Optimalizace metodiky ELISA pro stanovení obsahu Cry3Bb1 toxinu v různých částech kukuřice pomocí komerčního kitu O. Habuštová, F. Sehnal, Z. Svobodová, H. M. Hussein
3
Uplatněná metodika vznikla za podpory projektu NAZV QH91093 a GA 229518 (EU 7.RP)
ISBN: 978-80-86668-11-6
2
Biologické Centrum AV ČR v.v.i., Entomologický ústav
Optimalizace metodiky ELISA pro stanovení obsahu Cry3Bb1 toxinu v různých částech kukuřice pomocí komerčního kitu U P L AT N Ě N Á M E T O D I K A
Autorský kolektiv: O. Habuštová, F. Sehnal, Z. Svobodová, H. M. Hussein
České Budějovice 2011
1
Uplatněná metodika vznikla za podpory projektu NAZV QH91093 a GA 229518 (EU 7.RP) OPONENTI: Prof. RNDr. Dalibor Kodrík, CSc. – Přírodovědecká fakulta Jihočeské Univerzity Ing. Hana Jiráková, Ph.D. – Ministerstvo životního prostředí
© Biologické Centrum AV ČR v.v.i, 2011 ISBN: 978-80-86668-11-6
2
OBSAH I.
Cíl metodiky 5
II. Uplatnění metodiky 5 III. Úvodní definice (popis využití metodiky při práci s GMO)
5
1. GMO (geneticky modifikované organismy)
5
2. Cry3Bb1 protein a jeho původ
7
2.1. Exprese Cry3Bb1 v GM kukuřici a jeho determinace 7 2. 2. Způsoby stanovení proteinu
8
3. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
9
3.1. Základní složky ELISA testů a různé způsoby provedení 10 a. Přímá ELISA 10 b. Nepřímá ELISA 12 c. Přímá sendvičová ELISA 13 d. Nepřímá sendvičová ELISA
14
e. ELISA na tyčinkách (dipsticích)
14
4. Komerční kity pro stanovení Cry toxinů
15
a. Přímá sendvičová ELISA – komerční kit
15
b. ELISA – imunologická páska
17
4.1. Vlastní stanovení ELISA testu komerčním kitem
17
4.2. Statistické zpracování 20 IV. Srovnání novosti postupů 22 V. Přehled použité literatury 22 VI. Odkazy na původní vědecké práce autorů související s metodikou 23
3
ABSTRACT This publication provides information on Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) that is widely used in biological research, medicine, and industry for quantification of diverse antigene compounds. The major purpose of this book guide is a detail description of the ELISA usage for the monitoring of Cry toxins in the plant tissues of genetically modified crops. The Cry toxins are products of Bacillus thuringiensis genes used in plant transformations to make them resistant against specific insect pests. In our work we use ELISA to compare Cry content in different parts of the genetically modified maize during the growing season. We hope that this guide will simplify usage of ELISA not only for the measurements of Cry toxins but also for the analysis of other compounds present in plants naturally and as a result of transgenosis.
4
I. CÍL METODIKY Konkrétním cílem metodiky je popis a návod k použití modifikované metody ELISA pro monitorování exprese bakteriálního endotoxinu Cry 3Bb1 v průběhu vegetačního období ve všech částech rostlin geneticky modifikované (GM) kukuřice MON88017 a vyhodnocení závislosti změn exprese na povětrnostních podmínkách. Zvládnutí kvantifikace Cry toxinů usnadní využití ELISA i pro další imunologická stanovení nejrůznějších antigenů v biologickém materiálu.
II. UPLATNĚNÍ METODIKY Metodika umožní odborné veřejnosti pochopení metody ELISA a její zavedení na řadě pracovišť experimentálního, provozního i výukového charakteru. Metoda je použitelná k detekci geneticky modifikovaného materiálu, například příměsi přímo v porostech plodiny nebo ve sklizeném produktu.
III. Úvodní definice (POPIS VYUŽITÍ METODIKY PŘI PRÁCI S GMO) 1. GMO (geneticky modifikované organismy) Za geneticky modifikovaný organismus (GM organismus, GMO) je považován organismus, jehož dědičná informace uložená v DNA byla změněna pomocí technik genového inženýrství, tedy jiným způsobem než běžným rozmnožováním a kombinací vloh rodičovského páru. Geneticky modifikovány mohou být rostliny, zvířata i mikroorganismy. Jedná se o moderní šlechtitelské metody (genové inženýrství) z oblasti biotechnologií, které využívají v přírodě probíhající procesy. Nejčastějším případem genetické modifikace je transgenóze, tj. vnesení genu z jiného organizmu (případně syntetického genu, který z přírodního genu vychází). Cílem genetických modifikací je získání vhodných vlastností, mezi které patří zejména odolnost vůči škodlivým činitelům – škůdcům, chorobám, chladu, suchu apod., anebo tolerance vůči postřiku neselektivním herbicidem, který potlačuje všechny ostatní, nežádoucí rostliny (plevele). GM plodiny s uvedenými vlastnostmi přinášejí výhody především 5
pěstitelům. Nyní vyvíjené a zkoušené GM plodiny mají přímý přínos také pro spotřebitele – např. GM plodiny s vyšším obsahem či lepší skladbou nutričních látek nebo GM plodiny s antikarcinogenními účinky. Jiné GM plodiny jsou připravovány pro využití v lékařství nebo v průmyslu – např. jedlé vakcíny, biodegradovatelné plasty, náhrada fosilních paliv, odstraňování znečištění aj. K výhodným vlastnostem, kterých lze docílit genetickou modifikací, patří také například lepší nutriční hodnoty, tolerance vůči nepříznivému klimatu a rezistence vůči škůdcům (Bt toxin). Zásahy do genetického materiálu organismů můžeme rozdělit na dva základní typy. Prvním jsou nahodilé zásahy působením mutagenů nebo ionizujícího záření. Takto vznikla většina současných odrůd pšenice, řepky a dalších plodin. Tyto nahodilé zásahy však nejsou považovány za genetickou modifikaci a nevztahují se na ně regulace vyplývající ze zákona o nakládání s GMO (zákon č. 78/2004 Sb.). Druhým typem jsou cílené zásahy – mutace získané tak, že do organismu vneseme nebo v něm cíleně deaktivujeme nějaké konkrétní geny (např. rostliny, do nichž byl za pomoci bakterie Agrobacterium tumefaciens vnesen gen pro toleranci k herbicidům nebo gen pro produkci proteinu s toxickým účinkem, který působí v zažívacím ústrojí určitých druhů hmyzu - viz např. Bt kukuřice). Kvůli obavě z příměsi GM plodin v netransgenní produkci podléhá jejich pěstování specifickým pravidlům, která se někdy také nazývají pravidla koexistence. Cílem pravidel koexistence je stanovit opatření k minimalizaci potenciálních ekonomických ztrát, které mohou vzniknout přimícháním produktů GMO do konvenčních či do Bio produktů. V ČR se mohou produkčně pěstovat pouze takové GM plodiny, které prošly přísným schvalovacím procesem na úrovni EU, zahrnujícím mj. posouzení jejich případných rizik pro zdraví lidí a zvířat i pro životní prostředí a jejichž odrůdy byly zapsány do Státní odrůdové knihy v ČR příp. do Společného katalogu odrůd druhů zemědělských rostlin v EU. Pro pěstování v ČR, resp. EU, je povolena GM kukuřice typu MON810, tzv. Bt kukuřice, a od roku 2010 také GM brambory EH 92527–1 (komerční název Amflora) se změněným složením škrobu. V evropském kontextu se ČR řadí k dalším 7 státům EU (Španělsko, Rumunsko, Francie, Portugalsko, Německo, Polsko a Slovensko), které mají praktické zkušenosti s pěstováním této kukuřice. V ČR se Bt kukuřice pěstuje pro produkční účely od roku 2005; jedná se tedy prozatím o limitované zkušenosti, a to jak z časového pohledu, tak i z pohledu jejich minoritního podílu na celkové ploše zemědělské produkce. GM brambory Amflora byly v r. 2010 poprvé vysázeny kromě České republiky také v Německu a Švédsku. V roce 2011 bude Amflora vysazena pouze v Německu a ve Švédsku. 6
2. Cry3Bb1 protein a jeho původ Bacillus thuringiensis (Eubacteria) je grampozitivní půdní bakterie, která při sporulaci tvoří v buňce krystal speciální bílkoviny, a proto tato bílkovina dostala název Cry-protein. Protože je toxická pro hmyz, nazývá se také delta-endotoxin (δ-endotoxin). Dosud bylo popsáno 89 různých kmenů této bakterie tvořících různé Cry-proteiny. Geny pro ně jsou na plasmidech, které se snadno předávají mezi bakteriálními buňkami. Když je Cry-protein pozřen určitým hmyzím jedincem, krystal se za vhodných podmínek rozpustí. Tyto podmínky zahrnují především různou kyselost trávicích šťáv (nutnou pro rozpuštění krystalů různých Cry-proteinů), čímž je dána hrubá specifičnost účinku. Rozpuštěná bílkovina se naváže specificky systémem podobným reakci antigen-protilátka na receptory buněk výstelky trávicí trubice. Takové buňky pak mají narušenou buněčnou membránu a hynou. To vede k narušení střevní stěny a uhynutí hmyzu. Selektivní účinek Cry-toxinu je dán výběrem typu Cry-toxinu a druhově specifického receptoru v trávicím systému hmyzu. Těmito způsoby je účinek každého typu Cry-proteinu omezen na úzkou skupinu, např. jen na housenky motýlů (Lepidoptera), brouky (Coleoptera) nebo jejich larvy, larvy much (Diptera) a podobně. Některé působí i na háďátka (Nematoda). Díky této vlastnosti se používá buněk B. thuringiensis jako specifického insekticidu. Omezením je však jeho cena i načasování doby postřiku bakteriální kulturou, protože její buňky musí být na listu přítomny v době žíru škůdce. Při nepříznivém počasí je proto účinnost omezená. To vedlo genetické inženýry k zařazení genu pro Cry-proteiny (nebo pro jejich účinnou část) přímo do genomu rostliny, která tvoří příslušný toxický protein přímo ve svých buňkách. Takto vytvořené odrůdy se označují jako Bt-odrůdy. To ještě zvyšuje specifičnost Cry-proteinu, protože zasažen je jen hmyz, který konzumuje Bt-plodinu, nikoli např. hmyz živící se plevelem, který by při plošném postřiku kulturou bakterií byl také postihnut. Insekticidní spektrum proteinu Cry3Bb1, získaného z B. thuringiensis subsp. kumamotoensis, je omezeno jen na několik druhů brouků čeledi mandelinkovitých (Chrysomelidae). Tento protein je toxický pro larvy mandelinky bramborové (Leptinotarsa decemlineata) a bázlivce kukuřičného (Diabrotica spp.). 2.1. Exprese Cry3Bb1 v GM kukuřici a jeho determinace Příprava Bt kukuřice MON 88017 se provádí pomocí transgenóze prostřednictvím bakterií Agrobacterium tumefaciens. MON 88017 exprimuje protein CP4 EPSPS způsobující toleranci rostlin ke glyfosátu. Glyfosát je účinnou
7
látkou herbicidu Roundup®1, který se běžně využívá v zemědělské praxi. Genetická událost MON 88017 rovněž exprimuje modifikovaný protein Cry3Bb1. Exprese tohoto proteinu poskytuje rostlinám ochranu proti některým hmyzím škůdcům z řádu brouků (Coleoptera). V našich podmínkách poskytuje ochranu proti významnému škůdci kukuřice bázlivci kukuřičnému (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). V současné době se v praxi pěstují dva kultivary kukuřice s obsahem Cry3Bb1 proteinu. Cry3Bb1 exprimovaný v kukuřici MON 88017 je od původního proteinu izolovaného z B. thuringiensis sp. kumatomoensis odlišný pozicí šesti aminokyselin a od Cry3Bb1 z kultivaru MON 863 pozicí jedné aminokyseliny. Kukuřice MON 863 byla uvolněna ke komerčnímu využití ve Spojených státech už v roce 2003, proto v současné době existuje relativně hodně výsledků polních experimentů s touto transformační událostí. Kukuřice MON 88017 byla uvolněna do zemědělské praxe v USA až v roce 2005 a zatím bylo zaznamenáno jen několik málo polních studií. Dosud nebyl prokázán jasný negativní efekt Cry3Bb1 vůči necílovým druhům žijícím na rostlinách, včetně predátorů z řádu Coleoptera a jiných prospěšných druhů hmyzu. 2.2. Způsoby stanovení proteinu I. Imunochemické metody Imunochemické metody jsou založeny na použití protilátek jako specifických vazebných činidel. Pomocí imunochemických metod lze stanovit v původním biologickém materiálu celou řadu cizorodých antigenů (farmaka, toxické látky), látky tělu vlastní, látky infekčního původu nebo specifické protilátky vzniklé na nějaký imunologický podnět. Imunologické metody můžeme dělit na • Imunoprecipitační – interakce antigenu s protilátkou a detekce tvorby precipitátu • Imunochemické – tvorba komplexu antigen-protilátka a jeho detekce další značenou protilátkou (latexová aglutinace, ELISA, imunosenzory, imunobloting, dot-, blot- a další) • IMS – imunomagnetická separace-vazba buněk na specifické protilátky imobilizované na magnetické částice
1 Roundup, Roundup Ready a YieldGard jsou registrované ochranné známky společnosti Monsanto Technology LLC.
8
II. Metody molekulární biologie 1) restrikční analýza DNA, 2) hybridizace získaných fragmentů DNA, 3) dot-, blot- a slot-hybridizace, 4) reverzní transkripce, 5) amplifikační metody, polymerázová řetězová reakce (PCR), 6) elektroforetické metody, PFGE, PAGE, DGGE, TGGE, 7) sekvenování nukleových kyselin, apod. • Kvalitativní PCR • Kvantitativní (real-time ) PCR • DNA-sondy • Hybridizace Všechny vyjmenované metody imunochemické i metody molekulární biologie mají široké uplatnění při: • Identifikaci mikroorganismu • Detekci patogenu • Detekci jednobodových mutací • Detekci viru • Detekci transgenu v živém i zpracovaném biologickém materiálu
3. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) využívá, stejně jako všechny ostatní imunochemické metody, interakce antigenu se specifickými protilátkami in vitro za tvorby imunokomplexu antigen-protilátka. Stanovení tohoto komplexu je umožněno navázáním vhodné značky (v tomto případě enzymu) na jednoho z imunoreaktantů. ELISA je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci a kvantifikaci protilátek a antigenu. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to schopnost proteinů (tedy i imunoglobulinů) vázat se na povrch umělých hmot (např. polystyrenu) a za druhé pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty svých molekul. ELISA destička
9
3.1. Základní složky ELISA testů a různé způsoby provedení I. Antigen • detekovaný protein v testovaném vzorku • standard sloužící ke kalibraci ELISA II. Primární protilátka • antisérum, imunoglobuliny proti detekovanému antigenu III. Konjugát • sekundární protilátka reagující s primární protilátkou (které se chová vůči sekundární protilátce jako antigen), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná s enzymem) IV. Substrát • je chemická látka, která reaguje s enzymem za vzniku barevného produktu, jehož intenzita je úměrná množství detekovaného antigenu ELISA metoda má řadu modifikací. V následujícím přehledu jsou popsány ty nejběžnější, jimiž jsou: ELISA přímá, nepřímá, přímá sendvičová, nepřímá sendvičová a méně známa ELISA na tyčinkách. Je však třeba podotknout, že v oblasti ELISA testů není jednotná terminologie. Ta se může u různých literárních zdrojů lišit, proto je třeba si princip stanovení vždy pečlivě prostudovat. A. Přímá ELISA Imunoanalýzu lze rozdělit na kompetitivní a nekompetitivní. Na příkladu stanovení antigenu ve vzorku lze vysvětlit princip kompetitivního stanovení. • Kompetitivní imunoanalýza využívá jen jednu protilátku, která je v reakci přítomna v omezeném množství. O její vazebná místa soutěží (kompetuje) značený antigen, který je v mírném přebytku, s antigenem neznačeným, který je stanovovaným vzorkem. Kvantifikaci umožňuje značený antigen. Množství komplexu se značeným antigenem je nepřímo úměrné množství stanovovaného neznačeného antigenu. Tedy čím vyšší je koncentrace vzorku, tím nižší bude intenzita měřeného signálu v komplexu a tím vyšší bude koncentrace (signál, např. barevná látka navázaná na protilátku) nenavázaného značeného antigenu. • Nekompetitivní imunoanalýza používá primární protilátku v nadbytku. Reakce se účastní pouze jeden antigen a tím je analyzovaná látka. Komplex protilátka-antigen se kvantifikuje pomocí sekundární protilátky, která nese signál nebo je konjugována s enzymem. • Přímá nekompetitivní ELISA - „Sandwich“ Nejčastěji využívané uspořádání ELISA je přímý nekompetitivní (tzv. „sendvičový“) formát. V prvním kroku je na pevnou fázi (ELISA destičku) navázána primární protilátka. Poté je přidán antigen, který interaguje s navázanou 10
protilátkou. Po odstranění nenavázaných složek následuje aplikace sekundární protilátky značené enzymem (nejčastěji peroxidáza, alkalická fosfatáza, beta-galaktosidáza), která se váže na primární protilátku. K detekci je využita enzymová reakce, kdy je bezbarvý substrát přeměněn na barevný produkt. Přímá ELISA může být považována za nejjednodušší formu ELISA. Průběh stanovení, jenž je názorně předveden Obr. 1 Přímá ELISA. V první jamce je přidaný antigen (Ag) pasivně adsorbona obrázku 1, lze popsat takto: ván na pevnou fázi. Po promytí jsou Antigen je zředěn pufrem, který přidány enzymem značené protilátky má obvykle vysoké pH (9,6); bývá po(Ab*) vázající se na antigen, což je naznačeno v druhé a třetí jamce. Po inužíván karbonátový pufr (CB) nebo kubaci a promytí je přidán substrát/ neutrální fosfátový pufr s přídavkem chromofor (S) a dochází k barvené chloridu sodného (PBS). Důležité je, změně (viz jamka čtvrtá). Nakonec že pufr neobsahuje žádné jiné proteije přidán „zastavovací roztok“, čímž ny, které by mohly soutěžit s cílovým dojde k další barevné změně a především zastavení reakce. antigenem o navázání na plastovou (polystyrenovou) pevnou fázi (stěny a dno jamky v ELISA destičce). Antigeny jsou hlavně přírodní proteiny, připojující se pasivně během doby inkubace na pevnou fázi. Během inkubace je kvůli reprodukovatelnosti výsledků důležité používat standardní teplotní (zpravidla 37 °C) a časové podmínky. Po inkubaci je nadbytek antigenu odstraněn jednoduchým promytím, tj. naplněním a vyprázdněním jamek PBS pufrem. Nyní je přidána specifická primární protilátka nesoucí nějakou signální molekulu anebo konjugovaná s enzymem, tzv. konjugát, který reaguje specificky s antigenem navázaným na pevnou fázi. Konjugované protilátky jsou ředěny pufrem obsahujícím několik látek, které inhibují pasivní adsorpci proteinu, ale které stále umožňují imunologickou vazbu. Takové látky jsou buď jiné proteiny, (např. mléčné nebo bovinní sérové bílkoviny) které jsou přidány ve vysoké koncentraci pro soutěžení s protilátkou o místa na pevné fázi, nebo to jsou detergenty v nízké koncentraci, označované jako blokační činidla, obsažené v pufrech, nazývaných blokačními pufry. Při inkubaci se konjugáty váží k antigenu a odstranění nenavázaných konjugátů je opět provedeno promytím. Pak je přidán substrát (chromofor), 11
který reaguje se specifickým enzymem vázaným na protilátky. Účelem je díky enzymaticky katalyzované reakci vytvořit barevný produkt. Reakce je po určité době zastavena změnou pH systému, nebo přidáním inhibičního reaktantu. Nakonec je barva kvantifikována spektrofotometricky na ELISA čtečce při odpovídající vlnové délce pro vzniklou barvu. Přímá ELISA je jednoduchá, ale její nevýhodou je nízká citlivost a velmi omezený výběr primárních protilátek. B. Nepřímá ELISA Nepřímá ELISA, ilustrovaná na obrázku 2 má první dva stupně stanovení (přidání antigenu a odstranění nenavázaných komponentu) podobné jako přímá ELISA. Další krok obsahuje přidávání neoznačené detekční primární protilátky, která je přidávána v pufru obsahujícím látky zabraňující nespecifické vazbě protilátky na povrch desky (blokační pufr). Dále následuje inkubace a vymytí nadbytku nenavázané protilátky, k docílení specifické vazby. Poté je přidán konjugát enzymem značené sekundární protilátky v blokačním pufru, opět následuje inkubace a promytí a výsledkem je vazba konjugátu na neznačené protilátky, navázané na pevné fázi. Pak je přidán substrát (chromofor), který je hydrolyzován enzymem konjugátu, čímž se začne vyvíjet barva. Reakce je nakonec zastavena změnou pH a vyhodnocena spektrofotometricky. Nepřímá ELISA je podobná přímé v tom, že antigen je přímo navázán na pevnou fázi a na něj se váže protilátka (detekční neboli primární protilátka). Primární protilátky nejsou konjugované, konjugované s enzymem jsou až samy cílové protilátky (sekundární). Takové protilátky jsou produkovány proti bílkovinám (imunoglobulinům) primární protilátky, jinými slovy imunoglobuliny primární protilátky slouží jako antigen pro produkci sekundární protilátky. Sekundární protilátka musí být produkovaná v jiném živočišném druhu, Obr. 2 Nepřímá ELISA. V tomto uspořádání se na navázaný antigen (v první aby nedocházelo ke křížovým reakjamce) váže neznačená detekční procím. Použití antidruhových konjugátů tilátka (Ab) (v druhé jamce). V dalším umožňuje velkou flexibilitu, jelikož kroku je přidán konjugát (Ab*), který mohou být použity různé specificse váže na neznačené protilátky. Náké konjugáty k detekci jednotlivých sledující kroky jsou shodné s předchozím systémem. imunoglobulinů vázaných na vzorku. 12
Dnes jsou k dispozici doslova tisíce komerčně dostupných konjugátů. Nepřímý systém skýtá kromě vysoké citlivosti další výhodu v tom, že může být analyzován jakýkoliv počet druhů antiséra po vazbě na daný antigen, použitím jediného protidruhového konjugátu. Tyto systémy jsou hojně využívány v diagnostice, zvláště pro vyšetření velkého množství vzorků. Bohužel mají ale kolísavý stupeň nespecifických vazeb v individuálních sérech, což způsobuje variabilitu výsledků, a proto je třeba výsledky ověřovat pomocí analýzy více sér. C. Přímá sendvičová ELISA Sendvičová ELISA je rozdělena na dva systémy, a to na přímou sendvičovou ELISA a nepřímou sendvičovou ELISA. Prvním krokem stanovení je pasivní zachycení primárních protilátek na pevnou fázi. Ty pak vážou antigeny přidané v blokačním pufru, který opět brání nespecifické vazbě na pevnou fázi. Komponenty blokačního pufru nesmí obsahovat látky, které by se mohly vázat na zachycené protilátky. Po inkubaci a promytí je komplex protilátka-antigen vázán na pevné fázi. Zachycený antigen, někdy nazývaný jako uvězněný, je pak detekován sekundární protilátkou, která nese konjugovaný enzym a je přidána v blokačním pufru. Tato druhá protilátka může být ze stejného živočišného druhu, jako je primární protilátka. Po inkubaci a vymytí je přidán substrát (chromofor) pro tvorbu barevného produktu, který je vyhodnocen spektrofotometricky, viz obrázek 3. Protože je použit jediný konjugát enzym-protilátka, systém má omezenou specifičnost. Systém je použitelný jen pro antigeny, které mají nejméně dvě antigenní místa (epitopy), rozpoznávaná dvěma protilátkami. Stanovení dlouhých antigenních komplexů touto metodou je omezené. Reakce Obr. 3 Přímá sendvičová ELISA. Zde jsou navázané protilátky (na pevné fázi) na povrch první jamky navázány protilátky (Ab), na které se specifica detekční protilátky s rozdílnými ky váže antigen (Ag) (druhá jamka). epitopy antigenního komplexu vede Pak je přidán konjugát (Ab*) (třetí ke zvýšení citlivosti celého systému. jamka), který se váže na zachycený To může být výhoda v případě, kdy antigen (čtvrtá jamka). Další kroky jsou analyzovány malé rozdíly v anjsou opět shodné jako u předchozího stanovení. tigenních vlastnostech molekul při 13
použití rozdílných detekčních protilátek. Použití stejné protilátky pro navázání i detekci může vést k vážnému omezení dostupnosti vazebných míst pro detekující protilátku. Výsledky může ovlivnit také velikost a prostorové uspořádání epitopů na antigenu. D. Nepřímá sendvičová ELISA Nepřímá sendvičová ELISA je dosti podobná přímé sendvičové ELISA (viz obrázek 4). Protilátky pasivně navázané na pevnou fázi váží antigeny. V dalším kroku antigeny reagují s přidanou detekční protilátkou, která však není konjugováná s enzymem. Po inkubaci a promytí jsou navázané detekční protilátky vázány s protidruhovým enzymovým konjugátem. Další postup je shodný s přímou sendvičovou ELISA. Výhodou této modifikace ELISA je širokospektrální použití protilátek, je však třeba mít na paměti nutnost používat v jedObr. 4 Nepřímá sendvičová ELISA. První dva kroky jsou notlivých krocích protistejné jako u přímé sendvičové ELISA. V dalším kroku je ale přidána neznačená detekční protilátka látky z jiných živočišných (Ab2), na kterou se váže konjugát (Ab*). Další kroky druhů, aby se vyloučila jsou opět shodné jako u předchozích systémů. vzájemná křížová reakce. E. ELISA na tyčinkách (dipsticích) Průběh této ELISA (obrázek 5) modifikace je podobný jako při ELISA v jamkách mikrotitrační destičky. Odlišnost „dipstick“ modifikace spočívá v tom, že rozpustný substrát je přeměňován na nerozpustný produkt, způsobující barevné změny pouze v místě imobilizované protilátky. Vyhodnocení je semi-kvantitativní, určované podle intenzity zbarvení. Výhody dipstick uspořádání spočívají především v rychlosti a jednoduchosti provedení a ve skutečnosti, že nevyžaduje žádné přístrojové vybavení. Na rozdíl od mikrotitrační destičky je dipstick vhodný pro testování Obr. 5 Dipstick menšího počtu vzorků. 14
4. Komerční kity pro stanovení Cry toxinů A. Přímá sendvičová ELISA – komerční kit Firma AGDIA (BIOFORDS) z Francie poskytuje široký sortiment různých typů ELISA testů, převážně používaných v klinické a biologické imunologii. Nejvíce používanými jsou DAS ELISA (Double-Antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (obrázek 6). Pro stanovení Cry3Bb1 v rostlinách kukuřice jsme využívali komerční kity (katalogové číslo PSP 06100/0480), které firma dodává. Princip testu spočívá v tom, že polyklonální protilátka komerčně navázaná na dno mikrotitrační destičky reaguje se směsí (1) monoklonální protilátky proti Cry3Bb1 s navázanou peroxidázou a (2) vzorkem obsahujícím Bt toxin. Tím dojde k tvorbě komplexu destička – polyklonální protilátka – Bt toxin – monoklonální protilátka s peroxidázou. Obr. 6 DAS ELISA pro stanovení Cry3Bb1 komerční kit Po krátké inkubaci (2 hodiny) je nenavázaný obsah z destičky vymýván pomoci PBST pufru. Vizualizace výsledků je zprostředkována díky navázání dalšího TMB substrátu, který reakcí s konjugátem změní svou barvu a umožní spektrofotometrickou kvantifikaci. Kit Bt-Cry3Bb1 je dodáván jako balíček, který obsahuje mikrotitrační destičku s vyjímatelnými sloupci (obrázek 7) a sadu reagencí.
Obr. 7 Rozebíratelné mikrotitrační destičky (vlevo balení; vpravo rámeček s vyjímatelnými sloupci (stripy)
15
Lyofilizovaný antigen Cry3Bb1 (obrázek 8) který se používá jako pozitivní kontrola. Antigen se naředí PBST pufrem podle potřeby a koncentrací uvedených na dodacím balíčku. Poté se daný objem rozdělí na alikvoty o objemu 220 μl a zamrazí se při -20°C. Následně se podle potřeby rozmrazuje a jednorázově použije. Nedoporučuje se rozmrazování opakovat, protoObr. 8 Vybavení dodávaného balíčku ELISA že dochází k poškození reaktivity. Koncentrovaný enzym konjugát je 100x koncentrovaný a na použití se musí zředit s dodávaným ředidlem RUB6 a aplikovat před aplikací vzorků na mikrotitrační destičku v množství 100 μl do každé jamky. TMB substrát (3,3‘,5,5‘-tetramethyl benzidin) vizualizuje přítomnost testovaného Cry 3Bb1 toxinu ve vzorku. PBST pufr (obrázek 9) je dodávaný jako koncentrovaný roztok, který se ředí 950 ml destilované vody, anebo jako prášek, který se rozpouští v 500 ml destilované vody. Pufr slouží na extrahování vzorků i na promývání mikrotitrační destičky v procesu ELISA testu. Obr. 9 Balení PBST pufru 1 litr roztoku obsahuje: 8 g NaCl; 1,15 g Na3PO4; 0,2 g K3PO4; 0,2 KCl; 0,5 g Tween 20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát), pH 7,4). Bt Cry-3Bb1 ELISA komerční balíček slouží k determinaci přítomností toxinu ve všech částech rostlin kukuřice. Důležité je správně připravit vzorky na testování. Vzorky se mohou extrahovat v extrakčních sáčcích, které nejsou součástí komerčních balíčku (dají se však dokoupit samostatně) nebo se dají připravit ručně v třecí misce. Obr. 10 Extrakční sáček 16
Výhodnější je použití extrakčních sáčků, které mají vnitřní část vyloženou speciální mřížkou, umožňující kvalitnější bezezbytkové drcení materiálu a tím napomáhají extrakci toxinů (obrázek 10). B. ELISA - imunologická páska Imunologická páska je speciální ELISA používaná pro rychlé stanovení přítomnosti jednoho nebo skupiny antigenů a to jak v laboratorních, tak polních podmínkách. Je to velice jednoduchá metoda spočívající v ponoření detekční pásky do připraveného extraktu obsahujícího antigen. Koncentrace extrahované látky závisí na použitém materiálu (listy 1:20; semena 1:10). Na extrakci se používá extrakční pufr SEB4 (1% 2-Pyrrolidinone, 1-ethenyl-, homopolymer), který je součástí imunologického testu Bt-Cry3Bb1 ImmunoStrio pod katalogovým číslem: STX 06100/0050 od firmy AGDIA. Výsledek je možné získat do pěti minut od ponoření detekující pásky do testovaného roztoku zobrazením proužku potvrzujícího přítomnost antigenu na vyznačeném místě detekční pásky (obrázek 11). 4.1. Vlastní stanovení ELISA testu komerčním kitem Rostlinám kukuřice MON88017 v růstové fázi prvních pravých listů, šesti listů, kvetení a těsně před
Obr. 11 Imunologická páska
Obr. 12 Determinace přítomnosti skupiny toxinů v semenech rostlin
17
Obr. 13 Homogenizátor Homex
sklizní odebereme přímo na poli do plastových sáčků část pravých kořenů, vzdušných kořenů, stonku, listu, pylových zrn, blizny a zrno, uskladníme do boxu s ledem a transportujeme do laboratoře. V laboratoři odebrané rostlinné vzorky zbavíme zeminy promytím vodou a osušíme buničinou. Na homogenizaci použijeme 1 g čerstvého rostlinného pletiva z každého odebraného vzorku. Umístíme je do extrakčních sáčků a ředíme PBST pufrem na základní koncentraci 1:10. Sáčky umístíme do držáku homogenizátoru a extrahujeme do úplného rozdrcení rostlinných tkání. Na extrakci jsme použili homogenizátor Homex device od firmy Bioreba, Švýcarsko (obrázek. 13). Vyextrahovaný obsah ponecháme v extrakčních sáčcích na ledu přibližně 30 minut odstát. Poté odebereme přibližně 2 ml roztoku, který centrifugujeme v předem vychlazené centrifuze (Hettrich Zentrifugen, EBA 12R): 5 min, 4 °C, 8 000 otáček za minutu. Z mikrozkumavky poté odebereme odstředěný obsah přibližně 2 ml supernatantu, který dále ředíme pomocí extrakčního pufru podle potřeby a druhu extrahované látky. Stejně zpracováváme kontrolní vzorky, aby výsledky byly srovnatelné. Ředění přizpůsobíme růstové fázi kukuřici, extrahovanému materiálu a zohledníme povětrnostní podmínky v čase odběru vzorků. Velkou pozornost věnujeme hlavně období dlouhodobých dešťů a vysokého příjmu vody kořenovým systémem. Vzorky rostliny odebrané v prvních termínech až do stádia kvetení ředíme v poměrech 1:5 000 až 1:8 000, ve stádiu kvetení pak 1:25 000 až 1:50 000, ve stádiu voskové zralosti 1:10 000 a před sklizní 1:5 000 až 1:8 000. 18
Připravené a naředěné vzorky ponecháme na ledu odpočinout a připravíme mikrotitrační destičku aplikací 100 µl monoklonálního enzymového konjugátu (peroxidázy) ředěného RUB6 (0,0009% roztok). Následně připravíme pozitivní kontrolu zředěním 2 ml PBST. Pozitivní kontrola ředěná dvojkovou řadou se používá pro sestrojení standardní křivky. Pro ověření správnosti funkce Obr.14 Přítomnost Bt – modré zbarvení kitu použijeme jako negativní kontrolu PBST v dávce 100 µl na jamku. Následně na destičku aplikujeme připravené a před aplikací řádně promíchané vzorky v množství 100 µl do každé jamky. Poté destičku zakryjeme samolepicí PP fólií (od firmy Fisher Scientific), aby nedocházelo k odparu vzorků, a umístíme do boxu s vlhkým prostře- Obr.15 Elisa čtečka dím (namočená buničina pod destičkou). Směs se nechá reagovat na mikrotitrační destičce zakrytá hliníkovou fólií (alobal) 2 hodiny při pokojové teplotě (24 °C). Po inkubaci pomocí promývacího pufru PBST sedmkrát vymyjeme nenavázánu monoklonální protilátku a Bt toxin, a přidáme 100 µl roztoku TMB substrátu. Destičku poté inkubujeme 20 min v boxu s vlhkým prostředím při pokojové teplotě. Reakční směs se v přítomnosti Cry3Bb1 zbarví modře (obrázek 14). Přesnou absorbanci měříme pomocí čtečky ELISA (Spectra MAX 340 PC) při λ = 650 nm (obrázek 15). Naměřené absorbance vyhodnotíme v grafickém programu např. Graph Pad Prism 4. Díky známému obsahu toxinu v standardní řadě můžeme kvantifikovat množství Cry3Bb1 v rostlinných tkáních. Výsledné koncentrace uvádíme v µg/g čerstvé rostlinné hmoty. Výsledky konkrétního stanovení obsahu Bt toxinu v rostlinách kukuřice podle výše uvedeného návodu jsou shrnuty v tabulce 1. 19
Obsahy toxinu Cry 3Bb1 kolísaly v závislosti na růstové fázi kukuřice, vegetačním období a termínu setby. V roce 2009 stejně jako v roce 2010 byl nejvyšší obsah Bt stanoven v listové ploše a kořenech a pohyboval se v roce 2009 od 36,54±0,13 do 30,81±0,7 a v roce 2010 od 28,83±2,31do 23,33±3,23 μg/gram čerstvé hmoty vzorku. Nižší výsledky v roce 2010 byly zřejmě ovlivněny pozdní setbou kukuřice a zároveň velmi vlhkým počasím, kdy je kukuřice schopná pojmout kořenovým systémem značné množství vody a naředit tak obsah Bt v celé rostlině. Opačný trend, tedy vyšší expresi Cry3Bb1 zaznamenanou v roce 2010 u stonku: pro tento výsledek nemáme v současné době reálné vysvětlení. Části kukuřice použité na determinaci toxinu
Průměrný obsah Cry3Bb1 v μg na g listů čerstvé hmoty
Kořen Vzdušný kořen Stonek Listová plocha Pylová zrna + samčí květenství Blizny Zrno
Bt kukuřice v roce 2009 30,81±0,7 18,33±0,64 11,77±0,24 36,54±0,13 28,94±0,45
Bt kukuřice v roce 2010 23,33±3,23 Nestanoveno 21,68±3,45 28,83±2,31 20,12±1,73
konvenční kukuřice 0 0 0 0 0
27,45±0,91 Nestanoveno
15,01±1,69 7,62±0,83
0 0
Referenční vzorky A B
Ošetřená Dursban 10G I
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
0 0
0 0
0 0
Tabulka 1 Průměrný obsah Bt toxinu stanovený ELISA testem za dva roky sledování
4.2. Statistické zpracování V programu Graph Pad Prism 4 vybereme správnou statistickou analýzu „template analyse“, navolíme „Protein assay std. Curve“ a zadáme do sloupce X známé hodnoty koncentrace pozitivní kontroly (v ng), použité k sestrojení standardní křivky. Do sloupce Y vepíšeme naměřené hodnoty absorbance získané měřením mikrotitrační destičky pomoci ELISA čtečky při 650 nm (tabulka 2). Následně navolením funkce, „Analyzenonlinear regresionbuild in analysereceantly usedOK“ a navolením paramentů analýzy „Two site binding (hyperbola)unknows from standard curveOK“ program sestrojí graf se známými zadanými hodnotami standardní křivky, které použije k přepočtu zadaných absorbancí testovaných vzorků do sloupce Y. Po zadání příkazu „Results“ v ikoně „interpolated X values“ dostaneme naměřené hodnoty Bt v testovaných vzorcích v ng. Získané hodnoty Bt přepočteme na µg/g čerstvé hmoty a na použité výchozí koncentrace. 20
1 2.8068 2.6568 2.1489 1.2424 0.5135 0.1959 0.1089 0.0538
2 2.6872 0.0040 0.8594 0.8022 0.5337 0.4432 1.0932 1.2735
3 0.1023 0.0924 0.2408 0.1669 0.1472 0.1258 0.2731 0.2701
4 0.3798 0.3203 0.1177 0.1026 0.1207 0.118 0.3407 0.2704
5 0.2677 0.2565 0.4217 0.4099 0.0724 0.0482 0.2226 0.2035
6 0.1806 0.1802 0.2133 0.1828 0.5326 0.4721 0.2082 0.1966
7 0.1108 0.1113 0.2768 0.2609 0.1989 0.1929 0.5269 0.4622
8 0.1865 0.1836 0.1477 0.1382 0.3837 0.342 0.2153 0.1898
9 0.4509 0.5563 0.0939 0.0374 0.162 0.1421 0.2072 0.175
10 0.0938 0.0847 0.0982 0.0743 0.2568 0.2092 0.136 0.1245
11 0.1162 0.1199 0.1336 0.123 0.132 0.116 0.1757 0.1353
12 0.3114 0.2778 0.1118 0.0981 0.1062 0.0962 0.2042 0.2057
Tabulka 2 Absorbance vzorků získané z ELISA čtečky (žlutě jsou vyznačena data použitá k sestrojení standardní křivky)
Obr.16 Standardní křivka
Příklad vyhodnocení stanovení Bt toxinu:
Koncen. Absorb. 25,2639 2,6872 pozitivní kontrola 0,01089 0,0040 negativní kontrola 2,95723 0,8594 vzorek = 2,957*10 000/1 000 = 29,57 Bt ve vzorku kořene 2,70705 0,8022 1,65080 0,5337 Naměřená 1,33286 0,4432 Celkový obsah Bt hodnota Bt 4,09458 1,0932 ve vzorku ve vzorku 5,11731 1,2735 Ředění vzorku Přepočet ng na µg
Touto metodou byly stanoveny obsahy Bt toxinu v rostlinách kukuřice v průběhu celého vegetačního období a následně použity k dalšímu komplexnímu hodnocení porostu kukuřice v souvislosti s výskytem hmyzu na rostlinách. 21
IV. Srovnání novosti postupů Metodika je novou odbornou publikací, která přístupnou formou poskytuje široké odborné veřejnosti informace o principech metody ELISA, oblastech jejího využití, jakož i porovnání a návod k použití moderních komerčních kitů na testování (kontrolu) přítomnosti Bt toxinu v konvenčně ale i ekologicky pěstovaných porostech kukuřice a produktech z nich. Bude využita především při monitoringu nelegálního rozšiřování nepovolených GMO v ČR, testování nepovolených příměsí v rostlinných produktech, ale i k experimentálním účelům.
V. Přehled použité literatury Al-Deeb M.A., Wilde G.E. (2003): Effect of Bt corn expressing the Cry3Bb1 toxin for corn rootworm control on aboveground nontarget arthropods. Environmental Entomology. 32 (5): 1164–1170. Al-Deeb M.A., Wilde G.E. (2005): Effect of Bt corn expressing the Cry3Bb1 toxin on western corn rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) biology. Journal of the Kansas Entomological Society. 78 (2): 142–152. Ahmad A., Wilde G.E., Whitworth R.J., Zolnerowich G. (2006a): Effect of corn hybrids expressing the coleopteran-specific Cry3Bb1 protein for corn rootworm control on aboveground insect predators. Journal of Economic Entomology. 99 (4): 1085–1095. Cerdeira A.L., Duke S.O. (2006): The Current status and environmental impacts of glyphosate-resistant crops. Journal of Environmental Quality. 35: 1633–1658. Crowther J.R. (1995): ELISA theory and practice. Methods in molecular biology. Humana Press. 216 s. Crowther J.R. (2001): The ELISA guidebook. methods in molecular biology. Humana Press. 448 s. Fontes E.M.G., Pires C.S.S, Sujii E.R., Panizzi A.R. (2002): The Environmental effects of genetically modified crops resistant to insects. Neotropical Entomology. 31(4):497–513. Healy C., Hammond B., Kirkpatrick J. (2008): Results of a 13week safety assurance study with rats fed grain from corn rootworm-protected, glyphosate-tolerant MON 88017 corn. Food and Chemical Toxicology. 46 (7): 2517–2524. Chromý V. (2002): Bioanalytika: analytická chemie v laboratorní medicíně. Masarykova univerzita. Brno. 267 s. Icoz I., Stotzky G. (2008): Cry3Bb1 protein from Bacillus thuringiensis in root exudates and biomass of transgenic corn does not persist in soil. Transgenic Research. 17: 609–620. Nguyen H., Hunfeld H., Meissle M., Miethling-Graff R., Pagal-Wieder S., Rauschen S., Zurbrügg C., Eber S., Gessler F., Romeis J., Tebbe C.CH., Nentwig W., Jehle J.A. (2008): Round robin quantitation of Cry3Bb1 using the qualitative PathoScreen ELISA. GMO in Integral Plant Production. IOBC/WPRS Bulletin. 33: 59–66.
22
Nguyen H., Jehle J.A. (2009): Expression of Cry3Bb1 in transgenic corn MON88017. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (21): 9990–9996. Obrusníková R. (2008): Vývoj a optimalizace ELISA metody pro stanovení obsahu glykovaného hemoglobinu ve vzorcích krve (bakalářka práce). 24–40. Shirai Y. (2006): Laboratory evaluation of effects of transgenic Bt corn pollen on two non-target herbivorous beetles, Epilachna vigintioctopunctata (Coccinellidae) and Galerucella vittaticollis (Chrysomelidae). Applied Entomology and Zoology. 41 (4): 607–611. Whitehouse M.E. A., Wilson L.J., Fitt G.P. (2005): A Comparison of arthropod communities in transgenic Bt and conventional cotton in Australia. Environmental Entomology. 34(5): 1224–1241. Zwahlen C., Hilbeck A., Gugerli P., Nentwig W. (2003): Degradation of the Cry1Ab protein within transgenic Bacillus thuringiensis corn tissue in the field. Molecular Ecology. 12: 765–775.
Použité web odkazy: http://che1.lf1.cuni.cz/html/imuno.pdf (imunochemické metody) http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/ELISA.html http://www.elispot-analyzers.de/english/elisa-animation.html http://www.freewebs.com/immunology/elisa-plate.html http://www.mabtech.com/main/Page.asp?PageId=26&PageName=About+ELISA http://www.epa.gov/oppbppd1/biopesticides/ingredients/factsheets/factsheet_006484. htm (Bacillus thuringiensis Cry3Bb1 Protein and the Genetic Material Necessary for its Production (Vector ZMIR13L) in Event MON863 Corn (006484) Fact Sheet: MONSANTO COMPANY (2003): http://www.biotech-info.net/glyphosate_resist.html (Glyphosate resistance in another plant. University of Wisconsin. Wisconsin Crop Manager Newsletter): DOLL, J. (1999):
VI. Odkazy na původní vědecké práce autorů související s metodikou Svobodová Z. Holec M.; Habuštová O.; Hussein M H. (2010): Influence of transgenic Bt maize MON 88017 on the epigeic spiders (Araneae) in the field trial conditions (The Czech Republic). Pedobiologia (v tisku). Knecht S., Romeis J., Malone L.A., Candolfi M.P., Alonso M.G., Habuštová O., Huesing J.E., Kiss J., Nent W. (2010): A faunistic database as a tool for identification and selection of potential non-target arthropod species for regulatory risk assessment of GM maize. GMOs in Integrated Plant Production IOBC/WPRS Bulletin: 65-69. Habuštová O., Sehnal F. (2009): Genetically modified maize as a barrier to Diabrotica spreading in Europe: checking possible impact on other arthropods. Sehnal F., Drobník J. (eds.): White Book: Genetically modified crops. Biology Centre of Academy of Sciences of the Czech Republic. České Budějovice. 61.
23
Habuštová O., Hussein M.H., Doležal P., Spitzer L., Růžička V. (2009): Results of a four-year study of the impact of Bt maize. Sehnal F., Drobník J. (eds.): White Book: Genetically modified crops. Biology Centre of Academy of Sciences of the Czech Republic. České Budějovice. 60. Habuštová O., Sehnal F. (2007): Results of a four-year study of the Bt maize impact on the arthropod communities. KOSMOS problemy nauk biologicznych. Warszawa. GMO szanse i ograniczenia. 56: 275–284. Vinokurov K., Taranushenko Y., Kodrík D., Kludkiewicz B., Habuštová O., Sehnal F. (2007): Nové inhibitory proteáz a jejich využití v ochraně rostlin. Funkční genomika a proteomika ve šlechtění rostlin. Křtiny. 24. - 25. září: 13–15. Hussein H.M., Habuštová O., Sehnal F. (2006): Bt-potatoes resistant to the colorado potato beetle affect performance of the Egyptian armyworm, Spodoptera littoralis. Acta Phytotechnica et Zootechnica. 8: 38–41. Habuštová O., Turanli F., Spitzer L., Růžička V., Doležal P., Sehnal F. (2006): Communities of beetles and spiders in the stands of normal and genetically modified maize. Pesticides 2005: 125–131. Hussein H.M., Habuštová O., Turanli F., Sehnal F. (2006): Potato expressing beetlespecific Bacillus thuringiensis Cry3Aa toxin reduces performance of a moth. Journal of Chemical Ecology. 32: 1–13. Habuštová O., Turanli F., Doležal P., Růžička V., Spitzer L., Hussein H.M. (2006): Environmental impact of Bt maize – three year experience. IOBS/WPRS Bulletin: 57–63. Hussein, H.M., Sehnal, F., Habuštová, O. (2005): Bt-potatoes resistant to Colorado Potato Beetle affect the erformance of Egyptian Armyworm (Spodoptera littoralis) Btzemiaky odolné voči pásavke zemiakovej znižujú produktívnos? Spodoptera littoralis. Acta Phytotechnica et Zootechnica. 8: 38 -41. Habuštová O., Turanli F., Spitzer L., Růžička V., Doležal P., Sehnal F. (2005): Communities of beetles and spiders in the stands of normal and genetically modified maize. Pesticides. Poland. University of Wroclaw: 125–131. Hussein H.M., Habuštová O., Sehnal F. (2005): Beetle-specific Bacillus thuringiensis Cry3Aa toxin reduces larval growth and curbs reproduction in Spodoptera littoralis (Boisd.). Pest Management Science. 61: 1186–1192. Spitzer L., Růžička V., Hussein H. M, Habuštová O., Sehnal F. (2004): Expression of a Bacillus thuringiensis toxin in maize does not affect epigeic communities of carabid beetles and spiders. Acta Phytotechnica et Zootechnica. 7: 110–112. Rakouský S., Ondřej M., Sehnal F., Habuštová O., Hussein H.M., Ovesná J., Kučera L., Kocourek F., Říha K., Dostálová R., Seidenglanz M., Tejklová E.G. (2004): Transgenic plant products and their introduction into the environment and crop protection systems, a risk assessment. Nap J.P.H., Atanassov A., Stiekema W.J. (eds.): Genomics for Biosafety in Plant Biotechnology. IOS Press. Amsterdam. The Netherlands: 173–184. Sehnal F., Habuštová O., Spitzer L., Hussein H.M., Růžička V. (2004): A biannual study on the environmental impact of Bt-maize. IOBS/WPRS Bulletin. 27: 147–160. Habuštová O., Hussein H., Sehnal F. (2003): Insect communities on maize expressing a Bt-toxin. Acta Phytotechnica et Zootechnica. 1: p. 9–11.
24
