± 60 mg, dimasukkan ke dalam labu
t
a k a r 10 ml lalu ditambah n hexane sampai
Laruta~
tepat
tanda.
ini diplpet masing-maslng 1,0 ml untuk dimasukkan
ke
dalam labu takar 10 mI. Maslng-masing labu takar Ini ditambah dengan baku 1,0 ml Iarutan squalen 5000
ppm
serta
internal
standar progesteron masing-masing 600 ppm (konsentrasi akhir) Selanjutnya dltambah n hexane sampai
tanda.
inj selanjutnya dlinjeksikan ke dalam GC
dan
Larutan-Iarutan diproses
pad a
kondisi yang sarna dengan IV.S. Sebagai parameter akurasi adalah
prosen
(~)
rekoveri
(perolehan kcmbali) analit baku, yang sengaja dltambahkan
ke
dalam sampel. dalam konsentrasi tertentu. Sedangkan parameter presisi adalah koefisien variasi dari (%) rekoveri. Cara perhitungan rekoveri adalah sebagai berikut. Prosen (Xl rekover-I
=
Xn X
x 100
%
Keterangan
Xn = X(total) - X(sampel)
X(total) = konsentrasi analit total yang diperoleh berdasar
kan kurva kallbrasi (IV.B). X(sampel)= konsentrasi analit dalam sampel yang diperoleh ber dasarkan penentuan Kadar dengan cara langsung atau LAPORAN PENELITIAN ANALISIS KUANTITATIF ... DARMAWATI, ASRI dengan cara adisi standar. X = konsentrasi analit baku yang sengaja ditambahkan
ke dalam sampeJ
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
28
Koefisien varLas i
=
SD
x 100 %
x
Keterangan : SD = standar deviasi dari hasil replikasi penentuan akurasi, X = kadar (rerata) analit yang diperoleh
IV.IO.
Penentuan kadar Squalan dan squalen dalam sampel
Uji keser·a9an,an bobo!'
Ditimbong teliti satu per satu kapsul lunak (soft suls) sampel sebanyak 20 biji. Kemudian masing masing
cap kapsul
dibuka dengan pisau tajam, dikeluarkan isinya sebanyak kin untuk ditampung dalam botel coklat bertutup
rapat,
tersisa di delam kapsul dicuci bersih dengan eter q.s.
mungyang Sete
lah bebas isi, kapsul tersebut dikeringkan dengan dryer sela rna 10 menit. lalu di timbang teliti (USP XXIII,1995). Penyiapan sampel
Untuk penentuan kadar squalen
dilakukan
sebagai
ber
ikut. Ditirnbang teliti sampel sebanyak 50 mg, dilarutkan
da
lam n hexane sampai 10,0 ml. Larutan s ampe l ini
1,0
d i p i pe t
ml , l a l u dirnasukkan ke dalam labu takar 10 ml . Setelah ditam bah 2,0 ml pregesteron standar 3000 ppm, dan
diencerkan
ngan n hexane sampai tepat tanda, akhirnya di kocok (Yang diinjeksikan ke dalam GC adalah 2 LAPORAN PENELITIAN
ANALISIS KUANTITATIF ...
de
homogen.
~l). DARMAWATI, ASRI
ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITA AIRLANGGA
29
Untuk penentuan
kadar
squalan
dilakukan
cara
adisi
standar sebagai berikut. Ditimbang teliti sampel sebanyak 300 mg , l a l u di larutkan dalam n hexane sampai
10,0
ml .
Dipipet
masing- nlBsing 2 ml larutan sampel, dimasukkan ke dalam
labu
a ka r 10,0 rn l , lalu berturut-turut ditambah dengan 0 ml ,
1,0
ml Squalan baku 600 ppm, 5,0 ml Squalan baku 300 ppm dan
4,0
t
ml Squalan
baku
500
ppm.
Ke
dalam
masing-masing
ditambah dengan 2,0 ml Progesteron 3000 ppm sebagai standar, kemudian ditambah n hexane sampai 10,0
mI.
dikocok homogen, diinjeksikan ke dalam GC sebanyak 2
LAPORAN PENELITIAN
ANALISIS KUANTITATIF ...
tabung internal Setelah ~l.
DARMAWATI, ASRI
