Ieria9
Optimalisatie van analysemethoden voor de studie van antibioticaresistentie in Stenotrophomonas maltophilia
Sofie DEPLUVEREZ
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de Biochemie en de Biotechnologie Major Biochemie en Structurele Biochemie Academiejaar 2012-2013
Promotor: Prof. Dr. Bart Devreese Wetenschappelijk begeleider: Dhr. Simon Devos Vakgroep Biochemie en Microbiologie Laboratorium voor Eiwitbiochemie en Eiwitengineering
DANKWOORD Dit werk kon slechts tot stand komen dankzij de steun en hulp van een aantal mensen. Bijzondere dank gaat uit naar mijn promoter, Prof. Dr. Bart Devreese, voor de unieke kans die hij mij gegeven heeft om mee te werken aan dit leerrijke en uitdagende project in het labo van L-ProBE. Eveneens wil ik hem bedanken voor het aanreiken van het onderwerp, het ter beschikking stellen van de nodige middelen, het verstrekken van waardevolle informatie en het kritisch evalueren van deze tekst. In de tweede plaats zou ik Simon Devos willen bedanken voor de uitstekende begeleiding tijdens het tot stand komen van deze thesis, voor het feit dat hij altijd klaarstond met goede raad, voor het lezen en beantwoorden van talloze mails en voor het doornemen, bijsturen en corrigeren van mijn thesis. Hij heeft mij waardevolle kennis bijgebracht en vele, nieuwe wetenschappelijke vaardigheden aangeleerd. Ook wil ik de volledige L-ProBE unit bedanken voor de leuke sfeer en de gezellige babbels tussendoor. Zij maakten de vele uren in het labo een stuk aangenamer. Als laatste, maar daarom niet minder belangrijk, een enorme dankjewel aan mijn ouders, die mij de kans gaven om deze studierichting te volgen, en aan Theo Voorend. Zij waren mijn steun en toeverlaat in moeilijke dagen en gaven me steeds weer de energie die ik nodig had om er tegenaan te gaan. Sofie
i
INHOUDSOPGAVE DANKWOORD .............................................................................................................................. i INHOUDSOPGAVE....................................................................................................................... ii LIJST MET AFKORTINGEN .......................................................................................................... iv NEDERLANDSE SAMENVATTING ............................................................................................... vi ENGLISH SUMMARY ..................................................................................................................vii
1. INLEIDING................................................................................................... 1 1.1.
Stenotrophomonas maltophilia: een moeilijk te bestrijden opportunistische pathogeen .................................................................................................................... 1
1.2.
Signaaltransductie in bacteriën ................................................................................... 2
1.3.
Inductie van β-lactam resistentie via β-lactamasen in S. maltophilia ......................... 5
1.4.
Proteoomanalyse ......................................................................................................... 7
1.4.1.
Massaspectrometrie ........................................................................................................ 8
1.4.2.
Gel-gebaseerde versus gel-vrije analysemethoden ....................................................... 10
1.4.3.
Kwantitatieve proteoomanalyse ................................................................................... 13
1.4.4.
‘Targeted proteomics’ ................................................................................................... 15
1.4.5.
Fosfoproteoomanalyse .................................................................................................. 16
1.5.
Analyse van membraaneiwitten ................................................................................ 17
1.5.1.
Problemen geassocieerd met de analyse van plasmamembraaneiwitten .................... 18
2. DOELSTELLING ...........................................................................................19 3. RESULTATEN..............................................................................................20 3.1.
Optimalisatie van de extractie van membraaneiwitten ............................................ 20
3.1.1
Vergelijking van extractiemethodes .............................................................................. 21
3.1.2.
Invloed van chloroform delipidatie en acetonprecipitatie op de extractie van membraaneiwitten ........................................................................................................ 23
3.1.3.
Differentiële expressie van membraaneiwitten na imipenem stimulatie...................... 25
3.1.4.
Selectiviteit van de extractiemethode van Mirza et al. ................................................. 25
3.2.
Optimalisatie van de detectie en analyse van eiwitfosforylatie met SDS-PAGE ....... 27
3.2.1.
Detectie van veranderingen in fosforylatiegraad van membraaneiwitten na imipenem stimulatie ....................................................................................................................... 27
3.2.2.
Identificatie van (differentieel gefosforyleerde) eiwitten met LC-MS ........................... 32
ii
3.3.
Gel-vrije analyse van membraaneiwitten met HILIC ................................................. 35
3.4.
Gel-vrije analyse van membraaneiwitten met LC-MS ............................................... 41
3.4.1.
Optimalisatie van het trypsinedigest ............................................................................. 41
4. DISCUSSIE ..................................................................................................43 5. MATERIAAL EN METHODEN.......................................................................47 5.1.
Celcultuur................................................................................................................... 47
5.2.
Extractie van membraaneiwitten .............................................................................. 47
5.2.1.
Extractiemethode gebaseerd op Mirza et al. ................................................................ 47
5.2.2.
Extractiemethode gebaseerd op Van Oudenhove et al. ................................................ 48
5.3.
SDS-PAGE analyse ...................................................................................................... 48
5.4.
Trypsinedigest............................................................................................................ 49
5.5.
LC-ESI-MS analyse ...................................................................................................... 49
5.6.
HILIC ........................................................................................................................... 50
6. REFERENTIES .............................................................................................51 7. BIJLAGEN ...................................................................................................56 7.1.
Protocols .................................................................................................................... 56
7.2.
Medium, solventen, buffers en gels .......................................................................... 67
7.3.
Resultaten .................................................................................................................. 73
iii
LIJST MET AFKORTINGEN 2-D DIGE 2-DE 2-PrOH ACN anhMurNAc APS AQUA ATP AUC BSA CBB-G250 c-di-GMP CID Dap DGCs DTT ECD EDTA TMSE EF-Tu emPAI EPS ESI ETD FT-ICR GlcNAc HILIC His/Asp HK HPLC IAA ICAT ID x L IEF IMAC IPG iTRAQ kDa LB LC LIT LTTR m/z
‘Fluorescent Two-Dimensional Differential Gel Electrophoresis’ ‘Two Dimensional Gel Electrophoresis’ 2-propanol Acetonitrile 1,6-anhydro-N-acetylmuramoyl Ammoniumpersulfaat Absolute kwantificatie Adenosinetrifosfaat ‘Area Under Curve’ ‘Bovine Serum Albumin’ Coomassie Brilliant Blue G250 Cyclisch Diguanylaat ‘Collision Induced Dissociation’ ‘Meso-diaminopimelic acid’ Diguanylaat cyclases Dithiothreitol ‘Electron Capture Dissociation’ Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Tris-mannitol-sucrose-EDTA Elongation factor Tu ‘Exponentially Modified Protein Abundance Index’ Extracellulaire Polymere Substantie ‘Electrospray Ionisation’ ‘Electron Transfer Dissociation’ ‘Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance N-acetylglucosaminyl ‘Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography’ Histidine en aspartaat Histidine kinase ‘High Performance Liquid Chromatography’ Iodoacetamide ‘Isotope Coded Affinity Tags’ ‘Internal Diameter x Length’ ‘Isoelectric Focusing’ ‘Immobilized Metal Affinity Chromatography’ ‘Immobilised pH Gradient’ ‘Isobaric Tagging for Relative and Absolute Quantification’ Kilodalton Luria Bertani ‘Liquid Chromatography’ ‘Linear Ion Trap’ LysR-type transcriptionele regulator Massa over lading verhouding
iv
MALDI mAU MQ MRM MS MS/MS NPLC OD PAI PBP PDEs PFF PG pI PMF PTM Q-TRAP RND RPLC RR S/T/Y SCX SDS SDS-PAGE SEC SILAC SRM TCS TEMED TOF UDP v/v w/v w/w XIC
‘Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation’ ‘Milli Absorbance Units’ Milli-Q water ‘Multiple Reaction Mointoring’ Massaspectrometrie Tandem massaspectrometrie ‘Normal Phase Liquid Chromatography’ ‘Optical Density’ ‘Protein Abundance Index’ ‘Penicillin Binding Protein’ Fosfodiesterases ‘Peptide Fragmentation Fingerprint’ Peptidoglycaan Isoëlektrisch punt ‘Peptide Mass Fingerprint’ Posttranslationele modificatie ‘Hybrid Triple Quadrupole Linear Ion Trap’ ‘Resistance-Nodulation-Division’ ‘Reversed Phase Liquid Chromatography’ Respons regulator Serine, threonine en tyrosine ‘Strong Cation Exchange Chromatography’ ‘Sodium Dodecyl Sulfate’ ‘Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis’ ‘Size Exclusion Chromatography’ ‘Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture’ ‘Single Reaction Monitoring’ Twee-component systeem Tetramethylethyleendiamine ‘Time of Flight’ Uridinedifosfaat ‘Volume to volume’ ‘Weight per volume’ ‘Weight to weight’ ´Extracted Ion Chromatogram’
v
NEDERLANDSE SAMENVATTING Stenotrophomonas maltophilia is een snel opkomende nosocomiale pathogene bacterie die een intrinsieke resistentie bezit tegen de meeste van de momenteel beschikbare antibiotica. Uit voorafgaande studies is gebleken dat S. maltophilia twee chromosomaal gecodeerde βlactamasen (L1 en L2) bezit die β-lactam antibiotica kunnen hydrolyseren en inactiveren, maar de inductiemechanismen hiervan zijn nog steeds niet gekend. In Pseudomonas aeruginosa is de signalisatiecascade die leidt tot inductie van het L2 β-lactamase reeds gedeeltelijk opgehelderd, waarbij aangetoond werd dat er een sterke link bestaat tussen βlactamase inductie en peptidoglycaanrecyclage. Ook twee-component systemen blijken hierbij een belangrijke rol te spelen. Het uiteindelijke doel van dit project is om, via de studie van differentiële eiwitexpressie en –fosforylatie voor en na imipenem stimulatie, inzicht te verkrijgen in de signalisatiecascades die leiden tot de inductie van β-lactam resistentie in S. maltophilia. Aangezien een groot deel van deze signalisatiewegen zich afspeelt ter hoogte van de membraan, werd deze studie beperkt tot de analyse van het membraanproteoom. Vooreerst werd getracht om een efficiënte methode te ontwikkelen voor de extractie van membraaneiwitten, rekening houdend met de aard van de verdere analysemethoden (gelgebaseerd of gel-vrij). De extractiemethode waarbij de polaire TMSE buffer gebruikt wordt om hydrofobe membraaneiwitten te precipiteren, blijkt een stuk efficiënter te zijn dan de extractiemethode waarbij het basische natriumcarbonaat gebruikt wordt om membraaneiwitten te collecteren. In de eerste methode zijn chloroform delipidatie en acetonprecipitatie vereist wanneer een gel-vrije benadering wordt beoogd. De selectiviteit van de extractiemethode dient echter nog verbeterd te worden om een hoger percentage membraaneiwitten te kunnen detecteren. Een SDS-PAGE analyse werd uitgevoerd om veranderingen in fosforylatie van de geëxtraheerde membraaneiwitten na imipenem stimulatie te bestuderen. Verschillende differentieel gefosforyleerde eiwitten konden worden geïdentificeerd, welke betrokken zijn in de algemene stress respons van de cel (EF-Tu), in biofilmvorming (een TonB afhankelijk eiwit, ExbB, ClpB en twee eiwitten met een GGDEF domein) of in de biogenese van flagella (een H-NS histone family eiwit). Om de beperkingen van SDS-PAGE te omzeilen, werden twee gel-vrije benaderingen uitgetest. Fractionatie van eiwitten met HILIC blijkt enkel mogelijk wanneer detergent toegevoegd wordt om de oplosbaarheid van membraaneiwitten te verhogen. Desalniettemin blijft een groot deel van de eiwitten achter in de onoplosbare fase, wat een mogelijke verklaring is voor de lage intensiteit van de pieken in het chromatogram. Een tweede gel-vrije benadering is de directe LC-MS analyse van de geëxtraheerde membraaneiwitten. Na optimalisatie van het voorafgaande trypsinedigest, bleek dat 2 M urea/50 mM NH4HCO3 het meest geschikte solvent is voor een efficiënt digest. In de toekomst zal gepoogd worden om met deze directe LC-MS methode de aanwezigheid van de differentieel gefosforyleerde eiwitten, gevonden in de SDS-PAGE analyse, te bevestigen. Alsook zal getracht worden om veranderingen in expressie en fosforylatie van deze eiwitten te kwantificeren met MRM.
vi
ENGLISH SUMMARY S. maltophilia is an emerging nosocomial pathogen with an intrinsic resistance against most of the currently available antibiotics. Previous studies showed that S. maltophilia possesses two chromosomally encoded β-lactamases (L1 and L2) that can hydrolyse and inactivate βlactam antibiotics, but the mechanisms of induction hereof are still unknown. The signaling cascade, leading to the induction of the L2 β-lactamase, has already partially been elucidated in Pseudomonas aeruginosa, showing an intimate connection between β-lactamase induction and peptidoglycan recycling. It appears that two-component systems also play an important role in this process. The ultimate goal of this project is to gain insight in de signaling cascades leading to the induction of β-lactam resistance in S. maltophilia, through the study of differential protein expression and -phosphorylation before and after stimulation with imipenem. Because a significant part of the signalisation takes place at the level of the membrane, this study was limited to the analysis of the membrane proteome. First, it was attempted to develop an efficient method for the extraction of membrane proteins, taking into account the nature of the subsequent analytical methods (gel-based or gel-free). The extraction method whereby the polar TMSE buffer is used to precipitate membrane proteins, appears to be much more efficient than the method in which the basic sodium carbonate is used to collect membrane proteins. Chloroform delipidation and acetone precipitation are indispensible in the first method when a gel-free approach is intended. The selectivity of the extraction method still needs to be improved to be able to detect a higher percentage of membrane proteins. A SDS-PAGE analysis was performed to study changes in phosphorylation of the extracted membrane proteins after imipenem stimulation. Several differentially phosphorylated proteins could be identified, which are involved in the general stress response of the cell (EFTu), in biofilm formation (a TonB dependent protein, ExbB, ClpB and two GGDEF domain containing proteins) or in the biogenesis of flagella (an H-NS histone family protein). To circumvent the limitations of SDS-PAGE, two gel-free approaches were tested. Protein fractionation with HILIC appears to be possible, but only when detergent is added to enhance the solubility of membrane proteins. Nevertheless, a large part of the proteins remains in the insoluble fraction, which is a possible explanation for the low intensity of the peaks in the chromatogram. A second gel-free aproach is the direct LC-MS analysis of the extracted membrane proteins. After optimization of the tryptic digest preceding LC-MS, 2 M urea/50 mM NH4HCO3 was selected as the most suitable solvent for an efficient digest. In the future, this direct LC-MS method will be used to confirm the presence of the differentially phosphorylated proteins, found in the SDS-PAGE analysis. It will also be attempted to quantify changes in expression and phosphorylation of these proteins with MRM.
vii
Inleiding
1. INLEIDING 1.1.
Stenotrophomonas maltophilia: opportunistische pathogeen
een
moeilijk
te
bestrijden
Stenotrophomonas maltophilia, vroeger bekend als Pseudomonas maltophilia of Xanthomonas maltophilia, is een aërobe, niet-fermenterende Gram-negatieve bacterie (Senol, 2004), behorende tot de klasse van de Gamma-proteobacteriën (Abbott et al, 2011). S. maltophilia wordt regelmatig aangetroffen in grond- en waterstalen en is wereldwijd de derde meest voorkomende niet-fermenterende, Gram-negatieve bacterie in nosocomiale infecties (na Pseudomonas aeruginosa en Acinetobacter spp. (Sader & Jones, 2005)). De twee voornaamste ziekten/symptomen veroorzaakt door S. maltophilia zijn bacteriëmie en pneumonie, waarbij de infectie vaak overgedragen wordt via inwendige katheters of ventilatoren. Kolonisatie van de luchtwegen met S. maltophilia wordt waargenomen in ongeveer één derde van de mucoviscidose patiënten, hoewel er nog steeds controverse bestaat of dit al dan niet een verminderde klinische prognose tot gevolg heeft (Crossman et al, 2008). Hoewel S. maltophilia vroeger beschouwd werd als een organisme met slechts beperkte pathogeniciteit, wordt het nu steeds duidelijker dat deze bacterie toch een significante bijdrage levert aan de morbiditeit en mortaliteit van infecties in immuungecompromitteerde patiënten. Bovendien wordt de behandeling van S. maltophilia infecties sterk bemoeilijkt doordat vele isolaten een inherente resistentie bezitten tegen vele van de momenteel beschikbare breedspectrum antibiotica (Senol, 2004). S. maltophilia stam K279a werd voor het eerst geïsoleerd in de ‘Bristol Oncology Unit’ van het universitair ziekenhuis in Bristol (United Kingdom) in 1998 en de volledige genoomsequentie is intussen gekend (Crossman et al, 2008). In Gram-negatieve nosocomiale pathogenen wordt antibioticaresistentie voornamelijk teweeg gebracht door de overproductie van ‘resistance-nodulation-division’ (RND) type efflux pompen. Deze pompen hebben een brede substraatspecificiteit en kunnen onder andere organische solventen, ontsmettingsmiddelen en antibiotica exporteren uit de cel. S. maltophilia K279a bezit negen dergelijke RND type efflux pomp genen (Crossman et al, 2008; Sanchez et al, 2009). Andere, eveneens vaak voorkomende resistentiemechanismen omvatten mutaties in target sites van het antibioticum, veranderingen in de buitenste membraan, zoals het verlies van buitenste membraaneiwitten of porines, en enzymatische inactivering van het antibioticum (Nikaido, 2009). Dit laatste mechanisme is dominant in S. maltophilia door de aanwezigheid van twee chromosomaal gecodeerde β-lactamasen. Hoewel resistentie tegen antibiotica behorende tot de klasse van de β-lactams reeds uitgebreid bestudeerd is, blijven de onderliggende regulatiemechanismen grotendeels onopgehelderd (Denton & Kerr, 1998). Multidrugresistentie in Gram-negatieve niet-fermenterende pathogenen bemoeilijkt de behandeling van infecties met deze organismen en verhoogt de geassocieerde ziekenhuiskosten. Resistentie veroorzaakt vaak een vertraging in de toediening van
1
Inleiding efficiënte antibiotica, wat op zijn beurt de genezing van de patiënt op een negatieve manier beïnvloedt en leidt tot een verlengd ziekenhuisverblijf. Ook is in de meeste gevallen het gebruik van meer agressieve geneesmiddelen nodig, waardoor de kans op neveneffecten aanzienlijk stijgt en de kosten van de behandeling vaak hoog oplopen (McGowan, 2006). In de Europese Unie alleen al wordt het aantal patiënten dat sterft ten gevolge van infecties met resistente bacteriën, opgelopen in het ziekenhuis, geschat op een totaal van 25 000 per jaar (World Health Organization, 2013). Daarom is het essentieel te begrijpen hoe deze resistentie tot stand komt, en meer bepaald welke signalisatiecascades hierin een prominente rol spelen.
1.2.
Signaaltransductie in bacteriën
Een nauwkeurige regulatie van genexpressie is onontbeerlijk voor bacteriën om te overleven. De essentie van signaaltransductie is de omzetting van de herkenning van een signaal naar de activering van genen en andere cellulaire reacties (Hoch, 2000). Op- of neerregulatie en/of (in)activering van de juiste eiwitten op het correcte moment, in respons op specifieke interne en externe signalen, is bijgevolg cruciaal. Aangezien het grootste deel van dit proces gecontroleerd wordt op het niveau van gentranscriptie, is het belangrijk om de verschillende componenten van het regulatorische systeem te kennen en hun werking te begrijpen (Seshasayee et al, 2006). Posttranslationele modificaties (PTM’s), zoals fosforylatie, acetylatie en methylatie, dragen bij aan de controle van deze respons door de functie van bepaalde eiwitten te moduleren, waarbij deze geactiveerd of geïnactiveerd worden. Micro-organismen bezitten de opmerkelijke eigenschap om heel snel te reageren op veranderingen in hun omgeving (Gotoh et al, 2010). Om een gepaste respons op deze veranderingen mogelijk te maken, zijn transcriptiefactoren onmisbaar. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen exogene, endogene en hybride transcriptiefactoren. Exogene transcriptiefactoren detecteren signalen afkomstig van buiten de cel. Ze zijn opgebouwd uit een DNA bindend domein en een activeringsdomein. Dit laatste bevat één of meerdere allosterische controleplaatsen waaraan metabolieten op niet-covalente wijze kunnen binden of welke covalent gemodificeerd kunnen worden door enzymen om de regulatorische activiteit van de transcriptiefactor te wijzigen. Deze transcriptiefactoren worden vaak geactiveerd door fosforylatie door twee-component systemen (TCS) of door binding van metabolieten die getransporteerd worden in de cel. Endogene transcriptiefactoren anderzijds, worden geactiveerd door binding van metabolieten die binnen in de cel gesynthetiseerd worden. Zij reflecteren de intracellulaire status van de cel, zoals de concentratie van tussenproducten van de glycolyse. Wanneer transcriptiefactoren zowel geïmporteerde als intracellulair gesynthetiseerde metabolieten kunnen binden, worden ze hybride transcriptiefactoren genoemd (Seshasayee et al, 2006).
2
Inleiding
Bacteriële eiwitfosforylatie
Eiwitkinasen en -fosfatasen zijn zowel in eukaryoten als in prokaryoten verantwoordelijk voor de reversibele modificatie van een brede waaier aan eiwitten die een onderdeel vormen van intracellulaire signalisatiecascades. Eiwitkinasen kunnen worden onderverdeeld in twee klassen, afhankelijk van de specifieke aminozuurresiduen die ze modificeren. Enerzijds zijn er de alom bekende serine-, threonine- en tyrosine-kinasen (S/T/Y kinasen). Deze werden oorspronkelijk beschouwd als specifiek voor eukaryoten, maar met de opkomst van genoom sequentiebepaling in de jaren 1990 werden talrijke genen, coderend voor S/T/Y kinasen, eveneens teruggevonden in bacteriële genomen. Veel van deze bacteriële kinasen hebben eukaryote tegenhangers en worden bijgevolg vaak gebruikt om de defensiemechanismen van de gastheer te verstoren. Omwille van deze eigenschap spelen ze een cruciale rol in de mogelijkheid van deze organismen om ziekte te veroorzaken. Fosforylatie van bacteriële eiwitten op serine-, threonine- of tyrosineresiduen controleert eveneens de transcriptie van bepaalde virulentiegenen. Gelijkaardige kinasen zijn echter ook aanwezig in niet-pathogene bacteriën, wat aantoont dat hun functies veel uitgebreider zijn (zoals regulatie van eiwitsecretie en celvorm) (Kobir et al, 2011; Mijakovic, 2010). Daarnaast zijn histidine- en aspartaat-kinasen (His/Asp kinasen) eveneens prominent aanwezig in bacteriën, waar ze frequent deel uit maken van TCS. Het prototype TCS bestaat uit een sensor histidine kinase (HK) en een respons regulator (RR) (Figuur 1, links). Het sensor kinase is meestal een integraal membraaneiwit met een extracellulair domein voor de herkenning van zeer specifieke signalen (input domein), en een intracellulair autokinase domein. Wanneer een signaal ontvangen wordt, wordt het autokinase domein geactiveerd, resulterend in de fosfotransfer van adenosinetrifosfaat (ATP) naar een histidineresidu op het fosfotransferase subdomein van het HK (Hoch, 2000; Mitrophanov & Groisman, 2008). De fosfaatgroep wordt vervolgens overgedragen naar een geconserveerd aspartaatresidu van de RR, met een verandering in de biochemische eigenschappen van het output domein als gevolg. Dit domein is betrokken in DNA binding en transcriptionele controle, voert enzymatische functies uit, bindt RNA of neemt deel aan eiwit-eiwit interacties (Gao et al, 2007; Mitrophanov & Groisman, 2008). De RR kan in sommige gevallen gedefosforyleerd worden door het HK, en bijgevolg is het de balans tussen fosforylatie en defosforylatie die instaat voor de controle van genexpressie in de cel (Gotoh et al, 2010). Fosforelays zijn meer complexe TCS met een ingewikkelde signaaltransductie pathway die additionele regulatoren fosfotransferase domeinen bevat (Figuur 1, rechts). In dit systeem draagt het HK de fosfaatgroep over op een RR die het geconserveerde aspartaatresidu bevat, maar het output domein mist. Deze fosfaatgroep wordt nadien verder getransfereerd naar een histidinebevattend fosfotransfer eiwit en het is dit eiwit dat uiteindelijk de terminale RR fosforyleert. Deze bezit wel een output domein en kan een cellulaire respons teweegbrengen. Deze extra componenten zorgen ervoor dat de pathway nauwkeuriger gereguleerd kan worden. Fosforelays worden gebruikt in complexe pathways zoals sporulatie en controle van de celcyclus (Hoch, 2000; Mitrophanov & Groisman, 2008).
3
Inleiding
Figuur 1. Schematische voorstelling van twee-component systemen (links) en fosforelays (rechts) (Mitrophanov & Groisman, 2008).
4
Inleiding 1.3.
Inductie van β-lactam resistentie via β-lactamasen in S. maltophilia
β-lactamase productie is vaak de voornaamste oorzaak van bacteriële resistentie tegen βlactam antibiotica. Induceerbare β-lactamasen in Gram-negatieve bacteriën worden vaak teruggevonden in een genomische cluster met een ampR gen. Twee verschillende βlactamase klassen werden geïdentificeerd in dergelijke ampR-β-lactamase modules: AmpC (klasse C) en klasse A β-lactamasen. De regulatie en inductie van chromosomale ampR-ampC systemen is reeds uitgebreid onderzocht en bijna volledig opgehelderd in onder andere Citrobacter freundii en Pseudomonas aeruginosa (Lin et al, 2009). Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat de inductie van β-lactamasen in Gram-negatieve bacteriën sterk gelinkt is aan de peptidoglycaanrecyclage pathway (Huang et al, 2012; Huang et al, 2010; Lin et al, 2011; Normark, 1995; Tayler et al, 2010). De huidige hypothese hieromtrent is weergegeven in Figuur 2 (pathway in P. aeruginosa), maar het exacte mechanisme in S. maltophilia is nog niet helemaal opgehelderd. β-lactam resistentie in S. maltophilia is geassocieerd met de inductie van twee chromosomaal gecodeerde β-lactamasen, L1 en L2, die deze antibiotica hydrolyseren en inactiveren (Abbott et al, 2011). L1 is een Ambler klasse B Zn2+-afhankelijk metallo-βlactamase dat alle β-lactam klassen hydrolyseert, behalve monobactams (Sanchez et al, 2009). Het L1 holo-enzyme is een tetrameer van vier gelijke subeenheden (Denton & Kerr, 1998). L2 is een Ambler klasse A serine β-lactamase en is, in tegenstelling tot L1, functioneel als dimeer. Enkel L2 is gevoelig voor inhibitie door typische β-lactam inhibitoren, zoals clavulaanzuur, hoewel Payne et al. inhibitie van L1, en andere metallo-β-lactamasen, beschreven hebben (Payne et al, 1997). Aangezien de expressie van beide β-lactamasen wordt geïnduceerd in aanwezigheid van β-lactam antibiotica, werd oorspronkelijk gedacht dat er slechts één regulatorisch systeem, onder controle van de transcriptionele regulator AmpR, actief is (Okazaki & Avison, 2008; Sanchez et al, 2009). Verscheidene studies hebben intussen echter voldoende bewijs geleverd dat er twee verschillende β-lactamase regulatorische mechanismen aanwezig zijn in S. maltophilia: mutanten werden geselecteerd die enkel L2 overexpresseerden, terwijl L1 induceerbaar bleef (Avison et al, 2002; Okazaki & Avison, 2008). Minstens drie eiwitten zijn betrokken in het inductiemechanisme: AmpG, AmpD en AmpR. AmpR is een LysR-type transcriptionele regulator (LTTR) die de ampC gentranscriptie controleert. Een geconserveerd T-N11-A LysR-motief is gelokaliseerd in de ampR promoter regio en is verantwoordelijk voor de negatieve autoregulatie van ampR (Lin et al, 2009). AmpG is een permease, gelokaliseerd in de binnenste membraan, dat verantwoordelijk is voor het transport van peptidoglycaan (PG) afbraakproducten vanuit het periplasma naar het cytosol (Huang et al, 2010). AmpD codeert voor een cytosolisch N-acetylanhydromuramoyl-L-alanine amidase dat het anhMur-NAc-tripeptide hydrolyseert voor verdere recyclage (Lin et al, 2009). Gedurende normale bacteriële groei wordt PG voortdurend opgebouwd en afgebroken. Nacetylglucosaminyl-1,6-anhydro-N-acetylmuramoyl-tri/tetra/penta-peptiden (GlcNAcanhMurNAc-peptiden), de PG afbraakproducten, worden in het periplasma gegenereerd door de activiteit van ‘penicillin-binding proteins’ (PBP) (zoals PBP1a in S. maltiphilia). PBP4 in P. aeruginosa (een ‘low molecular weight’ PBP) is een endopeptidase dat de crosslink
5
Inleiding tussen D-Ala van de ene glycaan streng en ‘meso-diaminopimelic acid’ (Dap) van een naburige streng splitst. De afbraakproducten worden vervolgens getransporteerd naar het cytoplasma via het AmpG permease. Het permease systeem in S. maltophilia bestaat uit AmpG en AmpN, en dus niet enkel uit AmpG, zoals in P. aeruginosa. In het cytosol worden de PG afbraakproducten verwerkt door het β-N-acetylglucosaminidase NagZ en AmpD (AmpDI in S. maltophilia), waardoor tetrapeptiden gegenereerd worden. Deze worden dan opnieuw geïncorporeerd in de PG biosynthese pathway en omgezet in UDP-MurNAcpentapeptiden die getransporteerd worden naar het periplasma en ingebouwd worden in de PG laag (Yang et al, 2009). Ook hier spelen PBP’s een rol: ‘high molecular weight’ PBP’s katalyseren via hun transglycosylase en transpeptidase domeinen de opbouw van nieuwe crosslinks tussen PG subeenheden (Cavallari et al, 2013). In afwezigheid van β-lactam antibiotica interageren UDP-MurNAc-pentapeptiden met AmpR en verhinderen op deze manier β-lactamase inductie (Moya et al, 2009) (Figuur 2A). Wanneer er echter een inducerend β-lactam (zoals imipenem of cefoxitine) aanwezig is, verhoogt de concentratie van peptidoglycaanfragmenten in het periplasma. Dit veroorzaakt saturatie van AmpD, waardoor GlcNAc-anhMurNAc-tripeptide accumuleert in het cytoplasma. Deze geaccumuleerde MurNAc-tripeptiden vervangen wellicht de met AmpR interagerende UDP-MurNAc-pentapeptiden, waardoor AmpR geconverteerd wordt in een activator van β-lactamase gentranscriptie (Normark, 1995) (Figuur 2B). AmpD is dus een sleutelenzyme dat de balans tussen de activerende en represserende liganden van AmpR controleert (Yang et al, 2009). Het AmpR-AmpN-AmpG-AmpD netwerk is in S. maltophilia simultaan betrokken bij de inductie van zowel L2 als L1 β-lactamase, hoewel enkel het L2 gen (blaL2) gelinkt is aan het ampR gen (Lin et al, 2011). Het AmpR systeem is bovendien essentieel voor zowel L1 als L2 inductie (Huang et al, 2010; Lin et al, 2011). Okazaki en Avison toonden reeds aan dat de inductie van blaL1 expressie een hogere graad van AmpR activatie vereist dan de inductie van blaL2 expressie. Dit verklaarden ze door aan te nemen dat de relatieve bindingsaffiniteit van AmpR voor blaL1 en blaL2 verschillend is of dat er mogelijk een extra eiwit nodig is voor L1 inductie (Okazaki & Avison, 2008). Mutaties die leiden tot β-lactam resistentie duiken vaak op in PBP genen (Moya et al, 2009). In S. maltophilia leidt inactivatie van het mrcA gen, dat codeert voor het penicilline bindend eiwit PBP1a, tot een verhoging van de basale expressie van beide β-lactamasen. Mutatie van PBP4 in P. aeruginosa veroorzaakt een AmpR-afhankelijke overexpressie van het βlactamase AmpC. Daarnaast activeert dit ook het CreBC twee-component systeem dat eveneens betrokken is bij β-lactam resistentie via een nog ongekend mechanisme. Dit tweecomponent systeem bestaat uit het sensor HK CreC en de RR CreB. Een homoloog tweecomponent systeem, BlrAB genoemd, is aanwezig in Aeromonas hydrophila, waarbij BlrAB rechtstreeks geactiveerd wordt door een peptidoglycaanfragment, leidend tot AmpC βlactamase productie (Tayler et al, 2010). Deze studies wijzen op een mogelijk belangrijke rol van TCS bij de inductie van antibioticaresistentie. Een aanwijzing voor de link tussen TCS en de respons op β-lactam antibiotica in S. maltophilia werd gevonden in een voorgaande studie in het L-ProBE labo, waarbij een HK en een GGDEF respons regulator (van twee verschillende TCS) opgereguleerd werden na stimulatie met het antibioticum imipenem (een carbapenem) (Van Oudenhove et al, 2012).
6
Inleiding
Figuur 2. Schematische voorstelling van de peptidoglycaanrecyclage pathway en de regulatie van het AmpC β-lactamase in Pseudomonas aeruginosa. (A) In afwezigheid van β-lactam antibiotica, verhindert AmpR βlactamase inductie. (B) Na toediening van een AmpC inducerend β-lactam antibioticum, activeert AmpR βlactamase transcriptie (Moya et al, 2009).
1.4.
Proteoomanalyse
Proteoomanalyse kan gedefinieerd worden als de uitgebreide analyse van het volledige eiwitcomplement, geëxpresseerd in een cel of een biologisch staal, op een bepaald tijdstip onder specifieke omstandigheden (Graham et al, 2007). Dit vormt echter een enorme uitdaging: vele eiwitten ondergaan PTM’s, er zijn grote verschillen in eiwitconcentratie en bovendien komen sommige eiwitten slechts transiënt tot expressie. Proteoomanalyse maakt het mogelijk om de dynamische eigenschappen van het volledige eiwitnetwerk in kaart te brengen, waarbij een beter begrip van microbiële systemen, evenals hun evolutie en rol als ziekteverwekkers, kan bekomen worden (Graham et al, 2011; Zhang et al, 2010). De meeste, grootschalige experimenten hebben als doel om de differentiële eiwitexpressie tussen twee of meerdere condities te kwantificeren, veeleer dan eenvoudigweg een momentopname weer te geven van de aanwezige eiwitten (kwalitatieve analyse) (Graham et al, 2011). De ontwikkeling van massaspectrometrie (MS) betekende een ware revolutie voor de proteoomanalyse. MS is ondertussen een routinetechniek geworden voor de identificatie van membranaire, cellulaire, periplasmatische en extracellulaire eiwitten en is de methode
7
Inleiding bij uitstek voor de studie van differentiële eiwitexpressie en de identificatie van PTM’s (Graham et al, 2011; Mitulovic & Mechtler, 2006). MS-gebaseerde proteoomanalyse kan uitgevoerd worden op intacte eiwitten (‘top down’) of op proteolytisch verknipte eiwitten (‘bottom up’). Beide technieken werden reeds met succes gebruikt voor de analyse van bacteriële eiwitten (Graham et al, 2011). 1.4.1. Massaspectrometrie
Principe van MS
Massaspectrometers zijn instrumenten die in staat zijn om ionen te produceren en vervolgens te scheiden op basis van hun m/z waarde. Om deze scheidingen mogelijk te maken, worden er elektrische of magnetische velden gegenereerd binnenin het toestel die het traject, de snelheid of de richting van de ionen beïnvloeden. Het effect van een elektromagnetisch veld op de beweging van een ion is omgekeerd evenredig met de massa van dat ion en recht evenredig met de elektrische lading. Het massaspectrum van een bepaalde component bestaat uit een grafiek van de abundantie van het gegenereerde ion in functie van zijn m/z waarde, waaruit het moleculair gewicht kan afgeleid worden (Canas et al, 2006). De ionisatiebron, de massa analysator en de detector vormen essentiële onderdelen van een massaspectrometer (Graham et al, 2011). De ionisatiebron heeft een tweevoudige functie: ten eerste moet het ervoor zorgen dat het staal in de gasfase wordt gebracht en ten tweede dienen de te analyseren moleculen een lading te krijgen, ze moeten dus geïoniseerd worden. Deze twee aspecten zijn vaak contradictorisch: van nature vluchtige moleculen zijn meestal ongeladen, terwijl geladen moleculen zelden vluchtig zijn bij kamertemperatuur. Bovendien dissociëren polymeren vaak bij hoge temperatuur (voornamelijk in het geval van biopolymeren, gezien het hoge moleculaire gewicht en de polariteit). De ontwikkeling van ‘matrix assisted laser desorption/ionisation’ (MALDI) en ‘electrospray ionisation’ (ESI), beiden in staat om peptiden en eiwitten te ioniseren, leidde tot de doorbraak van MS in proteoomanalyse (Canas et al, 2006). In MALDI wordt ionisatie bekomen door het peptiden- of eiwitmengsel te kristalliseren samen met een matrixoplossing en te bestralen met een gepulseerde laserbron. De matrix helpt de peptiden/eiwitten over te gaan naar de gasfase en is eveneens verantwoordelijk voor de overdracht van protonen, waardoor positief en negatief geladen ionen ontstaan (Canas et al, 2006; Graham et al, 2011). In ESI daarentegen wordt een hoog voltage aangebracht op een verwarmd capillair binnenin een cilindrische elektrode. De elektrische spray die op deze manier ontstaat, bestaat uit kleine, geladen druppeltjes. In de ionisatiebron verkleinen de druppels door evaporatie van het solvent als gevolg van een tegenstroom van gasmoleculen (vaak N2) en een verhoogde temperatuur. Wanneer de afstoting tussen de ladingen op het oppervlak van de druppel groter wordt dan de oppervlaktespanning, explodeert de druppel. Dit proces gaat door tot de druppels extreem klein worden en enkel het geïoniseerde peptide/eiwit overblijft. De finale ionisatie gebeurt via het geladen residu mechanisme of via het ion evaporatie model. In ESI worden typisch
8
Inleiding meervoudig geladen ionen gevormd, terwijl in MALDI meestal enkelvoudig geladen ionen ontstaan (Wilm, 2011). De gegenereerde ionen worden vervolgens geïntroduceerd in de massa analysator, waar ze gescheiden worden op basis van hun m/z waarde. Verschillende soorten massa analysatoren werden reeds ontwikkeld, waaronder de quadrupool, de 3D en lineaire ‘ion trap’ (LIT), en time of flight (TOF), ‘Fourier transform ion cyclotron resonance’ (FT-ICR) en Orbitrap instrumenten. Wanneer twee of meerdere analysatoren aan elkaar gekoppeld zijn, spreekt men van een tandem massaspectrometer (Canas et al, 2006). Detectie gebeurt in de meeste gevallen met een ‘elektron mulitplier’ detector, waarbij een elektronencascade gebruikt wordt om invallende ionensignalen te amplificeren (Parker et al, 2010).
Identificatie van eiwitten
Voorafgaand aan een MS analyse, worden eiwitten in het staal meestal proteolytisch verknipt, waarna de resulterende peptiden geanalyseerd kunnen worden. De op deze manier verkregen set van peptidenmassa’s is de ‘peptide mass fingerprint’ (PMF). Dit experimentele massaprofiel wordt vergeleken met de theoretische massa’s verkregen na in silico digest (met hetzelfde protease) van alle eiwit aminozuursequenties in een databank. De eiwitten in deze databank worden vervolgens gerangschikt naargelang het aantal peptidenmassa’s die overeenkomen met de opgegeven sequentie. Helaas geeft een dergelijke fingerprint niet alle theoretische massa’s weer die verwacht worden en aangezien er geen aminozuursequentie informatie verkregen wordt, kunnen er in het spectrum pieken voorkomen die niet afkomstig zijn van peptiden in het gevonden eiwit. Deze twee factoren bemoeilijken een ondubbelzinnige identificatie. Dit probleem kan omzeild worden door fragmentatie van de peptiden in tandem MS, waardoor informatie over de exacte aminozuursequentie kan verkregen worden (Becker & Bern, 2011; Canas et al, 2006). ‘Collision induced dissociation’ (CID) is een veelgebruikte techniek om peptidenionen in de gasfase te fragmenteren. Ionen worden versneld in een elektrisch veld in het vacuüm van de massaspectrometer en krijgen hierbij een zeer hoge kinetische energie. In de ‘collision cell’ botsen ze met inerte, neutrale gasmoleculen (meestal argon of stikstof) en wordt een deel van hun kinetische energie omgezet in interne energie, waardoor covalente bindingen gebroken worden en de peptiden uiteenvallen in kleinere fragmentionen (Wells & McLuckey, 2005). Bij CID vindt fragmentatie gewoonlijk plaats ter hoogte van de peptidenbinding, wat aanleiding geeft tot b- en y-ionen (respectievelijk het N- en Cterminale deel van de peptiden). Het fragmentatiespectrum (MS/MS of MS² spectrum) kan opnieuw vergeleken worden met theoretische fragmentatiespectra van alle eiwitten in een databank om de eiwitten te identificeren (‘peptide fragmentation fingerprint’, PFF). Verscheidene software programma’s werden ontwikkeld voor deze doeleinden, zoals MASCOT en SEQUEST. Alternatieve fragmentatiemethoden die gebruikt worden voor eiwitanalyse zijn ‘electron capture dissociation’ (ECD), ‘electron transfer dissociation’ (ETD) en excitatietechnieken met infrarode straling (Sleno & Volmer, 2004).
9
Inleiding 1.4.2. Gel-gebaseerde versus gel-vrije analysemethoden Traditionele proteoomanalyse bestaat in de meeste gevallen uit een scheidingsstap, gevolgd door een identificatiestap (meestal met behulp van massaspectrometrie). Eiwitten, gescheiden door bijvoorbeeld tweedimensionale gelelektroforese (2-DE), kunnen na in-gel trypsinedigest geïdentificeerd worden via PMF, en/of PFF. Een andere benadering omvat peptiden fractionatie met (multidimensionale) vloeistofchromatografie (LC), gekoppeld aan ‘electrospray ionisation ion trap’ tandem massaspectrometrie (ESI-MS/MS) (Monteoliva & Albar, 2004). De analysemethoden worden, afhankelijk de gebruikte scheidingstechniek, ingedeeld in gel-gebaseerd of gel-vrij.
Gel-gebaseerde analysemethoden
In deze strategie worden eiwitten gescheiden m.b.v. polyacrylamide gelelektroforese, meestal in twee dimensies (2-DE). In sodium dodecylsulfaat – polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) reageren eiwitten met het anionische detergent SDS om negatief geladen complexen te vormen. De hoeveelheid SDS die per eiwit kan gebonden worden, is proportioneel met de grootte van het eiwit en zal dus de lading van het complex bepalen. Aldus worden de eiwitten, die gedenatureerd en oplosbaar worden na SDS binding, gescheiden in een elektrisch veld op basis van hun moleculair gewicht (Smith, 1984). In 2-DE wordt er een tweede dimensie ingevoerd, waarbij de eiwitten eerst onderworpen worden aan een geïmmobiliseerde pH gradiënt (‘isoelectric focusing’, IEF), waarbij ze gescheiden worden op basis van hun isoelektrisch punt (pI), alvorens in een elektrisch veld gebracht te worden (Rabilloud et al, 2010). Na deze stap kunnen de eiwitten gevisualiseerd worden door middel van autoradiografie (in het geval van radioactief gelabelde eiwitten), een colloïdale Coomassie Blue kleuring, een zilverkleuring of fluorescentie. Vervolgens worden de spots, overeenkomend met de eiwitten van interesse, uitgesneden en onderworpen aan een in-gel trypsinedigest. Hierbij worden de eiwitten verknipt tot peptiden die nadien geanalyseerd kunnen worden met massaspectrometrie (Monteoliva & Albar, 2004) (Figuur 3). 2-DE is een relatief eenvoudige, visuele methode voor het in kaart brengen van verschillen in eiwitexpressie en -modificatie, maar heeft een aantal tekortkomingen. De gevoeligheid en lineariteit van detectie zijn laag, membraaneiwitten kunnen minder goed opgelost worden in de gebruikte buffers, de ladingscapaciteit van geïmmobiliseerde pH-gradiënt strips (IPG strips) is beperkt, de reproduceerbaarheid van de gels is vrij laag en de procedure is arbeidsintensief en moeilijk automatiseerbaar (Monteoliva & Albar, 2004; Zhang et al, 2010). Enkele van deze beperkingen kunnen omzeild worden door nieuwere methoden, zoals fluorescente tweedimensionale differentiële gelelektroforese (2-D DIGE), waarbij twee of meerdere, fluorescent gelabelde eiwitmengsels simultaan gevisualiseerd kunnen worden. Dit leidt tot een significante reductie in variabiliteit, waardoor de nood om meerdere replica’s van de gels te maken, vermeden kan worden (Unlu et al, 1997). Visualisatie van gels met de computer en de opkomst van gerobotiseerde uitsnijding van spots biedt de mogelijkheid om het hele proces aanzienlijk te versnellen (Graham et al, 2007).
10
Inleiding Enkel eiwitten met een moleculair gewicht tussen 10 en 120 kilodalton (kDa) kunnen in klassieke gel-gebaseerde methoden geanalyseerd worden en bovendien dienen deze een neutraal tot zuur isoëlektrisch punt te hebben om correct gescheiden te worden op IPG strips. Basische eiwitten, met een pI hoger dan 9.5, en hydrofobe eiwitten, zoals integrale membraaneiwitten, worden zelden teruggevonden op 2D gels. Laag abundante eiwitten die vaak een belangrijke fysiologische functie vervullen, kunnen moeilijk gedetecteerd worden en additionele fractionatiestappen zijn dikwijls vereist om de complexiteit van de te analyseren eiwitmengsels te reduceren (Monteoliva & Albar, 2004). 2-DE blijft voor vele onderzoekers echter de methode bij uitstek om isovormen en PTM’s van eiwitten te onderscheiden en/of te detecteren (Zhang et al, 2010). Figuur 3. Analyse van differentiële eiwitexpressie via tweedimensionale gelelektroforese en identificatie met behulp van massaspectrometrie. Eiwitten worden gescheiden via 2-DE en gevisualiseerd met zilverkleuring. Spots met verschillende intensiteit in de verschillende condities worden proteolytisch verknipt en geanalyseerd met MALDI-TOF MS. In eiwit- of genomische databases kan worden gezocht naar een match voor de ‘peptide mass fingerprint’ om op deze manier kandidaat eiwitten te identificeren. Unieke identificatie van de eiwitten kan bekomen worden na tandem massaspectrometrie (MS/MS) en analyse van de resulterende ‘peptide fragmentation fingerprint’ (Monteoliva & Albar, 2004).
11
Inleiding
Gel-vrije analysemethoden
Vanwege de tekortkomingen van de traditionele methoden voor proteoomanalyse (een- of tweedimensionale gelelektroforese gevolgd door MS), winnen alternatieve strategieën, zoals LC gekoppeld aan online ESI-MS/MS detectie, aan populariteit. In deze benaderingen wordt een complex eiwitmengsel verknipt in oplossing (‘bottom up’ benadering), vooraleer gescheiden te worden (Monteoliva & Albar, 2004). Het aantal peptiden aanwezig in een staal na proteolyse kan enorm hoog zijn en bovendien kan het concentratiebereik van deze peptiden meerdere grootteordes omvatten (Eeltink et al, 2010). Een hoge resolutie voor de fractionatie van dit peptidenmengsel is dan ook noodzakelijk. In proteoomanalyse wordt bij voorkeur LC-MS gebruikt voor de grootschalige studie van eiwitten omwille van de hoge gevoeligheid, selectiviteit, nauwkeurigheid en de mogelijkheid om vele stalen in korte tijd te analyseren. In deze opstelling worden peptiden, bekomen na trypsinedigest, gescheiden met behulp van ‘High Performance Liquid Chromatography’ (HPLC) en vervolgens geïntroduceerd in een massaspectrometer voor identificatie (via PMF en/of PFF) en eventueel kwantificatie (Zhang et al, 2010). Het onderliggende principe van kolomchromatografie is dat moleculen niet alleen oplossen in vloeistoffen, maar ook kunnen adsorberen of interageren met het oppervlak van vaste stoffen of partikels. Wanneer een molecule, opgelost in een vloeistof, door een kolom gaat die bestaat uit vaste deeltjes waarmee de molecule interageert, zal deze molecule trager bewegen dan het solvent waarin ze opgelost is. Hierbij spendeert de molecule een deel van de tijd in de vloeibare, mobiele fase en een deel in de vaste fase. Bijgevolg zullen moleculen die goed interageren met de vaste fase later van de kolom elueren dan moleculen die zwak interageren. De scheiding van moleculen met chromatografie buit het soms subtiele verschil in fysische eigenschappen tussen de moleculen in het staal uit. Oplosbaarheid in water (adsorptie of normale fase chromatografie (NPLC)) of organische solventen (omgekeerde fase of ‘reversed phase’ chromatografie (RPLC)), netto positieve of negatieve ladingen (ion uitwisselingschromatografie) en grootte van de moleculen (‘size exclusion’ chromatografie (SEC)) zijn hier voorbeelden van. Vaak verandert de vloeibare fase van samenstelling in functie van de tijd, zodat een molecule van de kolom elueert wanneer de mobiele fase een bepaalde samenstelling heeft bereikt. Dit principe van gradiëntelutie kan toegepast worden op alle vormen van vloeistofchromatografie, behalve op SEC (Bird, 1989). Om een zo goed mogelijke scheiding te bekomen, moet de kolom zodanig ontworpen worden dat de moleculen in het staal uitgebreid in contact kunnen komen met de vaste fase. De kolom langer maken is één van de manieren om dit te bereiken, maar een groot verschil in lengte levert slechts een kleine verbetering van de scheiding op. Een meer succesvolle benadering is het verkleinen van de partikels die de vaste fase dragen. Niet alleen vergroot dit het contactoppervlak tussen de vaste fase en de moleculen in het staal (voor een gegeven kolom volume), maar tevens wordt het volume van het solvent dat zich tussen de partikels bevindt, en dus ook de diffusietijd, sterk gereduceerd. Een nadeel hiervan is echter een sterke verhoging van de druk. Vele vaste fasen die goede fysisch-chemische eigenschappen hebben bij normale druk (<0.5 kPa), zouden bij verkleining van de partikelgrootte voor hogere prestaties (HPLC) samengedrukt worden door de enorme druk (tot 3.5 kPa). Gelukkig werden er vaste fasen ontwikkeld die wel aan dergelijke hoge druk
12
Inleiding kunnen weerstaan, zoals silica partikels, die geschikt zijn voor zo goed als elke vorm van HPLC. Belangrijke voordelen van HPLC ten opzichte van gels zijn de snelheid waarmee analyses uitgevoerd kunnen worden en de volledig geautomatiseerde staalinjectie (Bird, 1989). 1.4.3. Kwantitatieve proteoomanalyse Een belangrijk aspect in proteoomstudies is het meten van de relatieve of absolute hoeveelheden van eiwitten aanwezig in een biologisch staal. Dit is essentieel wanneer het effect van een bepaalde component op een biologisch systeem bestudeerd wordt, wanneer twee verschillende condities met elkaar vergeleken worden of wanneer de opbrengst in een biotechnologisch proces geëvalueerd wordt. Kwantitatieve, vergelijkende of differentiële proteoomanalyse werd oorspronkelijk uitgevoerd met 2-DE, waarbij de intensiteit van eiwitspots op gepaarde gels vergeleken werd en de verschillen gekwantificeerd werden. Naast de tekortkomingen die reeds besproken werden in de vorige sectie, is er meer dan 100 µg totaal eiwit nodig voor elke analyse en bovendien is de verhouding van de intensiteit van de spots niet zo accuraat door variaties en beperkingen in de staalvoorbereiding (Canas et al, 2006; Ferguson & Smith, 2003). Omwille van deze redenen werden meer veelzijdige, MSgebaseerde strategieën, gekoppeld aan gel-vrije eiwit/peptiden scheidingen, ontwikkeld als alternatief voor de traditionele gel-gebaseerde technologie (Canas et al, 2006). Kwantitatieve expressie analyse wordt onderverdeeld in twee benaderingen: labelgebaseerd en label-vrij (Graham et al, 2011). Een andere manier waarop cellen kunnen reageren op een bepaalde stimulus, naast het verhogen of verlagen van de expressie van eiwitten, is door eiwitten te activeren of inactiveren. Dit aan- of afzetten kan gerealiseerd worden door verschillende PTM’s, waaronder fosforylaties, glycosylaties, nitrosylaties, methylaties, enz. Analyse van veranderingen in deze PTM’s is dan ook een essentieel onderdeel van differentiële proteoomanalyse.
Label-gebaseerde kwantitatieve expressie analyse
Veruit de meest gebruikte methodologie voor zowel relatieve als absolute kwantificatie is de labeling met stabiele isotopen (Canas et al, 2006). Deze isotooplabels bevatten in de meeste gevallen één of meerdere zware versies van de elementen waterstof (2H), koolstof (13C), zuurstof (18O) of stikstof (15N). Introductie van de labels kan gebeuren via in vitro chemische modificatie zoals in ‘isotope coded affinity tags’ (ICAT) en ‘isobaric tagging for relative and absolute quantification’ (iTRAQ), waarbij specifieke aminozuur residuen of functionele groepen reageren met een isotoop-gemerkt reagens. Een alternatieve methode is de enzymatische introductie van 18O, waarbij trypsine de 16O/18O uitwisseling katalyseert. Het label kan ook rechtstreeks geïntroduceerd worden in vivo door middel van metabolische labeling, zoals in ‘stable isotope labeling by amino acids in cell culture’ (SILAC). De cellen worden hierbij gegroeid in verrijkte media die isotoop-gelabelde aminozuren bevatten. Het
13
Inleiding medium van één van de te vergelijken celculturen bevat een isotoop-gemerkt aminozuur, zoals 13C6-lysine, dat ingebouwd wordt in alle nieuwe eiwitten die vanaf dan aangemaakt worden. Voorafgaand aan elke vorm van scheiding of aanrijking, maar na labeling, worden de eiwitten van beide culturen gepoold (Ong et al, 2002). De kracht van deze methoden ligt in het feit dat de gelabelde eiwitten of peptiden fysiochemisch identiek zijn en enkel onderscheiden kunnen worden met massaspectrometrie door een verschuiving in hun massa. De verhouding van de signaalintensiteit van de isotoopparen is een nauwkeurige reflectie van hun relatieve abundantie (Becker & Bern, 2011; Canas et al, 2006; Graham et al, 2011). Voor een betrouwbare kwantificatie is het belangrijk de isotooplabels zo vroeg mogelijk te introduceren, waardoor de te vergelijken condities vroeg in de experimentele procedure samengevoegd kunnen worden. Hierdoor kunnen ze zo veel mogelijk samen behandeld worden in eenzelfde experiment en wordt technische variatie geminimaliseerd (Bantscheff et al, 2007). Strategieën voor absolute kwantificatie (AQUA) berusten op het gebruik van interne standaarden, zoals synthetische peptiden gelabeld met isotoop-gemodificeerde aminozuren. Een gekende hoeveelheid van deze peptiden, die een verwacht proteolytisch peptide nabootsen maar een verschillende massa bezitten, wordt toegevoegd aan het staal. Aangezien de concentratie van de interne standaard gekend is, kan de ratio tussen de interne standaard en het natuurlijke peptide gebruikt worden om de absolute hoeveelheid van het natuurlijke peptide af te leiden. Deze methode laat een zeer accurate kwantitatieve meting toe van specifieke a priori gekozen targets (Canas et al, 2006; Steen & Mann, 2004; Yocum & Chinnaiyan, 2009). De keuze van de te kwantificeren peptiden is cruciaal, rekening houdend met de efficiëntie van de verknipping en de ionisatie, de onderhevigheid aan modificaties, de stabiliteit, … (Canas et al, 2006; Picotti & Aebersold, 2012).
Label-vrije kwantitatieve expressie analyse
Kort nadat labeling met stabiele isotopen geaccepteerd werd als kwantificatie methode, werden label-vrije benaderingen voorgesteld en ontwikkeld (Becker & Bern, 2011). De meest gebruikte methoden zonder labeling zijn de ‘spectral counting’ en emPAI techniek. ‘Spectral counting’ is gebaseerd op de observatie dat het aantal MS/MS spectra, toegewezen aan een bepaald eiwit, correleert met de abundantie van dat eiwit. Wanneer twee condities vergeleken worden, kunnen verschillen in expressie gemeten worden door het aantal spectrale hits per eiwit te analyseren. Deze methode is betrouwbaar om verhoudingen groter dan 2.5 te bepalen, maar niet voor kleinere veranderingen in expressie. De exponentieel gemodificeerde eiwit abundantie index (emPAI) kan toegepast worden om de absolute hoeveelheid van een eiwit in een staal te schatten. De emPAI is een aanpassing van de eiwit abundantie index (PAI), een verhouding die afgeleid wordt van het aantal geobserveerde peptiden gedeeld door het aantal peptiden die geobserveerd kunnen worden per eiwit. Deze waarde is een maatstaf voor de abundantie van dat eiwit (Graham et al, 2011). Een andere optie is om de ‘area under curve’ (AUC) in het ´extracted ion chromatogram’ (XIC) van een peptide te bepalen. Dit wordt meestal toegepast in combinatie met ‘multiple reaction monitoring’ (MRM), maar is sterk afhankelijk van de reproduceerbaarheid van de MRM analyse.
14
Inleiding 1.4.4. ‘Targeted proteomics’ Het eiwitcomplement van een cel is uiterst complex en dynamisch, en bijgevolg niet eenvoudig om nauwkeurig te meten. ‘Targeted proteomics’ – verkozen tot ‘Nature Method of the Year 2012’ – biedt hiervoor een oplossing door gericht een specifieke subset van eiwitten van interesse in een staal te analyseren. Een dergelijke gerichte benadering maakt de ontwikkeling van kwantitatieve analyses, om specifieke hypothese-gebaseerde vragen te beantwoorden, mogelijk. De toepassing van massaspectrometrie in ‘targeted proteomics’ is relatief recent en steunt voornamelijk op het gebruik van de triple quadrupool massaspectrometer (Marx, 2013). ‘Single reaction monitoring’ (SRM) is een ‘targeted’ massaspectrometrische methode die van toenemend belang is doordat het de mogelijkheid biedt zeer gevoelige en selectieve kwantitatieve analyses uit te voeren in complexe biologische stalen. De analyse is gericht op een specifieke subset van peptiden, welke representatief zijn voor eiwitten van interesse. De corresponderende ionen worden geselecteerd in de massaspectrometer en vervolgens gefragmenteerd, waarna enkele specifieke fragmentionen gevolgd worden voor detectie en kwantificatie. Dit soort analyse wordt typisch uitgevoerd op een triple quadrupool massaspectrometer, of een hybride triple quadrupool – lineaire ‘ion trap’ (QTRAP) massaspectrometer (Gallien et al, 2011). De eerste quadrupool massa analysator (Q1) selecteert ionen met een massa gecentreerd rond deze van het target peptide, waarna de ionen door middel van CID gefragmenteerd worden ter hoogte van de peptidebinding in de tweede quadrupool (Q2). Één of meerdere fragmentionen, uniek voor het peptide van interesse, worden vervolgens doorgelaten door de derde quadrupool (Q3) en bereiken de detector (Picotti & Aebersold, 2012). SRM vereist op deze manier dus twee ionen (een precursor en een fragment ion), ook wel een ‘transitie’ genoemd, om een positief resultaat te genereren, wat het een zeer specifieke en gevoelige methode maakt. MRM is een variant hierop waarbij meerdere transities in eenzelfde LC-MS analyse kunnen worden gevolgd (Yocum & Chinnaiyan, 2009) (Figuur 4). MRM laat dus toe om specifieke eiwitten te volgen in een totaal digest, zonder voorafgaande aanrijkings- of fractionatiestappen. Figuur 4. Vergelijking van het verwerven van MS/MS en MRM spectra in triple quadrupool instrumenten (Broad Institute, 2013).
15
Inleiding 1.4.5. Fosfoproteoomanalyse In biologische systemen worden honderden PTM’s teruggevonden. Reversibele eiwitfosforylatie vormt een belangrijk controlepunt in vele signaaltransductie pathways in bacteriën en fosforylatiecascades spelen een cruciale rol in, onder andere, TCS. Verschillende aminozuurresiduen kunnen gefosforyleerd worden, waarbij S/T/Y fosforylaties veruit de meest voorkomende zijn in eukaryote cellen. In bacteriële TCS zijn voornamelijk His/Asp fosforylaties van belang (Graham et al, 2011). Om deze complexe signalisatienetwerken volledig te begrijpen, dienen analytische strategieën ontwikkeld te worden voor de globale analyse van gefosforyleerde eiwitten en de karakterisering van fosforylatiesites onder verschillende condities (Kosako & Nagano, 2011). Gefosforyleerde eiwitten kunnen gevisualiseerd worden in 1D- en 2D-PAGE met een specifieke fluorescente fosfo-kleuring (zoals de ProQ Diamond kleuring). Deze kleuring laat een rechtstreekse detectie toe van fosfaatgroepen, waarbij de sterkte van het signaal correleert met het aantal fosfaatgroepen op het eiwit. Dit levert een indicatie op van eventuele kwantitatieve veranderingen in fosforylatie. MS analyse van fosfopeptiden wordt in de meeste gevallen voorafgegaan door een scheiding van deze peptiden op een nanoLC kolom, typisch gevuld met een ‘reversed phase’ (C18) materiaal. Detectie van fosfopeptiden met MS is gebaseerd op een massaverschil tussen het gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde peptide in het MS spectrum. Oorspronkelijk werden fosfopeptiden gedetecteerd met triple quadrupool instrumenten via hun diagnostisch fragment ion met m/z waarde 79 (HPO3-), gebruik makende van ‘precursor ion scanning’ in negatieve ion modus. In een ‘precursor ion’ scan, scant Q1 een bepaald massabereik en wordt Q3 gefixeerd om enkel de fragmentmassa van interesse door te laten. Het resulterende massaspectrum toont de massa’s van alle peptiden die deze specifieke fragmentmassa produceren. Later werden enkele specifieke MS strategieën ontwikkeld om fosfopeptiden op een zeer gevoelige manier te detecteren, steunend op de specifieke eigenschappen van de verschillende soorten fosforylatie. De O-fosfaat binding in serine- en threonine gefosforyleerde peptiden is zeer labiel gedurende CID, wat vaak resulteert in het verlies van fosforzuur (H3PO4; 98 Da) van het precursor ion (Macek et al, 2009). Dit kan gedetecteerd worden als een dominante ‘neutral loss’ piek in het MS/MS spectrum. Vaak wordt dit fenomeen gebruikt om peptiden, gefosforyleerd op serine of threonine, te detecteren via een ‘neutral loss’ scan. In deze scan worden beide quadrupolen ingesteld in de scan modus met een vast massaverschil tussen beide. Het massaspectrum geeft de massa van alle peptiden weer die dit specifieke verlies hebben ondergaan. Fosforylatie van tyrosine is een relatief stabiele modificatie en fragmentatie levert ionen op waar de fosfaatgroep nog aanwezig is. Het tyrosine immonium ion, resulterend van de fragmentatie aan beide zijden van een fosfotyrosine residu, kan gedetecteerd worden via een ‘precursor ion’ scan waarbij Q3 gefixeerd wordt op een m/z waarde van 216.042. Zowel fosfohistidine als fosfoaspartaat zijn zeer labiel in zure omstandigheden en worden vaak over het hoofd gezien tijdens fosfoproteoom analyses, aangezien veel van de technieken die normaal gebruikt worden voor de studie van eiwitfosforylatie gebruik maken van zure condities (Mijakovic, 2010).
16
Inleiding Analyse van fosforylatie verloopt echter niet zonder problemen. Aangezien eiwitfosforylatie een transiënte en reversibele PTM is, kan de concentratie van het gemodificeerde eiwit vaak zeer laag zijn. De stoichiometrie van fosforylatie is in vele gevallen afhankelijk van de toegepaste stimulus en strikte regulatie van de betrokken kinasen en fosfatasen kan leiden tot slechts minieme verschillen in de fosforylatiegraad van relevante eiwitten. MS analyse van fosfopeptiden wordt verder bemoeilijkt door de lage ionisatie-efficiëntie van fosfopeptiden in vergelijking met niet-gefosforyleerde peptiden, het verlies van de labiele fosfaatgroep en het ontoereikende fragmentatie patroon (Orsburn et al, 2011). Vanwege de lage abundantie van fosfopeptiden in vergelijking met hun niet-gemodificeerde tegenhangers, wordt kwantitatieve analyse van eiwitfosforylatie met massaspectrometrie in vele gevallen voorafgegaan door een aanrijkingsstap. Aanrijking van fosfopeptiden kan op verscheidene manieren bekomen worden: immunoprecipitatie met antilichamen tegen fosfotyrosine, ‘Immobilized Metal Affinity Chromatography’ (IMAC), grafiet of titanium dioxide (TiO2) kolommen, ‘Strong Cation Exchange’ (SCX) of ‘Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography’ (HILIC ) (Graham et al, 2011). Differentieel gefosforyleerde peptiden kunnen geanalyseerd worden met technieken die gebruik maken van stabiele isotopen, zoals ICAT, SILAC, enzymatische 18O labeling, iTRAQ en AQUA. In AQUA kan m.b.v. MRM de absolute hoeveelheid van het fosfopeptide in het staal bepaald worden door de intensiteit van de transities van het endogene fosfopeptide te vergelijken met deze van het gelabelde peptide (Lange et al, 2008). In een alternatieve benadering kan de intensiteit van het fosfopeptide vergeleken worden met deze van een niet gefosforyleerd peptide van hetzelfde eiwit. Deze informatie kan gebruikt worden om de relatieve hoeveelheid van het fosfopeptide te bepalen in verschillende experimentele condities (Cox et al, 2005).
1.5.
Analyse van membraaneiwitten
Gezien de complexiteit van het volledige proteoom, kan de analyse vereenvoudigd worden door gericht te kijken naar een specifieke subset van eiwitten. De respons op extracellulaire stimuli brengt vaak veranderingen in membraan-geassocieerde eiwitten en hun PTM’s met zich mee. In dit opzicht is het analyseren van het membraanproteoom een beloftevolle start voor het ophelderen van signaaltransductiemechanismen. Eventuele veranderingen in fosforylatiegraad van membraaneiwitten kunnen gedetecteerd worden na ProQ kleuring van SDS-PAGE gels of op een kwantitatieve manier gemeten worden met behulp van MRM. De analyse van dit subproteoom is echter niet evident. De lage abundantie en slechte oplosbaarheid van membraaneiwitten, gecombineerd met de moeizame isolatie, ionisatie en fragmentatie zijn verantwoordelijk voor het lage slaagpercentage van deze experimenten (Orsburn et al, 2011).
17
Inleiding 1.5.1. Problemen geassocieerd met de analyse van plasmamembraaneiwitten Een eerste probleem is de isolatie en zuivering van membraaneiwitten: slechts een laag percentage van alle membraaneiwitten kan teruggevonden worden. Deze eiwitten zijn vaak zeer hydrofoob, waardoor de klassieke benaderingen voor eiwitextractie niet toepasbaar zijn. Membraaneiwitten hebben de neiging om te aggregeren en vervolgens neer te slaan wanneer de conventionele staalvoorbereiding wordt gevolgd. Alternatieve methoden dienen dus ontwikkeld en geoptimaliseerd te worden, wat vaak een tijdrovend werk is. Een zorgwekkend probleem in de context van membraanfosfopeptiden is dat eiwitten schijnbaar minder gefosforyleerd lijken, terwijl deze daling in realiteit te wijten is aan het feit dat deze eiwitten niet efficiënt in de membraanfractie terecht komen, waardoor slechts een fractie van de werkelijke concentratie gedetecteerd wordt (Orsburn et al, 2011). Ten tweede is het niet zo eenvoudig om membraaneiwitten na isolatie op te lossen in het correcte solvent. De oplosbaarheid in het anionische oppervlakte-actieve solvent SDS is goed, maar dit anionische product is vaak incompatibel met verschillende stadia in de daaropvolgende verwerking van het staal. Verscheidene MS-compatibele solventen werden recent ontwikkeld, zoals het surfactant RapiGest (Waters, MA, USA) (Orsburn et al, 2011). Verder is ook de lage abundantie van vele membraaneiwitten een omvangrijk probleem, waardoor voornamelijk eiwitten die in grote hoeveelheid aanwezig zijn in de membraan, teruggevonden worden en laag abundante eiwitten maskeren. Als laatste bemoeilijken de intrinsieke eigenschappen van eiwitten die associëren met de plasmamembraan analyse met MS. Het ontbreken van geladen arginine en lysine residuen in transmembraan domeinen bemoeilijkt het verknippen van deze eiwitten in peptiden met een geschikte lengte voor MS analyse (Helbig et al, 2010).
18
Doelstelling
2. DOELSTELLING Dit project kadert in het onderzoek naar de inductie van antibioticaresistentie in S. maltophilia, een Gram-negatieve bacterie die vaak voorkomt in nosocomiale infecties. S. maltophilia wordt al sinds enkele jaren bestudeerd in het labo van Prof. Dr. Devreese (LProBE), waarbij met behulp van 2-DE en iTRAQ technologie de eiwitexpressie voor en na inductie met het antibioticum imipenem onderzocht werd (Van Oudenhove et al, 2012). Intrinsieke β-lactam resistentie in S. maltophilia is voornamelijk te wijten aan twee chromosomaal gecodeerde β-lactamasen, maar het inductiemechanisme is vooralsnog onbekend (Huang et al, 2010; Lin et al, 2009; Okazaki & Avison, 2008; Senol, 2004; Yang et al, 2009). Voorgaande studies toonden reeds aan dat de transcriptionele regulator AmpR opgereguleerd wordt na inductie, evenals enkele eiwitten betrokken in de peptidoglycaanrecyclage pathway en eiwitten die deel uitmaken van TCS. Aangezien eiwitfosforylatie een essentieel onderdeel is van de signalisatie, kan de studie van deze PTM meer inzicht bieden in het inductiemechanisme leidend tot antibioticaresistentie. Het doel van dit project is om gericht de expressie van bepaalde eiwitten, alsook hun mogelijke PTM’s, voor en na imipenem stimulatie te bestuderen. Het ophelderen van de signalisatiecascades die leiden tot de inductie van L1 en L2 β-lactamasen is het hoofddoel op lange termijn. Enerzijds zal getracht worden om, met behulp van SDS-PAGE en fosfospecifieke eiwitkleuring, veranderingen in fosforylatiegraad te visualiseren. Hierbij zal gericht gekeken worden naar eiwitten aanwezig in de binnenste membraan, aangezien deze een belangrijke rol spelen in signalisatie. Identificatie van de gevonden eiwitten is mogelijk met LC-MS voorafgegaan door in-gel trypsinedigest (gel-gebaseerde benadering). Verder zullen de geïsoleerde membraaneiwitten tevens gescheiden worden met HILIC om de complexiteit te verlagen, gevolgd door identificatie met LC-MS. Anderzijds wordt ook een directe LC-MS analyse zonder voorafgaande scheiding beoogd, ter verificatie van de resultaten verkregen met de gel-gebaseerde benadering. Eiwitfosforylatie is een reversibele, labiele modificatie die snel verloren kan gaan. Extra aandacht moet dan ook besteed worden aan het ontwikkelen en op punt stellen van methodes die het behoud van deze modificaties toelaten. Bovendien zullen voornamelijk membraaneiwitten onderzocht worden, welke de analyse bemoeilijken. De procedures voor de isolatie van membraaneiwitten en de LC en MS analyse dienen bijgevolg grondig geoptimaliseerd te worden om betrouwbare resultaten te verkrijgen. Deze optimalisatie vormt dan ook een essentieel onderdeel van deze scriptie.
19
Resultaten
3. RESULTATEN 3.1.
Optimalisatie van de extractie van membraaneiwitten
Vanwege het overwegend hydrofobe karakter van membraaneiwitten, werden aangepaste extractieprocedures ontwikkeld. Bovendien moeten gefosforyleerde eiwitten tijdens de extractie zoveel mogelijk intact blijven om ze later te kunnen detecteren en analyseren met SDS-PAGE of LC-MS. Deze fosforylaties zijn immers reversibel en labiel. Naast proteaseinhibitoren werden daarom ook fosfatase-inhibitoren toegevoegd aan de gebruikte extractiebuffers, indien de analyse van eiwitfosforylatie beoogd werd. Tijdens de zoektocht naar een efficiënte methode voor de extractie van membraaneiwitten uit S. maltophilia cellen, werd gestart van twee methodes die in de literatuur werden teruggevonden. De eerste methode werd reeds gebruikt in het L-ProBE labo voor de isolatie van membraaneiwitten uit S. maltophilia cellen (Van Oudenhove et al, 2012). Hierbij wordt het basische natriumcarbonaat toegevoegd aan gelyseerde cellen om contaminerende eiwitten die zwak associëren met de membraan, zoals elongatiefactoren en andere ribosomale eiwitten, los te maken en in oplossing te brengen. De celmembranen, die de integrale membraaneiwitten bevatten, zijn onoplosbaar in de natriumcarbonaatoplossing en kunnen gerecupereerd worden na centrifugatie aan zeer hoge snelheid (100000xg) (Molloy, 2008). Deze aanpak resulteerde in de identificatie van 349 eiwitten, waarvan 27% aanwezig is in de binnenste membraan en 12% in de buitenste membraan. De tweede methode, beschreven door Mirza et al., maakt gebruik van een hoge concentratie mannitol en sucrose in een viskeuze extractiebuffer om hydrofobe membraaneiwitten te precipiteren en zo te scheiden van hydrofiele cytosolische eiwitten die in oplossing blijven. Achtergebleven lipiden worden verwijderd door middel van een chloroform/methanol extractie, waarna het staal verder opgezuiverd wordt met een acetonprecipitatie. Van alle eiwitten die geïdentificeerd werden in deze studie (die uitgevoerd werd op vasculaire endotheliale cellen van de rat), was maar liefst 43% geassocieerd met de membraan. In deze studie werden de methodes van Van Oudenhove et al. (Van Oudenhove et al, 2012) en Mirza et al. (Mirza et al, 2007) geëvalueerd en vervolgens geoptimaliseerd. De efficiëntie van de verschillende extractiemethodes werd beoordeeld door de geëxtraheerde membraaneiwitten te scheiden met behulp van SDS-PAGE.
20
Resultaten 3.1.1 Vergelijking van extractiemethodes In een eerste experiment werd de aangepaste methode van Van Oudenhove et al. (methode 1, Tabel 1) vergeleken met een aangepaste versie van de procedure gebruikt door Mirza et al. (methode 3, Tabel 1). In methode 1 worden de cellen opgelost in 250 µl 50 mM Tris-HCl pH 8 met ‘Complete EDTA-free protease inhibitor mixture’ (Roche, Basel, Switzerland), gevolgd door twee sonicatie- (60 s, 15% amplitude, 1 s puls aan, 1 s puls uit) en centrifugatie- (2 x 8 min aan 2500xg) stappen. Vervolgens wordt het polaire natriumcarbonaat toegevoegd, gevolgd door centrifugatie aan zeer hoge snelheid (1 uur aan 100000xg) om hydrofobe membraaneiwitten te pelleteren. In methode 3 worden de cellen opgelost in 1 ml TMSE buffer (60 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM mannitol, 70 mM sucrose, 1 mM EDTA, gesupplementeerd met ‘Complete EDTA-free protease inhibitor mixture’ (Roche) en wanneer fosforylatie werd bestudeerd, gesupplementeerd met ‘PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail’ (Roche) en 1 mM natriumorthovanadaat) en gelyseerd door sonicatie (3 x 60 s, 15% amplitude, 1 s puls aan, 1 s puls uit). Membraaneiwitten worden gecollecteerd door centrifugatie (10 min, 8000xg). De eiwitten worden heropgelost in 1 ml TMSE buffer en opnieuw gecollecteerd door centrifugatie (10 min, 800xg). Ook ongelyseerde cellen worden gepelleteerd, wat een mogelijke verklaring is voor de grote en onzuivere pellet. Beide extractiemethodes werden parallel uitgevoerd en de geëxtraheerde membraaneiwitten werden opgelost in 150 µl SDS sample buffer (2% SDS, 0.01% broomfenol blauw, 1.32 M glycerol, 60 mM Tris-HCl pH 8) en gescheiden met SDS-PAGE (Figuur 5). De extractiemethode gebaseerd op de procedure van Mirza et al. levert duidelijk meer eiwitmateriaal op dan deze gebaseerd op de procedure van Van Oudenhove et al. en blijkt dus op het eerste zicht een stuk efficiënter te zijn. Hierbij moet wel worden uitgemaakt of de hoge eiwitopbrengst in de derde methode te wijten is aan een betere extractie van membraaneiwitten, of een grotere hoeveelheid ‘contaminerende’ cytoplasmatische eiwitten. Tabel 1. Vergelijking van de gebruikte methodes voor de extractie van membraaneiwitten.
Methode
Extractie buffer
Sonicatie
Centrifugatie
Acetonprecipitatie
Chloroform delipidatie
1
50 mM Tris-HCl pH 8
2 x 60 s op ijs
2 x 8 min aan 2500xg en 1 uur aan 100000xg
Nee
Nee
2
TMSE buffer
3 x 60 s op ijs
10 min aan 8000xg en 10 min aan 800xg
Ja
Ja
3
TMSE buffer
3 x 60 s op ijs
10 min aan 8000xg en 10 min aan 800xg
Nee
Nee
4
TMSE buffer
3 x 60 s op ijs
10 min aan 8000xg en 10 min aan 800xg
Ja
Nee
21
Resultaten
Figuur 5. Vergelijking van de extractiemethodes van Mirza et al. en Van Oudenhove et al. voor de isolatie van membraaneiwitten. De geëxtraheerde membraaneiwitten werden opgelost in 150 µl SDS sample buffer en gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. Respectievelijk 10 µl en 5 µl van de extracties werden geladen. De eiwitten werden gedetecteerd met behulp van een Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad) V1 en V2 = extractiemethode gebaseerd op Van Oudenhove et al. M1 en M2 = extractiemethode gebaseerd op Mirza et al.
Om het algemene patroon van de geëxtraheerde eiwitten verkregen met beide methodes beter te kunnen vergelijken, werd de extractie herhaald. In de methode van Van Oudenhove et al. werd de pellet deze keer opgelost in 75 µl SDS sample buffer, zodat een hogere concentratie van membraaneiwitten op de gel geladen kon worden. Wanneer beide extractiemethodes vergeleken worden, is duidelijk te zien dat het algemene eiwitpatroon grotendeels overeenkomt (Figuur 6). Aangezien de derde methode (Tabel 1) echter opvallend meer eiwitmateriaal oplevert, terwijl de procedure aanzienlijk minder stappen omvat, krijgt deze methode de voorkeur voor de isolatie van membraaneiwitten.
22
Resultaten
Figuur 6. Scheiding van membraaneiwitten geëxtraheerd met de methode van Van Oudenhove et al. (A) De geëxtraheerde membraaneiwitten werden opgelost in 75 µl SDS sample buffer en gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. Respectievelijk 10 µl en 15 µl van de extracties werden geladen. De eiwitten werden gedetecteerd met behulp van een Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). (B) Vergelijking van eiwitten geëxtraheerd met de methode van Mirza et al. (M2) en Van Oudenhove et al. (V2). M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad) V1 en V2 = extractiemethode gebaseerd op Van Oudenhove et al.
3.1.2. Invloed van chloroform delipidatie en acetonprecipitatie op de extractie van membraaneiwitten Om na te gaan of de delipidatie en acetonprecipitatie in de methode van Mirza et al. een invloed hebben op de zuiverheid van de geëxtraheerde eiwitten en om te bestuderen of er tijdens deze procedures een significant verlies van eiwit optreedt, werden in een volgend experiment methodes 2, 3 en 4 met elkaar vergeleken (Tabel 1). In de tweede methode werd de pellet, bekomen na centrifugatie aan 800xg, onderworpen aan een chloroform delipidatie. De pellet werd hiervoor opgelost in chloroform:methanol:water (2:1:1), zodat lipiden in de organische chloroform fase oplossen en eiwitten neerslaan tussen de organische en waterige fase. Na het verwijderen van de chloroform fase, werden de eiwitten geprecipiteerd met aceton. Zo kunnen contaminanten, zoals zout en detergenten, uit het staal verwijderd worden, terwijl de aanwezige eiwitten gecollecteerd kunnen worden na centrifugatie. In de derde methode werd de pellet meteen opgelost in 150 µl SDS sample buffer en in verschillende hoeveelheden geladen op de gel. Tenslotte werd in de vierde methode eerst een acetonprecipitatie uitgevoerd, alvorens de eiwitten te laden op gel.
23
Resultaten
Figuur 7. Vergelijking van drie methodes voor de extractie van membraaneiwitten, gebaseerd op de procedure van Mirza et al. De geëxtraheerde membraaneiwitten werden opgelost in 150 µl SDS sample buffer en gescheiden op een precast 12% polyacrylamide gel (Amersham ECL Gel 12%, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). Respectievelijk 15, 10 en 5 µl van de extracties werd geladen. De eiwitten werden gedetecteerd met behulp van een Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad) - = geen acetonprecipitatie/delipidatie (methode 1) A = acetonprecipitatie (methode 2) D + A = chloroform delipidatie en acetonprecipitatie (methode 3)
De drie extractiemethoden die getest werden in dit experiment, leverden gelijkaardige resultaten op (Figuur 7). De extra stappen die geïntroduceerd werden in methode 2 en 4, namelijk delipidatie d.m.v. chloroform/methanol extractie en acetonprecipitatie, leiden niet tot een zichtbare daling in de hoeveelheid geëxtraheerde eiwitten. De intensiteit van de SDSPAGE bandjes blijft gelijk, onafhankelijk van de gebruikte extractiemethode. Ook is er geen verandering te zien in de kwaliteit van de eiwitscheiding. Delipidatie en acetonprecipitatie leveren dus geen additioneel voordeel op wanneer de geëxtraheerde eiwitten geanalyseerd worden m.b.v. gelelektroforese, waardoor in dit geval deze stappen kunnen weggelaten worden. Deze experimenten laten toe te besluiten dat methode 3 (Tabel 1) de efficiëntste manier is om membraaneiwitten te isoleren voor analyse met SDS-PAGE.
24
Resultaten 3.1.3. Differentiële expressie van membraaneiwitten na imipenem stimulatie Om de verandering in eiwitexpressie na antibioticum stimulatie na te gaan, werden S. maltophilia cellen gedurende verschillende periodes gestimuleerd met het antibioticum imipenem. Een S. maltophilia celcultuur in de stationaire groeifase werd verdund naar drie subculturen, elk met een OD600 = 0.2, die al dan niet gestimuleerd werden met 25 µg/ml imipenem. De cellen werden vervolgens verder gegroeid tot de mid-exponentiële groeifase werd bereikt (OD600 = 0.65 – 0.75). Membraaneiwitten, geëxtraheerd met de methode van Mirza et al. uit een ongestimuleerde celcultuur (T0), en culturen gestimuleerd gedurende 15 en 30 min (T15 en T30), werden gescheiden met SDS-PAGE (Figuur 8A). Er zijn echter weinig zichtbare verschillen in expressie tussen de drie condities. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de korte duur van de stimulatie, aangezien veranderingen in eiwitexpressie in de meeste gevallen pas na langere tijd detecteerbaar zijn. Uit een studie van Van Oudenhove et al. blijkt echter dat stimulatie gedurende een halfuur wel kan leiden tot significante op- of neerregulatie van eiwitten (ongepubliceerde data).
3.1.4. Selectiviteit van de extractiemethode van Mirza et al. Als extra controle voor de selectiviteit van de methode van Mirza et al. voor de extractie van membraaneiwitten, werden ook de eiwitten die zich na centrifugatie in het supernatant bevonden, gecollecteerd en gescheiden met SDS-PAGE. De eiwitten in het supernatant zijn voornamelijk cytosolische eiwitten die oplosbaar zijn in de viskeuze TMSE extractiebuffer. Dit in tegenstelling tot membraaneiwitten, die vanwege hun hydrofoob karakter slechts een beperkte oplosbaarheid vertonen in dit polaire solvent. Het scheidingspatroon na kleuring van de gel met Coomassie is echter zeer gelijkaardig aan dit van de pellet, wat erop wijst dat de veronderstelde membraanfractie sterk ‘gecontamineerd’ is met cytosolische eiwitten (Figuur 8B). Toch zijn er enkele unieke bandjes zichtbaar in zowel pellet als supernatant. Beide fracties worden dus gedeeltelijk, maar niet volledig van elkaar gescheiden in de extractiemethode van Mirza et al. (Mirza et al, 2007).
25
Resultaten
Figuur 8. Extractie van membraaneiwitten met de methode van Mirza et al. uit S. maltophilia cellen, gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem op verschillende tijdstippen. Het supernatant, bekomen na centrifugatie van gelyseerde S. maltophilia cellen aan 8000xg en 800xg, werd samen met de pellet geanalyseerd op een precast 12% gel (Amersham ECL Gel 12%, GE Healthcare, Uppsala, Sweden). (A) Detectie van veranderingen in eiwitexpressie na stimulatie met 25 µg/ml imipenem. (B) Controle van de specificiteit van de extractiemethode. De eiwitten werden gedetecteerd met behulp van een Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De membraanfractie werd opgelost in 150 µl SDS sample buffer, waarvan 10 µl werd geladen. Aan de cytolosiche eiwitfractie werd SDS sample buffer toegevoegd in een 1:1 verhouding, waarna 20 µl werd geladen. M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad) S8000 = supernatant na centrifugatie aan 8000xg S800 = supernatant na centrifugatie aan 800xg T0 = geen imipenem stimulatie T15 = imipenem stimulatie gedurende 15 minuten T30 = imipenem stimulatie gedurende 30 minuten
26
Resultaten 3.2.
Optimalisatie van de detectie en analyse van eiwitfosforylatie met SDSPAGE 3.2.1. Detectie van veranderingen in fosforylatiegraad van membraaneiwitten na imipenem stimulatie
Om de respons van S. maltophilia na antibioticum stimulatie na te gaan, werden S. maltophilia cellen gestimuleerd met imipenem gedurende verschillende tijdsintervals. Zowel op- of neerregulatie van eiwitten (Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring) als veranderingen in eiwitfosforylatie (ProQ Diamond kleuring) werden gevolgd om een onderscheid te kunnen maken tussen een differentiële fosforylatie van een eiwit en een differentiële expressie van het gefosforyleerd eiwit. Membraaneiwitten werden geëxtraheerd met extractiemethode 1 (Tabel 1) en gescheiden met SDS-PAGE. Verschillende verdunningen werden geëvalueerd, aangezien de concentratie van de (gefosforyleerde) eiwitten ongekend is. Een ongestimuleerde S. maltophilia cultuur (T0), en culturen gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem gedurende 15, 30 en 60 min (respectievelijk T15, T30 en T60), werden vergeleken. Gefosforyleerde eiwitten werden gevisualiseerd met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Met het oog op de eventuele detectie van histidinefosforylaties, welke labiel zijn in zuur milieu (halfwaardetijd van ± 30 min bij pH 3) (Kleinnijenhuis et al, 2007), werd een neutrale fixatie-oplossing gebruikt, 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O, in plaats van de gebruikelijke 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur. Enkele eiwitten vertoonden een duidelijke, graduele verhoging in fosforylatiegraad na imipenem stimulatie gedurende een kwartier en een halfuur (Figuur 9). Langere stimulatie leidde opnieuw tot het verdwijnen van fosforylaties, hoewel dit een gevolg kan zijn van de aanzienlijk vertraagde groei van de cellen onder invloed van de toegediende antibiotica reeds voor de exponentiële groeifase werd bereikt (sectie 3.1.3). Dit is ook te zien aan de algemeen verlaagde intensiteit van de T60 bandjes in de totale eiwitkleuring met Coomassie (Bijlage, Figuur 18). De neutrale fixatie blijkt echter niet zo efficiënt te zijn, waardoor de kwaliteit van de Coomassie kleuring sterk afneemt. Hierdoor was ook de merker niet langer zichtbaar in het Coomassie beeld, wat de vergelijking met het ProQ beeld verder bemoeilijkt. De lage kwaliteit van het Coomassie beeld maakte het eveneens onmogelijk om op betrouwbare wijze bandjes uit te snijden en differentieel gefosforyleerde eiwitten te identificeren met LC-MS.
27
Resultaten
Figuur 9. Veranderingen in fosforylatiegraad van membraaneiwitten geïsoleerd uit S. maltophilia cellen, gestimuleerd met imipenem op verschillende tijdstippen. S. maltophilia celculturen werden gedurende 0, 15, 30 of 60 minuten gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem (respectievelijk T0, T15, T30 en T60). De geëxtraheerde membraaneiwitten werden gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. Respectievelijk 5 en 10 µl van de extractie werd geladen. Gefosforyleerde eiwitten werden gedetecteerd met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met de Pharos FX scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad)
Vervolgens werd nagegaan of de gedetecteerde gefosforyleerde eiwitten specifiek in de membraanfractie aanwezig zijn, en dus membraan- of membraan-geassocieerde eiwitten zijn. De eiwitten werden opnieuw geëxtraheerd volgens de methode van Mirza et al. (methode 1, Tabel 1). Het supernatant, bekomen na centrifugatie aan 8000xg en 800xg, werd gecollecteerd en eveneens geanalyseerd om veranderingen in fosforylatiegraad van de aanwezige eiwitten te detecteren. De geëxtraheerde eiwitten werden gescheiden met SDSPAGE. Voor de fixatie werd de conventionele zure oplossing van 50% methanol/10% azijnzuur gebruikt. Het ProQ beeld toont opnieuw een significante verandering in eiwitfosforylatie bij T15 en T30 (Figuur 10A). Dit is enkel te zien in de fractie die verondersteld wordt membraaneiwitten te bevatten, niet in het supernatant. Wel is de eiwitconcentratie in het 8000xg en 800xg supernatant door uitverdunning lager dan deze in de membraanfractie, zoals te zien is op het totaal eiwitbeeld na kleuring met Coomassie (Figuur 10B). Ditzelfde experiment werd eveneens uitgevoerd op een precast 12% polyacrylamide gel (Amersham ECL Gel 12%, GE Healthcare, Uppsala. Sweden), omdat deze minder onderhevig zijn aan variatie en bijgevolg het ProQ beeld gemakkelijker te linken is aan het Coomassie beeld. Uit dit experiment, en uit andere gelijkaardige experimenten met precast gels, blijkt dat deze gels echter incompatibel zijn met de fosfospecifieke ProQ Diamond kleuring (Bijlage, Figuur 19). Dit is voornamelijk te wijten aan de problematische ontkleuring van de ProQ kleuring uit de gels, wat leidt tot een te hoge achtergrondkleuring.
28
Resultaten
1 2
Figuur 10. Veranderingen in fosforylatiegraad van membraan- en cytosolische eiwitten van S. maltophilia, gestimuleerd met imipenem op verschillende tijdstippen. S. maltophilia celculturen werden gedurende 0, 15 of 30 minuten gestimuleerd (respectievelijk T0, T15 en T30) met 25 µg/ml imipenem. De geëxtraheerde membraan- en cytosolische eiwitten werden gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. (A) Fosfo-eiwitten werden gedetecteerd met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met de Pharos FX scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). (B) Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en visualisatie met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad). De membraanfractie werd opgelost in 150 µl SDS sample buffer, aan de cytolosiche eiwitfractie werd SDS sample buffer toegevoegd in een 1:1 verhouding. Van zowel membraan- als cytosolische extracties werd 10 μl geladen. M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards (Bio-Rad) S8000 = het supernatant na centrifugatie aan 8000xg S800 = het supernatant na centrifugatie aan 800xg
29
Resultaten
Vergelijking van fixatie-oplossingen
Voor de optimalisatie van de detectie en analyse van eiwitfosforylatie met SDS-PAGE, werden twee fixatie-oplossingen met elkaar vergeleken. De eerste oplossing is de conventionele zure fixatie-oplossing, 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur. Naast S/T/Y fosforylaties, zijn ook His/Asp fosforylaties van groot belang in bacteriële signalisatie, onder andere in TCS. Met het oog op het behoud van deze zuur-labiele histidinefosforylaties, werd een neutrale fixatie-oplossing getest, namelijk 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O. S. maltophilia cellen werden gestimuleerd met het antibioticum imipenem gedurende verschillende tijdsintervals (sectie 3.1.3). Zowel op- of neerregulatie van eiwitten (Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring) als veranderingen in fosforylatie (ProQ Diamond kleuring) werden gevolgd. Membraaneiwitten werden geëxtraheerd met extractiemethode 1 en 3 (Tabel 1) en gescheiden met SDS-PAGE. Een ongestimuleerde S. maltophilia cultuur (T0), en culturen gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem gedurende 15 en 30 min (respectievelijk T15 en T30), werden vergeleken. De eerste gel werd gefixeerd in 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur, waarna gefosforyleerde eiwitten gevisualiseerd werden met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen) (Figuur 11A). De tweede gel werd gefixeerd in het neutrale 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O, waarna gefosforyleerde eiwitten opnieuw gevisualiseerd werden m.b.v. de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen) (Figuur 11B). Nadien werd deze laatste gel een tweede keer gefixeerd, ditmaal in 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur, om de kwaliteit van de Coomassie kleuring te behouden. Wanneer de neutraal- en zuur-gefixeerde gels vergeleken worden, lijkt op het eerste zicht de neutrale oplossing meer gefosforyleerde SDS-PAGE bandjes op te leveren (Figuur 11A en B). Mogelijk komen deze additionele bandjes overeen met histidine-gefosforyleerde eiwitten, aangezien ze behouden blijven in de neutrale oplossing, maar verdwijnen in zuur milieu. Fixatie van de gel in 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O, gevolgd door herfixatie in 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur na ProQ kleuring, krijgt dus de voorkeur voor de detectie van veranderingen in fosforylatie met SDS-PAGE.
30
Resultaten
9
10
11 12 13
14 15
Figuur 11. Vergelijking van fixatie-oplossingen na scheiding van membraaneiwitten van S. maltophilia, gestimuleerd met imipenem op verschillende tijdstippen. S. maltophilia celculturen werden gedurende 0, 15 of 30 minuten gestimuleerd (respectievelijk T0, T15 en T30) met 25 µg/ml imipenem. De geëxtraheerde membraaneiwitten werden gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. Fosfo-eiwitten werden gedetecteerd met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) en gevisualiseerd met de Pharos FX scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). (A) Gel gefixeerd in 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur. (B) Gel gefixeerd in 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O. M = PeppermintStick™ Phosphoprotein Molecular Weight Standards (Invitrogen)
31
Resultaten 3.2.2. Identificatie van (differentieel gefosforyleerde) eiwitten met LC-MS Verschillende eiwitbandjes werden uitgesneden en onderworpen aan een in-gel trypsinedigest (Figuur 10A en B en Figuur 11B, rode pijlen). Enkele differentieel gefosforyleerde (1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14 en 15) en niet-gefosforyleerde eiwitten (6, 7 en 8) werden geselecteerd voor identificatie met LC-MS/MS. De verkregen peptiden werden gescheiden met nano-RPLC op een Ultimate 3000 RSLC systeem (Dionex, Sunnyvale, CA, USA) en geanalyseerd met een 4000 QTRAP massaspectrometer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). De verkregen spectra werden gezocht met het Mascot zoekalgoritme, waarna de geïdentificeerde eiwitsequenties geanalyseerd werden met NetPhosBac 1.0, een Ser/Thr fosforylatiesite predicitie algoritme. Slechts vier van de veertien geïdentificeerde eiwitten zijn geannoteerd als membraaneiwitten, wat er opnieuw op wijst dat de gebruikte extractiemethode aanleiding geeft tot een hoog percentage ‘contaminerende’ cytosolische eiwitten (Tabel 2). Twee eiwitbandjes (band 3 en 14) konden niet geïdentificeerd worden. Uit de NetPhosBac 1.0 predictie blijkt dat de eiwitten, die in het ProQ beeld een differentiële fosforylatie na imipenem stimulatie vertoonden, inderdaad mogelijke fosforylatiesites bevatten (eiwit 1, 2, 4, 5, 9, 11 en 13). Fosforylatie van deze eiwitten dient echter nog bevestigd te worden met bijkomende experimenten, aangezien contaminatie met eiwitten van naburige bandjes niet uitgesloten kan worden. Het predictiealgoritme suggereert ook potentiële fosforylatiesites in de niet-gefosforyleerde eiwitten (eiwit 6, 7 en 8). Wel moet benadrukt worden dat dit slechts een predictie is en dus geen zekerheid biedt over het al dan niet aanwezig zijn van fosforylaties. Ook wordt fosforylatie op tyrosine-, histidine- en aspartaatresiduen niet in rekening gebracht met dit predictiealgoritme. Tabel 2. Lokalisatie, functie en fosforylatie van de geïdentificeerde eiwitten. Mw = moleculair gewicht. * = fosforylatie is waarschijnlijk, maar dient nog bevestigd te worden met bijkomende experimenten. Predicties met NetPhosBac 1.0 suggereren potentiële fosforylatiesites.
Pijl
Eiwit + Mw
UniProtKB identifier
Lokalisatie
Functie
Fosforylatie
1
Putative Elongation Factor Tu
B2FQ31
Cytoplasma
Promoot de GTPafhankelijke binding van aminoacyl-tRNA aan de Asite van het ribosoom tijdens translatie
JA
B2FMR4
Intracellulair
Regulatie van transcriptie, rol in gen silencing en DNA compactie, inductie van flagellatie
JA*
Mw = 43 kDa 2
Putative H-NS histone family trans-acting regulatory protein Mw = 13.9 kDa
32
Resultaten 3
/
/
/
4
Putative biopolymer transport exbB protein
B2FT88
Membraan
ExbB is een deel van het TonB-afhankelijk energie transducerend systeem voor de import van ijzersiderofoor complexen en vitamine B12 over de buitenste membraan
JA*
B2FI93
Cytoplasma
Initieert, na fosforylatie door een sensor kinase, een verandering in de toestand van de cel of een activiteit. Veel respons regulators treden op als transcriptionele regulators om een cellulaire respons op te wekken
JA
B2FQ41
Ribosoom
Één van de primaire rRNA bindende eiwitten, bindt rechtstreeks aan 16S rRNA, waarbij het de kern vormt van het hoofddomein van de 30S subunit
JA*
B2FIU9
Cytoplasma
Voorkomt misvouwing en promoot de hervouwing en correcte opbouw van ongevouwen polypeptiden, gegeneerd onder condities van stress
MOGELIJK
B2FHY8
Membraan
Produceert ATP van ADP in aanwezigheid van een protongradiënt over de membraan. De beta keten bevat de katalytische sites
MOGELIJK
B2FQ31
Cytoplasma
Promoot de GTPafhankelijke binding van aminoacyl-tRNA aan de Asite van het ribosoom tijdens translatie
JA
Mw = 26.9 kDa
Putative twocomponent transcriptional regulator response regulatory protein Mw = 25.4 kDa 5
30S ribosomal protein S7 Mw = 17.5 kDa
6
60 kDa chaperonin Mw = 57.4 kDa
7
ATP synthase subunit beta Mw = 50.8 kDa
8
Putative Elongation Factor Tu Mw = 43 kDa
/
/
33
Resultaten 9
Putative heat shock chaperone ClpB
B2FRQ4
Cytoplasm
Deel van een stressgeïnduceerd multichaperone systeem, betrokken in het herstel van de cel na warmte schade
JA*
B2FQ31
Cytoplasma
Promoot de GTPafhankelijke binding van aminoacyl-tRNA aan de Asite van het ribosoom tijdens translatie
JA
B2FTR5
Membraan
Speelt een rol bij de import van ijzer-siderofoor complexen en vitamine B12 over de buitenste cel membraan
JA*
B2FQ31
Cytoplasma
Promoot de GTPafhankelijke binding van aminoacyl-tRNA aan de Asite van het ribosoom tijdens translatie
JA
B2FP65
Membraan
GGDEF eiwitdomeinen zijn betrokken in de cyclisch diGMP signalisatie en spelen onder andere een rol in biofilm vorming
JA*
Mw = 95.3 kDa 10
Putative Elongation Factor Tu Mw = 43 kDa
11
Putative TonB dependent protein, possible siderophore receptor Mw = 115.3 kDa
12
Putative Elongation Factor Tu Mw = 43 kDa
13
Putative transmembrane GGDEF signaling protein Mw = 45.3 kDa
14
/
/
/
15
Putative GGDEF PAS signalling domain protein
B2FJD4
Cytoplasma
/
/
Betrokken in de cyclische biosynthese van nucleotiden. Aangetoonde fosforelay sensor kinase activiteit
JA
Mw = 80.5 kDa
34
Resultaten 3.3.
Gel-vrije analyse van membraaneiwitten met HILIC
HILIC is een techniek die voornamelijk gebruikt wordt voor het scheiden van intacte eiwitten. Hierbij worden hydrofiele eiwitten sterker weerhouden op de kolom dan hydrofobe, omwille van een sterkere interactie met de polaire vaste fase. Elutie van de gebonden eiwitten wordt bekomen door een stijgende concentratie waterig solvent in de elutiebuffer. De reden waarom HILIC en niet RPLC gebruikt wordt voor de analyse is omwille van de hogere oplosbaarheid van hydrofobe membraaneiwitten in de gebruikte organische solventen en de hoge tolerantie voor denaturerende agentia als SDS en urea (Swiderek et al, 1997). Zowel eiwitten als peptiden kunnen gescheiden worden m.b.v. HILIC. Het voordeel van een scheiding op eiwitniveau is de hogere stabiliteit van PTM’s, zoals fosforylaties, op intacte eiwitten in vergelijking met modificaties op peptiden en de mogelijkheid om abundante eiwitten te scheiden van laag-abundante. Dit in tegenstelling tot de ‘bottom-up’ benadering, waarbij abundante peptiden (afkomstig van abundante eiwitten) gespreid worden over de hele scheiding, en laag abundante peptiden kunnen onderdrukken. Het nadeel is echter dat intacte eiwitten moeilijker op te lossen zijn in de gebruikte solventen dan peptiden en dat de elutie bemoeilijkt wordt door de vele mogelijke interactiesites met de stationaire fase. De analyse van membraaneiwitten met behulp van HILIC werd voorafgegaan door een optimalisatie van het systeem, gebruik makende van testeiwitten.
PolyHYDROXYETHYL A kolom
Om een idee te krijgen van de relatie tussen de eiwitconcentratie en de intensiteit van de pieken, werd in een eerste experiment 50 µg BSA testeiwit geladen op een polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA) aan een vloeistofsnelheid van 100 µl/min solvent A (63% 2-propanol, 22.5% ACN, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, aangezuurd met HCOOH tot pH 3.7) met een 200 µl injectieloop. Het eiwit werd geëlueerd met volgende gradiënt: 10 min 100% A, van 0-100% solvent B (30% 2-propanol, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 0.1% HCOOH, 20 mM ammonium formaat) in 30 minuten, gevolgd door 5 min 100% B en 10 min reequilibratie aan 100% A. BSA wordt vertegenwoordigd door een scherpe piek met een retentietijd van 27.20 min en een intensiteit van ± 100 mAU. In een tweede experiment werd 10 µg BSA geladen op dezelfde polyHYDROXYETHYL A kolom aan een vloeistofsnelheid van 100 µl/min solvent A met een 100 µl injectieloop. Dezelfde gradiënt werd toegepast voor de elutie van het eiwit. De intensiteit van de piek is ± 25 mAU, wat ongeveer een kwart is van de intensiteit in het vorige experiment. Rekening houdende met het feit dat er een verschillende injectieloop gebruikt werd, is dit een voortreffelijk resultaat. De retentietijd is verschoven naar 25.84 min (Figuur 12). De reproduceerbaarheid van de metingen is dus over het algemeen vrij goed, zowel wat betreft de intensiteit, als wat betreft de retentietijd.
35
20130423 20130423 20130423 20130423
BSA BSA BSA BSA
50ug 50ug 50ug 50ug
R60 R60 R60 R60
G30 G30 G30 G30
HILIC HILIC HILIC HILIC
no no no no
frac frac frac frac
Resultaten
test01001:10_UV3_280nm test01001:10_Conc 20130423 BSA 50ug R60 G30 HILIC no frac test01001:10_Inject test01001:10_Logbook test01001:10_UV3_280nm@03,BASEM
mAU
%B 100
27.20
100
BSA 50µg
80
80
60
60
40 40
20 20 6.47
0
29.30
0.01
20130423 20130423 0.020130423 20130423
BSA BSA BSA BSA
10ug 10ug 10ug 10ug
R60 G30 R60 G30 R60 10.0G30 R60 G30
HILIC HILIC HILIC HILIC
no no no no
frac frac frac frac
41.37
52.97 53.78
45.31
test03001:10_UV3_280nm 0 test03001:10_Conc 20130423 BSA 10ug R60 G30 HILIC no frac test03001:10_Inject test03001:10_Logbook 20.0 30.0 40.0 50.0 min test03001:10_UV3_280nm@03,BASEM
mAU
%B 100
25.84
25.0
BSA 10µg
20.0
80
15.0 60
10.0
40 5.0
51.64
-0.25
5.15
0.0
53.82
20
52.52 44.10
-5.0 0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
Figuur 12. HILIC chromatogram van (A) 50 µg BSA testeiwit (200 µl injectieloop) en (B) 10 µg BSA testeiwit (100 µl injectieloop). Kolom: polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Stroomsnelheid: 100 μl/min. Lichtgroen: concentratie solvent B in %. Paars: absorbantie bij 280 nm in mAU. Solvent A: 63% 2-propanol, 22.5% ACN, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, aangezuurd met HCOOH tot pH 3.7. Solvent B: 30% 2-propanol, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7.
36
Resultaten Na deze testexperimenten werden membraaneiwitten, geïsoleerd met de methode van Mirza et al., inclusief delipidatie en acetonprecipitatie (methode 2, Tabel 1), gescheiden op de polyHYDROXYETHYL A kolom (PolyLC). De pellet werd opgelost in 150 µl solvent A. Van het staal werd 100 µl geladen op de kolom met een 100 µl injectieloop aan een vloeistofsnelheid van 100 µl/min. De eiwitten werden geëlueerd met een gradiënt van 10 min 100% B, 0-100% B in 60 minuten, gevolgd door 5 min 100% B en 10 min re-equilibratie aan 100% A. Fracties van eluerende eiwitten werden elke minuut gecollecteerd. In het 20130424 smlt membrane R90G60 HILIC pellet 01001:10_UV3_280nm 20130424 smlt R90G60 HILIC pellet 01001:10_Conc chromatogram zijnmembrane verschillende pieken te zien, echter wel met zeer lage intensiteit (max. 10 20130424 smlt membrane R90G60 HILIC pellet 01001:10_Fractions 20130424 smlt membrane R90G60 HILIC pellet 01001:10_Inject mAU) (Figuur 13). 20130424 smlt membrane R90G60 HILIC pellet 01001:10_UV3_280nm@03,BASEM 20130424 smlt membrane R90G60 HILIC pellet 01001:10_Logbook 5.55
mAU
%B
20.0 80
15.0 60 34.89
10.0
40 10.04 5.0
28.67
16.28
22.05
53.91
31.88 36.14
81.67
20
43.20
0.0
57.23
1A1 1A4 1A7 1A11 1B10 1B6 1B3 1C1 1C4 1C7 1C11 1D10 1D6 1D3 1E1 1E4 1E7 1E11 1F10
-5.0 0.0
20.0
40.0
60.0
84.14 82.55
Waste
0
min
Figuur 13. HILIC chromatogram van membraaneiwitten geïsoleerd uit S. maltophilia cellen. Kolom: polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Stroomsnelheid: 100 μl/min. Lichtgroen: concentratie solvent B in %. Paars: absorbantie bij 280 nm in mAU. Fracties van eluerende eiwitten werden elke minuut gecollecteerd. Solvent A: 63% 2-propanol, 22.5% ACN, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, aangezuurd met HCOOH tot pH 3.7. Solvent B: 30% 2propanol, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7.
37
Resultaten Voor de volgende experimenten werd, na advies van de firma PolyLC (Dr. Andrew Alpert), overgeschakeld op een nieuw buffersysteem, met solvent A 45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7 en solvent B 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7. Hexafluoro-isopropanol werd, vanwege zijn chaotrope karakter, weggelaten uit de solventen om de retentietijd van de eiwitten te verhogen. Om de prestaties van dit buffersysteem te vergelijken met die van het vorige buffersysteem, werd opnieuw BSA gebruikt als testeiwit. Van dit eiwit werd 10 µg geladen op de polyHYDROXYETHYL A kolom aan een vloeistofsnelheid van 100 µl/min met een 100 µl injectieloop. De volgende gradiënt werd gebruikt voor de elutie van het eiwit: 10 min 100% A, van 0-100% B in 30 minuten, gevolgd door 5 min 100% B en 10 min re-equilibratie aan 100% A. De retentietijd van de BSA piek is, ondanks het weglaten van hexafluoroisopropanol, zeer vergelijkbaar met deze in het vorige experiment (25.68 min vergeleken 20130509 BSA 10ug R60de G30intensiteit new solvents001:10_UV3_280nm 20130509 BSA 10ug 14). R60 G30 new solvents001:10_Conc met 25.84 min), terwijl van de piek iets20130509 hoger is (Figuur 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents001:10_Inject BSA 10ug R60 G30 new solvents001:10_Logbook 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents001:10_UV3_280nm@03,BASEM mAU
%B 100 25.68
30.0
BSA 10 µg 80
25.0
20.0 60
15.0
40 10.0
5.0 20 5.20 0.0
0.01
2.99
52.48 39.10
0
-5.0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
Figuur 14. HILIC chromatogram van 10 µg BSA testeiwit. Kolom: polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Stroomsnelheid: 100 μl/min. Lichtgroen: concentratie solvent B in %. Paars: absorbantie bij 280 nm in mAU. 100 µl injectieloop. Solvent A: 45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7. Solvent B: 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7.
Ditzelfde experiment werd herhaald, maar deze keer werd 0.1% SDS toegevoegd aan 10 µg BSA die op de kolom geladen werd. Dit om te evalueren of SDS al dan niet een storend effect heeft op de scheiding, en dus kan gebruikt worden om de membraaneiwitten beter in oplossing te brengen. Het chromatogram na scheiding van 10 µg BSA met 0.1% SDS ziet er identiek uit als dit na scheiding van 10 µg BSA zonder SDS (Figuur 15). Zowel de retentietijd
38
Resultaten als de intensiteit van de piek blijft gelijk. Er wordt bijgevolg geen significante verstoring van de scheiding veroorzaakt door SDS, zodat dit ongehinderd kan toegevoegd worden in deze 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents SDS001:10_UV3_280nm concentratie. is belangrijk, aangezien SDS de oplosbaarheid van membraaneiwitten in 20130509 Dit BSA 10ug R60 G30 new solvents SDS001:10_Conc 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents SDS001:10_Inject organische solventen aanzienlijk kan verhogen. 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents SDS001:10_Logbook 20130509 BSA 10ug R60 G30 new solvents SDS001:10_UV3_280nm@03,BASEM mAU
%B 25.84
30.0
BSA 10 µg 80
25.0
20.0 60 15.0
40
10.0
5.0 20 0.0
0.30
5.19 6.44
27.29
52.03 38.40
0
-5.0 0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
min
Figuur 15. HILIC chromatogram van 10 µg BSA testeiwit met 0.1% SDS. Kolom: polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Stroomsnelheid: 100 μl/min. Lichtgroen: concentratie solvent B in %. Paars: absorbantie bij 280 nm in mAU. 100 µl injectieloop. Solvent A: 45% 2propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7. Solvent B: 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7.
Aangezien SDS blijkbaar geen invloed heeft op de kwaliteit van de scheidingen, werd de pellet van membraaneiwitten, geïsoleerd met methode 2 (Tabel 1), opgelost in 150 µl solvent A met 0.1% SDS en geladen op de polyHYDROXYETHYL A kolom aan een vloeistofsnelheid van 100 µl/min solvent A (45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7) met een 100 µl injectieloop. De eiwitten werden geëlueerd met een gradiënt van 10 min 100% solvent B (30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7), 0-100% B in 60 minuten, gevolgd door 5 min 100% B en 10 min re-equilibratie aan 100% A. Fracties van eluerende eiwitten werden elke minuut gecollecteerd. De intensiteit van de pieken is duidelijk hoger dan wanneer geen SDS toegevoegd werd aan solvent A om de pellet op te lossen, maar de scheiding is echter nog steeds niet optimaal (Figuur 16).
39
20130509 20130509 20130509 20130509
Smlt Memb Smlt Memb Smlt Memb Smlt Memb
R90 R90 R90 R90
G60 G60 G60 G60
frac frac frac frac
Resultaten
SDS001:10_UV3_280nm 20130509 Smlt Memb R90 G60 frac SDS001:10_Conc SDS001:10_Fractions 20130509 Smlt Memb R90 G60 frac SDS001:10_Inject SDS001:10_Logbook SDS001:10_UV3_280nm@03,BASEM
5.47
mAU
%B 100
46.23 40.0 28.64
80
30.0
60
30.69 43.27
20.0
40
27.27 23.41
33.85
23.93 22.37
10.0
82.19 57.91
20
81.22
82.96 0.0
1A1 1A4 1A7 1A11 1B10 1B6 1B3 1C1 1C4 1C7 1C11 1D10 1D6 1D3 1E1 1E4 1E7 1E11 1F10 1F6 1F3 1G1 0.0
20.0
40.0
60.0
Waste
0
min
Figuur 16. HILIC chromatogram van membraaneiwitten, geïsoleerd uit S. maltophilia cellen, met 0.1% SDS. Kolom: polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Stroomsnelheid: 100 μl/min. Lichtgroen: concentratie solvent B in %. Paars: absorbantie bij 280 nm in mAU. 100 µl injectieloop. Solvent A: 45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7. Solvent B: 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7.
40
Resultaten 3.4.
Gel-vrije analyse van membraaneiwitten met LC-MS 3.4.1. Optimalisatie van het trypsinedigest
Naast de gel-gebaseerde (SDS-PAGE) en de gel-vrije (HILIC) analyse van membraaneiwitten, werden membraaneiwitten eveneens geanalyseerd met behulp van LC-MS zonder voorafgaande fractionatiestappen. Op deze manier kan een totaal beeld verkregen worden van alle geëxtraheerde eiwitten, evenals van het percentage membraaneiwitten. Vooraleer de analyse kon uitgevoerd worden, diende de methode voor het trypsinedigest geoptimaliseerd te worden. Hiervoor werden verschillende condities met elkaar vergeleken. Membraaneiwitten, geïsoleerd met methode 3 (Tabel 1), werden verdeeld over tien 25 µg aliquots en onderworpen aan een acetonprecipitatie. De eiwitpellets werden heropgelost in 100 µl van verschillende solventen om de invloed van de aanwezige componenten op het trypsinedigest na te gaan. o o o o o o o o o o
Blanco (-): 2 M urea/50 mM NH4HCO3 1: 2 M urea/50 mM NH4HCO3 2: 2 M urea/250 mM NH4HCO3 3: 2 M urea/50 mM NH4HCO3/30% methanol 4: 2 M urea/50 mM NH4HCO3/60% methanol 5: 50 mM NH4HCO3/30% methanol 6: 50 mM NH4HCO3/60% methanol 7: 50 mM NH4HCO3/0.1% SDS 8: 50 mM NH4HCO3/30% methanol/0.1% SDS 9: 50 mM NH4HCO3/60% methanol/0.1% SDS
De stalen werden gereduceerd met 10 mM DTT, gevolgd door alkylatie met 20 mM IAA en overnacht trypsinedigest. Vervolgens werden ze uitgedroogd en gescheiden met SDS-PAGE (Figuur 17). In het blanco staal zijn de eiwitten nog steeds intact en dus zichtbaar op de gel. De stalen waaraan 2 M urea werd toegevoegd (pellet 1, 2, 3 en 4), geven een opmerkelijk beter resultaat dan de stalen zonder urea. Enkel trypsine is nog als intact eiwit zichtbaar (Mw = 24.4 kDa), wat betekent dat alle eiwitten efficiënt verknipt zijn tot peptiden. Urea veroorzaakt denaturatie van de eiwitten, waardoor deze beter in oplossing blijven. Methanol werd toegevoegd om de oplosbaarheid van de eiwitten te verhogen, maar in dit experiment is dit effect niet waarneembaar. Hetzelfde geldt voor de toevoeging van het detergent SDS. In de stalen zonder urea (5–9) zijn nog enkele vage eiwitbandjes zichtbaar op de gel, wat er op wijst dat in deze condities ofwel de werking van trypsine verstoord wordt, ofwel de eiwitten niet voldoende in oplossing blijven, waardoor ze niet toegankelijk zijn voor trypsine. Bovendien is in deze stalen het trypsine bandje niet langer duidelijk zichtbaar. Aangezien noch methanol, noch SDS een positieve invloed hebben op de efficiëntie van het trypsinedigest, werden deze in de volgende experimenten niet langer gebruikt. Om ook de hoeveelheid toegevoegd zout te beperken, werd daarom gekozen voor 2 M urea/50 mM NH4HCO3 als solvent voor de digesten.
41
Resultaten Uit verdere testen met HPLC en LC-MS bleek dat deze methode voor het trypsinedigest op het volledige membraan eiwitextract succesvol kan worden toegepast voor ‘bottom-up’ experimenten (resultaten niet meegedeeld). Ook is delipidatie en acetonprecipitatie van de eiwitten, voorafgaand aan het trypsinedigest, aan te raden om de efficiëntie van het digest te verhogen. Deze additionele stappen leiden eveneens tot een verlaagd risico op blokkades in het nano-LC systeem.
Figuur 17. Vergelijking van verschillende condities voor trypsinedigest. Membraaneiwitten (10 x 25 µg), geïsoleerd met de methode van Mirza et al., werden opgelost in verschillende solventen (zie onder), waarna ze gereduceerd en gealkyleerd werden om vervolgens verknipt te worden met trypsine (uitgezonderd de blanco). De peptiden en/of eiwitten werden gescheiden met SDS-PAGE, gedetecteerd met een Coomassie Brilliant Blue G250 kleuring en gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). M = Precision Plus Protein Unstained Standards (Bio-Rad) Blanco (-): 2 M urea/50 mM NH4HCO3; 1: 2 M urea/50 mM NH4HCO3; 2: 2 M urea/250 mM NH4HCO3; 3: 2 M urea/50 mM NH4HCO3/30% methanol; 4: 2 M urea/50 mM NH4HCO3/60% methanol; 5: 50 mM NH4HCO3/30% methanol; 6: 50 mM NH4HCO3/60% methanol; 7: 50 mM NH4HCO3/0.1% SDS; 8: 50 mM NH4HCO3/30% methanol/0.1% SDS; 9: 50 mM NH4HCO3/60% methanol/0.1% SDS
42
Discussie
4. DISCUSSIE Hoewel infecties met antibioticaresistente S. maltophilia stammen een groeiend probleem vormen, is er slechts weinig geweten over de mechanismen die leiden tot de inductie van resistentie tegen β-lactam antibiotica. De signalisatiewegen verantwoordelijk voor de activering van het L1 en L2 β-lactamase blijven grotendeels onopgehelderd. Eiwitfosforylatie is een belangrijke PTM, betrokken in bacteriële celregulatie en –signalisatie. Zowel His/Asp fosforylaties in TCS, als S/T/Y fosforylaties spelen hieren een belangrijke rol. Uit voorgaande studies in P. aeruginosa blijkt dat TCS een prominente rol spelen in antibioticaresistentie, waarbij de overdracht van fosfaatgroepen tussen HK en RR een essentieel onderdeel is van de signaaltransductie (Moya et al, 2009). Aangezien het merendeel van deze processen zich afspeelt ter hoogte van de celmembraan, vormt de analyse van het membraanproteoom een beloftevolle start in het ontrafelen van het volledige signalisatienetwerk. Verschillende moeilijkheden zoals de lage abundantie en de slechte oplosbaarheid van membraaneiwitten, zorgen er echter voor dat de analyse van deze fractie van het proteoom niet vanzelfsprekend is. Bovendien wordt de analyse verder bemoeilijkt door het transiënte en labiele karakter van eiwitfosforylaties, alsook omwille van de moeilijke ionisatie van fosfopeptiden. De studie van TCS His/Asp fosforylaties vormt een extra uitdaging vanwege hun instabiliteit in zuur milieu (Kleinnijenhuis et al, 2007). Daarom was een grondige optimalisatie van alle analysemethoden vereist, vooraleer de inductiemechanismen die leiden tot antibioticaresistentie in S. maltophilia verder bestudeerd kunnen worden. Twee methodes voor de extractie van membraaneiwitten werden met elkaar vergeleken. De methodes maken geen gebruik van detergenten om membraaneiwitten in oplossing te krijgen, gezien de beoogde LC-MS analyse van deze eiwitten. In de methode, beschreven door Van Oudenhove et al., wordt het basische natriumcarbonaat toegevoegd om eiwitten te verwijderen die zwak geassocieerd zijn met de membraan, maar geen membraaneiwitten zijn. Integrale membraaneiwitten zijn onoplosbaar in dit solvent en kunnen gecollecteerd worden na centrifugatie (Van Oudenhove et al, 2012). Gedurende deze procedure treedt er echter een aanzienlijk verlies van eiwitmateriaal op, waardoor de uiteindelijke opbrengst zeer laag is. Daarom werd een tweede methode geëvalueerd, die gebaseerd is op het gebruik van een viskeuze extractiebuffer met een hoge concentratie sucrose en mannitol, om membraaneiwitten te precipiteren (Mirza et al, 2007). Deze methode levert duidelijk meer eiwitmateriaal op, hoewel nog dient uitgemaakt te worden of dit te wijten is aan een betere extractie van membraaneiwitten of de aanwezigheid van meer ‘contaminerende’ cytosolische eiwitten. In de oorspronkelijke procedure worden overtollige lipiden en andere contaminanten verwijderd door respectievelijk een chloroform/methanol extractie en een acetonprecipitatie. Wanneer de extracten geanalyseerd worden met SDS-PAGE, leveren deze additionele stappen geen zichtbaar voordeel op wat betreft de kwaliteit van het staal. Belangrijk hierbij is ook dat er gedurende deze procedures geen waarneembaar verlies van eiwitmateriaal optreedt. Chloroform delipidatie en acetonprecipitatie zijn echter wel vereist wanneer de extracten geanalyseerd worden met LC-MS, aangezien dit de efficiëntie van het eiwitdigest bevordert en het risico op blokkades van het nano-LC systeem sterk vermindert. De methode van Mirza et al., krijgt bijgevolg de voorkeur voor de extractie van
43
Discussie membraaneiwitten. Hoewel deze methode een goede basis vormt voor de extractie van membraaneiwitten uit S. maltophilia, zijn cytosolische eiwitten nog steeds sterk vertegenwoordigd in de extracten. Voornamelijk abundante cytosolische eiwitten, zoals elongation factor Tu (EF-Tu), maskeren de aanwezige laag-abundante membraaneiwitten. Verdere optimalisatie van deze procedure is dan ook noodzakelijk om de selectiviteit van de extractie te verhogen en een hoger percentage membraaneiwitten te kunnen detecteren. Een combinatie van beide methodes, waarbij de wasstap met natriumcarbonaat, gevolgd door centrifugatie aan hoge snelheid, toegevoegd wordt aan de methode van Mirza et al., kan mogelijk een oplossing bieden. Aangezien veel signaaltransductiewegen in bacteriële cellen (waaronder TCS) gebruik maken van fosforylaties om te reageren op externe stimuli, werden veranderingen hierin gevolgd door membraaneiwitten te scheiden met SDS-PAGE en fosfo-eiwitten te detecteren met een fosfospecifieke ProQ Diamond kleuring. S. maltophilia cellen werden gedurende verschillende periodes gestimuleerd met het antibioticum imipenem, waarna membraaneiwitten werden geëxtraheerd. De beste resultaten werden bekomen wanneer de gel initieel gefixeerd werd in een neutrale oplossing van 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O, en na de ProQ kleuring een tweede keer gefixeerd werd in het zure 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur. Op deze manier worden zuur-labiele histidinefosforylaties, die essentieel zijn in onder andere TCS, beter bewaard. Verschillende differentieel gefosforyleerde eiwitten konden worden geïdentificeerd, welke voornamelijk betrokken zijn in de algemene stress respons van de cel en biofilm vorming. Elongation factor Tu speelt een essentiële rol in translatie door de GTP-afhankelijke aminoacyl-tRNA binding aan het ribosoom te katalyseren. Hydrolyse van GTP tot GDP veroorzaakt een conformationele verandering in EF-Tu naar de open vorm, welke niet langer kan binden aan het ribosoom. In condities van stress, zoals de aanwezigheid van antibiotica, wordt EF-Tu gefosforyleerd op een threonineresidu. De zijketen van threonine maakt in de niet-gefosforyleerde vorm contact met een glutamaatresidu om de GTP-gebonden vorm van EF-Tu te stabiliseren. Fosforylatie van threonine promoot de GDP-gebonden vorm, aangezien dit leidt tot de afstoting van glutamaat en het verlies van stabilisatie. Deze gefosforyleerde vorm van EF-Tu kan niet binden aan het ribosoom en is bijgevolg inactief (Alexander et al, 1995; Lippmann et al, 1993; Schumacher et al, 2009). Uit onze experimenten blijkt dat EF-Tu gefosforyleerd en bijgevolg geïnactiveerd wordt na imipenem stimulatie van S. maltophilia cellen. Hierdoor neemt de snelheid van translatie af en bereikt de cel een dormante toestand, ook wel persistentie genoemd. Dit is consistent met de resultaten van Schumacher et al., die reeds aantoonden dat EF-Tu gefosforyleerd kan worden door HipA, een essentiële persistentiefactor in E. coli (Schumacher et al, 2009). Dit fenomeen van bacteriële persistentie is een veelgebruikte manier om te overleven in aanwezigheid van antibiotica. Een biofilm is een groep van micro-organismen waarin de cellen als het ware aan elkaar kleven op een substraat. Deze adherente cellen zijn in de meeste gevallen omgeven door een matrix of extracellulaire polymere substantie (EPS). Biofilmvorming laat bacteriën toe om te ontsnappen aan het immuunsysteem en biedt eveneens bescherming tegen antibiotica. Verscheidene eiwitten betrokken in de vorming van dergelijke biofilms, vertoonden in onze experimenten een graduele verhoging in fosforylatie na imipenem stimulatie. Een eerste is het ‘heat shock’ eiwit ClpB dat deel uitmaakt van een stressgeïnduceerd multi-chaperone systeem. Uit een eerdere studie in Shewanella oneidensis MR-
44
Discussie 1 bleek dat dit Clp protease neergereguleerd wordt in de biofilm toestand. Mogelijk leidt fosforylatie dus tot inactivering van dit eiwit. Dezelfde studie toonde eveneens aan dat enkele eiwitten gelinkt aan het TonB transport systeem, neergereguleerd worden in biofilms. Dit TonB complex is verantwoordelijk voor de overdracht van de ‘proton motive force’ over de binnenste membraan naar actieve transporters (TonB afhankelijke eiwitten) in de buitenste membraan. Op deze manier wordt de nodige energie geleverd voor de import van ijzer-siderofoor complexen en vitamine B12 over de buitenste membraan. Het complex bevat naast TonB, dat de ruimte tussen de binnenste en buitenste membraan overbrugt, ook de binnenste membraaneiwitten ExbB en ExbD. Wanneer ijzer in onvoldoende mate beschikbaar is, importeren bacteriën heem of heem-bevattende componenten via het TonB systeem als bron van ijzer. Ijzer wordt vervolgens vrijgesteld van heem in een zuurstofafhankelijk proces. Aangezien biofilms een overwegend anaërobe manier van groeien vertegenwoordigen, wordt de mogelijkheid om in deze groeivorm heem te gebruiken, gelimiteerd (De Vriendt et al, 2005). Dit is een mogelijke verklaring waarom componenten van dit heem/ijzer-import systeem neergereguleerd worden in biofilms. Uit de SDS-PAGE analyse blijkt dat een TonB afhankelijke transporter en het membraaneiwit ExbB worden gefosforyleerd na imipenem stimulatie, wat mogelijk vereist is voor hun inactivering. Dit is echter tegenstrijdig met de resultaten van de studie van Van Oudenhove et al., waarbij het ExbB eiwit opgereguleerd wordt na imipenem stimulatie van S. maltophilia cellen (Van Oudenhove et al, 2012). Bovendien toonden transposon mutagenese experimenten aan dat inactivering van TonB leidt tot een verminderde biofilm vorming (Theunissen et al, 2010). Verdere experimenten zijn dan ook noodzakelijk om het exacte mechanisme op te helderen. Naast de rol van het TonB transportsysteem, is reeds geweten dat cyclisch diguanylaat (c-diGMP) optreedt als een biofilm stimulerende secundaire boodschappermolecule. Diguanylaat cyclases (DGCs) sythetiseren c-di-GMP, terwijl gespecialiseerde fosfodiesterases (PDEs) c-diGMP afbreken. De DGC activiteit is sterk geassocieerd met GGDEF domeinen die het actieve centrum van het enzym vormen (Povolotsky & Hengge, 2012). Twee GGDEF domeinbevattende eiwitten werden in onze studie geïdentificeerd als zijnde differentieel gefosforyleerd. Mogelijk leidt fosforylatie in dit geval tot activering van deze eiwitten, waardoor de c-di-GMP concentratie in de cel stijgt en biofilmvorming gestimuleerd wordt. GGDEF domeinen werden eveneens teruggevonden in de RR van een TCS (Malone et al, 2007; Paul et al, 2004), die een verhoogde expressie vertoonde na imipenem stimulatie (Van Oudenhove et al, 2012). De geobserveerde verhoogde fosforylatie van een H-NS histone family eiwit kan wijzen op een effect op de beweeglijkheid van de cellen. H-NS eiwitten beïnvloeden de biogenese van flagella door de expressie te controleren van het flagellumchemotaxis master regulon. Mutaties in deze eiwitten zijn de oorzaak van een totaal gebrek aan flagella en bijgevolg een verminderde mobiliteit (Bertin et al, 1994). In S. maltophilia zijn flagella geassocieerd met biofilm vorming, waarbij ze kunnen optreden als adhesines die vasthechting aan het substraat stimuleren, of kracht kunnen genereren om de afstoting tussen bacteriën en substraat te overkomen en de verspreiding van de bacteriën over het substraat bevorderen (de Oliveira-Garcia et al, 2002). Fosforylatie van bovengenoemde eiwitten, met uitzondering van EF-Tu, werd nog niet beschreven, maar blijkt uit de NetPhosBac 1.0 predicites wel mogelijk te zijn. Al deze eiwitten bevatten potentiële Ser/Thr fosforylatiesites, hoewel verdere studies vereist zijn om dit te bevestigen. Bovendien bevat het transmembranair GGDEF signaling eiwit een potentiële histidine fosforylatiesite (KinasePhos 2.0 predicitie) (Bijlage, Figuur 20), wat een mogelijke verklaring kan zijn voor de
45
Discussie betere zichtbaarheid in de neutraal-gefixeerde gel in vergelijking met de zuur-gefixeerde gel. Voor het GGDEF PAS signalling domain eiwit werd geen histidine fosforylatiesite voorspeld, hoewel dit eiwit geannoteerd is als zijnde onderdeel van een fosforelay. Om de uitkomst van het KinasePhos 2.0 predicitie algoritme te bevestigen, zou kunnen gebruik gemaakt worden van een recent ontwikkeld antilichaam voor de specifieke detectie van histidinefosforylatie (Kee et al, 2013). Omwille van de lage gevoeligheid en beperkte reproduceerbaarheid van SDS-PAGE analyse, werd een alternatieve gel-vrije methode ontwikkeld voor de prefactionatie van eiwitten, voorafgaand aan LC-MS analyse. Hierbij werd gebruik gemaakt van HILIC, waarbij eiwitten gescheiden worden op basis van hydrofiliciteit. Het beste resultaat werd bekomen met 45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7 als solvent A en 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7 als solvent B en wanneer de geëxtraheerde membraaneiwitten opgelost werden in solvent A met 0.1% SDS. De intensiteit van de pieken is echter nog steeds vrij laag en de scheiding suboptimaal. Het grootste obstakel in deze strategie is de oplosbaarheid van membraaneiwitten in de gebruikte organische solventen. Vermoedelijk is precipitatie van een groot deel van de geëxtraheerde eiwitten de oorzaak van de geobserveerde lage intensiteit. Het gebruik van een hoger percentage hexafluoro-isopropanol zou in dit geval een oplossing kunnen bieden, aangezien op deze manier de oplosbaarheid van membraaneiwitten verhoogd kan worden, zonder een negatief effect op de retentietijd. Een andere strategie die nog dient geëvalueerd te worden, is de scheiding van intacte membraaneiwitten met RPLC. Om een volledig beeld te krijgen van alle geëxtraheerde eiwitten, alsook van het percentage membraaneiwitten, werd een directe LC-MS analyse van het membraanproteoom uitgevoerd. Hiervoor werden eerst en vooral de omstandigheden waarin het trypsinedigest plaatsvindt, geoptimaliseerd. De aanwezigheid van 2 M urea blijkt noodzakelijk te zijn voor een efficiënte verknipping van de eiwitten, en aangezien noch detergent, noch methanol een positieve invloed hebben op het digest, werden deze componenten weggelaten. Om de zoutconcentratie te beperken, werd daarom 2 M urea/50 mM NH 4HCO3 gekozen als solvent voor het trypsinedigest. Bovendien is het ten zeerste aan te raden om, voorafgaand aan het digest, zowel delipidatie als acetonprecipitatie uit te voeren, aangezien deze stappen de efficiëntie van het digest verhogen en, zoals reeds gezegd, het risico op blokkades in het nano-LC systeem beperken. Het doel is om in de toekomst via directe LC-MS analyse de aanwezigheid van de differentieel gefosforyleerde eiwitten te bevestigen en om vervolgens uit de verkregen MS/MS spectra transities te selecteren voor daaropvolgende analyse met behulp van MRM. Deze laatste techniek maakt het mogelijk om eventuele veranderingen in eiwitexpressie en fosforylatie na imipenem stimulatie te volgen en te kwantificeren. Verder zou het interessant zijn om ook de eiwitten betrokken in de peptidoglycaanrecyclage pathway te analyseren met MRM, om zo informatie te verkrijgen over het mechanisme verantwoordelijk voor de inductie van antibioticaresistentie. Op deze manier wordt getracht om mogelijke targets te vinden voor de ontwikkeling van nieuwe behandelingen voor S. maltophilia infecties, waardoor de mortaliteit, de duur van het ziekenhuisverblijf en ook de geassocieerde kosten verlaagd kunnen worden.
46
Materiaal en methoden
5. MATERIAAL EN METHODEN 5.1.
Celcultuur
Stenotrophomonas maltophilia stam 44/98 werd geïsoleerd in de ‘Clinical Microbiology Unit’ van het Varese universitair ziekenhuis in Italië (Paola Mercuri). Een S. maltophilia cultuur werd overnacht aëroob gegroeid in Luria Bertani (LB) medium (zie bijlage) op een schudder bij 37°C tot de stationaire groeifase werd bereikt, corresponderend met een optische densiteit OD600 ≈ 2. Vervolgens werden de cellen verdund naar een OD600 van 0.2 en verder gegroeid tot ze de mid-exponentiële groeifase bereikt hebben (OD600 ≈ 0.65 – 0.75). Tijdens deze groeiperiode werden de culturen al dan niet voor een bepaalde tijdsduur gestimuleerd met 25 μg/ml imipenem. De cellen werden gecollecteerd via centrifugatie aan 6000xg gedurende 10 minuten.
5.2.
Extractie van membraaneiwitten 5.2.1. Extractiemethode gebaseerd op Mirza et al.
De S. maltophilia celpellet werd heropgelost in 1 ml TMSE buffer (60 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM mannitol, 70 mM sucrose, 1 mM EDTA (ethyleendiaminetetra-azijnzuur), gesupplementeerd met ‘Complete EDTA-free protease inhibitor mixture’ (Roche, Basel, Switzerland), en wanneer fosforylatie werd bestudeerd met ‘PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail’ (Roche) en 1 mM natriumorthovanadaat). De cellen werden gelyseerd met behulp van sonicatie (3 x 60 seconden, 15% amplitude). Na centrifugatie (8000xg, 10 min) werd de pellet heropgelost in 1 ml TMSE buffer en opnieuw gecentrifugeerd (800xg, 10 min). Eiwitten aanwezig in de pellet werden gedelipideerd door middel van een chloroform/methanol extractie. De pellet werd hiervoor opgelost in 500 µl chloroform en gedurende 30 min geschud. Nadien werd 500 µl methanol toegevoegd, opnieuw gevolgd door een half uur hevig schudden. Vervolgens werd dit mengsel gecentrifugeerd (2000xg, 1 min) en de onderste chloroform fase verwijderd. De extractie werd herhaald door opnieuw 500 µl chloroform toe te voegen, gevolgd door schudden en centrifugatie (10000xg, 5 min). De onderste chloroform fase werd opnieuw verwijderd. Aceton (-20°C, 4 volumes) werd toegevoegd aan de waterige en onoplosbare fase om de eiwitten gedurende minstens één uur bij -20°C te precipiteren. De eiwitten werden gecollecteerd door centrifugatie (14000xg, 10 min) en gedroogd op ijs. Voor de analyse van membraaneiwitten met SDS-PAGE werd geen chloroform/methanol delipidatie en acetonprecipitatie uitgevoerd (Mirza et al, 2007).
47
Materiaal en methoden 5.2.2. Extractiemethode gebaseerd op Van Oudenhove et al. De gecollecteerde cellen werden heropgelost in 50 mM Tris-HCl pH 8, gesupplementeerd met ‘Complete EDTA-free protease inhibitor mixture’ (Roche), en wanneer fosforylatie werd bestudeerd met ‘PhosSTOP phosphatase inhibitor cocktail’ (Roche) en 1 mM natriumorthovanadaat). De cellen werden gelyseerd met behulp van sonicatie op ijs (1 min, 15% amplitude). Ongelyseerde cellen werden verwijderd door centrifugatie gedurende 8 min aan 2500xg. Het supernatant (S1) werd gecollecteerd en de cel pellet werd onderworpen aan een tweede ronde van heroplossen, sonicatie en centrifugatie. Het supernatant (S2) werd opnieuw gecollecteerd en samengevoegd met S1. Hieraan werd 1 ml ijskoude 0.1 M Na2CO3 (pH 11) toegevoegd, waarna het mengsel gedurende één uur gemengd werd op ijs. Membraaneiwitten werden gecollecteerd door centrifugatie aan 100000xg gedurende één uur met de Avanti J-301 centrifuge (Beckman Coulter, Fullerton, CA, US) (Van Oudenhove et al, 2012).
5.3.
SDS-PAGE analyse
Eiwitten werden heropgelost in reducerende SDS sample buffer (2% SDS, 0.01% broomfenol blauw, 1.32 M glycerol, 60 mM Tris-HCl pH 8, MQ H2O, 1% 2-mercaptoethanol) en geladen op precast 12% polyacrylamide gels (Amersham ECL 12% Gels, GE Healthcare, Uppsala, Sweden), die bij 160V werden gelopen, of op 12.5% polyacrylamide gels, die bij 150V werden gelopen. De gel werd gefixeerd in een zure oplossing van 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur, of een neutrale oplossing van 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O gedurende een half uur, en nadien gewassen met MQ H2O. Voor de detectie van gefosforyleerde eiwitten werd de gel gekleurd met de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gedurende één uur in het donker. Na ontkleuren in 30% methanol (4 x 15 min in het donker) en wassen in MQ (2 x 5 min), werd de gel gescand met de Pharos FX scanner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) (excitatie golflengte 532 nm en 580 nm, bandpass emissiefilter 100 µm). Indien de initiële fixatie werd uitgevoerd in het neutrale 50% (v/v) ethanol/50% (v/v) MQ H2O, werd de gel opnieuw gefixeerd in 50% (v/v) methanol/10% (v/v) azijnzuur. Voor een totaal eiwitbeeld werd de gel overnacht gekleurd met Coomassie Brilliant Blue G250 (34% (v/v) methanol, 3% (w/v) H3PO4, 17% (w/v) (NH4)2SO4, 0.2% (w/v) CBB-G250), en nadien ontkleurd in 30% methanol (4 x 15 min). De gel werd gescand met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad) (licht doorlatend, rode filter, 100 µm resolutie), waarna het beeld verwerkt werd met het Quantity One softwarepakket.
48
Materiaal en methoden 5.4.
Trypsinedigest In-gel trypsinedigest
Uitgesneden SDS-PAGE bandjes werden gewassen met 50% ACN/200mM NH4HCO3 (20 minuten bij 30°C) tot alle Coomassie verdwenen was en gedroogd in de Speedvac. Trypsine (0.02 µg) werd toegevoegd en de stalen werden gedurende 45 minuten geïncubeerd op ijs. De eiwitten werden overnacht bij 37°C verknipt. De gedigereerde eiwitten werden gecentrifugeerd en het supernatant werd gecollecteerd in een nieuwe eppendorf, waarna peptiden verder werden geëxtraheerd met 60% ACN/0.1% HCOOH (2 maal 20 minuten bij 30°C). De extractie oplossing werd gedroogd in de Speedvac en ingevroren bij -20°C tot analyse.
Gel-vrij trypsinedigest
De eiwitconcentratie van de extracten werd bepaald met behulp van de Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (Thermo Scientific, San Jose, CA, USA) (zie bijlage). De eiwitten werden gedurende een half uur gereduceerd met 10 mM dithiothreitol (DTT) bij 60°C en vervolgens gedurende een half uur gealkyleerd met 20 mM iodoacetamide (IAA) bij kamertemperatuur in het donker. Na reductie en alkylatie werden de eiwitten overnacht bij 37°C verknipt met trypsine (Promega, Madison, WI, USA) (1/50 w/w). De peptiden werden uitgedroogd in de SpeedVac en heropgelost in 0.1% HCOOH, zodat een concentratie van 500 ng/µl bereikt werd.
5.5.
LC-ESI-MS analyse
Peptiden werden gescheiden met nano-RPLC op een Ultimate 3000 RSLC systeem (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), uitgerust met een Acclaim PepMap100 trap kolom (ID x L 75 µm x 20 mm, C18, 3 µm, 100 Å) (Thermo Scientific) en een Acclaim PepMap100 ‘reversed phase’ analytische kolom (ID x L 75 µm x 150 mm, C18, 3 µm, 100 Å) (Thermo Scientific). Zowel de laadpomp als de nanopomp zijn voorzien van volgende solventen: 0.1% HCOOH in H2O (solvent A) en 0.1% HCOOH in ACN (solvent B). Peptiden werden eerst gedurende 3 min geladen op de trap-kolom aan een stroomsnelheid van 3 μl/min (2% B). Na drie minuten werden de peptiden gescheiden op de analytische kolom aan een stroomsnelheid van 0.3 μl/min met volgende gradiënt: in 60 min van 2% naar 40% B, 10 min bij 80% B, 17 min reequilibratie bij 2% B en tenslotte 10 min terug over de trap kolom bij 2% solvent B. Eluerende peptiden werden online geïoniseerd voor MS analyse met de NanoSpray II ESI bron (AB Sciex, Framingham, MA, USA), uitgerust met de MicroIon Spray II head (AB Sciex) en een uncoated silica PicoTip Emitter (ID 20 µm, tip ID 10 µm) (New Objective, Ringoes, NJ, USA). Hierop werd een spanning van 3500 V aangelegd. De 4000 QTRAP massaspectrometer (AB Sciex) verwierf MS-scans in de ‘linear ion trap’ (LIT), met een bereik van 400 – 1200 m/z
49
Materiaal en methoden en aan een scansnelheid van 4000 Da/s. Uit elke MS scan werden de twee meest intense ionen achtereenvolgens geselecteerd voor MS/MS. Ionen werden gefragmenteerd met CID, met N2 als botsingsgas, en fragmentionen werden gedetecteerd met de LIT (bereik 100 – 1400 m/z, scansnelheid 4000 Da/s). De data werd gezocht tegen een S. maltophilia databank die de Uniprot eiwitsequenties van de stam K279a bevat (4369 entries), samen met een lijst van veel voorkomende contaminanten (trypsine, keratine, lysozyme, ...). Naast de default parameters werden twee gemiste trypsine verknippingen toegestaan en werden de precursor- en fragmentionen massa-toleranties respectievelijk op 1.2 Da en 0.6 Da gezet. Enkel peptiden met een lading van +2 of +3 werden in rekening genomen. Volgende variabele modificaties werden geselecteerd: carbamidomethylatie van cysteïne, oxidatie van methionine en optioneel fosforylatie van serine, threonine, tyrosine, aspartaat en histidine. De sequenties van de geïdentificeerde eiwitten werden geanalyseerd met NetPhosBac 1.0 (www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosBac-1.0) (Miller et al, 2009), een Ser/Thr fosforylatiesite predictie algoritme (zie bijlage), om potentiële fosforylatiesites te identificeren.
5.6.
HILIC
HILIC werd uitgevoerd op het Ettan LC systeem (GE Healthcare). Solvent A (63% 2-propanol, 22.5% ACN, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 0.1% HCOOH, 20 mM ammonium formaat, pH 3.7) en solvent B (30% 2-propanol, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 0.1% HCOOH, 20 mM ammonium formaat, pH 3.7) werden gebruikt om een lineaire gradiënt te creëren. De geëxtraheerde membraaneiwitten werden opgelost in solvent A en geladen met een 100 μl injectieloop. De scheiding werd uitgevoerd op een polyHYDROXYETHYL A kolom (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) (PolyLC, Columbia, MD, USA). Honderd µl staal werd geladen met een 100 µl injectieloop aan een stroomsnelheid van 100 µl/min. De volgende gradiënt werd gebruikt voor de elutie: 10 minuten 100% A, injectie, 10 minuten 0% B, in 60 min van 0% naar 100% B, 5 minuten 100% B, 10 minuten 100% A. Fracties van eluerende eiwitten werden elke minuut gecollecteerd met de Frac-950 (GE Healthcare). De scheiding werd gevolgd door de absorbantie te meten bij 280 nm met een UV-900 monitor (GE Healthcare). Een ander solventsysteem dat gebruikt werd, was 45% 2-propanol, 40% acetonitrile, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7 als solvent A en 30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7 als solvent B.
50
Referenties
6. REFERENTIES Abbott IJ, Slavin MA, Turnidge JD, Thursky KA, Worth LJ (2011) Stenotrophomonas maltophilia: emerging disease patterns and challenges for treatment. Expert review of anti-infective therapy 9: 471-488 Alexander C, Bilgin N, Lindschau C, Mesters JR, Kraal B, Hilgenfeld R, Erdmann VA, Lippmann C (1995) Phosphorylation of elongation factor Tu prevents ternary complex formation. The Journal of Biological Chemistry 270: 14541-14547 Avison MB, Higgins CS, Ford PJ, von Heldreich CJ, Walsh TR, Bennett PM (2002) Differential regulation of L1 and L2 beta-lactamase expression in Stenotrophomonas maltophilia. The Journal of antimicrobial chemotherapy 49: 387-389 Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B (2007) Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and bioanalytical chemistry 389: 1017-1031 Becker CH, Bern M (2011) Recent developments in quantitative proteomics. Mutation research 722: 171-182 Bertin P, Terao E, Lee EH, Lejeune P, Colson C, Danchin A, Collatz E (1994) The H-NS protein is involved in the biogenesis of flagella in Escherichia coli. Journal of bacteriology 176: 5537-5540 Bird IM (1989) High performance liquid chromatography: principles and clinical applications. British medical journal 299: 783-787 Broad Institute. (2013) MRM (Multiple Reaction Monitoring). Canas B, Lopez-Ferrer D, Ramos-Fernandez A, Camafeita E, Calvo E (2006) Mass spectrometry technologies for proteomics. Briefings in functional genomics & proteomics 4: 295-320 Cavallari JF, Lamers RP, Scheurwater EM, Matos AL, Burrows LL (2013) Changes to its peptidoglycan-remodeling enzyme repertoire modulate beta-lactam resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial agents and chemotherapy Cox DM, Zhong F, Du M, Duchoslav E, Sakuma T, McDermott JC (2005) Multiple reaction monitoring as a method for identifying protein posttranslational modifications. Journal of biomolecular techniques : JBT 16: 8390 Crossman LC, Gould VC, Dow JM, Vernikos GS, Okazaki A, Sebaihia M, Saunders D, Arrowsmith C, Carver T, Peters N, Adlem E, Kerhornou A, Lord A, Murphy L, Seeger K, Squares R, Rutter S, Quail MA, Rajandream MA, Harris D, Churcher C, Bentley SD, Parkhill J, Thomson NR, Avison MB (2008) The complete genome, comparative and functional analysis of Stenotrophomonas maltophilia reveals an organism heavily shielded by drug resistance determinants. Genome biology 9: R74 de Oliveira-Garcia D, Dall'Agnol M, Rosales M, Azzuz AC, Martinez MB, Giron JA (2002) Characterization of flagella produced by clinical strains of Stenotrophomonas maltophilia. Emerging infectious diseases 8: 918-923 De Vriendt K, Theunissen S, Carpentier W, De Smet L, Devreese B, Van Beeumen J (2005) Proteomics of Shewanella oneidensis MR-1 biofilm reveals differentially expressed proteins, including AggA and RibB. Proteomics 5: 1308-1316 Denton M, Kerr KG (1998) Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia. Clinical microbiology reviews 11: 57-80
51
Referenties Eeltink S, Dolman S, Detobel F, Swart R, Ursem M, Schoenmakers PJ (2010) High-efficiency liquid chromatography-mass spectrometry separations with 50 mm, 250 mm, and 1 m long polymer-based monolithic capillary columns for the characterization of complex proteolytic digests. Journal of chromatography A 1217: 6610-6615 Ferguson PL, Smith RD (2003) Proteome analysis by mass spectrometry. Annual review of biophysics and biomolecular structure 32: 399-424 Gallien S, Duriez E, Domon B (2011) Selected reaction monitoring applied to proteomics. Journal of mass spectrometry : JMS 46: 298-312 Gao R, Mack TR, Stock AM (2007) Bacterial response regulators: versatile regulatory strategies from common domains. Trends in Biochemical Sciences 32: 225-234 Gotoh Y, Eguchi Y, Watanabe T, Okamoto S, Doi A, Utsumi R (2010) Two-component signal transduction as potential drug targets in pathogenic bacteria. Current opinion in microbiology 13: 232-239 Graham C, McMullan G, Graham RL (2011) Proteomics in the microbial sciences. Bioengineered bugs 2: 17-30 Graham R, Graham C, McMullan G (2007) Microbial proteomics: a mass spectrometry primer for biologists. Microbial cell factories 6: 26 Helbig AO, Heck AJ, Slijper M (2010) Exploring the membrane proteome--challenges and analytical strategies. Journal of proteomics 73: 868-878 Hoch JA (2000) Two-component and phosphorelay signal transduction. Current opinion in microbiology 3: 165170 Huang YW, Hu RM, Lin CW, Chung TC, Yang TC (2012) NagZ-dependent and NagZ-independent mechanisms for beta-lactamase expression in Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrobial agents and chemotherapy 56: 1936-1941 Huang YW, Lin CW, Hu RM, Lin YT, Chung TC, Yang TC (2010) AmpN-AmpG operon is essential for expression of L1 and L2 beta-lactamases in Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrobial agents and chemotherapy 54: 25832589 Kee JM, Oslund RC, Perlman DH, Muir TW (2013) A pan-specific antibody for direct detection of protein histidine phosphorylation. Nature chemical biology Kleinnijenhuis AJ, Kjeldsen F, Kallipolitis B, Haselmann KF, Jensen ON (2007) Analysis of histidine phosphorylation using tandem MS and ion-electron reactions. Analytical chemistry 79: 7450-7456 Kobir A, Shi L, Boskovic A, Grangeasse C, Franjevic D, Mijakovic I (2011) Protein phosphorylation in bacterial signal transduction. Biochimica et biophysica acta 1810: 989-994 Kosako H, Nagano K (2011) Quantitative phosphoproteomics strategies for understanding protein kinasemediated signal transduction pathways. Expert Review of Proteomics 8: 81-94 Lange V, Picotti P, Domon B, Aebersold R (2008) Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular systems biology 4: 222 Lin CW, Huang YW, Hu RM, Chiang KH, Yang TC (2009) The role of AmpR in regulation of L1 and L2 betalactamases in Stenotrophomonas maltophilia. Research in microbiology 160: 152-158 Lin CW, Lin HC, Huang YW, Chung TC, Yang TC (2011) Inactivation of mrcA gene derepresses the basal-level expression of L1 and L2 beta-lactamases in Stenotrophomonas maltophilia. The Journal of antimicrobial chemotherapy 66: 2033-2037
52
Referenties Lippmann C, Lindschau C, Vijgenboom E, Schroder W, Bosch L, Erdmann VA (1993) Prokaryotic elongation factor Tu is phosphorylated in vivo. The Journal of Biological Chemistry 268: 601-607 Macek B, Mann M, Olsen JV (2009) Global and site-specific quantitative phosphoproteomics: principles and applications. Annual review of pharmacology and toxicology 49: 199-221 Malone JG, Williams R, Christen M, Jenal U, Spiers AJ, Rainey PB (2007) The structure-function relationship of WspR, a Pseudomonas fluorescens response regulator with a GGDEF output domain. Microbiology 153: 980994 Marx V (2013) Targeted proteomics. Nature methods 10: 19-22 McGowan JE, Jr. (2006) Resistance in nonfermenting gram-negative bacteria: multidrug resistance to the maximum. American journal of infection control 34: S29-37; discussion S64-73 Mijakovic I (2010) Protein phosphorylation in bacteria. Febs Journal 277: 20-21 Miller ML, Soufi B, Jers C, Blom N, Macek B, Mijakovic I (2009) NetPhosBac - a predictor for Ser/Thr phosphorylation sites in bacterial proteins. Proteomics 9: 116-125 Mirza SP, Halligan BD, Greene AS, Olivier M (2007) Improved method for the analysis of membrane proteins by mass spectrometry. Physiological genomics 30: 89-94 Mitrophanov AY, Groisman EA (2008) Signal integration in bacterial two-component regulatory systems. Genes & development 22: 2601-2611 Mitulovic G, Mechtler K (2006) HPLC techniques for proteomics analysis--a short overview of latest developments. Briefings in functional genomics & proteomics 5: 249-260 Molloy MP (2008) Isolation of bacterial cell membranes proteins using carbonate extraction. Methods in molecular biology 424: 397-401 Monteoliva L, Albar JP (2004) Differential proteomics: an overview of gel and non-gel based approaches. Briefings in functional genomics & proteomics 3: 220-239 Moya B, Dotsch A, Juan C, Blazquez J, Zamorano L, Haussler S, Oliver A (2009) Beta-lactam resistance response triggered by inactivation of a nonessential penicillin-binding protein. PLoS pathogens 5: e1000353 Nikaido H (2009) Multidrug resistance in bacteria. Annual review of biochemistry 78: 119-146 Normark S (1995) beta-Lactamase induction in gram-negative bacteria is intimately linked to peptidoglycan recycling. Microbial drug resistance 1: 111-114 Okazaki A, Avison MB (2008) Induction of L1 and L2 beta-lactamase production in Stenotrophomonas maltophilia is dependent on an AmpR-type regulator. Antimicrobial agents and chemotherapy 52: 1525-1528 Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, Kristensen DB, Steen H, Pandey A, Mann M (2002) Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular and Cellular Proteomics 1: 376-386 Orsburn BC, Stockwin LH, Newton DL (2011) Challenges in plasma membrane phosphoproteomics. Expert Review of Proteomics 8: 483-494 Parker CE, Warren MR, Mocanu V (2010) Mass Spectrometry for Proteomics. In Neuroproteomics, Alzate O (ed). Boca Raton (FL)
53
Referenties Paul R, Weiser S, Amiot NC, Chan C, Schirmer T, Giese B, Jenal U (2004) Cell cycle-dependent dynamic localization of a bacterial response regulator with a novel di-guanylate cyclase output domain. Genes & development 18: 715-727 Payne DJ, Bateson JH, Gasson BC, Proctor D, Khushi T, Farmer TH, Tolson DA, Bell D, Skett PW, Marshall AC, Reid R, Ghosez L, Combret Y, Marchand-Brynaert J (1997) Inhibition of metallo-beta-lactamases by a series of mercaptoacetic acid thiol ester derivatives. Antimicrobial agents and chemotherapy 41: 135-140 Picotti P, Aebersold R (2012) Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature methods 9: 555-566 Povolotsky TL, Hengge R (2012) 'Life-style' control networks in Escherichia coli: signaling by the second messenger c-di-GMP. Journal of biotechnology 160: 10-16 Rabilloud T, Chevallet M, Luche S, Lelong C (2010) Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. Journal of proteomics 73: 2064-2077 Sader HS, Jones RN (2005) Antimicrobial susceptibility of uncommonly isolated non-enteric Gram-negative bacilli. International journal of antimicrobial agents 25: 95-109 Sanchez MB, Hernandez A, Martinez JL (2009) Stenotrophomonas maltophilia drug resistance. Future microbiology 4: 655-660 Schumacher MA, Piro KM, Xu W, Hansen S, Lewis K, Brennan RG (2009) Molecular mechanisms of HipAmediated multidrug tolerance and its neutralization by HipB. Science 323: 396-401 Senol E (2004) Stenotrophomonas maltophilia: the significance and role as a nosocomial pathogen. The Journal of hospital infection 57: 1-7 Seshasayee AS, Bertone P, Fraser GM, Luscombe NM (2006) Transcriptional regulatory networks in bacteria: from input signals to output responses. Current opinion in microbiology 9: 511-519 Sleno L, Volmer DA (2004) Ion activation methods for tandem mass spectrometry. Journal of mass spectrometry : JMS 39: 1091-1112 Smith BJ (1984) SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology 1: 41-55 Steen H, Mann M (2004) The ABC's (and XYZ's) of peptide sequencing. Nature reviews Molecular cell biology 5: 699-711 Swiderek KM, Alpert AJ, Heckendorf A, Nugent K, Patterson SD. (1997) Structural analysis of proteins and peptides in the presence of detergents: tricks of the trade. The Association of Biomolecular Resource Facilities. Tayler AE, Ayala JA, Niumsup P, Westphal K, Baker JA, Zhang L, Walsh TR, Wiedemann B, Bennett PM, Avison MB (2010) Induction of beta-lactamase production in Aeromonas hydrophila is responsive to beta-lactammediated changes in peptidoglycan composition. Microbiology 156: 2327-2335 Theunissen S, De Smet L, Dansercoer A, Motte B, Coenye T, Van Beeumen JJ, Devreese B, Savvides SN, Vergauwen B (2010) The 285 kDa Bap/RTX hybrid cell surface protein (SO4317) of Shewanella oneidensis MR-1 is a key mediator of biofilm formation. Research in microbiology 161: 144-152 Unlu M, Morgan ME, Minden JS (1997) Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts. Electrophoresis 18: 2071-2077 Van Oudenhove L, De Vriendt K, Van Beeumen J, Mercuri PS, Devreese B (2012) Differential proteomic analysis of the response of Stenotrophomonas maltophilia to imipenem. Applied microbiology and biotechnology 95: 717-733
54
Referenties Wells JM, McLuckey SA (2005) Collision-induced dissociation (CID) of peptides and proteins. Methods in enzymology 402: 148-185 Wilm M (2011) Principles of electrospray ionization. Molecular and Cellular Proteomics 10: M111 009407 World Health Organization. (2013) Antibiotic resistance. Yang TC, Huang YW, Hu RM, Huang SC, Lin YT (2009) AmpDI is involved in expression of the chromosomal L1 and L2 beta-lactamases of Stenotrophomonas maltophilia. Antimicrobial agents and chemotherapy 53: 29022907 Yocum AK, Chinnaiyan AM (2009) Current affairs in quantitative targeted proteomics: multiple reaction monitoring-mass spectrometry. Briefings in functional genomics & proteomics 8: 145-157 Zhang X, Fang A, Riley CP, Wang M, Regnier FE, Buck C (2010) Multi-dimensional liquid chromatography in proteomics--a review. Analytica et chimica acta 664: 101-113
55
Bijlagen
7. BIJLAGEN 7.1.
Protocols
7.1.1. Celcultuur en isolatie van membraaneiwitten uit S. maltophilia cellen S. maltophilia celcultuur
voeg één slent ingevroren bacteriën toe aan 100 ml vers LB medium en plaats overnacht op de schudder bij 37°C meet de OD600 (staal 1/10 verdund in LB, blanco = LB medium) en verdun vervolgens naar een OD600 van 0.200 plaats de cultuur voor 2u tot 2u30 op de schudder bij 37°C (tot een OD 600 van 0.650 – 0.750 (mid-exponentiële groeifase)) verdeel de 100 ml cultuur over 50 ml falcons centrifugeer voor 10 min aan 6000xg bij 4°C en giet het supernatant weg (de celpellets worden bewaard bij -80°C wanneer deze niet meteen gebruikt worden)
Isolatie van membraaneiwitten: methode 1 (Van Oudenhove et al., Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 250 µl 50 mM Tris-HCl pH met protease inhibitor mengsel, breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 1 minuut op ijs (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer aan 2500xg voor 8 min, collecteer supernatant S1 los de celpellet opnieuw op in 250 µl 50 mM Tris-HCl pH met protease inhibitor mengsel soniceer 1 minuut op ijs (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer aan 2500xg voor 8 min, collecteer supernatant S2 meng beide supernatant en voeg 1 ml ijskoude 0.1 M Na2CO3 pH 11 toe laat het mengsel 1 uur roeren op ijs centrifugeer gedurende 1 uur aan 100000xg los de pellet op in 75 µl reducerende SDS sample buffer vortex en centrifugeer kort
Isolatie van membraaneiwitten: methode 2 (Mirza et al., Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 1 ml TMSE buffer (Tris-mannitol-sucroseEDTA), breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 3 x 60s op ijs met 2 min rust ertussen (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer voor 10 min aan 8000xg los de pellet opnieuw op in 1 ml TMSE buffer en centrifugeer voor 10 min aan 800xg
56
Bijlagen
voeg 500 µl chloroform toe aan de pellet en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de schudder voeg 500 µl methanol-water (50/50) toe en vortex gedurende 30 min centrifugeer voor 1 min aan 2000xg en verwijder de onderste chloroform laag voeg 1500 µl ijskoude aceton (-20°C) toe aan de vloeibare en onoplosbare fase incubeer gedurende minstens 1 uur bij -20°C centrifugeer voor 10 min aan 14000xg en verwijder het supernatant, laat de pellet drogen op ijs los de pellet opnieuw op in 150 µl reducerende SDS sample buffer vortex en centrifugeer kort
Isolatie van membraaneiwitten: methode 3 (Mirza et al., Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 1 ml TMSE buffer (Tris-mannitol-sucroseEDTA), breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 3 x 60s op ijs met 2 min rust ertussen (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer voor 10 min aan 8000xg los de pellet opnieuw op in 1 ml TMSE buffer en centrifugeer voor 10 min aan 800xg los de pellet op in 150 µl reducerende SDS sample buffer vortex en centrifugeer kort
Isolatie van membraaneiwitten: methode 4 (Mirza et al., Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 1 ml TMSE buffer (Tris-mannitol-sucroseEDTA), breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 3 x 60s op ijs met 2 min rust ertussen (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer voor 10 min aan 8000xg los de pellet opnieuw op in 1 ml TMSE buffer en centrifugeer voor 10 min aan 800xg voeg 1 ml ijskoude aceton (-20°C) toe aan de pellet incubeer gedurende minstens 1 uur bij -20°C centrifugeer voor 10 min aan 14000xg en verwijder het supernatant, laat de pellet drogen op ijs los de pellet opnieuw op in 150 µl reducerende SDS sample buffer vortex en centrifugeer kort
57
Bijlagen 7.1.2. SDS-PAGE scheiding van membraaneiwitten en identificatie met behulp van massaspectrometrie SDS-PAGE
laad de stalen op de gel en laat hem lopen bij 160V tot het front het einde van de gel bereikt heeft (± 1 uur) ProQ Diamond kleuring van de gel voor detectie van gefosforyleerde eiwitten: → fixeren 1 x 30 min → wassen (MQ H2O) 2 x 5 min → ProQ Diamond kleuring 1 uur in het donker → ontkleuren (30% methanol) 4 x 15 min in het donker → wassen (MQ H2O) 2 x 5 min in het donker inscannen van de gel: Pharos FX scanner, Quantity One software (excitatie golflengte 532 nm en 580 nm, bandpass emissiefilter 100 µm) in het geval van neutrale fixatie: herfixatie in 50% methanol/10% azijnzuur Coomassie Brilliant Blue kleuring van de gel: → Coomassie Brilliant Blue overnacht → Coomassie ontkleuren (30% methanol) 4 x 15 min → wassen (MQ H2O) 2 x 5 min inscannen van de gel: GS-800 densitometer, Quantity One software (licht doorlatend, rode filter, 100 µm resolutie)
In-gel trypsinedigest (Coomassie interfereert met de verdere analyse van de eiwitten, aangezien het een verstoring veroorzaakt ter hoogte van lysine residuen en trypsine eiwitten knipt na lysine of arginine residuen)
was de uitgesneden bandjes met 150 µl 50% ACN/200 mM NH4HCO3 gedurende 20 min bij 30°C, vortex en centrifugeer kort. Herhaal tot de kleuring verwijderd is droog de stalen in de Speedvac gedurende 10-15 min voeg 10 µl trypsine van een 50x verdunde 0.1 µg/µl stock (in 50 mM NH4HCO3) toe incubeer op ijs gedurende 45 min voeg 50 mM NH4HCO3 toe tot de gelstukjes volledig onder staan verknip de eiwitten overnacht bij 37°C label nieuwe 0.5 ml eppendorfs centrifugeer de digesten en breng het solvent over in de correpsonderende 0.5 ml eppendorf extractie: was de gelblokjes met 40 µl 60% ACN/0.1% HCOOH gedurende 20 min bij 30°C, vortex gedurende 3 min, centrifugeer kort en breng het solvent over in dezelfde 0.5 ml eppendorf herhaal de extractie stap droog de extractie oplossing in de Speedvac los de geëxtraheerde peptiden op in 15 µl 0.1% HCOOH
58
Bijlagen LC-ESI-MS/MS analyse
breng de peptidenoplossing over in een standaard MS vial
U3000-RSLC nano LC system Column: Thermo Scientific PepMap 100, 75µm x 15cm, nanoviper, C18, 3 µm, 100Å Trap column: Thermo Scientific PepMap 100, 75µm x 2cm, nanoviper, C18, 3 µm, 100Å Solvents: A = 0.1% HCOOH in H2O B = 0.1% HCOOH in ACN LC method: Simon PepMap LCMSMS R100G60D35T3
;Initialize all Analyst synchronisation properties to 0. ReadyToRun = DoInject = InjectResponse = Sampler.TempCtrl = Sampler.Temperature.Nominal = Sampler.Temperature.LowerLimit = Sampler.Temperature.UpperLimit = Sampler.ReadyTempDelta = ColumnOven.TempCtrl = ColumnOven.Temperature.Nominal = ColumnOven.Temperature.LowerLimit = ColumnOven.Temperature.UpperLimit = EquilibrationTime = ColumnOven.ReadyTempDelta = LoadingPump.Pressure.LowerLimit = LoadingPump.Pressure.UpperLimit = LoadingPump.MaximumFlowRampDown = LoadingPump.MaximumFlowRampUp = LoadingPump.%A.Equate = LoadingPump.%B.Equate = %C.Equate = NC_Pump.Pressure.LowerLimit = NC_Pump.Pressure.UpperLimit = NC_Pump.MaximumFlowRampDown = NC_Pump.MaximumFlowRampUp = NC_Pump.%A.Equate = NC_Pump.%B.Equate = DrawSpeed = DrawDelay = DispSpeed = DispenseDelay = WasteSpeed = WashSpeed = LoopWashFactor =
0 0 0 On 5.0 [°C] 4.0 [°C] 45.0 [°C] None On 35.0 [°C] 25.0 [°C] 75.0 [°C] 0.5 [min] 5.0 [°C] 0 [bar] 500 [bar] 10 [µl/min²] 10 [µl/min²] %A %B %C 0 [bar] 800 [bar] 997.999 [µl/min²] 997.999 [µl/min²] %A %B 200 [nl/s] 5000 [ms] 2000 [nl/s] 2000 [ms] 4000 [nl/s] 4000 [nl/s] 2
59
Bijlagen SampleHeight = PunctureDepth = WashVolume = RinseBetweenReinjections = LowDispersionMode = InjectMode = FlushVolume = FlushVolume2 = AnalystMinVolume = AnalystDefaultVolume = AnalystMaxVolume = LoadingPump_Pressure.Step = LoadingPump_Pressure.Average = NC_Pump_Pressure.Step = NC_Pump_Pressure.Average = LoadingPump.Flow = LoadingPump.%B = %C = LoadingPump.Curve = ValveLeft =
4.000 [mm] 8.000 [mm] 20.000 [µl] Yes Off FullLoop 5.000 [µl] 3.000 [µl] 0.500 [µl] 1.000 [µl] 20.000 [µl] 0,5 Off 0,5 Off 3.000 [µl/min] 2.0 [%] 0.0 [%] 5 10_1 LoadingPump.Ready and NC_Pump.Ready and ColumnOven.Ready and Sampler.Ready and Wait PumpModule.Ready ;Chromeleon sets this property to signal to Analyst that it is ready to start a run. ReadyToRun = 1 Wait DoInject ;Analyst sets this property to start the injection. NC_Pump.Flow = 0.300 [µl/min] NC_Pump.%B = 2.0 [%] LoadingPump.Ready and NC_Pump.Ready and ColumnOven.Ready and Sampler.Ready and Wait PumpModule.Ready Inject LoadingPump_Pressure.AcqOn NC_Pump_Pressure.AcqOn ;Chromeleon sets this property to signal the injection to Analyst. InjectResponse = 1 ;Depending on your system configuration it might be necessary to manually insert ;a "Relay" command below in order to send the start signal to the MS. ;Typical syntaxes: ;Pump_Relay_1.Closed Duration = 2.00 ;UM3PUMP_Relay1.On Duration = 2.00 ;Pump_Relay_1.Closed Duration = 2.00
60
Bijlagen ;UM3PUMP_Relay1.On NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B =
Duration = 2.00 0.300 [µl/min] 2.0 [%]
ValveLeft = NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B =
1_2 0.300 [µl/min] 2.0 [%]
NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B = NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B =
0.300 [µl/min] 40.0 [%] 0.300 [µl/min] 80.0 [%]
NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B = NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B =
0.300 [µl/min] 80.0 [%] 0.300 [µl/min] 2.0 [%]
ValveLeft =
10_1
LoadingPump_Pressure.AcqOff NC_Pump_Pressure.AcqOff NC_Pump.Flow = NC_Pump.%B = InjectResponse = End
0.300 [µl/min] 2.0 [%] 0
61
Bijlagen
MS/MS methode (Applied Biosystems 4000 QTRAP LC/MS/MS system):
EMS
scan range LIT fill time scan rate number of scans to sum Q0 trapping delay time
ER
scan range LIT fill time scan rate number of scans to sum
IDA criteria
ion selection greater than smaller than charge state cps treshold dynamic exclusion rolling CE
400-1200 amu 20 ms 4000 amu/s 2 no 180 s 2 most intense ions from EMS dynamic 250 amu/s 1 2 most intense ions 400 m/z 1200 m/z 2+, 3+ 100000 after 2 occurrences for 30 s 2+ 3+ unknown
(m/z x 0.05) + 5 (m/z x 0.044) + 4 (m/z x 0.05) + 5
use ER scan to confirm charge state EPI
scan range LIT fill time scan rate number of scans to sum Q1 resolution
Source/gas parameters CUR CAD IS GS1 GS2 IHT DP
150-630 amu 625-1400 amu 200 ms 4000 amu/s 4 LOW
MicroIonSpray II head 10 high 3500 5 0 60 35
62
Bijlagen 7.1.3. HILIC scheiding van massaspectrometrie
membraaneiwitten
en
identificatie
met
behulp
van
Cellyse en extractie van membraaneiwitten: methode 2 (Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 1 ml TMSE buffer (Tris-mannitol-sucroseEDTA), breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 3 x 60s op ijs met 2 min rust ertussen (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer voor 10 min aan 8000xg los de pellet opnieuw op in 1 ml TMSE buffer en centrifugeer voor 10 min aan 800xg voeg 500 µl chloroform toe aan de pellet en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de schudder voeg 500 µl methanol-water (50/50) toe en vortex gedurende 30 min centrifugeer voor 1 min aan 2000xg en verwijder de onderste chloroform laag voeg 1500 µl ijskoude aceton (-20°C) toe aan de vloeibare en onoplosbare fase incubeer gedurende minstens 1 uur bij -20°C centrifugeer voor 10 min aan 14000xg en verwijder het supernatant, laat de pellet drogen op ijs los de pellet opnieuw op in 150 µl solvent A vortex en centrifugeer kort
HILIC
monteer de PolyHYDROXYETHYL A kolom (PolyLC) (ID x L 2.1 x 200 mm, 5 µm, 300 Å) op het Ettan LC systeem (GE Healthcare) (100 μl injectieloop) spoel de kolom 1 uur met 80% ACN spoel alle leidingen 1 uur met MQ H2O conditioneer de kolom overnacht met 40 mM EDTA om vrije bindingsplaatsen voor fosfaatgroepen te blokkeren conditioneer de kolom met solvent A1 (63% 2-propanol, 22.5% ACN, 0.5% hexafluoro-isopropanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7) of solvent A2 (45% 2-propanol, 40% ACN, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7) conditioneer de kolom met solvent B1 (30% 2-propanol, 0.5% hexafluoroisopropanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7) of solvent B2 (30% 2-propanol, 20 mM ammonium formaat, HCOOH tot pH 3.7) injecteer 100 µl solvent A in de injectieloop van het LC systeem en start de blanco methode: 10 min 100% solvent A 5 min 0% solvent B in 15 min naar 100% solvent B 10 min 100% solvent B 5 min 100% solvent A stroomsnelheid: 0.1 ml/min injecteer 100 μl staal in de injectieloop van het LC systeem en start de methode:
63
Bijlagen
10 min 100% solvent A 10 min 0% solvent B in 30 min of 60 min naar 100% solvent B 10 min 100% solvent B 5 min 100% solvent A stroomsnelheid: 0.1 ml/min fracties van eluerende eiwitten worden elke minuut gecollecteerd in een 96-well plaat, die vervolgens wordt ingevroren bij -20°C na gebruik: spoel de kolom overnacht met 80% ACN haal de kolom van het LC systeem, sluit de kolom af en bewaar bij 4°C
7.1.4. Directe massaspectrometrische analyse van membraaneiwitten Cellyse en extractie van membraaneiwitten: methode 1 (Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 250 µl 50 mM Tris-HCl pH met protease inhibitor mengsel, breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 1 minuut op ijs (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer aan 2500xg voor 8 min, collecteer supernatant S1 los de celpellet opnieuw op in 250 µl 50 mM Tris-HCl pH met protease inhibitor mengsel soniceer 1 minuut op ijs (amplitude 15%, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer aan 2500xg voor 8 min, collecteer supernatant S2 meng beide supernatant en voeg 1 ml ijskoude 0.1 M Na2CO3 pH 11 toe laat het mengsel 1 uur roeren op ijs centrifugeer gedurende 1 uur aan 100000xg voeg 1 ml ijskoude aceton (-20°C) toe aan de pellet en incubeer gedurende minstens 1 uur bij -20°C centrifugeer gedurende 10 min aan 14000xg en verwijder het supernatant los de pellet op in 200 µl 2 M urea/50 mM NH4HCO3 breng 10 µl van het eiwitextract over naar een nieuwe eppendorf en verdun met MQ tot 100 µl voor de Bradford eiwitconcentratie bepaling → eiwitopbrengst = eiwitconcentratie (mg/ml) x 0.5 ml
Cellyse en extractie van membraaneiwitten: methode 2 (Tabel 1)
los de S. maltophilia celpellet op in 1 ml TMSE buffer (70 mM sucrose, 200 mM mannitol, 1 mM EDTA, PhosSTOP fosfatase inhibitor cocktail (Roche), Complete EDTA-free (Roche), 1 mM sodium orthovanadate), breng over naar een nieuwe 2 ml eppendorf soniceer 3 x 60s op ijs met 1 min rust ertussen (15% amplitude, 1s puls aan, 1s puls uit) centrifugeer voor 10 min aan 8000xg bij 4°C om de membraaneiwitten te pelleteren
64
Bijlagen
los de pellet opnieuw op in 1 ml TMSE buffer en centrifugeer voor 10 min aan 800xg los de pellet op in 500 µl chloroform en incubeer gedurende 30 min bij kamertemperatuur (licht schudden) voeg 500 µl methanol/water (50/50) toe laat hevig schudden gedurende 30 min centrifugeer aan 2000xg voor 1 min en verwijder de onderste chloroform laag voeg opnieuw 500 µl chloroform toe, vortex en centrifugeer aan 10 000xg voor 5 min en verwijder de onderste chloroform laag voeg 1500 µl ijskoude aceton (-20°C) toe aan de waterige en onoplosbare fase en incubeer gedurende minstens 1 uur bij -20°C centrifugeer gedurende 10 min aan 14000xg en verwijder het supernatant los de pellet op in 200 µl 2 M urea/50 mM NH4HCO3 breng 10 µl van het eiwitextract over naar een nieuwe eppendorf en verdun met MQ tot 100 µl voor de Bradford eiwitconcentratie bepaling → eiwitopbrengst = eiwitconcentratie (mg/ml) x 0.5 ml
Bradford eiwitconcentratie bepaling
bereid de BSA verdunningsreeks met 1/10 verdunde 2 M urea/50 mM NH4HCO3 (Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit (Thermo Scientific))
A B C D E F G H I
Buffer (µl)
BSA standaard (µl)
BSA concentratie (µg/ml)
0 125 325 175 325 325 325 400 400
300 stock 375 stock 325 stock 175 B 325 C 325 E 325 F 100 G 0
2000 1500 1000 750 500 250 125 25 0
pipetteer 10 µl van elke standaardverdunning en van elk onbekend staal (1/10 verdund) in de gepaste welletjes van de 96-well plaat voeg 300 µl Coomassie Plus Reagent toe aan elk welletje incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur meet de OD595 van elke standaardverdunning en van elk onbekend staal met de microplaat lezer (Model 680XR, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) plot de gemeten OD595-waarden van elke BSA standaardverdunning tegenover de BSA concentratie en gebruik de standaardcurve om de eiwitconcentratie van het onbekende staal te bepalen
65
Bijlagen Trypsinedigest
breng 25 µg (methode 1) of 100 µg eiwit (methode 2) over in een nieuwe eppendorf reduceer de eiwitten met 10 mM DTT (dithiothreitol) gedurende 30 min bij 60°C → maak een 200 mM DTT stock (30 mg/ml in MQ H2O) en verdun 1/20 in het eiwitstaal alkyleer de eiwitten met 20 mM IAA (iodoacetamide) gedurende 30 min bij kamertemperatuur in het donker → maak een 200 mM IAA stock (36 mg/ml in MQ H2O) en verdun 1/10 in het eiwitstaal verknip de eiwitten met 0.5 µg (methode 1) of 2 µg (methode 2) trypsine overnacht bij 37°C droog de oplossing uit in de SpeedVac los de peptiden op in 50 µl (methode 1) of 200 µl (methode 2) 0.1% HCOOH centrifugeer 10 min aan 16000xg breng het supernatant over in een standaard MS vial
66
Bijlagen 7.2.
Medium, solventen, buffers en gels Luria Bertani (LB) medium (1 liter)
10 g A-trypton, 5 g NaCl, 5 g gist extract aanvullen met MQ H2O tot 1 liter autoclaveren
SDS sample buffer Samenstelling 2% SDS 0.01% broomfenol blauw 1.32 M glycerol 60 mM Tris-HCl pH 8
Hoeveelheid in 50 ml 1g 5 mg 5 ml 3 ml 1M Tris-HCl pH 8 stock
leng aan met MQ H2O tot 50 ml voeg 1% 2-mercaptoethanol toe voor gebruik
TMSE buffer Samenstelling 200 mM mannitol 70 mM sucrose 1 mM EDTA 200 mM Tris-HCl pH 8 Complete ULTRA mini protease inhibitor cocktail (Roche)
Hoeveelheid in 10 ml 0.364 g 0.238 g 3.7 mg 2 ml 1M Tris-HCl pH 8 stock 1 tablet (2x stock: 1 tablet in 5 ml 50 mM NH4HCO3)
In geval van fosforylatie analyse: PhosSTOP phosphatase inhibitor 1 tablet cocktail (Roche) (10x stock: 1 tablet in 1 ml 50 mM NH4HCO3) 1 mM sodium orthovanadate 100 µl 50 mM Tris-HCL pH 8 met protease inhibitor mengsel Samenstelling 1 M Tris-HCl pH 8 Complete EDTA-free (Roche)
Hoeveelheid in 10 ml 500 µl 400 μl (25x stock: 1 tablet in 2 ml MQ)
67
Bijlagen 0.1 M Na2CO3 pH 11 Samenstelling Na2CO3 (anhydrous)
Hoeveelheid in 5 ml 0.053 g
50 mM NH4HCO3 Samenstelling NH4HCO3
Hoeveelheid in 50 ml 0.197 g
SDS-PAGE zure fixatie-oplossing
50% (v/v) methanol 10% (v/v) azijnzuur
SDS-PAGE neutrale fixatie-oplossing
50% (v/v) ethanol 50% (v/v) MQ H2O
SDS-PAGE running buffer Samenstelling 250 mM Tris base 1.92 M Glycine 1% SDS
Hoeveelheid in 1 liter 30.2 g 144 g 10 g
- aanlengen met MQ H2O tot 1 liter SDS-PAGE stacking gel Samenstelling MQ H2O 0.5 M Tris pH 6.8 + 0.1% SDS Acrylamide (30%) TEMED APS (10%)
Hoeveelheid voor 2 kleine gels 3.07 ml 1.26 ml 0.666 ml 10 µl 50 µl
68
Bijlagen SDS-PAGE 12.5% resolving gel Samenstelling MQ H2O 1.5 M Tris pH 8.8 + 0.4% SDS Acrylamide (30%) TEMED APS (10%)
Hoeveelheid voor 2 kleine gels 5 ml 3.75 ml 6.25 ml 10 µl 100 µl
1.5 M Tris pH 8.8 + 0.4% SDS Samenstelling SDS Tris base
Hoeveelheid in 100 ml 0.4 g 18.171 g
- aanlengen met MQ H2O tot 100 ml, aanzuren met HCOOH tot pH 8.8 0.5 M Tris pH 6.8 + 0.1% SDS Samenstelling SDS Tris base
Hoeveelheid in 100 ml 0.1 g 6.057 g
- aanlengen met MQ H2O tot 100 ml, aanzuren met HCOOH tot pH 6.8 Coomassie Brilliant Blue G250 Samenstelling 34% (v/v) methanol 3% (w/v) H3PO4 17% (w/v) (NH4)2SO4 0.2% (w/v) CBB-G250
Hoeveelheid in 2 liter 680 ml 70 ml 340 g 4g
leng aan met MQ H2O tot 2 liter overnacht roeren HILIC solvent A1 Samenstelling 63% 2-PrOH 22.5% ACN 0.5% hexafluoro-isopropanol 20 mM ammonium formate
Hoeveelheid in 200 ml 126 ml 45 ml 1 ml 400 μl
69
Bijlagen - aanlengen met MQ water tot 200 ml, HCOOH tot pH 3.7 HILIC solvent B1 Samenstelling 30% 2-PrOH 0.5% hexafluoro-isopropanol 20 mM ammonium formate
Hoeveelheid in 200 ml 60 ml 1 ml 400 μl
- aanlengen met MQ water tot 200 ml, HCOOH tot pH 3.7 HILIC solvent A2 Samenstelling 45% 2-PrOH 40% ACN 20 mM ammonium formate
Hoeveelheid in 200 ml 90 ml 80 ml 400 μl
- aanlengen met MQ water tot 200 ml, HCOOH tot pH 3.7 HILIC solvent B2 Samenstelling 30% 2-PrOH 20 mM ammonium formate
Hoeveelheid in 200 ml 60 ml 400 μl
- aanlengen met MQ water tot 200 ml, HCOOH tot pH 3.7 2 M urea/50 mM NH4HCO3 Samenstelling Urea NH4HCO3
Hoeveelheid in 10 ml 1.2 g 0.039 g
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 2 M urea/250 mM NH4HCO3 Samenstelling Urea NH4HCO3
Hoeveelheid in 10 ml 1.2 g 0.197 g
- aanlengen met MQ water tot 10 ml
70
Bijlagen 2 M urea/50 mM NH4HCO3/30% methanol Samenstelling Urea NH4HCO3 Methanol absoluut
Hoeveelheid in 10 ml 1.2 g 0.039 g 3 ml
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 2 M urea/50 mM NH4HCO3/60% methanol Samenstelling Urea NH4HCO3 Methanol absoluut
Hoeveelheid in 10 ml 1.2 g 0.039 g 6 ml
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 50 mM NH4HCO3/30% methanol Samenstelling NH4HCO3 Methanol absoluut
Hoeveelheid in 10 ml 0.039 g 3 ml
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 50 mM NH4HCO3/60% methanol Samenstelling NH4HCO3 Methanol absoluut
Hoeveelheid in 10 ml 0.039 g 6 ml
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 50 mM NH4HCO3/0.1% SDS Samenstelling NH4HCO3 SDS
Hoeveelheid in 10 ml 0.039 g 1g
- aanlengen met MQ water tot 10 ml
71
Bijlagen 50 mM NH4HCO3/30% methanol/0.1% SDS Samenstelling NH4HCO3 Methanol absoluut SDS
Hoeveelheid in 10 ml 0.039 g 3 ml 1g
- aanlengen met MQ water tot 10 ml 50 mM NH4HCO3/60% methanol/0.1% SDS Samenstelling NH4HCO3 Methanol absoluut SDS
Hoeveelheid in 10 ml 0.039 g 6 ml 1g
- aanlengen met MQ water tot 10 ml
72
Bijlagen 7.3.
Resultaten
SDS-PAGE gels
Figuur 18. Totaal eiwitbeeld van membraaneiwitten geïsoleerd uit S. maltophilia cellen, gestimuleerd met imipenem op verschillende tijdstippen. S. maltophilia celculturen werden gedurende 0, 15, 30 of 60 minuten gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem (respectievelijk T0, T15, T30 en T60). Membraaneiwitten, geëxtraheerd met de methode van Mirza et al., werden gescheiden op een 12.5% polyacrylamide gel. Respectievelijk 5 en 10 µl van de extractie werd geladen. Om een totaal eiwitbeeld te verkrijgen, werd de gel gekleurd met Coomassie Brilliant Blue G250. De eiwitten werden gevisualiseerd met de GS-800 densitometer scanner (Bio-Rad). M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards.
A.
B.
Figuur 19. Veranderingen in fosforylatiegraad van membraaneiwitten geïsoleerd uit S. maltophilia cellen, gestimuleerd met imipenem op verschillende tijdstippen. S. maltophilia celculturen werden gedurende 0, 15 of 30 minuten gestimuleerd met 25 µg/ml imipenem (respectievelijk T0, T15 en T30). Membraaneiwitten, geëxtraheerd met de methode van Mirza et al., werden gescheiden op een precast 12% polyacrylamide gel (Amersham ECL Gel 12%, GE Healthcare). Gefosforyleerde eiwitten werden gedetecteerd met behulp van de ‘ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain’ (Invitrogen) en gevisualiseerd met de Pharos FX scanner (Bio-Rad). (A) Respectievelijk 20, 10 en 5 µl van de extractie werd geladen. M = Peppermint Stick Phosphoprotein Molecular Weight Standards (Invitrogen). (B) 10 µl van de extractie werd geladen. M = Precision Plus Protein™ Unstained Standards.
73
Bijlagen NetPhosBac 1.0 resultaten Eiwit: 60 kDa Chaperonin >sp_B2FIU9_CH60_STRMK 549 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# sp_B2FIU9_CH60_STRMK 14 S EDARSRMVR 0.511 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 30 T AVKATLGPK 0.210 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 43 S VLEKSFGAP 0.615 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 48 T FGAPTITKD 0.167 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 50 T APTITKDGV 0.198 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 55 S KDGVSVAKE 0.478 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 79 S KEVASRTND 0.288 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 81 T VASRTNDDA 0.219 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 89 T AGDGTTTAT 0.307 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 90 T GDGTTTATV 0.264 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 91 T DGTTTATVL 0.242 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 93 T TTTATVLAQ 0.262 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 125 S DKAVSAAVA 0.214 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 135 S LKNISKPTA 0.577 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 138 T ISKPTADDK 0.279 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 149 T AQVGTISAN 0.231 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 151 S VGTISANSD 0.374 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 154 S ISANSDESI 0.193 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 157 S NSDESIGQI 0.334 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 176 T EGVITVEEG 0.297 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 181 S VEEGSGLDN 0.260 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 201 S RGYLSPYFI 0.478 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 210 S NNQQSQTAD 0.359 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 212 T QQSQTADLD 0.186 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 228 S DKKISNVRD 0.615 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 261 T EALATLVVN 0.274 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 266 T LVVNTIRGI 0.429 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 296 T MAVLTGGTV 0.365 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 299 T LTGGTVISE 0.353 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 302 S GTVISEEVG 0.426 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 308 S EVGLSLEKA 0.437 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 313 T LEKATIKDL 0.195 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 326 S KVQVSKENT 0.476 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 330 T SKENTTIID 0.187 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 331 T KENTTIIDG 0.303 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 351 T AQIKTQIQD 0.315 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 356 T QIQDTSSDY 0.407 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 357 S IQDTSSDYD 0.329 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 358 S QDTSSDYDR 0.534 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 384 S KVGASTEIE 0.477 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 385 T VGASTEIEM 0.372 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 403 T ALHATRAAV 0.199 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 424 T VRAITALAG 0.405 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 463 S GDEPSVIIN 0.271 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 473 T VKEGTGSFG 0.177 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 475 S EGTGSFGYN 0.672 main Y # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 482 T YNAATGEFG 0.130 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 497 T ILDPTKVTR 0.377 main . # sp_B2FIU9_CH60_STRMK 500 T PTKVTRSAL 0.199 main .
74
Bijlagen # # # # #
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
sp_B2FIU9_CH60_STRMK sp_B2FIU9_CH60_STRMK sp_B2FIU9_CH60_STRMK sp_B2FIU9_CH60_STRMK
502 509 516 517
S S T T
KVTRSALQN QNAASIAGL GLMITTEAM LMITTEAMV
0.483 0.276 0.176 0.169
main main main main
MAAKDIRFGEDARSRMVRGVNVLANAVKATLGPKGRNVVLEKSFGAPTIT KDGVSVAKEIELADKFENMGAQMVKEVASRTNDDAGDGTTTATVLAQALI REGAKAVAAGMNPMDLKRGIDKAVSAAVAELKNISKPTADDKAIAQVGTI SANSDESIGQIIADAMKEVGKEGVITVEEGSGLDNELDVVKGMQFDRGYL SPYFINNQQSQTADLDDPFILLHDKKISNVRDLLPVLEGVAKAGKPLLIV AEEVEGEALATLVVNTIRGIVKVVAVKAPGFGDRRKAMLEDMAVLTGGTV ISEEVGLSLEKATIKDLGRAKKVQVSKENTTIIDGVGDKANVDARVAQIK TQIQDTSSDYDREKLQERVAKLAGGVAVIKVGASTEIEMKEKKDRVDDAL HATRAAVEEGVVPGGGVALVRAITALAGLKGANEDQNHGIQIALRAMEAP LREIVANAGDEPSVIINKVKEGTGSFGYNAATGEFGDMLQFGILDPTKVT RSALQNAASIAGLMITTEAMVAEAPKKDEPAMGGAGGMGGMGGMGGMDF .............S............................S....... .................................................. ..................................S............... .................................................. ...........................S...................... .................................................. .................................................. .......S.......................................... .................................................. ........................S......................... .................................................
. . . . # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Eiwit: ATP synthase subunit beta >sp_B2FHY8_ATPB_STRMK 468 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# sp_B2FHY8_ATPB_STRMK 2 S ---MSQGKI 0.224 main . # sp_B2FHY8_ATPB_STRMK 22 S FPRESVPKV 0.554 main Y # sp_B2FHY8_ATPB_STRMK 35 T KVENTEITL 0.184 main .
75
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK sp_B2FHY8_ATPB_STRMK
38 52 57 58 70 75 82 103 105 114 119 122 127 155 170 173 182 195 221 224 253 257 260 268 275 288 289 290 294 296 297 309 312 315 316 322 323 325 327 329 332 344 345 346 361 368 388 396 406 416 418 428
T T S T T S T S S S S T T T S S T S T T T T S S T T S T S T S T S T T S T T S S S S T S T T S S S T S T
NTEITLEVQ GVVRTIALG IALGSTDGL ALGSTDGLK VAVNTGRGI GRGISVPVG VGAGTLGRI PVAASDSWE AASDSWEIH RAAPSYEDQ YEDQSPATE QSPATELLE ELLETGIKV GVGKTVNMM AKAHSGLSV HSGLSVFAG VGERTREGN EMKDSNVLD RVALTGLTM LTGLTMAEY IYRYTLAGT TLAGTEVSA GTEVSALLG GRMPSAVGY GYQPTLAEE QERITSTKN ERITSTKNG RITSTKNGS TKNGSITSI NGSITSIQA GSITSIQAV ADDLTDPSP LTDPSPATT PSPATTFAH SPATTFAHL AHLDSTVTL HLDSTVTLS DSTVTLSRS TVTLSRSIA TLSRSIASL RSIASLGIY DPLDSTSRQ PLDSTSRQM LDSTSRQMD EHYDTAQRV RVQQTLQKY MDELSEEDK KQAVSRARK ERFFSQPFH AEVFTGSPG VFTGSPGKY PLKDTIRGF
0.103 0.218 0.247 0.431 0.239 0.609 0.279 0.295 0.401 0.257 0.344 0.261 0.188 0.229 0.317 0.576 0.290 0.479 0.236 0.176 0.174 0.219 0.224 0.438 0.177 0.270 0.382 0.399 0.351 0.459 0.494 0.185 0.296 0.239 0.176 0.573 0.383 0.273 0.420 0.458 0.423 0.368 0.318 0.314 0.288 0.130 0.171 0.457 0.687 0.219 0.496 0.369
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MSQGKIVQIIGAVVDVEFPRESVPKVYDALKVENTEITLEVQQQLGDGVV RTIALGSTDGLKRNLVAVNTGRGISVPVGAGTLGRIMDVLGRPIDEAGPV AASDSWEIHRAAPSYEDQSPATELLETGIKVIDLMCPFAKGGKVGLFGGA GVGKTVNMMELINNIAKAHSGLSVFAGVGERTREGNDFYHEMKDSNVLDK VAMVYGQMNEPPGNRLRVALTGLTMAEYFRDEKDENGKGKDVLLFVDNIY RYTLAGTEVSALLGRMPSAVGYQPTLAEEMGVLQERITSTKNGSITSIQA VYVPADDLTDPSPATTFAHLDSTVTLSRSIASLGIYPAVDPLDSTSRQMD
# # # # # # #
. . . . . Y . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . . . . . . . Y . . . 50 100 150 200 250 300 350
76
Bijlagen
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
PLVIGHEHYDTAQRVQQTLQKYKELKDIIAILGMDELSEEDKQAVSRARK IERFFSQPFHVAEVFTGSPGKYVPLKDTIRGFKAIVDGEYDHLPEQAFYM VGGIEEAVEKAKKMAEKA .....................S............................ ........................S......................... .................................................. ......................S........................... .................................................. .................................................. .....................S............................ .................................................. .....S............................................ ..................
# # # # # # # # # # # #
400 450 500 50 100 150 200 250 300 350 400 450
Eiwit: Putative Elongation factor Tu seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FQ31_B2FQ31_STRMK" to "tr_B2FQ31_B2FQ31_STR" >tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 396 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 9 T KFERTKPHV 0.492 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 17 T VNVGTIGHV 0.322 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 26 T DHGKTTLTA 0.489 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 27 T HGKTTLTAA 0.340 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 29 T KTTLTAALT 0.252 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 33 T TAALTKIGA 0.176 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 48 S FKDYSSIDA 0.411 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 49 S KDYSSIDAA 0.425 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 62 T ARGITISTA 0.528 main Y # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 64 S GITISTAHV 0.317 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 65 T ITISTAHVE 0.402 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 72 S VEYESPVRH 0.436 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 94 T KNMITGAAQ 0.196 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 107 S ILVCSAADG 0.270 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 116 T PMPQTREHI 0.153 main . # tr_B2FQ31_B2FQ31_STR 123 S HILLSRQVG 0.459 main .
77
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR tr_B2FQ31_B2FQ31_STR
159 168 174 184 200 222 224 228 231 256 257 259 284 300 305 315 323 337 338 341 364 385 392
S T S S S S S T T T T T T S T S T T T T T T S
RELLSKYDF PGDDTPIIA IIAGSARLA EGDQSDIGV DALDSWIPE EDVFSISGR VFSISGRGT SGRGTVVTG GTVVTGRIE PVQKTTVTG VQKTTVTGV KTTVTGVEM LLRGTKRDD AKPGSIKPH IKPHTKFEG VYVLSKDEG GGRHTPFFN FYFRTTDIT YFRTTDITG TTDITGAAA KMVVTLINP EGGRTVGAG AGVVSKIIE
0.611 0.247 0.735 0.389 0.564 0.434 0.788 0.483 0.323 0.325 0.246 0.297 0.234 0.436 0.207 0.367 0.269 0.197 0.219 0.275 0.296 0.749 0.487
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MAKGKFERTKPHVNVGTIGHVDHGKTTLTAALTKIGAERFGGEFKDYSSI DAAPEEKARGITISTAHVEYESPVRHYAHVDCPGHADYVKNMITGAAQMD GAILVCSAADGPMPQTREHILLSRQVGVPYIVVFLNKADMVDDAELLELV EMEVRELLSKYDFPGDDTPIIAGSARLALEGDQSDIGVPAILKLVDALDS WIPEPERAIDKPFLMPVEDVFSISGRGTVVTGRIERGVIKVGDEIEIVGI RPVQKTTVTGVEMFRKLLDQGQAGDNAGLLLRGTKRDDVERGQVLAKPGS IKPHTKFEGEVYVLSKDEGGRHTPFFNGYRPQFYFRTTDITGAAALPEGV EMVMPGDNVKMVVTLINPVAMDEGLRFAIREGGRTVGAGVVSKIIE .................................................. ...........T...................................... .................................................. ........S..............S.........................S .......................S.......................... .................................................. .................................................. ..................................T...........
# # # # # # # # # # # # # # #
Y . Y . Y . Y . . . . . . . . . . . . . . Y . 50 100 150 200 250 300 350 400 50 100 150 200 250 300 350
78
Bijlagen
Eiwit: Putative H-NS histone family trans-acting regulatory protein seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FMR4_B2FMR4_STRMK" to "tr_B2FMR4_B2FMR4_STR" >tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 127 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 2 S ---MSIDLT 0.329 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 6 T SIDLTGLSA 0.160 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 9 S LTGLSAREL 0.580 main Y # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 19 T ALIRTAKKQ 0.145 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 25 T KKQQTIVAK 0.633 main Y # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 34 T RRPITKVRA 0.500 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 41 T RAQLTKLAK 0.379 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 46 T KLAKTEGYT 0.206 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 50 T TEGYTIEEL 0.258 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 74 S AKAPSKTAG 0.389 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 76 T APSKTAGRK 0.371 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 97 T NPKETWTGR 0.158 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 99 T KETWTGRGK 0.354 main . # tr_B2FMR4_B2FMR4_STR 112 T MAELTAKGN 0.105 main . # MSIDLTGLSARELGALIRTAKKQQTIVAKRRPITKVRAQLTKLAKTEGYT # 50 IEELFGGAPAPRARKAAPAAKAPSKTAGRKLGKVAPKYRNPANPKETWTG # 100 RGKQPRWMAELTAKGNKKPEDFLIKKA # 150 %1 ........S...............T......................... # 50 %1 .................................................. # 100 %1 ...........................
Eiwit: Putative biopolymer transport exbB protein seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FT88_B2FT88_STRMK" to "tr_B2FT88_B2FT88_STR" >tr_B2FT88_B2FT88_STR 253 amino acids
79
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
%1 %1 %1 %1 %1 %1
netphosbac-1.0a prediction results Sequence # x Context Score Kinase Answer ------------------------------------------------------------------tr_B2FT88_B2FT88_STR 16 S GGNPSNALS 0.340 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 20 S SNALSQMGF 0.249 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 32 T IHEMTTKPG 0.150 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 33 T HEMTTKPGD 0.165 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 41 S DFAVSWVVL 0.389 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 47 T VVLLTLIAM 0.405 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 52 S LIAMSAMSW 0.186 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 55 S MSAMSWYWT 0.189 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 59 T SWYWTVINI 0.186 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 67 T IFRATRLKS 0.213 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 71 S TRLKSAADR 0.634 main Y tr_B2FT88_B2FT88_STR 78 S DRVVSLFWD 0.391 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 83 T LFWDTPNAQ 0.263 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 99 S EQPASEPFS 0.327 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 103 S SEPFSKIAL 0.346 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 124 T EGGATGGVG 0.257 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 132 S GENLSRSEF 0.614 main Y tr_B2FT88_B2FT88_STR 134 S NLSRSEFVD 0.246 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 146 T RQAVTRESN 0.264 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 149 S VTRESNKLQ 0.298 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 154 S NKLQSGMTL 0.434 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 157 T QSGMTLLAT 0.296 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 161 T TLLATVGAT 0.304 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 165 T TVGATAPFV 0.480 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 174 T GLLGTVWGI 0.158 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 188 T KIGATGSAS 0.414 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 190 S GATGSASID 0.303 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 192 S TGSASIDAV 0.495 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 207 T ALIMTAIGL 0.124 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 225 S FNFFSKINS 0.367 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 229 S SKINSATIS 0.399 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 231 T INSATISKF 0.245 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 233 S SATISKFDT 0.266 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 237 T SKFDTFAHD 0.308 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 248 T DFFATGSRV 0.301 main . tr_B2FT88_B2FT88_STR 250 S FATGSRVR0.533 main Y MLQEIFIAAAAGGNPSNALSQMGFEHLIHEMTTKPGDFAVSWVVLLTLIA MSAMSWYWTVINIFRATRLKSAADRVVSLFWDTPNAQDAIRAMEEQPASE PFSKIALDAAQAAAHHQRAEGGATGGVGENLSRSEFVDRALRQAVTRESN KLQSGMTLLATVGATAPFVGLLGTVWGIYGALIKIGATGSASIDAVAGPV GEALIMTAIGLFVAIPAVFAFNFFSKINSATISKFDTFAHDLHDFFATGS RVR .................................................. ....................S............................. ...............................S.................. .................................................. .................................................S ...
# # # # # # # # # # #
50 100 150 200 250 300 50 100 150 200 250
80
Bijlagen
Eiwit: 30S ribosomal protein S7 >sp_B2FQ41_RS7_STRMK 157 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# sp_B2FQ41_RS7_STRMK 2 S ---MSRKGN 0.266 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 7 T RKGNTPQRS 0.518 main Y # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 11 S TPQRSVLPD 0.423 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 20 S PKHGSETIA 0.355 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 22 T HGSETIARF 0.295 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 33 S MVMQSGKKS 0.166 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 37 S SGKKSVAEK 0.484 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 51 T MDVITEKNS 0.120 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 55 S TEKNSSANA 0.253 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 56 S EKNSSANAI 0.641 main Y # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 78 S VEVKSRRVG 0.457 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 85 T VGGATYQVP 0.432 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 94 S VEVRSSRKM 0.701 main Y # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 95 S EVRSSRKMA 0.435 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 108 S WLIDSARKR 0.566 main Y # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 116 T RGENTMPKK 0.303 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 129 S LIDASENRG 0.317 main . # sp_B2FQ41_RS7_STRMK 142 T KREETHRMA 0.245 main . # MSRKGNTPQRSVLPDPKHGSETIARFINMVMQSGKKSVAEKIVYGAMDVI # 50 TEKNSSANAIELVQKALDNVAPAVEVKSRRVGGATYQVPVEVRSSRKMAL # 100 AMRWLIDSARKRGENTMPKKLAAELIDASENRGGAIKKREETHRMAEANK # 150 AFAHYRW # 200 %1 ......T........................................... # 50 %1 .....S.....................................S...... # 100 %1 .......S.......................................... # 150 %1 .......
81
Bijlagen
Eiwit: Putative heat shock chaperone ClpB seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STRMK" to "tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR" >tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 861 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 7 T MDKLTSRFQ 0.152 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 8 S DKLTSRFQQ 0.415 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 19 S ADAQSLAVG 0.219 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 27 S GRDNSIIEP 0.606 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 36 S VHLFSALLD 0.508 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 45 S QQGGSTRPL 0.640 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 46 T QGGSTRPLL 0.690 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 65 T RERLTEALD 0.323 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 75 S LPKVSGQAG 0.430 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 82 S AGNVSMGND 0.237 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 94 T LLNQTDKLA 0.185 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 108 S AFIASEWFV 0.528 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 121 T DDGGTLGMA 0.294 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 134 T GADKTRLQA 0.215 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 151 S ENVQSENAE 0.436 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 165 T LEKYTIDLT 0.301 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 169 T TIDLTARAE 0.549 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 174 S ARAESGKLD 0.255 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 190 T EIRRTIQVL 0.301 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 198 T LQRRTKNNP 0.398 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 213 T GVGKTAIVE 0.502 main Y # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 239 S KRVLSLDMG 0.414 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 282 T DELHTMVGA 0.281 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 314 T CIGATTLDE 0.279 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 315 T IGATTLDEY 0.388 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 342 S VGEPSVEDT 0.467 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 346 T SVEDTIAIL 0.236 main . # tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR 366 T GVEITDPAI 0.234 main .
82
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
%1 %1 %1
tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR tr_B2FRQ4_B2FRQ4_STR
375 377 382 399 407 437 456 464 473 499 532 541 544 581 587 592 600 607 612 617 625 635 642 663 672 700 706 712 717 718 722 729 733 738 799 826 838 846
T S T S S S S S T S T S T S S S S T T S S S S T S T T T T S S S S T S S S T
VAAATLSNR AATLSNRYI NRYITDRQL DEAASRLRM MEIDSKPEE KDEASRQRL EREFSDLNE EIWKSEKAA LQGATKIKE FAKMSEIQY QDRVTDEEI AEVVSRWTG VSRWTGIPV IKVVSDAVR AVRRSRAGL RAGLSDPNR RPAGSFLFL FLGPTGVGK GVGKTELCK ELCKSLAEF FLFDSADAM RIDMSEFME MEKHSVARL GGYLTEAVR RRPYSLILL DGRLTDGQG GQGRTVDFR DFRNTVIVM VIVMTSNLG IVMTSNLGS SNLGSHQIQ IQDMSADDS SADDSPEAY PEAYTQMKA KLAVSDAAF RAIQSQLEN QQILSGAFV VNGDTIEVG
0.192 0.335 0.214 0.248 0.650 0.324 0.262 0.512 0.270 0.267 0.271 0.532 0.585 0.635 0.397 0.626 0.265 0.400 0.234 0.545 0.514 0.230 0.468 0.378 0.543 0.285 0.454 0.501 0.170 0.447 0.289 0.225 0.338 0.115 0.357 0.400 0.418 0.411
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MRMDKLTSRFQQALADAQSLAVGRDNSIIEPVHLFSALLDQQGGSTRPLL AQAGVNVPVLRERLTEALDALPKVSGQAGNVSMGNDLGRLLNQTDKLAQQ HGDAFIASEWFVLAALDDGGTLGMALRAAGADKTRLQAAIDKLRGGENVQ SENAEEQRQALEKYTIDLTARAESGKLDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKN NPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINDEVPEGLRGKRVLSLDMGALIAGAK FRGEFEERLKGVLNDLAKNEGQIILFIDELHTMVGAGKADGAMDAGNMLK PALARGELHCIGATTLDEYRKYIEKDAALERRFQKVFVGEPSVEDTIAIL RGLKEKYAVHHGVEITDPAIVAAATLSNRYITDRQLPDKAIDLMDEAASR LRMEIDSKPEELDRLERRVIQLKIQREMLKKEKDEASRQRLADLENDIDG LEREFSDLNEIWKSEKAALQGATKIKEQVEQAKLELEAAQRRQDFAKMSE IQYGLLPQLEKQLAAAQEAEHKDFKLVQDRVTDEEIAEVVSRWTGIPVNK MLEGERDKLLRMEEVLHNRVVGQEEAIKVVSDAVRRSRAGLSDPNRPAGS FLFLGPTGVGKTELCKSLAEFLFDSADAMIRIDMSEFMEKHSVARLIGAP PGYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSLILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLT DGQGRTVDFRNTVIVMTSNLGSHQIQDMSADDSPEAYTQMKAAVMGVVQA HFRPEFINRLDDIVVFHPLDKQQIKQIARIQMRGLEKRLAERGLKLAVSD AAFDLLGNVGFDPVYGARPLKRAIQSQLENPLAQQILSGAFVNGDTIEVG NDGGRLVFAKA ..........................S........S........ST.... .................................................. .......S..........................................
# # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
. . . . Y . . Y . . . Y Y Y . Y . . . Y Y . . . Y . . Y . . . . . . . . . . 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 50 100 150
83
Bijlagen %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
..................T............................... ............T..................................... .................................................. .................................................. .................................................. ......S........................................... .............S.................................... ........................................S..T...... ..............................S..........S........ ................S.......S......................... .....................S............................ ...........T...................................... .................................................. .................................................. ...........
# # # # # # # # # # # # # #
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850
Eiwit: Putative TonB dependent protein, possible siderophore receptor seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FTR5_B2FTR5_STRMK" to "tr_B2FTR5_B2FTR5_STR" >tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 1040 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 3 S --MPSTASA 0.224 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 4 T -MPSTASAC 0.356 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 6 S PSTASACHR 0.396 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 13 T HRRATALAL 0.374 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 20 S ALAVSTALL 0.275 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 21 T LAVSTALLP 0.265 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 46 T VRQYTIPEQ 0.340 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 71 S VVFRSDLVD 0.326 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 79 S DGRRSSAVK 0.446 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 80 S GRRSSAVKG 0.477 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 87 S KGEYSQMQA 0.360 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 99 S LLRGSGVRA 0.467 main . # tr_B2FTR5_B2FTR5_STR 110 T GMDGTWSLR 0.317 main .
84
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR
112 128 130 139 159 160 163 174 188 194 213 222 231 258 268 290 291 303 309 317 320 326 333 335 374 376 379 399 400 414 415 416 420 426 438 442 444 452 456 468 472 486 498 500 502 504 506 525 531 541 546 553 554 558 570 577 578 598 608 616
S T T S T T S S S S S T S S T S S T T S S T S S S T S T T T S S S S T T S S S S S S T T S T S S T T S S T T S T T T T S
DGTWSLRAA GVRVTETLD RVTETLDVA GRLQSEGGE ALDLTTAYS LDLTTAYSG TTAYSGRDR RYRGSNPAD VGVFSGDAR DARNSGALD RVPVSIDGG EQALTVWRG YNGVSNRNY RDVHSGIGG LVIKTIDVD KIEGSSNAV IEGSSNAVA PRLHTGEDY EDYRTVPGF FPQGSPNSP GSPNSPYDD YDDRTLVVP VPVKSRSGN VKSRSGNNP GNYFSGTQG YFSGTQGSA GTQGSAYYE IDYITTLAR DYITTLARY EVPNTSSEQ VPNTSSEQE PNTSSEQES SEQESWLVK LVKGSWQIN QLKATWRRT TWRRTLSHY RRTLSHYGE EIMPSRILS SRILSAPDY QWPLSRVDS SRVDSDAWN QPAGSRWLD NLWRTETDS WRTETDSDT TETDSDTYS TDSDTYSAG SDTYSAGGF NPDASPILR ILRNTALAN RNDRTGLIL GLILSNRFA FALHSTLDL ALHSTLDLT TLDLTVGGN EKLGSRDPY PYFGTTDGW YFGTTDGWR EGYLTLEWR VDFLTLNAG GVRYSRYWA
0.661 0.181 0.276 0.538 0.118 0.239 0.446 0.745 0.761 0.293 0.216 0.161 0.611 0.754 0.256 0.639 0.614 0.291 0.426 0.247 0.148 0.399 0.619 0.542 0.282 0.132 0.299 0.328 0.252 0.135 0.576 0.563 0.402 0.287 0.393 0.321 0.754 0.594 0.585 0.464 0.423 0.437 0.148 0.187 0.482 0.345 0.582 0.419 0.434 0.197 0.557 0.338 0.306 0.246 0.354 0.159 0.470 0.458 0.445 0.302
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
Y . . Y . . . Y Y . . . Y Y . Y Y . . . . . Y Y . . . . . . Y Y . . . . Y Y Y . . . . . . . Y . . . Y . . . . . . . . .
85
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR tr_B2FTR5_B2FTR5_STR
644 681 691 698 710 734 743 746 754 764 766 768 772 782 789 793 794 798 800 824 830 844 863 880 885 887 896 897 923 930 934 937 948 970 973 983 988 989 1003 1009 1021 1023 1024 1031 1037
T S T T T S S S S T S T S S S S T S S S T T T T T T S T T S S T S S S T T T S S T S T T T
EAQYTVNEL FIDDSIRAL APYETPRPV PVRYTRPWL DGNYTRAGN VFAGSDQVC NIGNSVQSQ NSVQSQPVD DGRNSRRRD AWLPTFSAT LPTFSATAH TFSATAHLS TAHLSPAAR YVRYSEAVR VRFPSMFES SMFESTIAF MFESTIAFS TIAFSGSLN AFSGSLNPL VHNLSALFG LFGNTADAD YVHKTRDVI IDKQTIRGI RRFFTDLGI DLGITRTLE GITRTLENE VCDESTAVL CDESTAVLL GYLLTQAIP IPRLSINGS SINGSLGTR GSLGTRLFD LELGSRIVH DRLLSGGSG LSGGSGLLW NVPFTWGNI WGNITTVDA GNITTVDAY NEHASVELV ELVGSNLGN VDPATRSTL PATRSTLPA ATRSTLPAP APGRTLKLG KLGVTARF-
0.193 0.736 0.283 0.262 0.195 0.353 0.510 0.312 0.584 0.327 0.726 0.334 0.511 0.469 0.415 0.423 0.133 0.545 0.407 0.422 0.407 0.193 0.239 0.176 0.353 0.463 0.261 0.474 0.159 0.497 0.782 0.109 0.543 0.580 0.434 0.128 0.284 0.422 0.640 0.367 0.193 0.336 0.432 0.366 0.455
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MPSTASACHRRATALALAVSTALLPLAWVPAVQAQPAIVAPVRQYTIPEQ PLADAVRAFGRQADVQVVFRSDLVDGRRSSAVKGEYSQMQALQQLLRGSG VRAQRGMDGTWSLRAAAEAGEGEGVRVTETLDVAGRLQSEGGEARDRRGY DDVFALDLTTAYSGRDRVERYRGSNPADVVKDLVGVFSGDARNSGALDVN IRGIQGPGRVPVSIDGGEQALTVWRGYNGVSNRNYIDPNLIGGIQVIKGP GLVRDVHSGIGGALVIKTIDVDDIVAAGERFGGELKIEGSSNAVAPRLPR LHTGEDYRTVPGFPQGSPNSPYDDRTLVVPVKSRSGNNPFDGEDQAWRLA LGVRGGNVDLMAAYAWRKRGNYFSGTQGSAYYEQDRREQFEYQGIDYITT LARYFKPGDEVPNTSSEQESWLVKGSWQINDDQQLKATWRRTLSHYGEIM PSRILSAPDYGRIQWPLSRVDSDAWNLEYRFQPAGSRWLDLYANLWRTET DSDTYSAGGFPNFAVGNPAWNPDASPILRNTALANARNDRTGLILSNRFA LHSTLDLTVGGNWQYEKLGSRDPYFGTTDGWRMFPRAGRRQEGEGYLTLE WRPVDFLTLNAGVRYSRYWAFDDFLEAHPELLNKGVGGKEAQYTVNELPP RPANLQARIDALEARRAVWEKRGMGWFIDDSIRALLAPYETPRPVRYTRP
# # # # # # # # # # # # # #
. Y . . . . Y . Y . Y . Y . . . . Y . . . . . . . . . . . . Y . Y Y . . . . Y . . . . . . 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
86
Bijlagen
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
WLPDADGNYTRAGNPCLNGEVAAVPGVQPVFAGSDQVCNIGNSVQSQPVD GRNSRRRDHAWLPTFSATAHLSPAARAYVRYSEAVRFPSMFESTIAFSGS LNPLHALKPEHAYNYEVGYVHNLSALFGNTADADVKLAYYVHKTRDVIER DGNFLFDNIDKQTIRGIELQARFDNRRFFTDLGITRTLENEVCDESTAVL LDANRGLVPNCVQDGFVGGYLLTQAIPRLSINGSLGTRLFDERLELGSRI VHYQRHENPDLQAYRDRLLSGGSGLLWQNVPFTWGNITTVDAYARWRFNE HASVELVGSNLGNRYYVDPATRSTLPAPGRTLKLGVTARF .................................................. .................................................. ...........S..........................S........... .......................S.............S............ ..............................S................... .......S...............................SS......... ................................S.S............... .................................................. ..............SS...........................S...... .S...S............................................ .....S.......................................S.... .................................................. .................................................. ..............................S................... ..........................................S....... ...S...........S.....S.........................S.. .................................................. .................................................. .................................S.............S.. ...................S.............................. ..S.....................................
# # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
750 800 850 900 950 1000 1050 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
Eiwit: Putative trans-membrane GGDEF signaling protein seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FP65_B2FP65_STRMK" to "tr_B2FP65_B2FP65_STR" >tr_B2FP65_B2FP65_STR 412 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # -------------------------------------------------------------------
87
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR tr_B2FP65_B2FP65_STR
22 48 72 76 77 79 87 114 117 119 129 140 145 166 182 210 224 234 245 252 254 265 269 274 284 325 329 337 338 340 345 355 358 362 364 370
S T S T S T S S S T T S S T T S S T T T S S T T S T T S T S T S T T S S
EDVASPAQR HQVRTLCLL GYLHSGHVT SGHVTSLTP GHVTSLTPL VTSLTPLRF FHAISAWLP LLLRSVASG RSVASGTAL VASGTALLI LLLATQQPR HDLLSNRHW NRHWSWIPA FLLATAALG RPLHTAMLL PALASAALL MLQESFHMA RDELTGLPG AFNETLQRA RARGTYSIA RGTYSIAMV DHFKSFNDT SFNDTHGHD HGHDTGDDV RLVASRLDR ALRQTIEDT TIEDTRMQL LRDRSTRSR RDRSTRSRD RSTRSRDDE RDDETGRRQ GRGGSGQTV GSGQTVQVT TVQVTVSIG QVTVSIGLA GLADSRVDE
0.450 0.390 0.528 0.324 0.525 0.199 0.659 0.357 0.552 0.218 0.208 0.316 0.543 0.178 0.603 0.272 0.222 0.212 0.245 0.148 0.484 0.511 0.487 0.413 0.538 0.186 0.345 0.669 0.323 0.599 0.317 0.561 0.336 0.186 0.805 0.559
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MLPAVLVAVVLWAALGNEDVASPAQRILPWLLACLGAGLALLYHQVRTLC LLLVVAVMFALLHQDVGGYLHSGHVTSLTPLRFHAISAWLPLLFAGLALW PERGRRRHDLLLRSVASGTALLIFLLLATQQPRGMHDLLSNRHWSWIPAD WNALAQLPALLFLLATAALGWQAWRHPRPLHTAMLLALLCLWWMLPRVFL QPVLLPALASAALLLMLGAMLQESFHMAFRDELTGLPGRRAFNETLQRAR GTYSIAMVDVDHFKSFNDTHGHDTGDDVLRLVASRLDRVGDGGRAFRYGG EEFAVVFLDRPAAACVDAVEALRQTIEDTRMQLRDRSTRSRDDETGRRQR GRGGSGQTVQVTVSIGLADSRVDERPAAVIKAADQALYAAKDGGRNQVRA HAGQRVLAARGG .................................................. .....................S....S.........S............. ................S...........................S..... ...............................T.................. .................................................. ..............S..................S................ ....................................S..S.......... ....S........S.....S.............................. ............
# # # # # # # # # # # # # # # # #
. . Y . Y . Y . Y . . . Y . Y . . . . . . Y . . Y . . Y . Y . Y . . Y Y 50 100 150 200 250 300 350 400 450 50 100 150 200 250 300 350 400
88
Bijlagen
Eiwit: Putative GGDEF PAS signalling domain protein seq2seq: entry name truncated from "tr_B2FJD4_B2FJD4_STRMK" to "tr_B2FJD4_B2FJD4_STR" >tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 729 amino acids # # netphosbac-1.0a prediction results # # Sequence # x Context Score Kinase Answer # ------------------------------------------------------------------# tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 6 T AGQGTNGNG 0.186 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 33 T IIDGTAAGT 0.163 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 37 T TAAGTWEWN 0.191 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 71 T VCQKTFLKL 0.349 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 84 S DIALSDAAL 0.270 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 96 T FEGRTDNYA 0.440 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 141 T HADVTELQQ 0.131 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 153 T DAAETRQRL 0.099 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 164 S VVDASDEVA 0.433 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 172 T AVIATDIDG 0.300 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 177 T DIDGTITLF 0.255 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 179 T DGTITLFNT 0.238 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 183 T TLFNTGAQR 0.366 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 192 S LLGYSAADV 0.457 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 233 S FEALSARAD 0.602 main Y # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 240 T ADGQTYSRQ 0.183 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 242 S GQTYSRQWT 0.402 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 246 T SRQWTLLRK 0.308 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 260 S QVRLSISRM 0.494 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 262 S RLSISRMDG 0.486 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 282 T AIDITEILQ 0.231 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 294 S EARLSAEKF 0.406 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 303 T AGAFTSAAL 0.155 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 304 S GAFTSAALG 0.217 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 313 S MALVSLEGR 0.331 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 345 T FQRLTHPDD 0.474 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 352 T DDLQTDLAL 0.228 main . # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 366 S AGRRSHYHL 0.556 main Y # tr_B2FJD4_B2FJD4_STR 387 S WARLSVSLV 0.653 main Y
89
Bijlagen # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
%1 %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR tr_B2FJD4_B2FJD4_STR
389 403 409 413 414 421 425 428 438 440 463 476 477 483 488 495 512 518 540 559 562 576 581 586 601 616 625 641 644 658 661 663 676 687 717 724
S S T S S S S T S S S T T S S S T T T T S T T S T S S S T T S S S S S S
RLSVSLVRN LHFVSQIQD IQDITAQRS TAQRSSEQR AQRSSEQRL RLFESEQRS SEQRSRITL RSRITLDAV DLVLSVSLD VLSVSLDGR DGALSLAGH VLALTTEYA LALTTEYAP YAPGSVLDV VLDVSVLLD LDPDSNAVD LGAATVPVD PVDLTRAWL LRDDTQQRA IDPLTELSN LTELSNRRG QQAITRVER RVERTGQAA GQAASLMYI PINDTWGHL WAVASVLRH GVRDSDVVA AVILSGCTP LSGCTPRRA ELLHTLASL HTLASLSIP LASLSIPWD RVGASIGIA AGGMSVDQA QGEASELPG PGDDSEVVE
0.576 0.481 0.233 0.566 0.343 0.512 0.487 0.483 0.430 0.479 0.304 0.153 0.317 0.268 0.320 0.316 0.262 0.269 0.437 0.214 0.366 0.401 0.344 0.238 0.409 0.433 0.568 0.560 0.458 0.172 0.252 0.454 0.706 0.294 0.371 0.571
main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main main
MAGQGTNGNGLLERRLQALAEERRRLAMIIDGTAAGTWEWNVQNGEMRVN ARWAEIVGYRLEELEPVCQKTFLKLVHPDDIALSDAALDEHFEGRTDNYA CLLRMRHKNGQWIWIQDRGRVFEWDGQGKPLWMAGAHADVTELQQARQDA AETRQRLQAVVDASDEVAVIATDIDGTITLFNTGAQRLLGYSAADVVGQR RLDAFHDPQELNAWLRPLADADGQLPDVFEALSARADGQTYSRQWTLLRK DGQPRQVRLSISRMDGADGVRIGYVGMAIDITEILQARAEARLSAEKFAG AFTSAALGMALVSLEGRWLDVNDALCRILGYPREELLQVDFQRLTHPDDL QTDLALVQDLLAGRRSHYHLEKRYLDRDGKVIWARLSVSLVRNEHGEPLH FVSQIQDITAQRSSEQRLFESEQRSRITLDAVADLVLSVSLDGRIDYANA AAVRMLAGDGALSLAGHKVQDVLALTTEYAPGSVLDVSVLLDPDSNAVDL HADLLLRLGAATVPVDLTRAWLRDDEGHVRGAVWVLRDDTQQRARQREAR HLAEIDPLTELSNRRGFEVHLQQAITRVERTGQAASLMYIDLDRFKPIND TWGHLAGDAVLWAVASVLRHGVRDSDVVARLGGDEFAVILSGCTPRRAAR IGGELLHTLASLSIPWDQDRLRVGASIGIAPLAGGMSVDQAVAAADAQCY RAKAMGRNNVQVQGEASELPGDDSEVVEG .................................................. .................................................. .................................................. .................................................. ................................S................. .................................................. .................................................. ...............S....................S.S...........
# # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # # #
Y . . Y . Y . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Y Y . . . . Y . . Y 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 50 100 150 200 250 300 350 400
90
Bijlagen %1 %1 %1 %1 %1 %1 %1
............S.......S............................. .................................................. .................................................. .................................................. ........................S...............S......... .........................S........................ .......................S.....
# # # # # #
450 500 550 600 650 700
KinasePhos 2.0 resultaten
Figuur 20. Predicitie van histidine fosforylatiesites in het transmembranair GGDEF signalling eiwit.
91
