PENGARUH PARAMETER PANJANG GELOMBANG, pH DAN SUHU TERHADAP BIOSENSOR ASAM URAT MENGGUNAKAN ENZIM HRP-URICASE TERIMOBILISASI PADA MATERIAL SILIKA SECARA SOL-GEL Oleh: Sri Hastuti1, Tri Martini2, Rocky C.P.N3 , Agus Kuncaka4, Nuryono5, 1,2,3. Jurusan Kimia FMIPA UNS 4,5. Jurusan Kimia FMIPA UGM
Abstraks Telah dilakukan penelitian tentang pengaruh parameter panjang gelombang, pH, dan suhu terhadap biosensor asam urat menggunakan enzim HRP-Uricase yang terimobilisasi pada material silika secara sol-gel. Penelitian ini bertujuan mempelajari optimasi kondisi biosensor meliputi : optimasi panjang gelombang, optimasi pH fisiologis enzim HRP-Uricase dan suhu fisiologis enzim HRP-Uricase. Hasil penelitian menunjukkan bahwa optimasi kondisi biosensor asam urat dicapai pada panjang gelombang 490 nm, pH fisiologis enzim HRP-Uricase 7 dan suhu fisiologis enzim HRPUricse 25oC.
Kata Kunci : Biosensor, Asam urat, Sol-gel
BAB I. PENDAHULUAN
Biosensor merupakan suatu perangkat sensor yang menggabungkan senyawa biologi dengan suatu tranduser. Biomolekul terutama enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel dan mempunyai daya katalisis yang tinggi. Berdasarkan kespesifikannya maka enzim dapat digunakan sebagai bioreseptor yang melakukan pengenalan/deteksi zat tertentu. Matriks silika yang dibuat dengan proses sol-gel, memberi harapan untuk imobilisasi biomolekul seperti enzim, antibodi, dan sel. Hal ini dikarenakan lebih mudah disintesis, lebih stabil dan menunjukan kekuatan mekanik serta stabilitas termal yang tinggi. Dengan demikian, kemungkinan aktivitas biologi dari enzim, antibodi, dan sel yang masuk dapat dipertahankan ( Nguyen et al.,2002 ). Lan dkk.(1998) telah melakukan enkapsulasi heme protein seperti cytokrom-c (cyt-c), hemoglobin (Hb) dan myoglobin (Mb) dalam matrik silika melalui proses sol-gel. Hasil yang diperoleh stabilitas termal dari cyt-c signifikan lebih tinggi dengan imobilisasi ke dalam jaringan pori silika. Menurut Bhatia dkk.(2000), protein dienkapsulasi dalam pori matrik sol-gel dapat memperlihatkan sifat signifikan berbeda dari enzim bebas. Telah dilaporkan beberapa contoh enzim hanya menahan 1-2 % dari aktivitas spesifik pada enkapsulasi sol-gel pengemban (support). Hasil penelitian menunjukan enzim yang terenkapsulasi dapat lebih bertahan lama dibandingkan enzim bebas. Eggers dan Valentine (2001) telah melakukan enkapsulasi protein dengan metode sol-gel dalam matriks silica sebagai system eksperimental potensial untuk mengetahui pengaruh pengurungan molecular pada struktur dan stabilitas protein. Hasil yang diperoleh menunjukkan secara umum stabilitas termal protein berubah. Terjadi perubahan struktur sekunder pada protein menjadi tidak terlipat dan lebih besar dalam matriks silica.Diduga konformasi protein sangat dipengaruhi sifat dari air yang mengurung dalam pori matriks silica. Livage et al.,(2001) telah melakukan enkapsulasi biomolekul dengan proses sol-gel. Proses sol-gel pada temperature kamar memungkinkan untuk mengenkapsulasi biomolekul. Aplikasi bioenkapsulasi yang telah dilakukan yaitu enkapsulasi enzim glukosa oksidase (GOD) untuk analisa klinis dalam mendiagnosa diabetes, bioteknologi dan industry makanan.
Coiffer (2001) telah mengenkapsulasi bakteri Escherichia Coli melalui proses sol-gel dengan membandingkan precursor yang digunakan yaitu TMOS dan natrium silikat.dari hasil penelitian dilaporkan penggunaan precursor natrium silikat lebih baik dibandingkan slkoksida karena dengan precursor natrium silikat tidak terbentuk hasil samping berupa alkohol yang dapat mendenaturasi enzim dalam matriks silica. Pada penelitian ini dilakukan imobilisasi enzim HRP-Uricase dengan menggunakan precusor natrium silikat secara sol gel. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan inovasi baru tentang biosensor. Hasil penelitian ini juga mendukung pada bidang kesehatan khususnya untuk mengukur kadar asam urat dalam darah.
BAB IV. METODE PENELITIAN 1.
Alat dan Bahan Alat yang digunakan antara lain :Elisa reader, Microwell, Micro pipet, pH Meter dan alat
alat gelas. Sedangkan bahan yang digunakan adalah Natrium silikat (Na2SiO3), Resin penukar kation asam kuat Amberlite IR 120 ( Merck ), Natrium dihidrogen fosfat (NaH2PO4) (Merck), Dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4) (Merck), Enzim Horseradish peroxidase (HRP) (Sigma), Enzim Uricase (Sigma), Asam urat (Merck), Fenol (Merck), 4-aminoantipirin (4-AAP) (Merck)
2. Cara Kerja 2.1 Enkapsulasi Enzim dalam Silika Gel Larutan sol Na2SiO3 sebanyak 2,5 mL ditambah dengan 7,5 mL akuabides. Ke dalam larutan selanjutnya ditambahkan resin penukar kation asam kuat sampai pH larutan turun mendekati pH 9. Resin kemudian dipisahkan dengan filtrasi. Masing masing sumur mikrowell diisi larutan 40 µL sol Na2SiO3 , 5 µL HRP dan 5 µL uricase. dalam larutan buffer fosfat pH 7. Selanjutnya dilakukan penuaan selama lebih 24 jam.
2.2 Optimasi kondisi Biosensor Asam Urat 2.2.1 Optimasi panjang gelombang Optimasi panjang gelombang ini menggunakan pendekatan pengukuran untuk subtrat peroksida oleh enzim HRP. Larutan sol Na2SiO3 dengan pH sekitar 9 sebanyak 40 µL ditambah dengan 5 µL HRP dalam larutan buffer fosfat 7. Selanjutnya dilakukan penuaan selama lebih 24
jam. Setelah siap diisi dengan kromogen ( campuran dari fenol dan 4-aminoantipirin) dan variasi konsentrasi peroksida ( 0 – 100 µM) selanjutnya diukur absorbansinya menggunakan elisa reader pada λ = 340, 415, 450, 490, 550, dan 655 nm.
2.2 .3 Pengaruh pH Variasi pH dilakukan dengan memvariasikan pH larutan buffer fosfat yang digunakan untuk melarutkan enzim HRP dan Uricase yaitu mulai pH 5-9. Untuk enkapsulasi enzim, masing masing sumur mikrowell diisi larutan 40 µL sol Na2SiO3 , 5 µL HRP dan 5 µL uricase. dalam larutan buffer fosfat pada pH 5. Hal yang sama dilakukan untuk pH 6, 7, 8, dan 9. Selanjutnya dilakukan penuaan selama lebih 24 jam. Setelah siap digunakan, ditambahkan kromogen ( campuran dari fenol dan 4-aminoantipirin) dan substrat Asam urat diukur absorbansinya menggunakan elisa reader pada λ = 490 nm.
2.2.3
Pengaruh Temperatur Variasi temperatur yang digunakan adalah 25°C, 45°C, 60°C. Ke dalam sumur mikrowell
diisi larutan 40 µL sol Na2SiO3 , 5 µL HRP dan 5 µL uricase.pada pH buffer 7. Selanjutnya dilakukan penuaan selama lebih 24 jam, setelah siap dilanjutkan pemanasan dalam oven dengan variasi suhu selama 15 menit. Untuk enzim yang tidak diimobilisasi, larutan enzim dipanaskan dengan variasi temperatur 25°C, 45°C, 60°C, selama 15 menit. Selanjutnya enzim dimasukkan ke dalam mikro well yang telah berisi larutan 40 µL sol Na2SiO3 , 5 µL HRP dan 5 µL uricase dalam bentuk gel, setelah siap masing-masing ditambah dengan kromogen dan substrat asam urat dan diukur aktivitas enzimatisnya pada λ = 490 nm.
BAB III. HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1.Imobilisasi Enzim HRP-Uricase dalam Akuagel Silika Material akuagel silika termobilisasii enzim dalam penelitian ini disintesis melalui proses sol-gel. Tahapan yang dilalui pada proses sol-gel ini meliputi pembentukan larutan sol, pembentukan gel, dan penuaan (aging). Enzim yang digunakan dalam penelitian ini adalah enzim gabungan Horseradish peroxidase (HRP) dan Uricase sedangkan material silika yang digunakan adalah Natrium silikat. Larutan natrium silikat, dari merck mempunyai pH basa, yaitu
pH 13-14. Ke dalam larutan sol ini selanjutnya ditambahkan resin penukar kation asam kuat Amberlite IR 120. Na2SiO3 + H2O + 2 H+
Si(OH)4 + 2 Na+
Di daerah pH ≤ 7, pembentukan gel terjadi melalui reaksi kondensasi asam silikat untuk membentuk dimer, tetramer, dan akhirnya polimer akuagel silika. Reaksi kondensasi awal yang terjadi, yaitu pembentukan dimer, melibatkan reaksi substitusi nukleofilik (SN2) dari atom oksigen pada gugus siloksi ≡Si–O- terhadap atom silikon pada gugus silanol ≡Si–O. Dari sini akan terbentuk ikatan siloksan Si–O–Si, bersamaan dengan dihasilkannya molekul air. Si(OH)4 + -O–Si(OH)3
(OH )3 Si–O–Si(OH)3 + H2O
Si O Si O H
Si O H + Si O-
-OHSi O Si
Gambar 1. Model pembentukan dimer siloksan
Melalui mekanisme ini akan terbentuk intermediet spesies silikon pentakoordinat. Setelah dimer terbentuk, reaksi kondensasi lanjutan antara dimer dengan monomer sangat cepat terjadi dan akan terbentuk trimer, tetramer, dan oligomer.
3.2. Uji Aktivitas Enzim Pada penelitian ini digunakan sistem multi enzim, yaitu gabungan antara enzim uricase dan enzim horseradish peroxidase (HRP). Pertama, uricase mengkatalisis oksidasi asam urat menjadi alantoin dengan adanya molekul oksigen dan dihasilkan hidrogen peroksida (H2O2). Untuk mengetahui aktivitas enzim uricase, digunakan reaksi enzimatis lain yang digabung dengan kromogen untuk menghasilkan senyawa kompleks berwarna sehingga aktivitas enzim uricase bisa ditentukan melalui metode spektrofotometri. Reaksi enzimatis gabungan yang digunakan melibatkan enzim HRP dengan kromogen gabungan fenol dan 4-aminoantipirin (4-AAP). Dari reaksi enzimatis ini akan dihasilkan kompleks senyawa kuinonimin yang berwarna merah yang diukur pada panjang gelombang 490 nm.
Reaksi multi enzim yang terjadi adalah :
HRP H2O2 + PhOH + 4-AAP
kuinonimin + H2O merah, λ = 490 nm
Aktivitas enzimatis ditunjukkan oleh banyaknya produk reaksi yang dihasilkan yang sebanding dengan absorbansi. Oleh karena itu, absorbansi digunakan untuk ukuran aktivitas enzimatis.
3.3.Optimasi Kondisi 3.3.1 Panjang gelombang Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk melihat daerah serapan yang paling tinggi pada pengukuran asam urat. Pengukuran dilakukan menggunakan konsentrasi peroksida. Hal ini diasumsikan bahwa reaksi enzimatis dari asam urat oleh uricase menghasilkan peroksida. Pengukuran dilakukan pada serapan daerah tampak (visible). Hasil pengukuran dapat dilihat pada gambar 2. Dengan melihat gambar 2 terlihat bahwa absorbansi maksimum dicapai pada panjang gelombang 340 nm. Karena daerah ini bukan daerah tampak, maka panjang gelombang ini tidak dipilih. Pada daerah 415 juga mempunyai serapan tinggi, akan tetapi tidak menggambarkan perbedaan yang signifikan terhadap perubahan konsentrasi. Dengan demikian yang dipilih adalah panjang gelombang 490 nm. Hal ini sesuai dengan teori bahwa senyawa kuinonimin yang dihasilkan warna merah yang ditunjukkan pada daerah 490 nm.
Absorbansi
Optimasi Panjang Gelombang 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0
HRP panjang gelombang 340 nm HRP panjang gelombang 415 nm HRP panjang gelombang 450 nm HRP panjang gelombang 490 nm HRP panjang gelombang 550 nm HRP panjang gelombang 655 nm 0
20
40
60
80
100
120
Variasi Konsentrasi Peroksida 0-100 (µM)
GGambar 2. Grafik Optimasi Penentuan Panjang Gelombang (Waktu reaksi enzimatis satu jam, pH 7 )
3.3.3 Optimasi pH Optimasi ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh perubahan kondisi fisiologis, yaitu perubahan pH terhadap aktivitas enzim terimobilisasi. Variasi nilai pH dilakukan dengan memvariasikan pH bufer fosfat yang digunakan untuk melarutkan enzim HRP-Uricase. Hasil analisis tentang pengaruh pH terhadap reaksi enzimatis HRP-Uricase dan terenkapsulasi disajikan pada gambar 3. Pada imobilisasi enzim HRP-uricase diperoleh kecenderungan dari pH 5 naik terus hingga diperoleh pH maksimum untuk aktivitas enzimatis pada pH 7 dan turun kembali setelah pH 8 dn 9. Hal ini menunjukkan bahwa reaksi enzimatis ini lebih dikontrol oleh enzim HRP dimana enzim HRP mempunyai pH optimum 7 sedangkan uricase mempunyai pH optimum 8,5.
Optimasi pH 0.05
absorbansi
0.04 0.03 0.02
HRP-Uricase
0.01 0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Variasi pH
Gambar 3. Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim HRP-Uricase (Panjang gelombang 490 nm, waktu reaksi enzimatis satu jam, pH 7)
3.3.4. Pengaruh temperatur Enzim merupakan katalis berbagai reaksi kimia pada makhluk hidup yang bekerja sampai batas temperatur tertentu. Hal ini disebabkan karena pada temperatur tinggi enzim akan terdenaturasi dan akan kehilangan aktivitas enzimatisnya. Pengaruh temperatur terhadap reaksi enzimatis pada penentuan asam urat disajikan pada gambar 4. Dari gambar 4 terlihat bahwa pada enzim yang terimobilisasi terlihat lebih stabil, perubahan suhu tidak menaikkan secara signifikan absorbansi. Hal ini dapat dijelaskan bahwa enzim yang terimobilisasi akan lebih terlindungi karena material silica mempunyai ketahanan termal yang tinggi. Pada enzim yang tidak terimobilisasi pada suhu 45 0C terjadi kenaikan kemudian pada temperature 60 0C, terjadi penurunan lagi. Hal ini dapat dijelaskan bahwa enzim yang tidak terimobilisasi kurang stabil, perubahan suhu sangat berpengaruh pada aktivitas enzim. Pada suhu 45 0C absorbansi paling tinggi, hal ini disebabkan reaksi enzimatis pada dasarnya terjadi pada makluk hidup yang mempunyai suhu diatas 250C sedangkan pada suhu 60 0C menurunkan aktivitas enzimatis. Pada temperature yang semakin tinggi enzim semakin rusak dan terdenaturasi. Dengan demikian untuk lebih aman maka penggunaan enzim dilakukan pada suhu 25 0 C, hal ini lebih memudahkan dalam preparasi saat pengukuran.
Optimasi Suhu 0.4 0.35 Absorbansi
0.3 0.25 0.2
HRP-Uricase imobilisasi
0.15
HRP-Uricase bebas
0.1 0.05 0 0
20
40
60
80
Variasi Suhu (°C)
Gambar 4. Grafik pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim HRP-Uricase (Panjang gelombang 490 nm dan waktu reaksi enzimatis satu jam)
BAB IV. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan: Kondisi optimum penggunaan aquagel silika terimobilisasi enzim HRP-Uricase pada pengukuran asam urat yaitu pada panjang gelombang 490 nm, pH buffer phospat untuk larutan enzim 7 dan suhu fisiologis enzim 25oC. Saran : Penggunaan aquagel silika terimobilisasi enzim sebaiknya tidak digunakn untuk mendeteksi reaksi enzimatis yang didasarkan pada perubahan warna.
DAFTAR PUSTAKA
Bhatia, Rimple B., and Brinker , C.Jeffrey, 2000, Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation, Chem.Mater., 12, 2434-2441. Brinker,C.J., dan Scherer, W.J., 1990, Sol-Gel Science : The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing,Academic Press, San Diego Coiffier, A., Coradin, T., Roux, C., Bouvet, O.M.M., and Livage, J., 2001, Sol-Gel Encapsulation of Bacteria : A Comparison between Alkoxide and Aqueous Routes, J. Mater. Chem., 11, pp. 2039-2044 Eggers, D., Valentine, J., 2001, Molecular Confinement Influences Protein Structure and Enhances Thermal Protein Stability, Protein Science, 10, 250-261. Eggers, D., Valentine, J., 2001, Crowding and Hidration effects on Protein Conformation: a Study with Sol-Gel Encapsulation Protein, J. Mol. Biol, 314, 911-922. Lan, E.H, Dave , B.C., Fukuto, J.M., Dunn, B., Zink, J.I., and Valentine, J.S.,1998,Synthesis of Sol-Gel Encapsulated Heme Proteins with Chemical Sensing Properties, J.Mater. Chem., 9, pp.45-53 Livage, J.,Coradin, T., and Roux, C., 2001, Encapsulation of Biomolecules in Silica Gels, J.Phys.: Condens.Matter., 13, R673-R691
Nguyen, D.T., Mark S., Bruce D., and Jeffrey I.Z., 2002. Stabilization of Creatine Kinase Encapsulation in Silicate Sol gel Materials and Unusual Temperature Effect on its Activity, Chem. Mater., 14 4300-4306. Noor Hindryawati, 2005, “Enkapsulasi Enzim Dehidrogenase Laktat (Dhl) Dalam Silika Dengan Bahan Dasar Natrium Silika Dari Abu Sekam Padi Jurusan Kimia Program Pascasarjana,Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta
Yevie Zuhardiansari , 2005, “Enkapsulasi Enzim Horseradish Peroxidase-Glucose Oxidase (HrpGox)Dalam Akuagel Silika Hasil Sintesis Dari Abu Sekam Padi” Jurusan Kimia Program Pascasarjana,Universitas Gadjah Mada,Yogyakarta
