Pavlína Tinavská Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice

Pavlína Tinavská Laboratoř imunologie, Nemocnice České Budějovice



nízce agresivní lymfoproliferativní onemocnění



základem je proliferace a akumulace klonálních maligně transformovaných vyzrálých B lymfocytů



charakteristický imunofenotyp: CD19+CD5+CD23+CD20lowCD22+CD200+ bez exprese lehkých

povrchových řetězců kappa i lambda 

postupný vzrůst počtu lymfocytů je způsoben nekontrolovanou

klonální proliferací, poruchou jejich zániku, dlouhověkostí



nejčastější leukémie v Evropě a Severní Americe



25 – 30 % všech leukémií



incidence v Evropě 3/100 000



obvyklá je u starší populace, zřídka u lidí mladších 50-ti let, 2x častější u mužů, nepostihuje děti



choroba má dlouhé, roky až desetiletí trvající bezpříznakové období – jediným znakem nemoci je lymfocytóza v periferní

krvi i kostní dřeni



klinické příznaky až při pokročilejším stadiu onemocnění (při vyšší mase maligních buněk)





teploty neinfekčního původu



zvýšené noční pocení



úbytek na váze



anémie a trombocytopenie s krvácivými příznaky



zvětšení uzlin a sleziny



infiltrace nelymfatických orgánů

deficit T buněčné imunity – zvýšená náchylnost k častějším virovým infekcím



3 typy B-CLL 

typická (malé uniformní vyzrálé lymfocyty, < 10 % atypických lymfocytů)



smíšená B-CLL/B-PLL (11 – 51 % prolymfocytů)



atypická (> 10 % atypických lymfocytů, < 10 % prolymfocytů)



heterogenní onemocnění s vysoce variabilní prognózou



klinická kritéria pro klasifikaci stupně pokročilosti onemocnění





tumorózní masa



rychlost progrese onemocnění



senzitivita k chemoterapii

2 systémy dle Raie a Bineta

0

Rai Lymfocytóza přes 15 000

Binet A

I

Lymfocytóza, lymfadenopatie

B

II

Lymfocytóza, hepatosplenomegalie

C

III

Lymfocytóza, anémie

IV

Lymfocytóza, trombocytopénie

Postižení méně než 3 lymfoidních oblastí* Postižení více než 3 lymfoidních oblastí Anémie nebo trombocytopénie

*lymfoidní oblast: uzliny krční, axilární, linguinální, slezina, játra



na základě systémů klinického stagingu nelze přesně předpovědět prognózu jednotlivých pacientů zejména v časných stadiích tohoto onemocnění



přesnější a časnější stratifikace tohoto onemocnění pomocí biologických prognostických ukazatelů



Cytogenetické aberace

pozitivní x negativní prognostické markery



Del 13q – ovlivnění exprese anti-apoptického proteinu Bcl-2



Trisomie chromozómu 12 – atypická morfologie lymfocytů



Del 17p – rychlá progrese nemoci, špatná odpověď na léčbu



Del 11q – změny v signálních drahách zprostředkovanými některými supresorovými geny (p53)





Sérové prognostické markery 

b2 – mikroglobulin



sérová CD23 (> 2700 U/ml)



thymidin kináza (sTK)

Molekulární prognostické markery 

exprese CD38



mikro RNA na 13 chromozómu



Bcl-2 gen – inhibice apoptózy



mutační status genů pro variabilní části těžkých řetězců imunoglobulinů (IgVh)



ZAP70 (70 kDa zeta – asociovaný protein)



vysoká prognostická hodnota



postačující k určení prognózy pacienta 

mutované IgVh geny se liší od sekvence odpovídající zárodečné linie o více než 2 % (s homologií se zárodečnou linií < 98 %) = pozitivní MS





nemutované IgVh (s homologií se zárodečnou linií >98 %) = negativní MS

běžné používání v diagnostice a určování prognózy u nemocných s B-

CLL naráží na časovou a technickou náročnost provedení tohoto vyšetření 

zástupné markery technicky i finančně dostupnější – jedním z genů, které umožňují odlišit mutovanou a nemutovanou formu B-CLL je gen pro ZAP-70



zeta – asociovaný protein o molekulové hmotnosti 70 kDa



gen pro ZAP-70 na dlouhém rameni 2. chromozómu



tyrozinkináza složená ze 3 funkčních jednotek



normálně exprimována v cytoplazmě T lymfocytů a NK buněk



je součástí TCR a hraje zásadní roli v T- buněčné signalizaci vedoucí k aktivaci T lymfocytů



u normálních B lymfocytů není ZAP-70 exprimován



exprese v maligních lymfocytech B-CLL vysoce koreluje s nemutovanou formou tohoto onemocnění



je prokázána souvislost mezi vyšší hladinou exprese ZAP-70 a rychlejší progresí nemoci a kratší dobou přežívání pacientů



významný prognostický marker doplňující vyšetření mutačního stavu genu pro variabilní části

těžkých řetězců imunoglobulinů u pacientů s B-CLL



Imunohistochemie



Western blotting



Stanovení ZAP-70 mRNA (PCR)



Průtoková cytometrie – nejčastěji používaná metoda 

velmi dobrá dostupnost



relativní snadnost a časová nenáročnost



bez potřeby separace čisté populace B lymfocytů



absence jednotně užívané standardizované metodiky



intracelulární značení pomocí MAbs



stanovení exprese ZAP-70 na CD5+ T lymfocytech a CD56+ NK

buňkách jako vnitřní kontrola 

hranice pro pozitivitu je volena dle statisticky zjištěné hodnoty nejlépe korelující s mutačním stavem IgVh nebo s výsledky citlivějších metod



poměrné vyjádření exprese ZAP-70 pomocí střední intenzity

fluorescence (MeanFluorescenceIndex) maligních buněk B-CLL a kontrolních T lymfocytů

Hraniční mez pozitivity ZAP – 70: % ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2

MFI (T-ly/B-CLL) < 3



muž K.N., 1936



lymfocytóza 81 %



celkově cca 74 % CD19+CD5+ B lymfocytů



pozitivní mutační status - 93 % homologie



mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

x-mean T - Ly = 1,71

x-mean B - CLL = 0,28



MFI = 0,164



0,67 % ZAP-70+

buněk B – CLL 

ZAP – 70 negativní



lepší prognóza



muž Z.Č., 1950



lymfocytóza 93 %



celkově cca 71 % CD19+CD5+ B lymfocytů



negativní mutační status - 100 % homologie



nemutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

x-mean T - Ly = 3,79

x-mean B - CLL = 1,29



MFI = 0,340



79,2 % ZAP-70+

buněk B – CLL 

ZAP – 70 pozitivní



horší prognóza



žena A.K., 1943



lymfocytóza 67 %



celkově cca 52 % CD19+CD5+ B lymfocytů



pozitivní mutační status – 90% homologie



mutovaný stav genu Vh3 pro variabilní část těžkého

imunoglobulinového řetězce

x-mean T - Ly = 2,52



MFI = 0,163



1,72 % ZAP-70+

x-mean B – CLL = 0,41

buněk B – CLL 

ZAP – 70 negativní



lepší prognóza



muž P.P., 1959



lymfocytóza 60 %



celkově cca 53 % CD19+CD5+ B lymfocytů



negativní mutační status - 99,7 % homologie



nemutovaný stav genu Vh5 pro variabilní část těžkého imunoglobulinového řetězce

x-mean T - Ly = 3,01

x-mean B - CLL = 1,12



MFI = 0,372



59,8 % ZAP-70+

buněk B – CLL 

ZAP – 70 pozitivní



horší prognóza



MFI = 0,163 < 0,2



1,72 % ZAP-70+ buněk B – CLL < 20 %



ZAP – 70 negativní



mutovaný gen IgVh



lepší prognóza



MFI = 0,372 > 0,2



59,8 % ZAP-70+ buněk B – CLL > 20 %



nemutovaný gen IgVh



ZAP – 70 pozitivní



horší prognóza



Adams et al., 2014: Prognostic Value of ZAP-70 Expression in Chronic Lymphocyic Leukemia as Assessed by Quantitative Polymerase Chain Reaction and Flow Cytometry. Clinical Cytometry. 2014. 86B: 80-90.



Rossi et al., 2010: Prognostic impact of ZAP-70 expression in chronic lymphocytic leukemia: mean fluorescence intensity T/B ratio versus percentage of positive cells. Journal of Translational Medicine. 2010.8:23.



Princip et al., 2006: Clinical significance of ZAP-70 protein expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Blood. 2006, 108/3:853 – 861.



MFI = 0,163 < 0,2



1,72 % ZAP-70+ buněk B – CLL < 20 %



ZAP – 70 negativní



pozitivní mutační status



lepší prognóza Hraniční mez pozitivity ZAP – 70: % ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2 MFI (T-ly/B-CLL) < 3



MFI = 0,372 > 0,2



59,8 % ZAP-70+ buněk B – CLL > 20 %



ZAP – 70 pozitivní



negativní mutační status



horší prognóza Hraniční mez pozitivity ZAP – 70:

% ZAP-70+ buněk B-CLL > 20 % MFI (B-CLL/T-ly) > 0,2 MFI (T-ly/B-CLL) < 3