Gregor J., Maršálek B. (2004): Optické metody pro in situ kvantifikaci sinic. Seminář „Cyanobakterie“, Brno, 21. 1. 2004: 35-38. Ekomonitor ISBN 80-903203-8-4. OPTICKÉ METODY PRO IN SITU KVANTIFIKACI BIOMASY SINIC Jakub Gregor, Blahoslav Maršálek Botanický ústav AV ČR, Květná 8, 603 65 Brno, tel/fax: 543 241 911 Úvod Kvantifikace fytoplanktonu (včetně sinic) je v současné době založena na dvou standardně používaných metodách a parametrech – množství chlorofylu a (celkový parametr biomasy fytoplanktonu, stanovuje se po extrakci z buněk etanolem spektrofotometricky) a údaje o taxonomickém složení a počtu buněk získané pomocí mikroskopických technik. Vzhledem k časové náročnosti těchto metod stoupá poptávka po technologiích, které umožňují kvantifikaci fytoplanktonu přímo v terénu a případně zaměřit detailní taxonomické analýzy jen na takové vzorky, kdeto má smysl vzhledem k rozdílům v množství a složení fytoplanktonního společenstva. Optické metody pro kvantifikaci fytoplanktonu přímo v terénu lze rozdělit (i když poněkud uměle) do dvou skupin. První je monitoring „na dálku“, tedy pomocí satelitů nebo letadel. Druhou skupinu tvoří klasická in situ kvantifikace, kdy je měřící technika v přímém kontaktu se vzorkem. Téměř všechny metody spadající do obou těchto skupin využívají fluorescence fotosyntetických pigmentů, tedy vlastnosti, kdy tyto molekuly absorbují světlo o určité vlnové délce a následně vyzařují zpět světlo o vyšší vlnové délce a nižší energii. Excitační i emisní spektra jsou pro jednotlivé typy pigmentů charakteristická a díky tomu je možné na základě těchto metod nepřímo určovat nejen množství biomasy, ale do určité míry i složení fytoplanktonních společenstev. Remote sensing AVHRR Metodika AVHRR (Advanced Very High Resolution Radiometer) vychází v podstatě z běžného snímkování zemského povrchu pomocí satelitů (např. NOAA). Různé typy povrchů odrážejí dopadající světlo s různou intenzitou a v různých vlnových délkách. I vodní plochy se v tomto liší v závislosti na turbiditě nebo právě koncentraci fytoplanktonu. Tato metoda je vhodná především pro monitoring velkých vodních ploch (velká jezera, mořské zálivy), na nichž dochází k rozvoji extenzivních cyanobakteriálních květů [1,2,3]. Snímky lze zpětně hodnotit mnoho let dozadu a získat tak přehled o vývoji fytoplanktonní biomasy v rámci jedné sezóny i v průběhu více roků. Pro detailnější údaje je však samozřejmě třeba dalších podrobných analýz (mikroskopie). Nevýhodou je často malé rozlišení a neschopnost jakkoliv rozpoznat taxonomické skupiny. Úspěšnost snímkování je samozřejmě také závislá i na dalších (např. meteorologických) faktorech. LIDAR Pokročilejší a specifičtější metodou v rámci remote sensing je LIDAR (LIght Detection And Ranging), která již využívá fluorescence pigmentů zmíněné na začátku tohoto příspěvku. Princip spočívá v excitaci fotosyntetických pigmentů fytoplanktonu laserovým paprskem přicházejícím ze vzdáleného zdroje a snímání výsledného emisního spektra. Měření probíhá obvykle z letadla. Touto metodou lze od sebe odlišit fluorescenci fytoplanktonu a organických látek rozpuštěných ve vodě (dissolved organic matter – DOM). Kromě toho lze odlišit ty fotosyntetické pigmenty, které mají schopnost autofluorescence, tj. chlorofyl a, fykoerythriny (typické pro skrytěnky a některé sinice) a fykocyaniny (typické pro sinice) – viz obr. 1. Zde se již tedy setkáváme s možností odlišit některé skupiny fytoplanktonu [4,5]. Laserový paprsek samozřejmě proniká skrz vodní sloupec a díky tomu lze měřit fluorescenci i ve větších hloubkách. To je ovšem pochopitelně ovlivněno vzdáleností, sílou signálu, jeho vlnovou délkou, citlivostí detektoru i průhledností vody. Celkový signál zahrnuje kromě fluorescence DOM a fytoplanktonu další dva typy signálu – elastický rozptyl emisního paprsku na hladině a ve vodním sloupci a dále jeho neelastický rozptyl na molekulách vody (Raman scattering). To může působit poněkud rušivě na interpretaci emisního spektra, nicméně na druhé straně lze z těchto hodnot nepřímo odvozovat průhlednost vody, stav hladiny apod. [5]. Přímé (kontaktní) měření v nádrži Fluorometr Nejjednodušším způsobem fluorescenčního stanovení biomasy je použití běžného fluorometru. V praxi je fluorometr většinou na palubě lodi napojen na čerpací systém, který čerpá vzorky vody (kontinuálně nebo diskrétně) do měřící cely fluorometru a zde je ve stanovených intervalech měřena fluorescence[6,7]. Celý systém
Gregor J., Maršálek B. (2004): Optické metody pro in situ kvantifikaci sinic. Seminář „Cyanobakterie“, Brno, 21. 1. 2004: 35-38. Ekomonitor ISBN 80-903203-8-4. pak často zahrnuje i měření dalších parametrů kvality vody. Hodnoty fluorescence lze podle předem nebo následně získané kalibrační křivky snadno převést na konkrétní hodnoty chlorofylu a (ten stanovíme u několika vybraných vzorků standardní metodou). Velkým problémem je to, že klasické fluorometry umožňují okamžité měření pouze s jednou excitační a jednou emisní vlnovou délkou, což je vzhledem k různorodosti fotosyntetických pigmentů málo. Navíc ve sladkých vodách (zmíněné metody jsou primárně vyvíjeny pro oceanografický výzkum) bývá velké množství rozpuštěných organických látek, které významně přispívají k celkové fluorescenci. Řešením je mít několik diod s různými vlnovými délkami přizpůsobenými excitačním maximům fotosyntetických pigmentů, které se budou sekvenčně rozsvěcovat a zároveň se bude snímat fluorescence, opět při různých vlnových délkách. Tímto se však již pozvolna dostáváme k metodě SFS (spectral fluorescent signatures). Nicméně v praxi si lze představit, že se budeme snímat fluorescenci pouze na dvou excitačně emisních „kanálech“, jeden pro detekci chlorofylu eukaryotických řas a druhý pro sinice. V prvním případě bychom měřili fluorescenci chlorofylu a (emise 685 nm) zprostředkovanou dalšími přídatnými pigmenty (chlorofyl b, c, karotenoidy – excitace v oblasti 460-500 nm), ve druhém pak autofluorescenci fykocyaninu (excitace cca 610 nm, emise cca 650 nm). Z poměru těchto dvou hodnot pak lze nepřímo určit podíl sinic na celkové biomase fytoplanktonu. Obr. 1. Ukázka emisního spektra pořízeného LIDARem. Excitace laserem o vlnové délce 480 nm (nahoře) a 520 nm (dole). 1 – Raman scattering, 2 – fluorescence organických látek, 3 – fluorescence fykoerythrinu, 4 – fluorescence chlorofylu a. Převzato z [5].
Obr. 2. 3D spektrum a dvourozměrný „otisk“ přírodního společenstva fytoplanktonu získané metodou SFS. Za povšimnutí stojí pík v oblasti zhruba 550ex / 580em nm (fykoerythrin) a souvislé pásmo píků v oblasti emise kolem 685 nm (chlorofyl a). Převzato z [5].
Gregor J., Maršálek B. (2004): Optické metody pro in situ kvantifikaci sinic. Seminář „Cyanobakterie“, Brno, 21. 1. 2004: 35-38. Ekomonitor ISBN 80-903203-8-4. SFS Metoda SFS (spectral fluorescent signatures, volně přeloženo jako spektrální fluorescenční stopy, otisky či podpisy) spočívá v nasnímání kompletního excitačně-emisního spektra konkrétního společenstva fytoplanktonu. Pigmenty fytoplanktonních organismů přítomných ve vzorku jsou postupně excitovány světlem o vlnových délkách zhruba 400-700 nm (v intervalech obvykle 5-10 nm) a zároveň jsou snímána kompletní emisní spektra (cca 500-750 nm). Výsledkem je pak trojrozměrné spektrum, jehož tři osy tvoří excitace, emise a intenzita fluorescence při dané excitační a emisní vlnové délce (obr. 2). Při pohledu „shora“ uvidíme jakýsi charakteristický otisk (či spíše v případě přírodních vzorků několik „otisků“), tedy vlnové délky, při nichž je fluorescence výrazně vyšší. Poloha a schéma tohoto „otisku“ je závislá na fluorescenčních vlastnostech pigmentů přítomných v buňkách toho kterého organismu a analýzou celého 3D spektra přírodního vzorku je možné nepřímo určit strukturu fytoplanktonního společenstva [5]. Na spektru najdeme několik oblastí, z nichž můžeme i bez počítačové analýzy složení fytoplanktonu odhadnout. V oblasti emise kolem 685 nm najdeme souvislý pás píků prakticky v celém excitačním spektru. Ten patří fluorescenci chlorofylu a zprostředkované buď přímým dopadem excitačního paprsku na molekulu chlorofylu a nebo nepřímo přes přídatné pigmenty (chlorofyl b, c, karotenoidy, fykobiliproteiny). Fykobiliproteiny (fykoerythriny a fykocyaniny) mají též schopnost autofluorescence, tj. na rozdíl od ostatních přídatných pigmentů vykazují také vlastní fluorescenci o charakteristických vlnových délkách. V případě fykoerythrinů je excitační maximum v oblasti 560-570 nm, emise kolem 580 nebo 620 nm v závislosti na typu molekuly. Fykocyaniny mají excitační maximum v oblasti 610-620 nm, emise se pohybuje v rozmezí 640-650 nm. Přehled excitačních a emisních maxim jednotlivých typů pigmentů je uveden v tabulce 1. Vzhledem k tomu, že např. fykocyaniny jsou typické pro „modré“ sinice, fykoerythriny pro skrytěnky a „červené“ sinice, chlorofyl b pro zelené řasy či karotenoidy a chlorofyl c pro Chromophyta (např. rozsivky, zlativky), můžeme si ze získaného spektra udělat rychlý přehled o zastoupení těchto skupin v daném vzorku. Tabulka 1. Přehled excitačních a emisních maxim jednotlivých typů pigmentů. Emise v oblasti 685 nm je vždy fluorescence zprostředkovaná chlorofylem a, u fykobiliproteinů jsou uvedeny i emisní maxima jejich autofluorescence. Pigment Excitace (nm) Emise (nm) Chlorofyl a 440 685 Chlorofyl b 480 685 Chlorofyl c 460 685 Karotenoidy 500-550 685 Fykoerythrin 560-570 580 (auto), 620 (auto), 685 Fykocyanin 610-620 645 (auto), 685 Flowcytometrie Při monitoringu fytoplanktonu lze do jisté míry kombinovat již zmíněné fluorescenční vlastnosti fotosyntetických pigmentů s výhodami klasické flowcytometrie. Tato metoda nám rozdělí společenstvo na základě fluorescence i velikosti buněk a poskytne také rovnou údaje o počtu buněk spadajících do jednotlivých kategorií[8]. Z hlediska kvantifikace se jedná na první pohled o výbornou metodu, bohužel pro klasické přírodní populace je jen těžko aplikovatelná. Hlavním důvodem je fakt, že většina sinic vodního květu (a o ty nám jde především) tvoří nejrůznější typy vláken a kolonií s naprosto odlišnými rozměry i v rámci jednoho druhu a jedné populace. Ponorné sondy K fluorometru nebo flowcytometru je třeba vzorek nějakým způsobem dopravit. V posledních letech však získávají na oblibě tzv. ponorné sondy, což jsou v podstatě fluorometry spouštěné přímo do vody. Přístroj samotný je obvykle napojen na počítač, z něhož je řízen a kam jsou ve stanovených časových intervalech posílána aktuální naměřená data. Sondu lze umístit stacionárně, stejně tak s ní lze ovšem měřit kompletní vertikální profily na různých lokalitách, přičemž měřená hloubka je limitována pouze délkou kabelu spojujícího přístroj a počítač. Většinou se jedná o přístroje s podobným principem měření a výstupy jako je klasický fluorometr, tj. dostáváme data v podobě relativních fluorescenčních jednotek, které pak na základě kalibračních údajů převedeme na množství chlorofylu a (např. SCUFA od Turner Designs nebo AQUAtracka od Chelsea Technologies Group). Tyto sondy opět měří s jednou excitační a jednou emisní vlnovou délkou, maximálně umožňují ruční výměnu filtrů (např. pro detekci fykocyaninu). Nicméně existuje i technologie kombinující
Gregor J., Maršálek B. (2004): Optické metody pro in situ kvantifikaci sinic. Seminář „Cyanobakterie“, Brno, 21. 1. 2004: 35-38. Ekomonitor ISBN 80-903203-8-4. výhody ponorných sond a metody SFS (i když ve značně „očesané“ formě). Jedná se o sondu „FluoroProbe“ vyvinutou firmou bbe-Moldaenke, která měří při šesti excitačních vlnových délkách a jedné emisní (685 nm). Unikátní je však především forma výstupů, protože tento přístroj (resp. jeho software) je schopný na základě excitačního spektra vzorku od sebe odlišit čtyři skupiny fytoplanktonu (sinice, zelené řasy, hnědé řasy a skrytěnky – obr. 3) a poskytnout údaje o jejich množství přímo v jednotkách chlorofylu a na litr [9]. Během několika minut tak získáme údaje o množství chlorofylu a v celém vodním sloupci i o podílu těchto skupin fytoplanktonu na celkové biomase. Obr. 3. Excitační spektra čtyř skupin fytoplanktonu při emisi 685 nm, na jejichž základě je stanovováno sondou FluoroProbe jejich množství. Převzato z [9].
Závěr Jak je zřejmé z tohoto příspěvku, metody pro kvantifikaci fytoplanktonu in situ představují výborný nástroj pro účely, kdy je nutné mít k dispozici výsledky rychle a není třeba detailních analýz. Při podrobných studiích fytoplanktonu je však vždy nutné tato data doplnit údaji o taxonomickém složení a alespoň semikvantitativními údaji o počtu buněk. Nicméně se dá předpokládat, že využití metod založených na fluorescenci fotosyntetických pigmentů fytoplanktonu se zdokonalujícími se technologiemi poroste, a to především v oblasti rutinního monitoringu kvality vody, neboť současné standardní metody (stanovení chlorofylu a extrakční metodou, zdlouhavé mikroskopické rozbory) jsou velice náročné na čas i lidské zdroje. Použitá literatura [1] KAHRU, M., BROWN, C.W. (1997): Monitoring algal blooms: new techniques for detecting large-scale environmental change. Springer – Verlag and Landes Bioscience 1997 [2] SUBRAMANIAM, A., CARPENTER, E.J., FALKOWSKI, P.G. (1999): Bio-optical properties of the marine diazotrophic cyanobacteria Trichodesmium spp. II. A reflectance model for remote sensing. Limnology and Oceanography 44(3): 618-627 [3] IBELINGS, B.W., VONK, M., LOS, H.F.J., VAN DER MOLEN, D.T., MOOIJ, W.M. (2003): Fuzzy modeling of cyanobacterial surface waterblooms: Validation with NOAA-AVHRR satellite images. Ecological Applications 13(5): 1456-1472 [4] HOGE, F.E., WRIGHT, C.W., SWIFT, R.N., YUNGEL, J.K., BERRY, R.E., MITCHELL, R. (1998): Fluorescence signatures of an iron-enriched phytoplankton community in the eastern equatorial Pacific Ocean. Deep-Sea Research II 45: 1073-1082 [5] BABICHENKO, S., KAITALA, S., LEEBEN, A., PORYVKINA, L., SEPPALA, J. (1999): Phytoplankton pigments and dissolved organic matter distribution in the Gulf of Riga. Journal of Marine Systems 23: 69–82 [6] PINTO, A.M.F., VON SPERLING, E., MOREIRA, R.M. (2001): Chlorophyll-a determination via continuous measurement of plankton fluorescence: Methodology development. Water Research 35(16): 3977-3981
Gregor J., Maršálek B. (2004): Optické metody pro in situ kvantifikaci sinic. Seminář „Cyanobakterie“, Brno, 21. 1. 2004: 35-38. Ekomonitor ISBN 80-903203-8-4. [7] ODATE T, HIRAWAKE T, KUDOH S, KLEIN B, LEBLANC B, FUKUCHI M. (2002): Temporal and spatial patterns in the surface-water biomass of phytoplankton in the North Water. Deep-Sea Research II 49: 4947-4958 [8] BECKER, A., MEISTER, A., WILHELM, C. (2002): Flow cytometric discrimination of various phycobilincontaining phytoplankton groups in a hypertrophic reservoir. Cytometry 48: 45-57 [9] BEUTLER, M., WILTSHIRE, K.H., MEYER, B., MOLDAENKE, C., LURING, C., MEYERHOFER, M., HANSEN, U.P., DAU, H. (2002): A fluorometric method for the differentiation of algal populations in vivo and in situ. Photosynthesis Research 72(1):39-53.
