Oleh: Bagus Komang Satriyasa I Made Jawi ABSTRAK

POTENSI EKSTRAK AIR UMBI UBI JALAR UNGU MENINGKATKAN EKSPRESI GEN SUPEROXIDE DISMUTASE DAN CATALASE SERTA MENURUNKAN MDA PADA BERBAGAI ORGAN TIKUS DIABETES

Oleh: Bagus Komang Satriyasa I Made Jawi

ABSTRAK Diabetes mellitus (DM) adalah suatu penyakit yang disertai dengan pembentukan radikal bebas yang sangat tinggi sehingga mudah menimbulkan berbagai komplikasi, akibat dari stres oksidatif. Bahan makanan seperti umbi ubijalar ungu yang mengandung flavonoid yaitu antosianin cukup tinggi diyakini dapat melindungi tubuh dari pengaruh buruk radikal bebas, sehingga diduga dapat mencegah komplikasi DM. Umbi ubijalar ungu yang ada di Bali dikenal mengandung antosianin cukup tinggi dan telah diteliti sebagai antioksidan in vivo pada tikus. Tujuan penelitian ini adalah untuk membuktikan ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat peningkatan ekspresi gen superoxide dismutase (SOD) dan catalase serta menurunkan malondialdehyde (MDA) pada organ penting tikus DM. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan rancangan randomized post test only control group design. Subyek penelitian adalah tikus putih DM yang dibagi menjadi 2 kelompok yaitu kontrol dan perlakuan, masing-masing 12 ekor. Kelompok kontrol akan diberikan streptozotocin sehingga menjadi DM. Kelompok perlakuan diberikan streptozotocin dan ekstrak air umbi ubijalar ungu 4 cc/hari. Perlakuan ini dilakukan selama 2 bulan.. Ekstrak air umbi ubijalar ungu secara bermakna meningkatkan ekspresi mRNA SOD2 aorta dan ginjal namun menurunkan ekspresi mRNA SOD2 secara bermakna pada hati. Ekstrak air umbi ubijalar ungu juga meningkatkan ekspresi mRNA SOD2 jantung namun secara statistik tidak bermakna. Ekstrak air umbi ubijalar ungu secara bermakna meningkatkan ekspresi mRNA CAT ginjal dan meningkatkan ekspresi mRNA CAT pada jantung, aorta namun tidak bermakna. Ekstrak air umbi ubijalar ungu menurunkan ekspresi mRNA CAT hati namun tidak bermakna.

Kata kunci : Ekstrak air umbi jalar ungu, gen SOD, catalase, MDA

BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Diabetes mellitus (DM) merupakan masalah kesehatan

hingga saat ini, karena dapat

menimbulkan berbagai komplikasi pada berbagai organ. Komplikasi tersebut disebabkan oleh keadaan hiperglikemia yang kronis sehingga meningkatkan terbentuknya advanced glycation end products (AGEs ), dan radikal bebas yang lain (Kataya, 2007; Srinivasan, 2007). Radikal bebas yang meningkat pada DM disertai dengan penurunan fungsi antioksidan endogen, seperti misalnya superoxide dismutase (SOD) dan catalase, sehingga terjadi stres oksidatif (Maritim et al.,2003). Peningkatan SOD dan Catalase serta antioksidan lain dapat memperkecil terjadinya komplikasi DM (Krishan and Chakkarwar, 2011). Pemberian antioksidan pada penderita DM dapat mengatasi komplikasi makrovaskular, mikrovaskular serta mengatasi kerusakan jaringan akibat stres oksidatif (Lean, 1999; Kataya, 2007). Flavonoid dari berbagai bahan makanan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan memiliki efek antioksidan sehingga bersifat protektif terhadap stres oksidatif (Prior, 2003; SanchezMoreno, 2003; Micallef, 2007). Antosianin adalah salah satu jenis flavonoid (Ghosh, 2007), dan dapat meningkatkan ekspresi gen antioksidan endogen yang diperantarai aktivasi Nrf2 ( Johnson et al.,2009). Antosianin dari blueberry dapat meningkatkan SOD melalui aktivasi Nrf2 (Wang et al.,2010), dan mengatur ekspresi gen yang berkaitan dengan inflamasi (Mauray et al.,2010).

Ubijalar ungu yang ada di Bali memiliki kadar antosianin cukup tinggi (Suprapta, 2004), dan terbukti dapat mengatasi stres oksidatif pada mencit (Jawi, 2008). Selain sebagai antioksidan ekstrak air umbi ubijalar ungu juga dapat mempertahankan kadar gula darah dan meningkatkan total antioksidan pada tikus yang diberikan beban glukosa dosis tinggi (Sutirta-Yasa dan Jawi, 2011). Ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan kadar gula dan MDA serta meningkatkan antioksidan total pada darah tikus diabetes (Jawi dan Sumardika, 2012), dan dapat meningkatkan SOD darah kelinci normal (Jawi, 2012). Berdasarkan hasil penelitian tersebut diduga ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat mengatasi stres oksidatif pada berbagai organ penderita DM dengan meningkatkan antioksidan endogen melalui mekanisme peningkatan ekspresi gen atau peningkatan mRNA SOD dan catalase. Untuk membuktikan dugaan tersebut maka dilakukan penelitian pada tikus putih

DM yang diinduksi dengan pemberian

streptozotocin. Tikus yang menderita DM tersebut kemudian diberikan esktrak air umbi ubijalar ungu, dan dilakukan evaluasi terhadap ekspresi gen tersebut pada berbagai organ penting.

1.2 Rumusan Masalah Dari latar belakang diatas dirumuskan masalah sebagai berikut: 1. Apakah pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan MDA pada hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin? 2. Apakah pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen SOD pada jaringan hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin?

3. Apakah pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen catalase pada jaringan hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin?

1.3.Tujuan Penelitian

1. Membuktikan ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan kadar MDA pada jaringan hati,ginjal, jantung dan aorta tikus putih DM

yang diinduksi dengan

streptozotocin. 2. Membuktikan ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen SOD pada jaringan hati,ginjal, jantung dan aorta tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin. 3. Membuktikan ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen catalase pada jaringan hati,ginjal, jantung dan aorta tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin. 4.Manfaat dan Keutamaan Penelitian Masalah DM yang kurang terkontrol sangat banyak dijumpai dalam masyarakat. Penyebabnya adalah pengobatan DM yang memerlukan pengobatan yang lama dan bahkan seumur hidup. Harga obat yang mahal dan munculnya efek samping obat mendorong penderita DM menjadi kurang taat dalam minum obat, sehingga terjadilah fluktuasi dari kadar gula darah yang terus menerus. Keadaan ini akan menyebabkan terjadinya stress oksidatif dengan segala dampak buruk yang ditimbulkan, sehingga terjadi berbagai komplikasi DM. Stres oksidatif adalah salah satu penyulit penderita DM

yang perlu diatasi. Cara yang mudah dan relatif murah mengatasi stress oksidatif adalah dengan memanfaatkan makanan yang mengandung antioksidan alami. Umbi ubijalar ungu telah terbukti pada hewan coba memiliki khasiat antioksidan yang cukup baik, sehingga perlu dikaji manfaatnya untuk mencegah terjadinya berbagai komplikasi pada DM, akibat stress oksidatif. Bila dalam penelitian ini terbukti bahwa ekstrak air dari umbi ubijalar ungu dapat mengatasi stress oksidatif melalui peningkatan ekspresi gen antioksidan SOD dan catalase pada berbagai organ, maka sebagai manfaat praktis dari penelitian ini adalah ditemukan obat herbal yang baru dari umbi ubijalar ungu dengan indikasi mencegah komplikasi akibat stres oksidatif khusunya pada penderita DM dan pada keadan stress oksidatif yang lain, pada berbagai organ penting. Bila hal ini terbukti maka para petani ubijalar ungu dapat mengembangkan tanaman dan dapat meningkatkan penghasilan karena umbi ubijalar ungu akan diburu oleh pengusaha farmasi untuk dijadikan bahan baku pembuatan obat herbal yang bermutu, sehingga harga ubijalar ungu tersebut meningkat.

BAB II. KAJIAN PUSTAKA

2.1. Stres Oksidatif dan Kaitannya dengan Komplikasi DM Hiperglikemia yang kronis akan menyebabkan meningkatnya pembentukan reactive oxygen species (ROS), melalui beberapa mekanisme yaitu oksidasi glukosa, peroksidasi lipid dan adanya interaksi glukosa dengan protein membentuk Amadori product sehingga akan terjadi stres oksidatif (Maritim,2003). Sumber lain produksi ROS pada keadaan hiperglikemia adalah meningkatnya Advanced Glycation End-product (AGEs) sebagai akibat dari hiperglikemia dan stress oksidatif ( Gao and Mann, 2009). Kadar AGEs yang tinggi di dalam darah merupakan salah satu faktor penting terhadap timbulnya inflammasi kronis pada pembuluh darah sehingga muncul berbagai keluhan yang disebut komplikasi kardiovaskuler dari DM. Sumber penyebab dari AGEs pada penderita DM adalah kadar gula yang tinggi atau adanya fluktuasi dari kadar gula darah yang terus menerus. Kadar gula darah yang stabil akan memperkecil untuk terbentuknya AGEs (Tedgui and Mallat, 2006). Selain disebabkan oleh kadar gula darah, AGEs juga akan meningkat bila terjadi stres oksidatif yang terjadi dengan berbagai penyebab. Stres oksidatif adalah kondisi dimana kadar antioksidan endogen tidak mampu mengatasi radikal bebas yang terbentuk didalam tubuh. Radikal bebas sendiri akan mempercepat terbentuknya AGEs dan sebaliknya AGEs akan meningkatkan terbentuknya radikal bebas. AGEs yang beredar didalam darah akan ditangkap oleh reseptor AGEs yang terdapat pada makrofag.

Ikatan AGEs dengan reseptornya akan menimbulkan signal tranduksi pada makrofag yang akan mengaktifkan makrofag sehingga terbentuknya interleukin proinflammasi, sehingga terjadi inflamasi pada berbagai organ yang merupakan mekanisme komplikasi DM. Ikatan AGEs dengan reseptor AGEs yang ada pada endotel pembuluh darah akan menyebabkan terekspresinya berbagai adhesion molekul terutama VCAM-1, ICAM-1 dan E-selectin yang merupakan mediator inflammasi penting untuk terjadinya aterosklerosis (Tedgui and Mallat, 2006) Stres oksidatif pada penderita DM diperberat oleh adanya stres metabolik dan AGEs yang berkelanjutan, sehingga bisa menyebabkan kerusakan berbagai sel dan jaringan. Stres oksidatif sebagai akibat terbentuknya ROS karena hyperglykemia sangat berperan terhadap berbagai komplikasi DM seperti nephropathy, retinopathy, neuropathy dan cardiomyopathy (Bhandari et al, 2007).

2.2 Stres Oksidatif , SOD, Catalase dan Peran Antosianin /Flavonoid Pada keadaan normal di dalam tubuh terdapat antioksidan endogen seperti SOD, glutathione peroxidase, catalase, heme oxygenase yang akan mencegah terjadinya kerusakan sel pada berbagai organ dalam keadaan stress oksidatif. Peningkatan SOD pada ginjal

mencit

transgenic mampu memperkecil kerusakan ginjal akibat stress oksidatif. Pemberian flavonoid resveratrol dan berbagai jenis antioksidan mampu mengatasi stress oksidatif pada jaringan ginjal pada DM (Krishan and Chakkarwar, 2011). Flavonoid merupakan senyawa dengan berat molekul rendah yang terdapat pada tumbuhtumbuhan yang pada umumnya berperan sebagai pigmen yang memberi warna pada daun dan bagian lain dari tumbuh-tumbuhan (Middleton et al., 2000). Flavonoid juga dapat mengatur

tranduksi sinyal di dalam sel (Han et al., 2007). Efek flavonoid terhadap sistem biologis berbedabeda tergantung dari jenis dan struktur kimia flavonoid. Sesuai dengan rumus kimia yang dimiliki, maka flavonoid genistein dapat meningkatkan kadar glutathione-S-transferase pada sel sehingga dapat melindungi sel dari berbagai genotoxic agents (Steiner et al, 2007). Secara umum efek flavonoid dalam mengatasi stress oksidatif dapat dilihat pada gambar 1 berikut.

STRES OKSIDATIF

Flavonoid

Gambar 1. Cara kerja dari flavonoid sebagai antioksidan dan mekanismenya dalam meningkatkan antioksidan endogen (dengan modifikasi) (Han, 2007).

Efek flavonoid terhadap ROS terjadi melalui dua mekanisme yaitu dengan meningkatkan antioksidan endogen dan menangkap radikal bebas/menetralisir radikal bebas. Peningkatan antioksidan endogen oleh flavonoid telah terbukti dalam penelitian in vitro melalui peningkatan faktor transkripsi Nrf2 yang meningkatkan ekspresi protein HO-1 (Maher and Hanneken, 2005).

Peran flavonoid terhadap peningkatan antioksidan endogen tergantung dari jenis flavonoid. Seperti terlihat dalam Gambar 1, flavonoid dapat mengaktifkan ERK (extracellular signalregulated protein kinase), JNK (c-Jun N-terminal kinase) dan p38. Selanjutnya akan mengaktifkan Nrf2 sehingga terjadi peningkatan ekspresi gen antioksidan endogen. Flavonoid quercetin dapat menghambat peroksidasi lipid, secara langsung maupun secara tidak langsung melalui peningkatan enzim antioksidan seperti superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), dan glutathione (GSH) pada mencit (Molina et al, 2003). Sedangkan ekstrak curcumin yang juga mengandung flavonoid dapat meningkatkan kadar SOD dan catalase serta menurunkan kadar malondialdehid pada jaringan hati yang mengalami reperfusi/stress oksidatif (Shen et al., 2007). Jadi, penghambatan stres oksidatif oleh berbagai jenis flavonoid berbeda-beda tergantung dari rumus kimia flavonoid tersebut. Diasumsikan bahwa flavonoid dari umbi ubijalar ungu yang merupakan suatu antosianin dapat meningkatkan antioksidan dengan mekanisme peningkatan ekspresi gen seperti SOD, dan catalase pada berbagai organ melalui aktivasi Nrf2 yang akan dibuktikan dalam penelitian ini.

2.3 Penelitian Umbi Ubijalar Ungu dan Stres Oksidatif yang Telah Dilakukan Penelitian tentang pemanfaatan ekstrak air umbi ubijalar ungu sebagai antioksidan telah dilakukan pada hewan coba mencit, tikus dan kelinci. Pada mencit yang mengalami stress oksidatif dengan memberikan beban fisik berat ternyata ekstrak

umbi ubijalar ungu dapat

menurunkan MDA, suatu indikator dari stress oksidatif yang diukur pada darah dan berbagai organ ( Jawi, 2008). Penelitian pada kelinci yang diberikan makanan tinggi kolesterol selama 12 minggu, terjadi kenaikan MDA dan penurunan total antioksidan darah yang bermakna. Kenaikan MDA dan penurunan total antioksidan tersebut dapat dicegah dengan ekstrak dan sirup umbi ubijalar ungu seperti terlihat pada tabel no 1 ( Jawi dan Budiasa, 2011).

Tabel No: 1 Rata-rata Kadar MDA, Total Antioksidan ( Pre test dan Post-test ) Ke 4 Kelompok

N0

Binatang Percobaan.

Rata-rata MDA

Rata-rata Total Antioksidan

Darah (mmol/l) ± SD

Darah ( mmol/l) ± SD

Pre-test

Post-test

Pre-test

Post-test

( 1) 4,44 ± 0,84

11,94 ± 1,77

1,54 ± 0,37

1,33 ± 0,04

( 2) 5,23 ± 1,17

5,81 ± 1,29

1,31 ± 0,34

3,23 ± 0,36

( 3) 5,59 ± 2,00

8,22 ± 3,99

1,06 ± 0,43

2, 12 ± 0,80

(4) 5,26 ± 1,96

9,38 ± 5,13

1,15 ± 0,45

2,10 ± 0,91

Keterangan: KLP (1): Kelompok kontrol ( Makanan tinggi kolesterol 3 bln) KLP (2): Kelompok ekstrak air ( Makanan tinggi kolesterol 3 bln dan ekstrak air umbi ubi jalar ungu 6 ml/hari/ekor)

KLP (3): Kelompok ekstrak ethanol ( Makanan tinggi kolesterol 3 bln dan ekstrak ethanol umbi ubi jalar ungu 6 ml/hari/ekor) KLP (4): Kelompok sirup ( Makanan tinggi kolesterol 3 bln dan sirup umbi ubi jalar ungu 6 ml/hari/ekor)

Penelitian pada tikus yang diberikan beban glukosa akut dan diberikan ekstrak ethanol umbi ubijalar ungu membuktikan bahwa terjadi penurunan MDA yang bermakna pada kelompok yang diberikan ekstrak 4 CC. Selengkapnya dapat dilihat pada grafik no 1 berikut.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

0 Menit

MDA Kontrol

MDA KLP 1CC MDA KLP 2 CC MDA KLP 4CC

60 menit

120 menit

180 menit

Grafik no 1 Perbandingan rata-rata kadar MDA darah pada semua kelompok percobaan (Hasil penelitian Sutirta-Yasa dan Jawi, 2011)

Pada grafik no 2 dapat dilihat terjadi kenaikkan total antioksidan darah pada tikus yang diberikan beban glukosa dengan ekstrak ethanol umbi ubijalar ungu. Semakin tinggi dosis yang diberikan angka total antioksidan darah semakin naik. Jadi ada manfaat antioksidan yang terlihat pada penelitian ini.

4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0

Kontrol Kelompok 1 cc Kelompok 2 cc Kelompok 4 cc

0 Menit

60 menit

120 menit

180 menit

Grafik no 2: Perbandingan rata-rata kadar total antioksidan darah pada semua kelompok percobaan ( Sutirta Yasa dan Jawi, 2011). 2.4 Penelitian Antosianin dan Ekstrak Air Umbi Ubijalar Ungu pada Diabetes. Antosianin adalah pigmen alami yang larut dalam air, dan menimbulkan warna yang bervariasi pada buah dan daun serta bunga dari tumbuh-tumbuhan. Antosianin diyakini sangat berpengaruh terhadap kesehatan manusia, sehingga penelitian tentang khasiat antosianin terhadap kesehatan manusia telah banyak dilakukan ( Ghosh, 2007).

Buah-buahan yang

mengandung antosianin telah terbukti dapat mencegah berbagai penyakit yang berhubungan

dengan stres oksidatif seperti misalnya penyakit jantung koroner, penyakit inflamasi, kanker dan diabetes mellitus. Efek antosianin terhadap kemampuannya mengatur kadar gula darah, telah banyak dilakukan secara invivo pada hewan maupun invitro. Penelitian yang melihat efek dari 9 jenis antosianin dari berbagai sumber ternyata ada dua jenis antosianin yang dapat meningkatkan sekresi insulin oleh sel beta pada biakan jaringan, yaitu cyanidin-3-glucoside dan delphinidin-3glucoside (Jayaprakasam, 2004). Dengan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa dengan mengkonsumsi buah dan sayur yang mengandung antosianin dapat menurunkan kejadian DM type 2 (Ghosh, 2007), karena beberapa antosianin adalah suatu insulin secretagogous. Pemberian cyanidin-3-glucoside dan delphinidin-3-glucoside terhadap sel beta yang diinduksi dengan glukosa 4-10 m M mampu meningkatkan insulin hampir 1,5 kali lebih tinggi dari kontrol. Kemampuan merangsang sekresi insulin oleh berbagai jenis antosianin berbeda-beda tergantung dari gugus hydroxil pada cincin B dari antosianin ( Jayaprakasam, 2004). Penelitian dengan pemberian cranberry yang mengandung antosianin, terhadap penderita DM type 2 selama 12 minggu ternyata separuh lebih dari pasien dapat mempertahankan kadar gula darah dalam batas normal. Antosianin juga memiliki efek penghambat ensim alfa-glucosidase sehingga dapat mencegah kenaikan gula darah setelah makan ( Ghosh, 2007). Hasil penelitian yang mengkaji pengaruh pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu selama 60 hari terhadap gula darah dan stress oksidatif pada tikus diabetes dapat dilihat pada Grafik 3 ( A.B.dan C). Pada grafik dapat dilihat terjadi kenaikan kadar gula darah, MDA darah dan terjadi penurunan total antioksidan yang bermakna setelah pemberian streptozotocin pada tikus. Pada kelompok perlakuan ( kelompok yang diberikan ekstrak air umbi ubijalar ungu) terjadi penurunan kadar gula,MDA darah yang bermakna dibandingkan kelompok kontrol

(P<0,05), dan terjadi kenaikan total antioksidan yang bermakna (p<0,05) dibandingkan dengan kontrol.

250 200 150

Kadar Gula darah Klp Kontrol

100

Kadar Gula Darah KLP Ekstrak

50 0 Awal

STL STZ

Post Test 1

post Test 2

Grafik 3 A. Perbandingan Kadar Gula Darah Antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan

10 8 6

MDA Kontrol

4 2 0 Awal

STL STZ Post Test 1post Test 2

Grafik 3 B. Perbandingan Kadar MDA Darah Antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan

3 2.5 2 TAS Kontrol

1.5

TAS Ekstrak

1

0.5 0 Awal

STL STZ

Post Test 1 post Test 2

Grafik 3.C. Perbandingan Kadar Perlakuan

Total antioksidan (TAS)

Darah Antara Kontrol dengan

BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Berpikir Dari sumber pustaka yang dikaji dan dari penelitian yang telah dilakukan dapat disusun kerangka berfikir sebagai berikut. Hiperglikemia akan menimbulkan stres oksidatif serta peningkatan AGES. Stres oksidatif dan stres metabolik akan menyebabkan penurunan aktivitas antioksidan endogen sehingga memperburuk stres oksidatif dan terjadi kerusakan berbagai organ sehingga terjadi komplikasi DM pada berbagai organ penting misalnya pada hati,ginjal, jantung dan aorta. Pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu yang mengandung antosianin diharapkan dapat mencegah stres oksidatif. Antosianin dalam ekstrak umbi ubijalar ungu berkhasiat sebagai antioksidan yang kuat dan sekaligus dapat menurunkan kadar gula darah sehingga dapat mencegah stres oksidatif, mengurangi AGEs, dan mengurangi inflamasi dan mempertahankan fungsi organ penting sehingga diharapkan meningkatkan kadar antioksidan seperti SOD dan catalase pada jaringan tersebut melalui aktivasi factor transkripsi Nrf2, sehingga meningkatkan mRNA SOD dan mRNA catalase.

3.2 Konsep Penelitian Berdasarkan landasan teori yang telah diuraikan dapat disusun kerangka konsep dari penelitian sebagai berikut.

Konsep Penelitian

TIKUS PUTIH

STREPTOZOTOCIN UMUR, KELAMIN, EKSTRAK AIR UMBI UBIJALAR

DIABETES MELLITUS

UNGU

GULA DARAH

AKTIVITAS FISIK, MAKANAN

STRES OKSIDATIF

BERBAGAI ORGAN/ JARINGAN MDA, mRNA SOD dan mRNA catalase

3.3 Hipotesis 1. Ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan MDA pada hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin. 2. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen SOD pada jaringan hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin.

3. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen catalase pada jaringan hati, ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM yang diinduksi dengan streptozotocin.

BAB IV METODA PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian selama 6 bulan yang berlangsung mulai bulan Mei 2014 sampai dengan Oktober 2014. Tempat penelitian adalah di Lab.Farmakologi FK Unud dan Lab.Gizi Pangan (Gedung PAU) UGM 4.2 Rancangan Penelitian Penelitian ini adalah eksperimental laboratorik

randomized control

only design. Rancangan Penelitian

S

P1

O1

P1

Po

O2

Po

O3

R O4

Keterangan N

= Sampel

R = Random alokasi P1

= Perlakuan pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu 4 cc setiap hari

Po

= Tanpa perlakuan (Kontrol)

group post-test

O1

= Tikus DM kelompok perlakuan (6 ekor) setelah perlakuan 30 hari

O2

= Tikus DM kelompok kontrol (6 ekor ) setelah perlakuan 30 hari

O3

= Tikus DM kelompok perlakuan selama 60 hari (6 ekor)

O4

= Tikus DM kelompok kontrol selama 60 hari (6 ekor )

4.3.1 Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah tikus putih ( rat ) jantan Wistar yang berumur 3-4 bulan yang didapat dari Animal Unit Lab. Farmakologi FK UNUD. 4.3.2 Besar Sampel Besar sampel ditentukan dengan rumus Frederer : (n-1)(t-1) ≥ 15 (n-1)(2-1) ≥ 15 n-1 ≥ 15 n≥ 16 didapat 16 ekor tiap kelompok, ditambah dengan 10% sehingga menjadi 18 ekor tikus setiap kelompok. Jadi jumlah sampel pada penelitian ini adalah 36 ekor. 4.3.3 Teknik Penentuan Sampel. Teknik penentuan sampel dilakukan dengan cara sebagai berikut: a. Dari populasi tikus putih diadakan pemilihan sampel berdasarkan kriteria inklusi ( jantan, umur 3-4 bulan, berat 175 gram -225 gram, sehat ).

b. Dari jumlah sampel yang telah memenuhi syarat diambil secara acak sederhana untuk mendapatkan jumlah sampel yang sesuai dengan yang didapat dengan rumus Frederer yaitu 18 ekor tiap kelompok, sehingga jumlah sampel keseluruhan 36 ekor.

4.4 Variabel Penelitian a. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah ekstrak air umbi ubijalar ungu b. Variabel tergantung adalah kadar MDA, mRNA SOD dan mRNA catalase pada jaringan ginjal, hati, jantung dan aorta tikus putih. c. Variabel kendali adalah jenis kelamin, kesehatan, berat badan,makanan, umur dan lingkungan. 4.5 Definisi Operasional Variabel 1. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu adalah ekstrak yang didapat dari hasil perasan umbi ubi jalar ungu yang telah siap dipanen dan didapat dari perkebunan petani di Bali. Ekstrak air dibuat dengan prosedur sebagai berikut: Umbi ubi jalar ungu yang didapat dari lapangan/Petani dicuci dengan air bersih kemudian dikupas kulitnya. Setelah dikupas ubi jalar ini dipotong-potong melintang dengan ketebalan 2-2,5 cm. Potongan ubi jalar tersebut dicampur dengan air bersih dengan perbandingan 1 kg ubi jalar ditambah air liter lalu diblender dan disaring dengan tiga lapis kain kasa. Cairan yang diperoleh dari penyaringan tersebut dipanaskan hingga mendidih. Kandungan antosianin dari bahan ini adalah 146 mg/ml.

2. Kadar MDA darah adalah kadar MDA serum(nmol/l) yang diukur dengan metode TBARS ( Thiobarbituric acid-reactive substances), dikerjakan di Lab Gizi UGM Jogjakarta. 3. mRNA SOD dan mRNA catalase jaringan hati, ginjal,jantung dan aorta diukur dengan metode RT-PCR dengan prosedur yang telah baku. 4. Tikus sehat adalah tikus yang telah diperiksa dan dinyatakan sehat oleh dokter hewan. 5. Berat badan adalah berat tikus yang ditimbang dengan timbangan khusus

merek

Shunle yang tersedia di Lab. Farmakologi FK unud. 6. Umur tikus

ditentukan dengan melihat tanggal kelahiran yang telah dicatat oleh

dokter hewan pada kandang binatang percobaan. 7.

Lingkungan adalah

kandang dan suasana sekitar kandang

dibuat

agar

tidak

menimbulkan stres terhadap binatang percobaan. Tiap-tiap kelompok diletakkan pada tempat atau kandang yang sama. 8. Makanan adalah makanan standar yang diperoleh dari pasar atau pedagang makanan ayam. 9. Tikus diabetes adalah tikus putih yang dibuat menderita diabetes mellitus dengan memberikan streptozotocin 40 mg/Kg BB sekali dosis secara intraperitoneal, sehingga pada hari ke 3 tikus telah menderita DM (bila kadar gula puasa diatas 200mg/dl).

4.6 Instrumen dan zat-zat yang diperlukan 1. Timbangan khusus untuk menimbang berat badan tikus yang telah tersedia di Lab. Farmakologi FK Unud. 2. Ekstrak Air Umbi Ubi Jalar Ungu

3. Streptozotocin 4. Primer SOD dan primer catalase 5. Reagen RT-PCR

4.7 Alur Penelitian 1. Persiapan sebelum penelitian a. Menghubungi Laboratorium terkait. b. Penyiapan binatang percobaan meliputi pemilihan umur yang sama, sehat,berat badan yang sesuai serta penyiapan kandang dan makanan hewan. c. Penentuan sampel berdasarkan kriteria yang di tentukan dilanjutkan dengan pembagian kelompok dan adaptasi binatang percobaan.

2. Pelaksanaan Penelitian

Prosedur Penelitian Setelah adaptasi selama 2 minggu terhadap tikus tersebut dilakukan pemberian streptozotocin intraperitoneal. Setelah tiga hari dari pemberian streptozotocin dilakukan pemeriksaan gula darah puasa. Bila kadar gula darah puasa diatas 200mg/dl, tikus tersebut diatas dianggap DM dan dilakukan random alokasi dari tikus tersebut menjadi 2 kelompok masing-masing 18 ekor. Perlakuan dilakukan selama 60 hari, terhadap masing-masing kelompok sebagai berikut: Kelompok perlakuan (P1): kelompok tikus diabetes yang diberikan makanan standar dan diberikan air minum ad libitum, serta ekstrak air umbi ubijalar ungu 4

CC/hari/ekor selama 60 hari. Setelah perlakuan P1 selama 30 hari, 9 ekor tikus dari kelompok tersebut dikorbankan sebagai kelompok (O1). Sisanya dilanjutkan sebagai kelompok O3, sampai hari ke 60, untuk dilakukan evaluasi terakhir. Kelompok kontrol(P0) adalah kelompok tikus diabetes sebagai kontrol yang hanya diberikan makanan standar dan air minum ad libitum. Setelah perlakuan Po selama 30 hari, 9 ekor tikus dikorbankan sebagai kelompok (O2). Sisanya dilanjutkan sebagai kelompok O4 sampai hari ke 60, untuk dilakukan evaluasi terakhir. Setelah perlakuan 30 hari dan 60 hari dilakukan pemeriksaan, mRNA SOD dan mRNA catalase pada organ hati,ginjal, jantung dan aorta, dan pemeriksaan MDA. Pemeriksaan PCR mRNA dilakukan dengan prosedur sebagai berikut: Semua tikus dikorbankan dengan anestesi ether lalu diambil jantung dan pembuluh darah aorta, hati dan ginjal. Aorta diidentifikasi lalu diambil sepanjang 5 cm. Jantung diambil utuh, hati sebagian dan ginjal satu buah. Isolasi RNA dilakukan dengan metode trizol lalu dilakukan pemeriksaan RT-PCR untuk menentukan jumlah mRNA SOD dan mRNA catalase. Secara ringkas isolasi RNA dengan metode trizol adalah sebagai berikut: 1. Sampel dibuat homogenate lalu ditambah 750 ul trizol bolak balik selama 1 menit, inkubasi 5 menit dalam suhu kamar. 2. Tambahkan 200 mikroliter kloroform, vorteks 15 detik, inkubasi suhu kamar 15 menit. Sentrifugasi 13 000 rpm 15 menit. Pisahkan lapisan atas ke tabung steril. 3. Tambahkan 500 mikroliter isopropil alkohol, vorteks, inkubasi 10 menit suhu kamar. Sentrifugasi 13 000 rpm 10 menit. Supernatan dibuang lalu tambahkan alkohol 70 %,

lalu sentrifugasi 13 000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuangkeringkan pada suhu 56 0C selama 15 menit. 4. Tambahkan RNAse free water sebanyak 20 mikroliter, dan siap dilakukan RT-PCR. Secara ringkas pemeriksaan RT-PCR mRNA SOD (one step RT-PCR) adalah sebagai berikut: 1. Primer CuZn-SOD yang dipakai adalah 5’- GTTCCGAGGCCGCCCGCGT- 3’ ( forwarding primer) dan 5-GTCCCCATATTGATGGAC- 3’(reversing primer) 2. Primer Mn-SOD yang dipakai adalah 5’- CTGAGGAGAGCAGCGGTCGT- 3’ ( forwarding primer) dan 5-CTTGGCCAGCGCCTCGTGGT 3’(reversing primer) (Cederberg, et al.,2000) 3. Setelah dilakukan reverse transcription terhadap mRNA maka terhadap cDNA dilakukan denaturasi, annealing dengan primer SOD dan amplifikasi terhadap pragmen gen SOD tersebut 40 siklus. 4. Dilakukan interpretasi hasil dengan metode kalibrator.

Secara ringkas pemeriksaan RT-PCR mRNA catalase (one step RT-PCR) adalah sebagai berikut:

1. Primer catalase yang dipakai adalah 5’- GGCAGCTATGTGAGAGCC- 3’ ( forwarding primer) dan 5-CTGACGTCCACCCTGACT- 3’(reversing primer) 2. Setelah dilakukan reverse transcription terhadap mRNA maka terhadap cDNA dilakukan denaturasi, annealing dengan primer catalase dan amplifikasi terhadap pragmen gen catalase tersebut 40 siklus. 3. Dilakukan interpretasi hasil dengan metode kalibrator.

Gambar Alur Penelitian

36 Ekor Tikus Adaptasi 14 hari

Hari ke 16 diberikan streptozotocin 40mg/Kg BB terhadap semua tikus

Hari ke 20 dilakukan pemeriksaan gula darah puasa terhadap semua tikus. Tikus DM ( gula darah puasa diatas 200 mg/dl) dibagi 2 kelompok secara random

KLP I 18 ekor

Perlakuan P1

Hari ke 30 setelah perlakuan P1 dilakukan pengorbanan terhadap 9 ekor, (Post test tahap 1)

KLP II 18 ekor ekor

Perlakuan Po

Hari ke 30 setelah perlakuan Po, dilakukan pengorbanan terhadap 9 ekor, (Post test tahap 1)

Perlakuan P1 terhadap 9 ekor tikus sisa diteruskan sampai hari ke 60.

Hari ke 61 dilakukan post test tahap 2. (Pengambilan organ untuk pemeriksaan mRNA SOD ,mRNA catalase dan MDA jaringan hati,ginjal jantung dan aorta. Untuk mRNA SOD, dan catalase.

lanjutkan air 1 cc 4.8 sampai Teknik hari Analisis 83. Data Hari ke 84 post test 2

Perlakuan Po, terhadap 9 ekor tikus sisa diteruskan sampai hari ke 60.

Hari ke 61 dilakukan post test tahap 2. (Pengambilan organ untuk pemeriksaan mRNA SOD ,mRNA catalase dan MDA jaringan hati,ginjal jantung dan aorta. Untuk mRNA SOD, dan catalase.

lanjutkan air 1 cc sampai hari 83. Hari ke 84 post test 2

Data yang diperoleh dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut a. Uji normalitas dengan shapiro Wilks test b. Uji Homogenitas dengan Leven test c. Uji T

BAB V HASIL PENELITIAN

5.1.Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan Gen CAT Jantung 5.1.1. Kelompok O3 vs O1 (Perlakuan Sesudah vs Sebelum)

Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O3 dan O1 adalah 2.440 (CI 95%: 0.197 - 13.655; p = 0.312) meningkat namun tidak bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O3 dan O1 adalah 1.872 (CI 95%: 0.158 - 8.731; p = 0,576) meningkat namun tidak bermakna secara statistik.

5.1.2. Kelompok O4 vs O2 (Kontrol Sesudah vs Sebelum)

Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O4 dan O2 adalah 1,668 (CI 95%: 0,858 - 4,625; p = 0,338) meningkat namun tidak bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O4 dan O2 adalah 1.309 (CI 95%: 0,502 – 3,084; p = 0,574) meningkat namun tidak bermakna secara statistik.

5.2.Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan Gen CAT Aorta 5.2.1. Kelompok O3 vs O1 (Perlakuan Sesudah vs Sebelum)

Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O3 dan O1 adalah 2.456 (CI 95%: 1.054 - 7.975; p = 0.000) meningkat dan bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O3 dan O1 adalah 2.279 (CI 95%: 0.969 - 6.505; p = 0.172) meningkat namun tidak bermakna secara statistik.


Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O4 dan O2 adalah 0.112 (CI 95%: 0.050 - 0.294; p = 0.031) menurun dan bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O4 dan O2 adalah 0.214 (CI 95%: 0.108 - 0.474; p = 0.031) menurun dan bermakna secara statistic.

5.3.Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan Gen CAT Hati 5.3.1. Kelompok O3 vs O1 (Perlakuan Sesudah vs Sebelum)

Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O3 dan O1 adalah 1.577 (CI 95%: 0.776 - 2.996; p = 0.237) meningkat namun tidak bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT

antara O3 dan O1 adalah 1.298 (CI 95%: 0.510 - 3.513; p = 0.431) meningkat namun tidak bermakna secara statistik.


Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O4 dan O2 adalah 3.300 (CI 95%: 1.327 - 8.916; p = 0.048) meningkat dan bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O4 dan O2 adalah 1.664 (CI 95%: 0.828 - 3.666; p = 0.099) meningkat namun tidak bermakna secara statistik. 5.4.Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan Gen CAT Ginjal 5.4.1. Kelompok O3 vs O1 (Perlakuan Sesudah vs Sebelum)

Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O3 dan O1 adalah 6.586 (CI 95%: 4.333 - 10.094; p = 0.050) meningkat dan bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O3 dan O1 adalah 64.433 (CI 95%: 47.319 - 99.668; p = 0.000) meningkat dan bermakna secara statistik.


Ekspresi relatif mRNA gen SOD2 antara O4 dan O2 adalah 0.317 (CI 95%: 0.250 - 0.418; p = 0.016) menurun dan bermakna secara statistik. Ekspresi relatif mRNA gen CAT antara O4 dan O2 adalah 0.517 (CI 95%: 0.261 - 1.152; p = 0.201) menurun namun tidak bermakna secara statistik.

5.4 Ekstrak Ubi Ungu terhadap Ekspresi mRNA SOD2 dan CAT

Tabel 5.1 Ekspresi mRNA SOD2 dan CAT pada Organ Jantung, Aorta, Hati dan Ginjal Jantung Perlakua

Aorta

Hati

Ginjal

Kontrol Perlakuan Kontrol Perlakuan Kontrol Perlakuan Kontrol

n SOD2 2.440

1,668

2.456*

0.112*

1.577

3.300*

6.586*

0.317*

CAT

1.309

2.279

0.214*

1.298

1.664

64.433*

0.517

1.872

5.5. Ektrak Ubi Jalar Ungu terhadap MDA Hepar Pertama setelah perlakuan 30 hari

Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata MDA hepar antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 1 berikut. Tabel 5.1 Perbedaan Rerata MDA Hepar antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan 30 hari

Rerata Kelompok Subjek

n

MDA SB

t

P

15,26

0,001

Hepar Kontrol Perlakuan

7 7

6,89

0,42

4,00

0,28

Tabel 1 di atas, menunjukkan bahwa rerata MDA hepar kelompok kontrol adalah 6,890,42 dan rerata kelompok perlakuan adalah 3,990,28. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent menunjukkan bahwa nilai t = 15,26 dan nilai p = 0,001. Hal ini berarti bahwa rerata penurunan MDA hepar pada kelompok kontrol dan perlakuan sesudah diberikan ekstrak ubi jalar ungu selama 30 hari berbeda secara bermakna (p<0,05).

5.6. Ektrak Ubi Jalar Ungu terhadap MDA Hepar Pertama setelah perlakuan 60 hari

Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata MDA hepar antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 2 berikut.

Tabel 5. 2 Perbedaan Rerata MDA Hepar antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan 60 hari


n

MDA SB

Hepar

t

P

Kontrol

7

Perlakuan

7

8,06

0,22

1,92

0,23

51,01

0,001

Tabel 2 di atas, menunjukkan bahwa rerata MDA hepar kelompok kontrol adalah 8,060,22 dan rerata kelompok perlakuan adalah 1,920,23. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent menunjukkan bahwa nilai t = 51,01 dan nilai p = 0,001. Hal ini berarti bahwa rerata penurunan MDA hepar pada kelompok kontrol dan kelompok perlakuan sesudah diberikan ekstrak ubi jalar ungu selama 60 hari berbeda secara bermakna (p<0,05).

Kontrol, Post1, 6.89

Perlakuan, Post1, 4.00

Kontrol, Post2, 8.06

Kontrol Perlakuan Perlakuan, Post2, 1.92

Gambar 1 Perbandingan MDA Hepar antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan

1.1. Ektrak Ubi Jalar Ungu terhadap MDA Ginjal setelah perlakuan 30 hari

Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata MDA ginjal antar kelompok sesudah diberikan perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 3 berikut. Tabel 5.3 Perbedaan Rerata MDA Ginjal antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan 30 hari


n

MDA SB

t

P

22,49

0,001

Ginjal Kontrol Perlakuan

7 7

5,91

0,19

3,29

0,24

Tabel 3 di atas, menunjukkan bahwa rerata MDA ginjal kelompok kontrol adalah 5,910,19 dan rerata kelompok perlakuan adalah 3,290,24. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent menunjukkan bahwa nilai t = 22,49 dan nilai p = 0,001. Hal ini berarti bahwa rerata MDA ginjal pada kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan selama 30 hari berbeda secara bermakna (p<0,05).

5.7. Ektrak Ubi Jalar Ungu terhadap MDA Ginjal setelah perlakuan 60 hari

Analisis efek perlakuan diuji berdasarkan rerata MDA ginjal antar kelompok sesudah diberikan

perlakuan. Hasil analisis kemaknaan dengan uji t-independent disajikan pada Tabel 4 berikut.

Tabel 5.4 Perbedaan Rerata MDA Ginjal antar Kelompok Sesudah Diberikan Perlakuan


n

MDA SB

t

P

80,57

0,001

Ginjal Kontrol Perlakuan

7 7

8,40

0,17

1,47

0,15

Tabel 4 di atas, menunjukkan bahwa rerata MDA ginjal kelompok kontrol adalah 8,400,17 dan rerata kelompok perlakuan adalah 1,470,15. Analisis kemaknaan dengan uji t-independent menunjukkan bahwa nilai t = 80,57 dan nilai p = 0,001. Hal ini berarti bahwa rerata MDA ginjal pada kedua kelompok sesudah diberikan perlakuan berbeda secara bermakna (p<0,05).

Kontrol, Post2, 8.40 Kontrol, Post1, 5.91

Perlakuan, Post1, 3.30

Kontrol Perlakuan Perlakuan, Post2, 1.47

Gambar 2 Perbandingan MDA Ginjal antara Kelompok Kontrol dengan Kelompok Perlakuan

BAB VI PEMBAHASAN

6.1 Ekstrak ubi jalar ungu terhadap MDA Hepar dan ginjal Stretozotocine yang diberikan pada tikus menyebabkan hiperglikemia dan menyebabkan terjadinya stress oksidatif pada ginjal sehingga meningkatkan MDA pada jaringan ginjal (Limaye et al., 2003; Anjaneyulu dan Chopra, 2004; Kataya dan Hamza, 2008), dan menimbulkan gangguan fungsi ginjal (Jiang et al., 2010). Hasil pemeriksaan MDA pada jaringan hepar tikus percobaan disajikan pada Tabel 5.1 dan Tabel 5.2, sedangkan hasil pemeriksaan MDA pada jaringan ginjal disajikan pada table 5.3 dan 5.4. Pemberina ekstrak ubi jalar ungu pada tikus diabetik selama 30 hari dan 60 hari terjadi penurunan kadar MDA yang bermakna (p<0,05) dibandingkan kontrol. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian Tedgui dan Mallat tahun 2006 yang melaporkan bahwa pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu yang mengandung antosianin mampu menurunkan MDA. Antosianin yang terdapat pada umbi ubijalar ungu merupakan antioksidan yang

mampu

mencegah stress oksidatif in vivo dan dapat menurunkan MDA (Jawi et al., 2008). Pada kelompok tikus DM yang diberikan ekstrak air umbi ubi jalar ungu selama 60 hari terjadi perubahan yang sangat bermakna pada MDA dan SOD darah. Pada kelompok tersebut terjadi penurunan kadar MDA dan kenaikan aktivitas SOD yang bermakna (p<0,05). Antosianin yang terdapat pada umbi ubijalar ungu (Suprapta et al., 2004), merupakan salah satu antioksidan yang mampu mencegah stres oksidatif in vivo sehingga menurunkan MDA (Jawi et al., 2008). Pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu yang mengandung antosianin mampu menurunkan

kadar gula darah sehingga akan memperkecil terbentuknya AGEs (Tedgui dan Mallat, 2006), Ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat meningkatkan SOD dan menurunkan MDA pada darah tikus putih DM. Ekstrak air umbi ubijalar ungu memiliki efek nefroprotektif dengan meningkatkan SOD dan menurunkan MDA jaringan ginjal tikus putih DM, serta meningkatkan serum kreatinin dan menurunkan kadar BUN dalam darah (Jawi et al. 2014). Pemberian ekstrak air umbi ubi jalar ungu dalam penelitian ini dapat menurunkan MDA pada jaringan ginjal pada tikus diabetes. Penelitian ini sama dengan Herawati Tahun 2013, yang melaporkan bahwa konsumsi ekstrak antosianin ubi jalar ungu mampu menurunkan glukosa darah, meningkatkan status antioksidan darah dengan peningkatan nilai FRAP dan penurunan kadar MDA, dan menghambat kerusakan sel β pankreas. Artinya ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat mempertahankan fungsi ginjal. Hal ini disebabkan oleh karena flavonoid yaitu yang terdapat pada ekstrak air ubi jalar ungu dapat menangkap radikal bebas karena flavonoid dari berbagai tanaman telah diketahui bisa berperan sebagai antioksidan (Drel dan Sybirna, 2010; Marouane et al.,2011). Pemberian antosianin dari jagung ungu pada kultur jaringan ginjal manusia terbukti dapat mencegah glomerulosklerosis yang dipapar dengan glukosa dosis tinggi (Li et al.,2012). Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitiannya Kataya dan Hamza tahun 2008, yang menggunakan tikus diabetik yang diberikan ekstrak cabai merah dengan kandungan antosianin cukup tinggi, mendapakan terjadi penurunan MDA pada jaringan ginjal yang bermakna. Jawi dkk., tahun 2008 melaporkan bahwa pemberian ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan kadar MDA pada darah, pada hati, pada jantung dan pada usus setelah pemberian beban maksimal pada mencit. Ekstrak umbi ubijalar ungu dapat sebagai antioksidan eksogen.

6.2 Ekstrak Ubi Ungu terhadap Ekspresi mRNA SOD2 dan CAT Ubijalar ungu yang ada di Bali memiliki kadar antosianin cukup tinggi (Suprapta, 2004), dan terbukti dapat mengatasi stres oksidatif pada mencit (Jawi, 2008). dan meningkatkan total antioksidan pada tikus yang diberikan beban glukosa dosis tinggi (Sutirta-Yasa dan Jawi, 2011). dan dapat meningkatkan SOD darah kelinci normal (Jawi, 2012). Flavonoid quercetin dapat menghambat peroksidasi lipid, secara langsung maupun secara tidak langsung melalui peningkatan enzim antioksidan seperti superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), dan glutathione (GSH) pada mencit (Molina et al, 2003). Sedangkan ekstrak curcumin yang juga mengandung flavonoid dapat meningkatkan kadar SOD dan catalase serta menurunkan kadar malondialdehid pada jaringan hati yang mengalami reperfusi/stress oksidatif (Shen et al., 2007). Penelitian ini pada Tabel 5.1 memperlihatkan ekstrak air umbi ubijalar ungu secara bermakna meningkatkan ekspresi mRNA SOD2 aorta dan ginjal namun menurunkan ekspresi mRNA SOD2 secara bermakna pada hati. Ekstrak air umbi ubijalar ungu juga meningkatkan ekspresi mRNA SOD2 jantung namun secara statistik tidak bermakna. Ekstrak air umbi ubijalar ungu secara bermakna meningkatkan ekspresi mRNA CAT ginjal dan meningkatkan ekspresi mRNA CAT pada jantung, aorta namun tidak bermakna. Ekstrak air umbi ubijalar ungu menurunkan ekspresi mRNA CAT hati namun tidak bermakna. Penelitian ini menunjukkan hasil yang berlawanan dengan curcumin dimana curcumin menigkatkan kadar SOD dan CAT pada hati yang terpapar stress oksidatif sedangkan ekstrak air umbi ubijalar ungu menurunkan kadar SOD2 secara bermakna. Hal ini mungkin dapat dijelaskan karena curcumin memiliki efek hepatoprotektor.

Penelitian lain yang mempelajari efek antosianin dari buah chokeberry memperlihatkan peningkatan aktivitas enzim SOD dan CAT pada kultur sel β pancreas TC3 yang terpapar hydrogen peroksida dan glukosa dosis tinggi secara invitro (Rugina et al., 2015). Pada penelitian ini walaupun tidak memeriksa pada jaringan pankreas namun menunjukkan hasil yang serupa dimana secara umum terjadi peningkatan ekspresi mRNA SOD2 dan CAT pada jantung, aorta dan ginjal namun dengan beberapa hasil tidak bermakna.

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN

7.1. SIMPULAN 1. Ekstrak air umbi ubijalar ungu dapat menurunkan MDA pada hati dan ginjal tikus putih DM 2. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi mRNA SOD2 pada jaringan ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM, namun pada jaringan hati menurun 3. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu dapat meningkatkan ekspresi gen catalase (CAT) pada ginjal, aorta dan jantung tikus putih DM, namun pada jaringan hati menurun.

7.2. SARAN Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mempelajari ekspresi mRNA Nrf2 sebagai landasan molecular peningkatan ekspresi mRNA SOD2 dan CAT.

Daftar Pustaka

1. Anjaneyulu M, Chopra K. 2004. Quercetin, anti-oxidant bioflavonoid, attenuates diabetic nephropathy in rats. Clin Exp Pharmacol Physiol31(4) : 244-248. 2. Bhandari, U., Jain, N., Pillai, K.K. 2007. Further Studies on Antioxidant Potential and Protection of Pancreatic β-Cells by Embelia ribes in Experimental Diabetes. Exp Diabetes Res. 2007; 2007: 15803. 3. Cederberg J, Galli J, Luthman H and Eriksson U J. 2000. Increased mRNA levels of Mn-SOD and catalase in embryos of diabetic rats from a malformation-resistant strain. Diabetes. 49 ( 1): 101-107 4. Gao L and Mann G E. 2009. Vascular NAD(P)H oxidase activation in diabetes: a doubled-edged sword in redox signaling. Cardiovascular research. 82, 9-20. 5. Ghosh D, Konishi T. 2007. Anthocyanins and anthocyanin-rich extracts: role in diabetes and eye function. Asia Pac J Clin Nutr. 16(2): 200-208. 6. Han, X., Shen, T., and Lou, H. 2007. Dietary Polyphenol and Their Biological Significance. Int.J.Mol.Sci, 8: 950-988. 7. Herawati, E.R.N., 2013. Pengaruh konsumsi ekstrak antosianain ubi jalar ungu (Ipomoea batatas L.) terhadap glukosa dara, status antioksidan darah dan gambaran histopatologis pancreas tikus hiperglikemia induksi aloksoan. Electronic Theses & Dessertation (ETD) Gadjah Mada University, Bandung 8. Jawi I M, Suprapta D N, Dwi S U, Wiwiek I.2008. Ubi Jalar Ungu Menurunkan Kadar MDA dalam Darah dan Hati Mencit setelah Aktivitas Fisik Maksimal. Jurnal Veteriner Jurnal Kedokteran Hewan Indonesia. 9(2):65-72.

9. Jawi I M dan Budiasa K, 2011. Ekstrak air umbi ubi jalar ungu menurunkan total kolesterol serta meningkatkan total antioksidan pada darah kelinci. Jurnal Veteriner, Jurnal Kedokteran Hewan Indonesia. 12 (2); 120-125. 10. Jawi I M., Sumardika I W. , Linawati M. 2014. Pencegahan Gangguan Fungsi Ginjal Karena Stres Oksidatif pada Tikus Diabetes dengan Ubi Jalar Ungu (THE USE OF BALINESE PURPLE SWEET POTATOES IN PREVENTING RENAL FUNCTION DISORDERS DUE TO OXIDATIVE STRESS IN DIABETIC RATS). Jurnal Veteriner , Vol. 15 No. 2 : 274-280 ISSN : 1411 – 8327 11. Jayaprakasam B, Vareed S K, Olson LK, Nair MG. 2004. Insulin Secretion by Bioactive Anthocyanins and Anthocyanidins Present in Fruits. J. Agric. Food Chem, 53 (1), 28-31. 12. Johnson, J., Maher, P., Hanneken, A. 2009. The Flavonoid, Eriodictyol, Induces LongTerm Protection in ARPE-19 Cells Through its Effects on Nrf2 Activation and Phase II Gene Expression. Invest ophthalmol Vis Sci,50(5):2398-2406. 13. Kataya H A H, Hamza A E A. 2007. Red Cabbage ( Brassica Oleracea ) Ameliorates Diabetec Nephropathy in Rats. Department of biology, Faculty of Science, UAE University, AL-Ain, PO Box: 17555, UAE. Available at http:// ecam.oxfordjournals. org/cgi/content/full/nemo29vl ( 3 Nopember 2008) 14. Krishan P and Chakkarwar V A. 2011. Diabetic nephropathy: Aggressive involvement of oxidative stress. J Pharm Educ Res; 2(1):35-41. 15. Limaye PV, Raghuram N, Sivakami S. 2003. Oxidative stress and gene expression of antioxidant enzymes in the renal cortex of streptozotocin-induced diabetic rats. Mol Cell Biochem 243(1-2) : 147-152.

16. Lean M E, Noroozi M, Kelly I, Burn J, Talwar D, Sattar N and Crozier. 1999. Dietary flavonols protect diabetic human lymphocytes againts oxidative damage to DNA. Diabetes 48, Issue 1 176-181. 17. Maritim A C, Sanders R A, and Watkin J B. 2003. Diabetes, Oxidative Stress and Antioxidants: A Review. J biochem Molecular Toxicology;17(1):24-38 18. Maher, P., Hanneken,

A. 2005. Flavonoids Protect Retinal

Ganglion Cells from

Oxidative Stress-Induced Death. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 46:4796-4803. 19. Mauray A, Felgines C, Morand C, Mazur A, Scalbert A, Milenkovic D. 2010. Nutrigenomic analysis of the protective effect of bilberry anthocyanin-rich extract in apo E-deficient mice. Genes & Nutrition Journal;5(4):343-353. 20. Micallef

M, Lexis

L, Lewandowski

P. 2007. Red wine consumption increases

antioxidant status and decreases oxidative stres in the circulation of both young and old humans. Nutrition Journal, 6:27. 21. Middleton, E., JrKandaswami, C., and Theoharides, T. C. 2000. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells:Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacol. Rev., 52:673-751. 22. Molina, M. F., Sanchez-Reus, I., Iglesias, I., Benedi, J. 2003. Quarcetin, a Flavonoid Antioxidant, Prevent and Protect Against Ethanol-Induced Oxidative Stress in Mouse Liver. Biol. Pharm. Bull, 26: 1398-1402.

23. Pan H Z, Zhang L, Guo M Y, Sui H, Li H, Wu W H, Qu N Q,Liang M H, Chang D. 2009. The oxidative stress status in diabetes mellitus and diabetic nephropathy. Acta Diabetol DOI 10.1007/s00592-009-0128-1. 24. Prior RL. 2003. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage.

American Journal of Clinical Nutrition, Vol.78, N03, 570s-578s. 25. Sanchez-Moreno

C,

Cao

G,

Boxin OU, Prior

RL. 2003. Anthocyanin and

Proanthocyanidin Content in Selected White and Red wines. Oxygen Radical Absorbance Capacity Comparison with Nontraditional Wines Obtained from Highbush Blueberry. J.Agric. Food Chem , 51, 4889-4896. 26. Shen, S. Q., Zhang, Y., Xiang, J.J., Xiong, C. L. 2007. Protective Effect of Curcumin Against Liver Warm Ischemia/Reperfusion Injury in Rat Model is Associated with Regulation of Heat Shock Protein and Antioxidant Enzymes. World J. Gastroenterol, 13: 1953-1961. 27. Steiner, C., Peters, W. H. M., Gallagher, E. P., Magee, P., Rowland, I., and Pool-Zobel, B. L. 2007. Genistein Protects Human Mammary Epithelial Cells from Benzo(a)pyrene7,8-Dihydrodiol-9,10-Epoxide and 4-hydroxy-2-nonenal Genotoxicity by Modulating the Glutathione/glutathione S-transferase System. Carcinogenesis 28(3):738-748 28. Sutirta-Yasa I W P dan Jawi I M. 2011. Ethanol Extract Purple Sweet Potato Tubers Decrease Blood Glucose and Increases Total Antioxidant level in Rats With High Glucose intake. Program and Abstract Book 3rd International Conference on Biosciences and Biotechnology. Bali September 21-22. H:106

29. Srinivasan

K, Ramarao

P. 2007. Animal models in type 2 diabetes research: An

Overview. Indian J Med Res 125. pp 451-472. 30. Suprapta DN, dkk. 2004. Kajian Aspek Pembibitan, Budidaya dan Pemanfaatan umbi-

umbian sebagai sumber pangan alternatif. Laporan Hasil Penelitian. Kerjasama BAPEDA Propinsi Bali dengan Fakultas Pertanian UNUD. 31. Tedgui A and Mallat Z. 2006. Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory Pathways. Physiol.Rev. 86: 515-581. 32. Wang, J., and Mazza, G. 2002. Effects of Anthocyanins and Other Phenolic Compounds on The Production of Tumor Necrosis Factor Alfa in LPS/IFN-Gama-Activated RAW 264.7 Macrophages. J. Agric. Food Chem, 50(15): 4183-4189. 33. Rugina, D., Diaconeasa, Z., Coman, C., Bunea, A., Socaciu, C. & Pintea, A. (2015) Chokeberry Anthocyanin Extract as Pancreatic beta-Cell Protectors in Two Models of Induced Oxidative Stress. Oxidative medicine and cellular longevity, 2015, 429075.

LAMPIRAN 1. Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Jantung yang dinormalisasi Gen ACTB antara O3 vs O1 Assay Parameters Parameter Value

Iterations 10000

Results Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error

95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

2.440

0.355 - 10.379 0.197 - 13.655 0.312

CAT TRG 0.9

1.872

0.187 - 6.849 0.158 - 8.731 0.576

ACTB REF 0.9

1.000

Legend: P(H1) - Probability of alternate hypothesis that difference between sample and control groups is due only to chance. TRG

-

REF - Reference

Interpretation SOD2 sample group is not different to control group. P(H1)=0.312

CAT sample group is not different to control group. P(H1)=0.576

Target

Boxplot

Boxes represents the interquartile range, or the middle 50% of observations. The dotted line represents the median gene

expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum

observations.

Non-Normalised Results The following results do not have expression values normalised to the selected housekeepers.

Gene Type Reaction Efficiency Expression Std. Error

95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.358

0.305 - 0.400 0.292 - 0.473 0.044 DOWN

CAT TRG 0.9

0.275

0.195 - 0.347 0.183 - 0.378 0.000 DOWN

ACTB REF 0.9

0.147

0.034 - 1.473 0.023 - 2.058 0.206

1.

Report

produced

by

© Copyright: 2009 (C) QIAGEN GmbH All rights reserved

REST

2009

V2.0.13

2. Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Aorta yang dinormalisasi Gen ACTB antara O3 vs O1 Relative Expression Report Assay Parameters Parameter Value

Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

2.456

1.212 - 4.589 1.054 - 7.975 0.000 UP

CAT TRG 0.9

2.279

1.273 - 5.324 0.969 - 6.505 0.172

ACTB REF 0.9

1.000


-

Target

REF - Reference

Interpretation SOD2 is UP-regulated in sample group (in comparison to control group) by a mean factor of 2.456 (S.E. range is 1.212 - 4.589). SOD2 sample group is different to control group. P(H1)=0.000


Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.874

0.640 - 1.377 0.589 - 1.495 0.505

CAT TRG 0.9

0.811

0.583 - 1.128 0.577 - 1.147 0.313

observations.

ACTB REF 0.9

3.

0.356

0.162 - 0.604 0.140 - 0.663 0.000 DOWN

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Hati yang dinormalisasi Gen ACTB antara O3 vs O1

Relative Expression Report Assay Parameters Parameter Value

Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

1.577

0.909 - 2.425 0.776 - 2.996 0.237

CAT TRG 0.9

1.298

0.693 - 2.383 0.510 - 3.513 0.431

ACTB REF 0.9

1.000


-

REF - Reference


Target


Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum

observations.



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

1.044

0.635 - 1.435 0.577 - 1.747 0.732

CAT TRG 0.9

0.859

0.690 - 1.050 0.623 - 1.277 0.331

ACTB REF 0.9

0.662

0.436 - 0.991 0.366 - 1.326 0.201

4.

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Ginjal yang dinormalisasi Gen ACTB antara O3 vs O1


Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

6.586

4.658 - 8.989

4.333 - 10.094 0.050 UP

CAT TRG 0.9

64.433

50.902 - 84.541 47.319 - 99.668 0.000 UP

ACTB REF 0.9

1.000


-

Target

REF - Reference


CAT is UP-regulated in sample group (in comparison to control group) by a mean factor of 64.433 (S.E. range is 50.902 - 84.541). CAT sample group is different to control group. P(H1)=0.000

Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum

observations.



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.754

0.615 - 0.935 0.516 - 1.074 0.099

CAT TRG 0.9

7.377

5.850 - 8.517 5.557 - 10.473 0.049 UP

ACTB REF 0.9

0.114

0.101 - 0.138 0.086 - 0.142 0.000 DOWN

5.

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Jantung yang dinormalisasi Gen ACTB antara O4 vs O2


Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

1.668

0.923 - 2.677 0.858 - 4.625 0.338

CAT TRG 0.9

1.309

0.676 - 2.515 0.502 - 3.084 0.574

ACTB REF 0.9

1.000


-

REF - Reference



Target

Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

7.159

1.489 - 23.682 1.353 - 25.710 0.038 UP

CAT TRG 0.9

5.621

1.730 - 18.416 1.362 - 21.692 0.064

ACTB REF 0.9

4.293

1.321 - 10.651 0.829 - 12.874 0.099

observations.

6.

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Aorta yang dinormalisasi Gen ACTB antara O4 vs O2


Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.112

0.064 - 0.175 0.050 - 0.294 0.031 DOWN

CAT TRG 0.9

0.214

0.141 - 0.375 0.108 - 0.474 0.031 DOWN

ACTB REF 0.9

1.000


-

Target

REF - Reference

Interpretation SOD2 is DOWN-regulated in sample group (in comparison to control group) by a mean factor of 0.112 (S.E. range is 0.064 - 0.175). SOD2 sample group is different to control group. P(H1)=0.031

CAT is DOWN-regulated in sample group (in comparison to control group) by a mean factor of 0.214 (S.E. range is 0.141 - 0.375).

CAT sample group is different to control group. P(H1)=0.031

Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

1.265

0.856 - 2.216 0.681 - 2.416 0.652

CAT TRG 0.9

2.409

1.938 - 3.199 1.488 - 3.587 0.000 UP

observations.

ACTB REF 0.9

7.

11.268

7.677 - 13.807 7.533 - 13.950 0.031 UP

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Hati yang dinormalisasi Gen ACTB antara O4 vs O2


Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

3.300

1.968 - 7.521 1.327 - 8.916 0.048 UP

CAT TRG 0.9

1.664

1.076 - 2.537 0.828 - 3.666 0.099

ACTB REF 0.9

1.000


-

Target

REF - Reference



Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

2.035

1.031 - 5.023 0.955 - 6.912 0.251

CAT TRG 0.9

1.026

0.822 - 1.253 0.714 - 1.466 0.795

observations.

ACTB REF 0.9

8.

0.617

0.382 - 1.252 0.279 - 1.431 0.258

Tes Statistik Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT Ginjal yang dinormalisasi Gen ACTB antara O4 vs O2


Iterations 10000


95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.317

0.263 - 0.366 0.250 - 0.418 0.016 DOWN

CAT TRG 0.9

0.517

0.335 - 0.943 0.261 - 1.152 0.201

ACTB REF 0.9

1.000


-

Target

REF - Reference

Interpretation SOD2 is DOWN-regulated in sample group (in comparison to control group) by a mean factor of 0.317 (S.E. range is 0.263 - 0.366). SOD2 sample group is different to control group. P(H1)=0.016


Boxplot


expression.

Whiskers

represent

the

minimum

and

maximum



95% C.I.

P(H1) Result

SOD2 TRG 0.9

0.866

0.605 - 1.166 0.502 - 1.458 0.539

CAT TRG 0.9

1.414

0.751 - 2.808 0.560 - 4.016 0.479

observations.

ACTB REF 0.9

2.733

2.246 - 3.270 2.010 - 3.515 0.000 UP

9. Grafik Ct Ekspresi mRNA Gen SOD2 dan CAT

10.

Grafik Ct Ekspresi mRNA Gen ACTB

Lampiran 1 Data MDA Hepar dan Ginjal Kelompok Kontrol dan Perlakuan

MDA MDA No

Hepar

MDA Ginjal MDA Hepar Post

Post 1

Ginjal Kelompok

Post 1

Post 2

2 1

6.32

8

5.61

8.35

Kontrol

2

6.98

7.76

5.91

8.17

Kontrol

3

7.16

8.23

6.03

8.47

Kontrol

4

6.5

8.35

5.73

8.65

Kontrol

5

6.62

8.17

6.14

8.41

Kontrol

6

7.4

7.82

6.08

8.23

Kontrol

7

7.28

8.11

5.85

8.53

Kontrol

8

3.82

1.91

3.22

1.43

Perlakuan

9

4.23

2.26

3.46

1.67

Perlakuan

10

3.76

2.03

3.1

1.49

Perlakuan

11

3.64

1.73

2.92

1.31

Perlakuan

12

3.94

1.55

3.34

1.25

Perlakuan

13

4.41

1.85

3.64

1.55

Perlakuan

14

4.17

2.08

3.4

1.61

Perlakuan

Oleh: Bagus Komang Satriyasa I Made Jawi ABSTRAK

Recommend Documents