Makalah Pendamping: Kimia
299
Paralel E
POTENSI ANTIKANKER FRAKSI TERAKTIF EKSTRAK Pandanus conoideus Lam. Var. buah kuning terhadap kultur sel kanker yang terinfeksi EBV (Epstein Barr Virus) 1
2
2
Nestri Handayani , Okid Parama Astirin , Dinar Sari C.W. 2 Jurusan Kimia FMIPA UNS; Jurusan Biologi FMIPA UNS Jl. Ir. Sutami 36A Surakarta, e-mail :
[email protected] 1.
Abstrak Jumlah penderita kanker saat ini semakin meningkat, dan menempati urutan keenam sebagai penyebab kematian (Hariani, 2005). Usaha penyembuhan kanker dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi pada umumnya belum mampu memberikan hasil yang memuaskan (Sugiyanto et al., 2003). Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning merupakan salah satu tanaman yang terbukti secara empiris memiliki aktivitas sebagai anti kanker. Pandanus conoideus Lam varietas buah kuning ini memiliki kandungan tokoferol yang lebih tinggi daripada P. conoideus Lam. varietas buah merah yang telah dikenal sebelumnya sebagai agen anti kanker (Budi dan Paimin, 2005). Penelitian ini bertujuan untuk meneliti tentang pengaruh pemberian sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada sel kanker Raji (kanker tenggorok yang terinfeksi EBV) secara in-vitro. Ekstrak cair buah kuning yang didapat dari I Made Budi dipisahkan kandungan kimianya dengan menggunakan campuran KOH 30% - methanol - eter (1:1:1), setelah pemisahan akan terbagi menjadi dua lapisan, fase metanol yang berada di atas dan fase eter di bawah. Untuk mengetahui profil kandungan kimia fase methanol dan fase eter dilakukan uji KLT. Masing – masing fase dilakukan uji sitotoksisitas dengan sel Raji. Fase yang memiliki nilai LC50 terkecil selanjutnya dilakukan fraksinasi dengan kromatografi vakum cair (KVC) menggunakan fase diam alumina dengan fase gerak mulai dari fase gerak bersifat non polar dan secara bertingkat (gradient) menuju fase gerak yang bersifat polar. Hasil fraksinasi dikelompokkan berdasarkan kemiripan profil KLT. Bioassay guided extraction menggunakan sel Raji dilakukan untuk menentukan fraksi teraktif yang akan diuji efek antiproliferasinya dengan uji doubling time terhadap sel Raji. Hasil penelitian menunjukkan bahwa berdasarkan hasil uji sitotoksisitas maka dapat dinyatakan fraksi teraktif dalam menimbulkan kematian sel Raji adalah pada fraksi C (fraksi methanol) dengan nilai LC50 sebesar 0.15625 µl/ml. Menurut Ueda et al. (2002) ekstrak tanaman yang memiliki LC50 < 100 g/ml berpotensi untuk dikembangkan. Hasil uji antiproliferasi memperlihatkan adanya kemampuan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker pada fraksi C (fraksi methanol). Kata kunci : Pandanus conoideus Lam var. buah kuning, fraksi teraktif, uji sitotoksisitas, antiproliferasi
PENDAHULUAN Jumlah penderita kanker saat ini semakin meningkat, dan menempati urutan keenam sebagai penyebab kematian (Hariani, 2005). Survei Kesehatan Rumah Tangga (SKRT) menunjukkan proporsi penyebab kematian karena kanker meningkat dari 1,7% pada tahun 1976 menjadi 3,4% pada tahun 1980 dan sekitar 5,5% pada tahun 1995. Usaha penyembuhan kanker dengan pembedahan, kemoterapi dan radioterapi pada umumnya belum mampu memberikan hasil yang memuaskan (Sugiyanto et al., 2003). Kemoterapi yang merupakan salah satu pengobatan utama kanker memang menunjang hasil yang bagus namun toksisitas dan efek sampingnya sangat besar (Moeljopawiro et al., 2007). Masalah utama yang dihadapi dalam kemoterapi adalah selektivitas yang rendah dari obat anti-kanker (Valeriote et al., 2002; Kinghorn et al., 2003). Selain itu penggunaan terapi radiasi, kemoterapi dan terapi hormon, banyak menimbulkan efek pada jaringan sehat non target ditandai dengan rontoknya rambut, dan kulit yang menghitam (Jiang et al., 2004). Hal ini mengakibatkan banyak dijumpai cara-cara
ISBN : 979-498-547-3
pengobatan alternatif antara lain dengan obat tradisional (Sugiyanto et al., 2003). Selama ribuan tahun, produk alam telah memerankan peran yang sangat penting dalam mengatasi dan mencegah penyakit manusia (Chin et al., 2006). Lebih dari 60% agen anti-kanker yang telah digunakan didapatkan dari bahan-bahan alam (Cragg and Newman, 2003; Cragg and David, 2005). Pandanus conoideus Lam. varietas buah kuning merupakan salah satu tanaman yang terbukti secara empiris memiliki aktivitas sebagai anti kanker. Pandanus conoideus Lam varietas buah kuning ini memiliki kandungan tokoferol yang lebih tinggi daripada P. conoideus Lam. varietas buah merah yang telah dikenal sebelumnya sebagai agen anti kanker (Budi dan Paimin, 2005). Namun efek sitotoksik dan mekanisme penghambatan proliferasi dari P. conoideus Lam varietas buah kuning ini belum sepenuhnya diketahui. Beberapa data di atas menunjukkan bahwa penelitian tentang pengaruh pemberian sari P. conoideus Lam. varietas buah kuning pada sel kanker Raji (kanker tenggorok yang terinfeksi EBV) secara in-vitro sangat penting untuk dilakukan. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan kontribusi
300
Makalah Pendamping: Kimia Paralel E
dalam perkembangan pengobatan kanker tengorok, khususnya mengenai penggunaan P. conoideus Lam. varietas buah kuning sebagai agen anti kanker. METODOLOGI PENELITIAN 1. Pengumpulan sampel Bahan utama yang digunakan adalah sari P. conoideus Lam varietas buah kuning yang diperoleh dari I Made Budi yang diperoleh dari Papua. Sampel berupa ekstrak cair simplisia P. conoideus Lam varietas buah kuning sebanyak 200 ml. 2. Partisi sampel Sampel sebanyak lima puluh ml dipisahkan komponen kandungan kimianya menggunakan corong pisah dengan campuran pelarut methanol – kalium hidroksida (KOH) 30% - eter (1:1:1 v/v). Campuran pelarut ini terbagi menjadi dua bagian yaitu metanol pada bagian atas dan eter pada bagian bawah serta KOH 30% terdistribusi diantara dua bagian tersebut. Perbandingan sampel dengan campuran pelarut yaitu 1:1 (v/v). Keberhasilan pemisahan ini dimonitor dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) yang ditandai dengan tidak adanya kesamaan bercak antara kedua ekstrak tersebut. Fase diam yang digunakan silika GF254 dengan fase gerak heksana-etil asetat (3:1 v/v) dan deteksi yang digunakan yaitu UV 254, UV 366 dan pereaksi kimia semprot serium sulfat 0 yang dipanaskan pada suhu 105 C selama 5 menit. Bioassay guided menggunakan metode uji sitotoksisitas terhadap cell line Raji . Bagian yang memberikan nilai LC50 paling kecil yang akan diteliti llebih lanjut. 3. Fraksinasi Bagian atas (fase methanol) difraksinasi menggunakan kromatografi cair yang dimodifikasi dengan vakum. Proses ini dilakukan dengan menggunakan fase diam alumina dengan fase gerak mulai dari fase gerak bersifat non polar dan secara bertingkat (gradient) menuju fase gerak yang bersifat polar (heksana - eter = 9:1; 5:1; 3:1; 1:1; 1:3; 1:5, etil asetat 100% dan metanol 100%). Volume masing-masing fase gerak yang dilakukan yaitu 50 ml. Proses ini menghasilkan sepuluh fraksi, yaitu berturutturut dari F1 sampai F10 Sepuluh fraksi yang diperoleh dimonitor profil kandungan kimianya dengan menotolkannya pada plat KLT dan dielusikan dengan fase gerak heksana-etil asetat (3:1
v/v). Deteksi yang digunakan adalah UV 254, UV 366 dan pereaksi kimia semprot serium 0 sulfat yang dipanaskan pada suhu 105 C selama 5 menit. Fraksi yang memiliki profil kandungan kimia hampir sama digabung menjadi 1 fraksi. Bioassay guided menggunakan metode uji sitotoksisitas terhadap cell line Raji dilakukan terhadap beberapa fraksi. Juga dilakukan uji doubling time terhadap fraksi. Bioassay guided menggunakan metode uji sitotoksisitas terhadap cell line Raji dilakukan terhadap beberapa fraksi. Fraksi yang memberikan nilai LC50 paling kecil (fraksi aktif). Uji Sitotoksisitas Sel uji Raji ditumbuhkan dengan metode Freshney (2000). Uji sitotoksisitas dilakukan pada plate mikrokultur 96 well. Uji sitotoksik sel Raji tiap 4 sumuran dibutuhkan 2 x 10 sel dalam 100 µl media RPMI (Zhu et al., 2003). Selanjutnya ekstrak diberikan 100 µl pada peringkat seri konsentrasi secara triplet. Dibuat Kontrol RPMI dan pelarut DMSO 0,25%. Uji sitotoksik dilakukan dengan metode penghitungan dye exclusion tryphan blue. Uji waktu penggandaan sel (doubling time) dilakukan dengan cara Sel distarvasi 24 jam dalam media kultur, selanjutnya sel ditumbuhkan di mikroplate dengan media ditambah sampel dengan konsentrasi yang tidak mematikan (di bawah LC50) sampling dilakukan pada jam ke 0, 24, 48 dan 72. Masing-masing sumuran dihitung jumlah sel hidup lalu dibuat kurva jumlah sel dan waktu inkubasi (Mursyidi, 1985). HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian Uji Sitotoksisitas Fraksi A, Fraksi B dan Fraksi C terhadap sel Raji dengan senyawa uji ekstrak Pandanus conoideus Lam. Var. buah kuning. Uji sitotoksik dilakukan dengan memberikan senyawa uji pada kultur sel selama 24 jam. Dari uji perbandingan dan perhitungan LC50 sel raji dengan menggunakan 3 fraksi sebagaimana tampak pada table 1 (Fraksi A), Tabel 2 (Fraksi B) dan Tabel 3 (Fraksi C) diperoleh berturut-turut 1.25 µl/mL, 0.3125 µl/mL, 0.15625 µl/mL. Berdasarkan perhitungan diatas maka dapat dinyatakan fraksi teraktif dalam menimbulkan kematian sel Raji adalah pada fraksi C. Menurut Ueda et al. (2002) ekstrak tanaman yang memiliki LC50 < 100 g/ml berpotensi untuk dikembangkan. Pengujian kinetika prliferasi dilaksanakan dengan melakukan uji doubling time.
ISBN : 979-498-547-3
Makalah Pendamping: Kimia
301
Paralel E
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tabel 1. Uji Sitotoksisitas fraksi A dari sari buah kuning pada sel Raji Sitotoksisitas Konsentrasi I II III Hidup Mati Hidup Mati Hidup Kontrol 70 69 71 5 15 31 7 29 10 2.5 15 30 11 26 13 1.25 20 25 19 22 20 0.625 22 22 24 19 24 0.3125 26 19 29 18 29 0.15625 30 16 33 16 31 0.078125 34 15 36 14 36 0.0309625 40 12 41 13 40 0.01953125 45 11 44 11 48 0.009765625 49 7 53 8 54
Mati 31 28 26 22 20 17 16 14 11 9
Tabel 2 . Uji Sitotoksisitas fraksi B dari sari buah kuning pada sel Raji Sitotoksisitas I II III Konsentrasi Hidup Mati Hidup Mati Hidup Kontrol 70 71 70 5 11 29 9 33 11 2.5 14 27 27 28 13 1.25 22 25 28 22 21 0.625 25 22 29 21 25 0.3125 30 19 31 19 29 0.15625 32 17 34 17 32 0.078125 37 14 37 15 37 0.0309625 43 13 41 12 42 0.01953125 49 10 50 11 51 0.009765625 55 8 57 8 57
Mati 30 29 26 22 20 19 16 14 11 8
Tabel
No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
3 . Uji Sitotoksisitas fraksi C dari sari buah kuning pada sel Raji Sitotoksisitas Konsentrasi I II III Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati Kontrol 69 69 67 5 29 38 33 2.5 30 35 34 1.25 29 32 33 0.625 32 1 33 30 0.3125 4 38 7 36 3 33 0.15625 7 40 9 36 9 36 0.078125 11 31 14 33 12 31 0.0309625 24 28 20 29 22 29 0.01953125 30 23 29 22 30 25 0.009765625 44 19 37 15 39 19
Efek penghambatan kinetika proliferasi Sel Raji Untuk mengetahui efek penghambatan kinetika proliferasi setelah perlakuan dengan ekstrak Pandanus conoideus Lamb var buah kuning pada sel Raji, maka dilakukan uji penghambatan kinetika proliferasi selama 72 jam, dengan cara menghitung pertumbuhan sel dalam rentang
ISBN : 979-498-547-3
waktu tertentu (jam ke-1, 24, 48 dan 72) melalui uji doubling time. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak Pandanus conoideus var buah kuning secara umum mempunyai efek anti proliferatif, dimana efek anti proliferatif cukup tinggi didapatkan dari fraksi C. Nilai kematian selama rentang waktu 24 jam, 48 jam dan 72 jam tampak bahwa kematian sel Raji memang dominan hanya disebabkan oleh efek ekstrak
Makalah Pendamping: Kimia
302
Paralel E
Pandanus conodeus var buah kuning, dengan nilai R 0,9 pada konsentrasi 0,0097653 µl/mL, 0,01953125 µl/mL dan 0,0309625 µl/mL. Yang menjadi permasalahan efek anti proliferasi ini letaknya pada rekonformasi p53 termutasi sehingga mendorong terjadinya apoptosis atau melalui jalur lainnya. Penemuan senyawa yang potensial sebagai sitostatika yang bekerja melalui peningkatan ekspresi dan aktivitas
transkriptional p53 tentunya sangat bermanfaat dalam terapi kanker. Hal ini disebabkan karena sebagian besar sel kanker pada manusia mengalami kelainan pada fungsi p53nya, sehingga dengan memberikan obat yang mampu meningkatkan atau memperbaiki fungsi p53, maka pertumbuhan kanker dapat dihambat sehingga diharapkan dapat diatasi.
Tabel 4. Rangkuman hasil uji doubling time SEL RAJI Konsentrasi I II III (µl/mL) Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati 4 4 4 Kontrol 2.10 2.10 2.10 4 4 4 0.078125 2.10 2.10 2.10 4 4 4 0.0309625 2.10 2.10 2.10 4 4 4 0.01953125 2.10 2.10 2.10 4 4 4 0.0097656 2.10 2.10 2.10 4 4 4 Kontrol 4,35.10 4,4.10 4,4.10 4 4 4 4 4 4 0.078125 2,55.10 0,2.10 2,6.10 0,2.10 2,55.10 0,2.10 4 4 4 4 4 4 0.0309625 3.10 0,2.10 2,6.10 0,2.10 2,55.10 0,2.10 4 4 4 4 4 4 0.01953125 3,45.10 0,25.10 3,45.10 0,25.10 3,4.10 0,25.10 4 4 4 4 4 4 0.0097656 3,75.10 0,35.10 3,7.10 0,35.10 3,7.10 0,35.10 4 4 4 Kontrol 8,9.10 8,95.10 8,9.10 4 4 4 4 4 4 0.078125 4,9.10 0,35.10 4,9.10 0,3.10 4,9.10 0,35.10 4 4 4 4 4 4 0.0309625 5,6.10 0,45.10 5,65.10 0,45.10 5,6.10 0,45.10 4 4 4 4 4 4 0.01953125 6.10 0,6.10 5,95.10 0,65.10 5,95.10 0,65.10 4 4 4 4 4 4 0.0097656 7.10 0,75.10 7,05.10 0,7.10 7.10 0,7.10 4 4 4 Kontrol 18,05.10 18.10 18.10 4 4 4 4 4 4 0.078125 9,05.10 0,45.10 9,1.10 0,45.10 9,05.10 0,45.10 4 4 4 4 4 4 0.0309625 10,9.10 0,6.10 11.10 0,55.10 10,95.10 0,55.10 4 4 4 4 4 4 0.01953125 11,9.10 0,75.10 11,75.10 0,8.10 11,8.10 0,75.10 4 4 4 4 4 4 0.0097656 13,8.10 1.10 13,8.10 1.10 13,8.10 0,95.10
Jam 0
24
48
72
Jam 0
24
48
72
Table 5. Rata-rata kematian SEL RAJI Konsentrasi RATA-RATA (µl/mL) Hidup Mati 4 Kontrol 2.10 4 0.078125 2.10 4 0.0309625 2.10 4 0.01953125 2.10 4 0.0097656 2.10 4 Kontrol 4,38.10 4 4 0.078125 2,56.10 0,2.10 4 4 0.0309625 3.10 0,216.10 4 4 0.01953125 3,43.10 0,216.10 4 4 0.0097656 3,716.10 0,35.10 4 Kontrol 8,916.10 4 4 0.078125 4,9.10 0,33.10 4 4 0.0309625 5,616.10 0,45.10 4 4 0.01953125 5,96.10 0,63.10 4 4 0.0097656 7,016.10 0,716.10 4 Kontrol 18,016.10 4 4 0.078125 9,06.10 0,45.10 4 4 0.0309625 10,95.10 0,56.10 4 4 0.01953125 11,816.10 0,76.10 4 4 0.0097656 13,8.10 0,983.10
ISBN : 979-498-547-3
Makalah Pendamping: Kimia
303
Paralel E
)@))?>*6* "
% ;
!# 1 $ #!! <= ; 444
;
2
2
$ # " !
$& $% $$ $"
!! 1 $ "4 <= ; 444
!
! /
/
)@)(?6A($6
;
;
! 1 $ "&& <= ; 44%
$
! 1 $ "%& <= ; 4&&
$
$ ! /
2
2
$
)@)A)?*$6
! /
Gambar 1. Grafik jumlah sel hidup vs waktu inkubasi dalam uji doubling time KESIMPULAN Fraksinasi ekstrak Pandanus conoideus, Lam var buah Kuning menggunakan kromatografi cair yang dimodifikasi dengan vakum dapat menghasilkan tiga fraksi yang kemudian diuji bioassay dengan sel Raji. Pemberian ketiga fraksi mampu meningkatkan tingkat kematian sel Raji dan fraksi C (fraksi metanol) merupakan fraksi teraktif dengan LC50 sebesar 0.1562 µl/mL. UCAPAN TERIMA KASIH Dengan terselesaikan penelitian ini maka tim peneliti mengucapkan terima kasih atas pendanaan HIbah Strategis Nasional DIKTI tahun 2009,pada Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu UGM sebaga salah satu penyedia sarana penelitian ini dan pada Drs I Made Budi, MSi dari Univesitas Cendrawasih yang telah memberikan ekstrak Pandanus conoideus Lam.var buah kuning. DAFTAR PUSTAKA Budi, I. M., dan F. R., Paimin. 2005. Buah Merah. Seri Agrisehat. Jakarta: Penebar Swadaya. h:20-48
ISBN : 979-498-547-3
Chin, Y. W., Balunas, M. J., Chai, H. B., Kinghorn, A. D. 2006. ‘Drug Discovery From Natural Sources’. The AAPS Journal 8(2):239-253 Cragg, G. M., and David, J. N. 2005. ‘Plant as Source of Anti-Cancer Agents’. Journal of Ethnopharmacology 100:72-79 Cragg, G. M., and Newman, D. J. 2003. ‘Plants as a Source of Anti-Cancer and Anti-HIV Agents. Ann. Appl. Biol. 143:127-133 Freshney R Ian, 2000, Culture of Animal Cells: A manual of Basic Techniques 4th Ed., Wiley-Lies, Canada Hariani, R. 2005. Nutrisi Pada Penderita Kanker. http://www.dharmais.co.id/ new/content.php?page=article&lang=id &id=4, [20 Juli 2008] Jiang, Q. et al. 2004. . ‘ -Tocopherol or Combinations of Vitamin E Forms Induce Cell Death in Human Prostate Cancer Cells by Interrupting Sphingolipid Synthesis’. PNAS 101 (51):17825-17830 Kinghorn, A. D, et al. 2003. ‘Novel Strategies for the Discovery of Plant-Derived
304
Makalah Pendamping: Kimia Paralel E
Anticancer Agents’. Pharmaceutical Biology 41: 53-67 Moeljoprawiro, S. et al. 2007. ‘Pengaruh Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) Terhadap Pertumbuhan Sel Kanker Payudara dan Sel Kanker Usus Besar’. Berkala Ilmiah Biologi 6(2): 121130 Mursyidi A., 1985, Statistika Farmasi dan Biologi, Ghalia, Indonesia, Jakarta. Rumanthi, E., 2008, Skripsi, Modifikasi Teknik Kromatografi Untuk Pemisahan Karotenoid Dari Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk.) sebagai turunannya, Universitas Sebelas Maret, Surakarta
Sugiyanto, B., Sudarto, Edy, M., dan Agung, E. N. 2003. ‘Aktivitas Antikarsinogenik Senyawa Yang Berasal Dari Tumbuhan’. Majalah Farmasi Indonesia. 14(3):132–141 Ueda .Y, Tezuka Y., Banskota A.H. Tran Q.L Tran Q.K. Harimaya Y, Saiki I dan Kadota S., 2002, Antiproliferatif activity of Vietnamese Medicinal Plants, Biol.Pharm Bull 25 (6): 753-760 Valeriote F, Grieshaber, C. K., Media, J., Pietraszkewics, H., Hoffmann, J., Pan, M., McLaughlin, S. 2002. ‘Discovery and Development of Anticancer Agents From Plants’. Journal of Experimental Therapeutics and Oncology 2:228-236
ISBN : 979-498-547-3
