17
III. METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung pada Januari 2015 sampai Maret 2015.
B. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik, inkubator, cawan petri, erlenmeyer, beaker glass, gelas ukur, bunsen, botol semprot, spatula, jarum ose, tabung reaksi, rak tabung reaksi, lemari pendingin, vortex mixer, oven, plastik tahan panas, aluminium foil, kapas, kertas label, tisue, transformator dan solenoida, water bath shaker, colony counter, micropipet, pipet tip, tabung eppendorf, autoclave, laminar air flow, hot plate magnetig stirrer, sentrifuge, spektrofotometer.
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Nutrient Broth; medium Agar Bacteriological; media Mandels yang dimodifikasi dengan komposisi: carboxymethyl-cellulose (CMC) 0,5%, yeast extract 0,35%, trypton water 0,35%, NaCl 0,2%, dan
0,245%, Mg
O 0,035%,
0,17%; alkohol 70%; buffer sitrat 50mM pH 6; DNS (3,5 -
18
dinitrosalicylic acid); spiritus; aquades; glukosa; dan isolat Bacillus sp. koleksi Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Unila.
C. Metode Penelitian
Penelitian disusun secara faktorial menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT). Faktor pertama adalah kuat medan magnet terdiri dari 4 taraf perlakuan kuat medan magnet yaitu: 0mT; 0,1mT; 0,2mT; 0,3 mT. Faktor kedua adalah lama pemaparan yang terdiri dari 4 taraf perlakuan lama pemaparan yaitu: 0, 10, 20, 30 menit. Masing – masing unit perlakuan diulang 3 kali. Data yang diperoleh adalah pertumbuhan relatif dan aktivitas relatif enzim selulase Bacillus sp. yang kemudian dianalisis secara deskriptif.
D. Pelaksanaan Penelitian
1. Peremajaan Inokulum Bacillus sp
Biakan murni bakteri Bacillus sp. dipindahkan ke media Mandels yang dimodifikasi dengan komposisi : carboxymethyl-cellulose (CMC) 0,5%, yeast extract 0,35%, trypton water 0,35%, NaCl 0,2%, Mg
O 0,035%, dan
0,245%,
0,17% serta ditambahkan Agar
Bakteriological 1,5 %,. Biakan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam.
19
2. Uji Pendahuluan
Dalam kajian ini dilakukan uji pendahuluan pemaparan medan magnet pada media Mandels yang dimodifikasi dengan menambahkan agar padat dengan 2 cara pemaparan, yaitu 1) pemaparan medan magnet pada media Mandels yang dimodifikasi dan belum diisi inokulum Bacillus sp., 2) pemaparan medan magnet pada media Mandels yang dimodifikasi dan telah di inokulasikan dengan Bacillus sp. masing – masing disertai dengan kontrol (tanpa pemaparan medan magnet). Kuat medan magnet yang digunakan adalah sebesar 0,2 mT dengan waktu pemaparan 5,10, dan 15 menit pada masing – masing perlakuan. Semua inokulum Bacillus sp. kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 12 jam. Inokulum Bacillus sp. yang telah diinkubasi diwarnai dengan menggunakan congo red untuk melihat zona jernihnya.
3. Pembuatan Starter Bacillus sp.
Bakteri Bacillus sp. dari biakan murni dipindahkan ke media Mandels yang dimodifikasi dengan komposisi seperti pada bagian 1, tanpa ditambahkan Agar Bakteriological. Biakan kemudian diinkubasi di dalam waterbath shaker pada suhu 40°C dan di goyang dengan kecepatan 80 rpm selama 18 jam.
20
4. Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Produksi Enzim Selulase Bacillus sp. Pada Media Mandels yang Dimodifikasi
Media Mandels yang dimodifikasi dan telah disterilkan diinokulasi dengan 5 ml starter Bacillus sp. yang berumur 18 jam. Biakan diinkubasi pada suhu 40°C selama 0, 6, 12, 18, 24, dan 30 jam di dalam waterbath shaker dengan kecepatan goyangan 80 rpm. Setelah selesai diinkubasi, media kultur disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Cairan supernatan yang terbentuk merupakan ekstrak kasar enzim selulase yang akan ditentukan aktivitasnya dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer.
5. Pemaparan Media Produksi Enzim Selulase Dengan Medan Magnet
Media untuk produksi enzim selulase menggunakan media Mandels yang dimodifikasi sebanyak 50 ml di dalam erlenmeyer 250 ml, media produksi kemudian diberi perlakuan pemaparan medan magnet dengan kuat medan magnet dan lama pemaparan seperti yang tertera pada metode penelitian bagian C.
6. Produksi Enzim Selulase
Media produksi enzim selulase (media Mandels yang dimodifikasi) yang telah diberi perlakuan pemaparan medan magnet diinokulasi dengan 5 ml starter Bacillus sp. yang berumur 18 jam. Biakan kemudian diinkubasi pada suhu 40°C selama 18 jam di dalam waterbath shaker dengan kecepatan goyangan 80 rpm. Setelah selesai diinkubasi, media kultur
21
disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Cairan supernatan yang terbentuk merupakan ekstrak kasar enzim selulase yang akan ditentukan aktivitasnya.
7. Pengujian Aktivitas Enzim Selulase
Pengujian aktivitas enzim selulase dilakukan dengan empat tahap, yaitu: penentuan gula standar glukosa, penentuan suhu optimum inkubasi enzim selulase, uji aktivitas enzim selulase, dan perhitungan aktivitas enzim selulase.
1. Penentuan Gula Standar Glukosa
Larutan gula standar yang digunakan adalah larutan standar reduksi glukosa pada interval 0-500 μg/ml. Berdasarkan metode Bernfeld (1955), gula standar glukosa ditentukan dengan cara membuat satu seri larutan glukosa standar secara berurutan dari konsentrasi 0 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, 400μg/ml, 500 μg/ml dalam tabung reaksi. Selanjutnya sebanyak 0,5 ml 0,1 % CMC (carboxymethylcellulose) dalam buffer sitrat pH 6 dicampur dengan 0,5 ml larutan glukosa. Ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1ml larutan DNS. Campuran tersebut dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Pendinginan larutan standar dilakukan dalam air dingin selama 20 menit sebelum dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 575 nm.
22
2. Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim Selulase
Media Mandels modifikasi berisi kultur Bacillus sp. yang telah diinkubasi selama 18 jam disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit. Cairan supernatan yang terbentuk merupakan ekstrak kasar enzim selulase. Ekstrak kasar enzim selulase ini kemudian akan diuji aktivitasnya dengan menggunakan 2 perlakuan yaitu: 1) 0,5 ml ekstrak kasar enzim selulase dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi buffer sitrat pH 6 (0,5 ml) tanpa diinkubasi, lalu ditambahkan dengan 1 ml DNS dan dipanaskan dalam waterbath shaker selama 15 menit untuk perlakuan kontrol. 2) 0,5 ml ekstrak kasar enzim selulase dimasukkan kedalam tabung reaksi yang berisi buffer sitrat pH 6 (0,5 ml) diinkubasi selama 30 menit pada suhu 30, 40, 50, 60, dan 70°C. Ekstrak kasar enzim selulase + buffer sitrat pH 6 lalu ditambahkan dengan 1 ml DNS dan dipanaskan dalam waterbath shaker selama 15 menit untuk perlakuan uji. Masing – masing larutan enzim dalam tabung reaksi yang telah dipanaskan kemudian didinginkan selama 20 menit pada air es, setelah itu dibaca absorbansinya dengan pengukuran menggunakan spektrofotometer. Hasil pengukuran absorbansi dari spektrofotometer kemudian digunakan untuk menghitung aktivitas enzim selulase dan menentukan suhu inkubasi optimum aktivitas enzim selulase.
23
3. Uji Aktivitas Enzim Selulase
Penentuan aktivitas enzim selulase dilakukan berdasarkan kadar glukosa yang dihasilkan. Kadar glukosa di ukur dengan menggunakan metode DNS (Miller, 1995). Supernatan diambil sebanyak 0,5 ml, kemudian dicampurkan dalam tabung sampel dengan CMC 0,5% dalam buffer sitrat sebanyak 0,5 ml dan dinkubasi selama 30 menit pada suhu 40°C. Sebagai kontrol digunakan campuran enzim dan larutan CMC 0,5% yang langsung dipanaskan tanpa diinkubasi selama 30 menit. Ke dalam tabung kontrol ditambahkan 1 ml 3,5- dinitrosalicylic acid. Semua tabung sampel dihomogenkan dan dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit. Tabung sampel kemudian didinginkan dengan air dingin selama 20 menit selanjutnya diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 575 nm. Absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menentukan kadar gula dengan rumus persamaan regresi linier Y = a + bx. Nilai a dan b diperoleh dari perhitungan gula standar, Y merupakan nilai absorbansi pada panjang gelombang 575 nm dan x adalah kadar glukosa yang dihasilan. Satu unit dari aktivitas selulase diartikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan µ mol glukosa dalam satu menit pada kondisi pengujian.
24
Tabel 1. Prosedur uji enzim selulase Bahan
Kontrol
Enzim
-
Uji 0,5 mL
0,5% CMC dalam buffer 0,05 M 0,5 mL 0,5 mL ....................................................................................................................... Enzim+Buffer diinkubasi pada suhu tertentu selama 30 menit dalam waterbath shaker Larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam air es (untuk menghentikan aktivitas enzim) ....................................................................................................................... Larutan DNS 1 mL 1 mL Enzim 0,5 mL ....................................................................................................................... Sampel dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit Sampel didinginkan di air dingin selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran absorbansi menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 575 nm
4. Perhitungan Aktivitas Enzim Selulase
Aktivitas enzim selulase didapatkan dengan perhitungan menggunakan rumus sebagai berikut: Aktivitas enzim selulase = Keterangan: Berat molekul glukosa
= 180 gram/mol
Waktu inkubasi
= 30 menit
5. Penentuan Pertumbuhan Bakteri Bacillus sp.
Penentuan pertumbuhan bakteri selulolitik dilakukan dengan menghitung jumlah koloni bakteri yang menghasilkan zona jernih disekitar koloni menggunakan metode pour plate. Sebanyak 1 ml isolat Bacillus sp. pada
25
media Mandels yang dimodifikasi divortex selama 1 – 2 menit lalu dimasukkan ke dalam garam fisiologis 9 ml (pengenceran Kemudian satu ml suspensi dari pengenceran
).
dipindahkan
menggunakan mikropipet ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml garam fisiologis steril sehingga didapatkan pengenceran suspensi dari pengenceran
. Lalu satu ml
dipindahkan dengan mikropipet ke dalam
tabung reaksi yang berisi 9 ml garam fisiologis steril sampai pengenceran , dengan cara yang sama.
Sebanyak 1 ml suspensi dari seri pengenceran
dan
masing-
masing dimasukkan ke dalam cawan petri steril kemudian ditambahkan media Mandels yang dimodifikasi dengan menambahkan agar padat dan dibiarkan hingga padat. Setelah media padat, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37° C. Setelah masa inkubasi berakhir, kultur bakteri ditetesi larutan congo red 0,1%. Koloni-koloni yang membentuk zona jernih menunjukkan adanya aktivitas bakteri selulolitik. Koloni yang membentuk zona jernih kemudian dihitung dengan menggunakan colony counter.
