Optimalisasi Teknik Kristalisasi Steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) Sebagai Pemanis Alami Rendah Kalori [Optimization of Stevioside Crystallization From Stevia rebaudiana (Bert.) As Low Calori Natural Sweetener) Yohanes Martono1, Rini Dwiastuti2, dan Arifah Sriwahyuni3 1) 2)
Dosen di Prodi Kimia Universitas Kristen Satya Wacana Salatiga Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta 3) Dosen Fakultas Farmasi Universitas Muhamadiyah Surakarta Jalan Diponegoro 52-60 Salatiga 50733
[email protected] ABSTRAK
Saat ini, orang cenderung mencari pemanis rendah kalori alami dan aman untuk dikonsumsi. Stevia rebaudiana (Bert.) merupakan tanaman herbal yang mengandung senyawa alami glikosida, steviosida yang memiliki 300 kali kemanisan dari sukrosa dan aman untuk dikonsumsi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengekstrak dan mengkristalkan steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.), menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif kandungan steviosida dalam kristal yang diperoleh dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Optimasi awal penelitian sebelumnya (kristalisasi berbasis pelarut organik non-air) telah berhasil mengkristalkan senyawa glikosida alami stevia, tetapi kendala yang dihadapi adalah kristal tidak larut dalam air dan persen yield yang rendah (<1%), dengan konsentrasi stevosida maksimal dalam kristal adalah 20,16% (b / b). Dalam optimasi ini, kristalisasi steviosida yang dikembangkan adalah kristalisasi steviosida berbasis air. Metode yang dikembangkan telah berhasil mengkristalkan steviosida. Karakteristik kristal yang diperoleh adalah larut dalam air. Persen yield yang diperoleh adalah 6,25%. Konsentrasi steviosida dalam kristal adalah 92,97%. ABSTRACT
Today, people tend to look for a low-calorie natural sweetener and are safe for consumption. Stevia rebaudiana Bert. is an herbal plant which contain natural glycosides compound, stevioside which has 300 times the sweetness of sucrose and safe for consumption. The purpose of this study were to extract and crystallize stevioside from Stevia rebaudiana (Bert.), to conduct qualitative and quantitative content analysis stevioside in the crystal obtained by HPLC, and to perform pre-formulation into products obtained crystalline sweetener. Preliminary optimization (organic solvent-based crystallization of non-water) has successfully conducted a natural glycoside compounds crystallize, but the obstacles encountered were crystals that form has not dissolve in water and the resulting yield is still too small (<1%), with maximal concentration stevoside in the crystal was 20.16% (w / w). In advanced optimization, stevioside crystallization was developed on water-based crystallization. The method developed has been successfully crystallized stevioside. Characteristics of the obtained crystals were water soluble. Percent of maximum yield obtained was 6.25%. Stevioside concentration in the crystal was 92.97%. Keywords : crystallization, stevioside, Stevia rebaudiana (Bert.)
PENDAHULUAN Kebutuhan pemanis semakin meningkat seiring dengan peningkatan produksi pangan dunia. Saat ini, pemenuhan kebutuhan pemanis di masyarakat dipenuhi dengan kehadiran gula sukrosa. Bila dilihat dari sisi kesehatan, gula sukrosa memiliki efek samping seperti obesitas, bahkan dapat memicu timbulnya penyakit diabetes. Dari efek samping tersebut, berbagai macam solusi dihadirkan seperti penggunaan pemanis sintetis yang rendah kalori seperti sakarin dan siklamat. Sebenarnya, pemanis sintetis ini hanya ditujukan untuk penderita diabetes atau konsumen dengan diet rendah kalori. Berdasarkan beberapa penelitian, ternyata pemanis ini bersifat karsinogenik apabila digunakan secara berlebihan dan berkesinambungan dalam jangka waktu yang lama (Mudjajanto, 2005). Dewasa ini, masyarakat cenderung mencari alternatif pemanis alami pengganti gula sukrosa maupun pemanis sintetis yang tidak hanya aman dikonsumsi tetapi juga rendah kalori. Salah satu alternatif pemanis alami tersebut adalah steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) dengan tingkat kemanisan 200 hingga 300 kali sukrosa (Philip, 1987). Beberapa penelitian menyebutkan bahwa steviosida mengandung kalori yang rendah sampai dengan nol kalori (Moraes dkk, 2001) sehingga aman bagi penderita diabetes atau konsumen yang sedang melakukan diet. Berdasarkan hasil penelitian, steviosida aman dikonsumsi oleh masyarakat umum karena tidak mempunyai efek teratogenik (Yodyingguard dan Bunyawong, 1991), mutagenik (Suttajit dkk., 1993), atau karsinogenik (Xili dkk., 1992). Oleh sebab itu, penelitian untuk mengekstrak daun stevia menjadi kristal yang mengandung steviosida yang tinggi dan mempunyai visualisasi kristal yang dapat diterima masyarakat akan memiliki potensi ekonomi yang besar. Salah satu cara untuk mendapatkan kristal dari steviosida adalah dengan metoda ekstraksi. Ekstraksi yang dikembangkan adalah ekstraksi pelarut yang dikombinasi dengan langkah-langkah yang lain seperti klarifikasi, penyesuaian pH dan kristalisasi (Moraes dkk, 2001; Philips, 1987). Pada penelitian sebelumnya, teknologi kristalisasi yang dikembangkan masih berbasis pada pelarut organik non-air. Teknologi yang dikembangkan sudah berhasil mengkristalkan steviosida tetapi persen yield yang dihasilkan masih rendah ( < 1%) dan kurang larut dalam air. Kandungan steviosida dalam kristal juga masih rendah ( < 25%). Pengembangan teknologi proses kristalisasi masih perlu dikembangkan terus, khususnya basis pelarut yang digunakan sebaiknya air dan meningkatkan yield, keterlarutan dalam air dan kandungan steviosidanya. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengoptimalkan metode kristalisasi steviosida berbasis air sekaligus menetapkan kadarnya secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). METODOLOGI Bahan Sampel yang digunakan adalah daun Stevia rebaudiana (Bert.) yang diperoleh dari Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya adalah aquades, eter, etanol, heksan, kaolin, CaO (Merck), asam sitrat, asetonitril (J.T. Baker 9017-03), metanol (Merck 1.06009.2500), standar steviosida (WAKO Jepang, kemurnian 99,8%).
Alat Sedangkan alat yang digunakan antara lain rotary evaporator (Buchi R114), sentrifuge (Swing Type centrifuge Model C-40N Tomy seiko co, ltd), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (Smart Line, Knauer Advanced Scientific Instruments), spektrofotometer (Shimadzu, UVmini 1240), dan sokhlet.
Metode Preparasi Sampel Sampel dibersihkan dari tanah, kemudian dikeringkan dengan cabinet drying selama 24 jam dan dihaluskan menggunakan grinder. Kristalisasi Steviosida Berbasis Pelarut Air Sebanyak 150 g sampel diekstrak dengan heksan sebanyak 1L menggunakan sokhlet selama 17,5 jam dan diambil residunya. 100 g residu sampel dimaserasi dengan aquades sebanyak 1,5 L pada suhu 500C selama 60 menit. Larutan disaring dan maserasi diulang sebanyak 2 kali dengan 1 L akuades, masing-masing selama 30 menit. Larutan disaring dan filtrate ditambahkan asam sitrat 50% hingga pH 4. Larutan disaring dan filtrate ditambahkan CaCO3 hingga pH 10. Selanjutnya, larutan disaring dan ditambahkan asam sitrat 50% hingga pH 6,4. Larutan diuapkan dengan rotary evaporator hingga pekat. Larutan pekat ditambahkan etanol sebanyak 30 mL kemudian ke dalam larutan ditambahkan 10 g bentonite/arang aktif lalu disaring, langkah ini diulang sebanyak 3 kali. Filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga jenuh dan larutan pekat dikristalisasi dengan penambahan etanol. Analisis Sampel Analisis Ekstrak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Identifikasi steviosida dilakukan dengan menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, metanol, dan air dengan flow rate 1,5mL/menit. Elusi fase gerak dilakukan secara isokratik menggunakan (aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan volume sampel yang diinjeksikan adalah 20μL. Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang gelombang 217nm. Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Spektroskopi Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan steviosida kemudian dilihat pola serapan cahayanya pada panjang gelombang 200-400 nm. Analisis Data Analisis data persen (% ) yield ekstraksi dan kristalisasi, identifikasi kandungan steviosida, dan kadar steviosida secara deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kristalisasi Berbasis Air Steviosida Pada optimasi lanjutan ini difokuskan pada kristalisasi berbasis air. Dasar perbaikan metode ini adalah menghasilkan kristal yang larut air, meningkatkan % yield, menghilangkan penggunaan eter. Metode yang dioptimalkan diharapkan lebih efisien dan efektif dalam pembentukan kristal. Beberapa dasar ekstraksi-kristalisasi yang dikembangkan adalah penyesuaian pH larutan dengan bahan-bahan yang lebih efisien dan mudah didapatkan, penjernihan larutan dengan klarifikasi menggunakan arang aktif dan bentonit, serta pencapaian keadaan larutan lewat jenuh yang dapat membentuk kristal steviosida. Penggunaan air pada suhu 50 ⁰C ternyata dapat mengestrak steviosida. Hal ini selaras dengan penelitian Adduci dkk. (1987) yang mengekstrak steviosida dengan air. Kristalisasi dapat dicapai dengan perubahan pH larutan secara ekstrim (DuBois, 2005). Oleh karena itu, pada optimasi ini, perubahan pH larutan dari 3 menjadi 10 tetap dipertahankan dengan menggunakan bahan yang lebih ekonomis yaitu kalsium karbonat dan asam sitrat. Pembentukan kristal sangat dipengaruhi oleh pencapaian larutan super jenuh, dimana setelah larutan super jenuh tercapai maka bila ditambahkan pelarut yang tidak melarutkan kristal maka akan mempercepat pembentukan kristal. Tetapi apabila penambahan ini berlebihan maka kristal akan kembali larut (Jones, 2002). Oleh karena itu, penambahan etanol pada larutan super jenuh dapat menyebabkan pembentukan kristal. Berdasarkan optimasi lanjutan ini, persen yield maksimal yang diperoleh adalah 6,25%. Hasil ini meningkat dari optimasi awal yang hanya menghasilkan persen yield dibawah 1,00 %. Selain itu, kristal yang diperoleh terlarut sempurna dalam air sehingga selanjutnya dapat dikembangkan untuk formulasi pemanis alami. Identifikasi dan Penentuan Kadar Steviosida dalam Kristal Kristal yang diperoleh kemudian diidentifikasi dan dianalisis kadar steviosidanya menggunakan KCKT. Hasil identifikasi dapat dilihat pada Gambar 1. Pada Gambar 1 terlihat bahwa sampel 1 dan 2 mengandung steviosida, sedangkan pada sampel 3 dan 4 tidak mengandung steviosida. Perbedaan antar sampel ini dapat disebabkan karena penambahan etanol dan atau asam sitrat pada larutan super jenuh yang berlebihan pada sampel 3 dan 4, sehingga kristal steviosida larut kembali. Kristal yang terbentuk dimungkinkan berikatan dengan asam sitrat sehingga menghilangkan atau merubah struktur steviosida, sehingga senyawa steviosida tidak teridentifikasi. Oleh karena itu, penambahan etanol merupakan titik kritis terbentuknya kristal. Selain itu, pada sampel 3 dan 4 tidak dilakukan langkah penghilangan lemak dan pengotor pada preparasi sampel (non defatisasi) sehingga dimungkinkan masih ada pengotor. Keberadaan pengotor ini dapat menggangu pembentukan kristal sehingga kristal tidak terbentuk atau jika terbentuk bukan kristal yang diharapkan.
Gambar 1. Kromatogram Hasil Kristalisasi Optimasi Lanjutan Steviosida. Kromatogram [A]. Standar Steviosida (tR=15,233), [B]. Sampel 1 (tR=15,067), [C]. Sampel 2 (tR=15,050), [D]. Sampel 3 (tR=14,967), [E]. Sampel 4 (tR=15,083)
Hasil ini diperkuat dengan identifikasi menggunakan spektroskopi. Spektra masing-masing sampel dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Spektra kristal steviosida hasil optimasi lanjutan. Spektra [A]. Standar Steviosida [B]. Sampel 1 [C]. Sampel 2, [D]. Sampel 3, [E]. Sa
Berdasarkan hasil identifikasi ini terlihat pola spektra sampel 1 dan 2 mirip dengan standar, sedangkan sampel 3 dan 4 berbeda dengan standar. Hal ini menunjukkan bahwa sampel 1 dan 2 mengandung steviosida, sedangkan pada sampel 3 dan 4 dimungkinkan terjadi perubahan struktur senyawa steviosida dalam kristal. Setelah dilakukan identifikasi, penentuan kadar steviosida ditetapkan secara KCKT. Kadar steviosida masing-masing kristal dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Data Kadar Steviosida % (b/b) Kristal Tiap Ulangan Kritalisasi Lanjutan. Sampel
Kadar Steviosida
Sampel 1
> 100
Sampel 2
92,97
Sampel 3
6,31
Sampel 4
1,61
Pada Tabel 1 terlihat bahwa kadar steviosida tertinggi didapat pada sampel 1. Walaupun kadar steviosida sampel 1 lebih tinggi dari sampel 2, tetapi persen yield sampel 2 lebih tinggi dari sampel 1. Selain itu, kristal sampel 1 yang terbentuk memiliki karakter fisik yang lebih menyerupai karamel sehingga sangat lengket dan belum dapat digunakan untuk formulasi. Oleh karena itu, sampel 2 merupakan kristal yang optimal yang diperoleh. Kristal sampel 2 ini kemudian digunakan untuk pra-formulasi dengan maltodekstrin pada penelitian selanjutnya. KESIMPULAN Berdasarkan penelitian ini dapat disimpulkan bahwa: 1. Metode kristalisasi berbasis air yang dikembangkan telah dapat menghasilkan kristal steviosida dengan persen yield maksimal sebesar 6,25 % dan kristal terlarut sempurna dalam air. 2. Kristal yang paling banyak mengandung steviosida adalah sampel 1 dan 2 dimana kristal sampel 2 merupakan kristal yang optimal dengan kandungan steviosida sebesar 92, 97% (b/b).
UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti berterimakasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI), Kementerian Pendidikan Nasional, Direktorat Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat yang telah membiayai penelitian ini sebagai bagian dari penelitian program Hibah Bersaing Tahun 2011.
DAFTAR PUSTAKA
Adduci, J., Buddhasukh, D., and Ternai, B. 1987. Improved Isolation and Purification of Stevioside. J. Sci. Soc. Thailand 13: 179-183.
Du Bois, G. E. 2005. SteviolmonosideAnalogs. http://www.freepatentsonline.com/4402990.html
Jones, A.G. 2002. Crystallization Process System. India: Butterworth-Heinneman. Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, Nádia Regina Camargo Fernandes. 2001.Clarification of Stevia Rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites. Maringáv.23, n. 6, p. 1375-1380 Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan Tradisional. http://www.kompas.com/kompascetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm. Philips, K.C. 1987. Stevia: step in developing a new sweetener. In:T.H.Grenby (Ed.), Development in Sweeteners 3, Elsevier, New York, p.1. Suttajit, M., Vinitketaumnuem, U., Meevatee, U. dan Buddhasukh, D. 1993Mutagenicity and Human Chromosomal Effect of Stevioside, a Sweetener From Stevia rebaudiana Bertoni. Environmental Health Perspective, 101 (Suppl.3), 53-56 Xili, L., Chengjiany, B.,Eryi X., Reiming, S., Yuenming, W., Haodong, S., dan Zhiyian, H. 1992 Chronic Oral Toxicity and Carcinogenicity Study of Stevioside in Rats. Food and Chemical Toxiology, 30, 957-965. Yodyinguard, V. dan Bunyawong, S. 1991. Effect of Stevioside on Growth and Reproduction. Human Reproduction,6 158-165.
