III.
METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung dari bulan Februari sampai dengan Mei 2015.
B. Alat dan Bahan
1. Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah laminar air flow cabinet, autoclave, neraca analitik, neraca, inkubator, oven, jarum ose,erlenmeyer, hot plate stirer, vortex mixer, micropipette, tip pipet, cawan petri, kapas, tabung reaksi, alumunium foil, bunsen, gelas ukur, gunting, pinset, dan colony counter.
2. Bahan
Isolat bakteri yang digunakan yaitu BT1, BT2, BT3, dan BT4 yang merupakan isolat BAL yang diisolasi dari tempoyak; daging yang digunakan adalah daging sapi dan ayam potong; bahan lain yang digunakan yaitu MRSB
17
(de Man Rogosa Sharpe Broth), MRSA (de Man Rogosa Sharpe Agar), NA(nutrien agar),tempoyak, nitrit, aquades, alkohol 70%, dan NaCl.
C. Metode Penelitian
Penelitian ini dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama ialah uji kemampuan ekstak metabolit BAL dalam menghambat pertumbuhan bakteri daging. Terhambatnya pertumbuhan bakteri daging ditunjukan dengan luas zona hambat yang terbentuk dengan mengunakan metode difusi sumur (Harley dan Prescott, 2002). Tahap kedua yaitu uji kemampuan ekstrak metabolit BAL dalam menghambat populasi bakteri daging. Parameter yang diamati adalah penurunan populasi bakteri daging. Dua isolat yang memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri daging terbesar diuji dengan mengunakan metode TPC (Total plate count). Uji penghambatan populasi disusun dengan Rancangan Acak Kelompok Lengkap (RAKL) dengan 3 ulangan sebagai kelompok. Perbedaan tiap isolat ditentukan dengan Rancangan Perlakuan Faktorial 2 x 2 x 6, yaitu isolat bakteri (2 isolat yang memiliki daya hambat terbesar), sampel daging (daging ayam dan daging sapi), dan lama pemaparan diruang terbuka (0 jam, 2 jam, 4 jam, dan 6 jam).
18
D. Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini di analisis dengan Anova untuk melihat ada tidaknya efek penggunaan ekstrak metabolit bakteri asam laktat terhadap pertumbuhan bakteri daging serta perbedaan efek masing-masing isolat. Untuk menyimpulkan ada atau tidak adanya pengaruh yang signifikan secara statistik digunakan nilai P < 0,05 dan dilanjutkan dengan menggunakan BNT (Beda Nyata Terkecil).
E. Cara Kerja
1. Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Tempoyak
Tempoyak yang berasal dari tiga tempat berbeda di campur di dalam suatu wadah lalu diambil sebanyak 5 gram. Tempoyak dilarutkan ke dalam 45 ml larutan garam fisiologis, setelah itu tempoyak diambil menggunakan ose steril lalu diinokulasikan dengan metode goresan pada media MRSA. Inokulan diinkubasi pada suhu 30oC selama 48 jam. Setelah 48 jam, dipilih beberapa koloni yang memiliki bentuk dan warna koloni yang berbeda untuk dimurnikan.
2. Peremajaan
Bakteri isolat BT1, BT2, BT3, dan BT4 dari tempoyak diremajakan pada tabung reaksi yang berisi medium MRSA padat miring kemudian diinkubasi selama 48 jam di dalam inkubator pada suhu 30oC.
19
3. Preparasi Sampel Daging
Sampel daging sapi dan ayam dipotong kecil - kecil kemudian ditimbang sebanyak 10 gram. Sampel kemudian dimasukan ke dalam erlenmeyer berisi garam fisologis sebanyak 90 mL sebagai pengenceran 10-1 untuk selanjutnya diencerkan menjadi 10-2. Pengenceran 10-2 ini yang akan digunakan pada uji daya hambat BAL dari tempoyak.
4. Uji Daya Hambat BAL dari Tempoyak
Mikroorganisme pada daging ayam dan sapi yang telah diencerkan menjadi 10-2 diinokulasikan ke dalam cawan petri steril sebanyak 1mL, kemudian ditambahkan media NA sebanyak 25 mL kemudian dihomogenkan dan di padatkan. Dibuat empat lubang sumur pada setiap cawan dengan diameter sekitar 7 mm menggunakan tip pipet 1 mL steril. Ke dalam sumur pertama dimasukan kultur isolat BT1, sumur kedua kultur isolat BT2, sumur ketiga kultur isolatt BT3 dan sumur keempat kultur isolat BT4 sebanyak 100 µL. Inokulan diinkubasi dengan posisi cawan tidak terbalik pada suhu 30oC selama 18 jam. Pada cawan yang berbeda dibuat empat lubang kontrol yang berisi 100 μL MRSB. Zona bening di sekitar sumur sebagai zona penghambatan BAL terhadap bakteri daging (Harley dan Prescott, 2002).
20
5. Penghitungan Luas Zona Hambat
Perhitungan luas zona hambat dilakukan dengan menggambar luas zona hambat pada plastik kaku. Plastik digunting sesuai zona dan ditimbang. Luas zona hambat diketahui dengan mengkonversikan berat masing – masing plastik kaku dengan berat plastik kaku berukuran 1cm2 dan dikurangi dengan luas lingkaran lubang sumur.
B
C A
Gambar 1. Perhitungan luas zona hambat Keterangan : A
= Luas lingkaran lubang sumur (cm2)
B
= Luas zona hambat (gram)
C
= Luas plastik kaku 1 cm2 (gram)
Luas Zona Hambat =
21
6. Produksi Antibakteri
Dua stater isolat yang memiliki daya hambat terbesar terhadap bakteri daging yang berasal dari daging sapi dan ayam masing - masing diinokulasikan sebanyak 10% ke dalam 50 mlmedia MRS Broth. Inokulan diinkubasi diinkubator selama 48 jam pada suhu 30oC. Kultur BAL yang yang telah diproduksi disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 5000 rpm untuk memisahkan supernatan dan pelet. Supernatan yang didapat akan digunakan dalam uji penghambatan pertumbuhan bakteri daging.
7. Uji Penghambatan Pertumbuhan BakteriDaging dan Ayam
Daging sapi dan ayam segar dipotong dadu atau filet seberat 5 gram, masing masing sebanyak 4 potongan untuk perlakuan kontrol, hasil metabolit (dua isolat bakteri tempoyak), tempoyak 10%, dan nitrit 1%. Setiap potongan daging dicelupkan kedalam ekstrak metabolit bakteri asam lakat, tempoyak 10% dan nitrit 1% selama satu menit (Hadiwiyoto et al., 2005). Masingmasing 3 potong sampel diletakan di atas alumunium foil di ruangan terbuka dengan lama waktu 2 jam, 4 jam dan 6 jam. Sampel yang digunakan untuk 0 jam dipotong kembali menjadi 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi larutan garam fisiologis 9 mL. Sampel selanjutnya dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Sampel tersebut adalah sampel dengan pengenceran 10-1, yang kemudian diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam larutan pengencer 9 mL untuk memperoleh
22
pengenceran 10-2. Cara yang sama dilakukan untuk pengenceran 10-3, 10-4 dan 10-5. Dari pengenceran 10-5 untuk daging sapi dan 10-6 untuk daging ayam diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam cawan petri yang kemudian ditambah medium NA. Setelah medium padat,cawan-cawan diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 30oC selama 48 jam. Setelah 48 jam dihitung total bakteri yang tumbuh.
8. Penghitungan Jumlah Total Mikroba
Perhitungan jumlah total mikroba dilakukan dengan metode Harrigan dan McCance (2014), dengan rumus : N = ∑C/ [(1 x n1) + (0.1 x n2)] x d Keterangan: N
= Jumlah koloni per gram
∑C
= Jumlah total koloni yang tumbuh dalam cawan yang dihitung
n1
= Jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung
n2
= Jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung
d
= Tingkat pengenceran pertama
23
F. Diagram Alir
Diagram alir penelitian adalah sebagai berikut.
Isolasi BAL Tempoyak
Identifikasi
Kultur Murni
Uji Ekstrak Metabolit BAL Tempoyak
Uji Kualitatif
Uji Kuantitatif
Zona Jernih
Total Plate Count Bakteri Daging
Indeks Antibakteri
Data Total Plate Count
Gambar 2. Diagram Alir Penelitian
