Protilátky třídy IgM proti EBV-EA-D Návod na použití ELISA testu Objednací číslo EI 2795-9601 M
Protilátky proti Virus EpsteinBarrové Časný difusní antigen (EBV-EA-D)
Třída Ig IgM
Substrát Ag-potažené mikrotitrační jamky
Formát 96 x 01 (96)
. Princip testu: ELISA test umožňuje semikvantitativní in-vitro stanovení lidských protilátek třídy IgM proti časnému difusnímu antigenu viru Epstein-Barrové (EBV-EA-D). Diagnostický kit (souprava) obsahuje oddělené proužky mikrotitrační desky, každý s osmi jamkami, které jsou potaženy EBV-EA-D. V prvním reakčním kroku se v jamce inkubují ředěné vzorky séra pacientů. V případě pozitivních vzorků, se specifické IgM (také IgA a IgG) protilátky navážou na antigeny. K detekci navázaných protilátek slouží druhá inkubace provedená s protilátkou proti lidským IgM značenou enzymem (enzymový konjugát), která je schopna vyvolat barevnou reakci. Intenzita vzniklé barevné reakce je úměrná koncentraci protilátek proti antigenům EBV-EA-D. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 oddělených proužků mikrotitrační desky, každý obsahuje 8 jednotlivých oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum: (lidské IgM): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno modře. - Negativní kontrolní sérum (lidské IgM): 1x 1,3 ml, připravené k použití, značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené kozí protilátky proti lidským IgM: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno červeně. - Vzorkový pufr: obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG): 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití1 N kyselina fosforečná - Návod k provedení testů - Protokol s kalibračními hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 oC až + 8 oC, nesmí být zmražen. Souprava, obsahuje-li všechny součásti neotevřené, vydrží až do vyznačeného data expirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAG, anti-HCV, anti- HIV-1 a anti-HIV-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou
1
jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte pokožku mýdlem a velkým množstvím vody. Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal . Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, zabráníte tím zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 oC až + 8 oC, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrace a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití. Zeleně obarvený vzorkový pufr obsahuje IgG/RF – Absorbent. Pro stanovení protilátek třídy IgM se vzorky séra nebo plazmy musí naředit tímto pufrem. Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 oC až + 8 oC. Poznámka. Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 oC a před ředěním ho promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok: Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Úvod: Dříve, než mají být ve vzorcích séra pacientů stanoveny protilátky třídy IgM , musí se odstranit protilátky třídy IgG. Toto lze provést ultracentrifugací, chromatografií nebo imunoabsorpcí. Tento proces musí být proveden proto, aby se zabránilo revmatickým faktorům reagovat se specifickými vázanými IgG, což by vedlo k falešně pozitivním výsledkům v testech pro IgM a dále se musí zabránit náhradě IgM za specifické IgG vázané k antigenu, což by naopak vedlo k falešně negativním výsledkům pro IgM. Princip: Vzorkový pufr (značeno zeleně ) obsahuje IgG/RF absorbent (kozí protilátky proti lidskému IgG). IgG ze séra nebo plazmy se navážou s vysokou specificitou na tyto protilátky a precipitují. Jestliže vzorek obsahuje revmatické faktory, tyto jsou absorbovány pomocí komplexu IgG/anti-lidský IgG komplex. Vlastnosti oddělení: - Pomocí anti-lidských IgG protilátek se navážou a precipitují všechny IgG podtřídy - IgG se z lidského séra odstraní až do koncentrace 15 mg na mililitr (průměrné sérum dospělého člověka obsahuje koncentraci IgG okolo 12 mg na mililitr)
2
-Odstraní se revmatické faktory - Výtěžek IgM frakce je téměř 100%. Provedení: Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1,0 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Inkubujte reakční směs po dobu alespoň 10 minut při pokojové teplotě. Potom naneste vzorky podle pipetovacího protokolu do jamek mikrotitrační desky. Poznámky: - Pomocí této reakční směsi nelze stanovit protilátky třídy IgG. - Ověření účinnosti absorbentu IgG/RF se udělá tak, že se provede paralelní test na stanovení IgG ve směsi pro IgM – stanovení IgM je spolehlivé pouze tehdy, je-li test na IgG negativní. -Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití. Neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Podle pipetovacího protokolu naneste 100µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně každou jamku promyjte třikrát pomocí 300µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamky vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů (provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky otočené dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgM) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol 1 A B C
C Poz. Neg.
2 P6 P7 P8
3 P14 P15 P16
4 P22 P23 P24
5
6
3
7
8
9
10
11
12
D E F G H
P1 P2 P3 P4 P5
P9 P10 P11 P12 P13
P17 P18 P19 P20 P21
Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativní analýzy sér 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C), pozitivní a negativní kontrolní séra (poz. a neg.) a všechny vzorky sér pacientů byly inkubovány jednotlivě v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. Výpočet výsledků: Hodnota absorbance kalibračního séra definuje horní hranici referenčního rozsahu pro neinfikované osoby (cut-off value) doporučenou EUROIMMUN. Hodnoty vyšší, než je tato hranice, se považují za pozitivní, pod touto hranicí za negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také semikvantitativní vyhodnocení výsledků. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: Extinkce kontrolního vzorku nebo vzorku séra = Poměr Extinkce kalibračního séra (cut-off) Poměry > 1,0 se považují za pozitivní, poměry < 1,0 za negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum, slouží jako vnitřní kontrola pro provedení testu, musí být proto zařazeny v každém prováděném testu. Charakteristiky testu Kalibrace: Jelikož neexistuje referenční sérum pro protilátky třídy IgM proti EBV-EA-D, kalibrace se provádí v relativních jednotkách (RU). Pro všechny skupiny prováděných testů musí hodnoty extinkce pro kalibrační séra a poměry určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v hranicích určených pro tyto důležité hodnoty pro každý kit. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a musel by se opakovat. Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra se vystaví stejnému vlivu, a proto nastalé změny jsou povětšinou zakalkulovány ve výpočtu výsledků. Tato situace se bere následně do úvahy a přizpůsobují se časy inkubace substrátu vzhledem k pokojové teplotě: Pokojová teplota 14 oC – 18 oC Pokojová teplota 19 oC – 23 oC Pokojová teplota 24 oC - 30 oC
doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min
Antigen: Jamky mikrotitrační destičky jsou potaženy rekombinantním časným difusním antiginem viru Epstein-Barrové. Molekulová hmotnost antigenu exprimovaného v E.coli je 28 kDA.
4
Reprodukovatelnost: Reprodukovatelnost testu byla zkoumána určením koeficientů rozptylu (CV) uvnitř jednoho a mezi jednotlivými měřeními za užití tří sér, jejichž hodnoty ležely v různých bodech kalibrační křivky. Koeficienty rozptylu uvnitř bloku byly stanoveny z 20 měření a koeficienty rozptylu mezi bloky ze 4 měření provedených v šesti různých dnech. sérum 1 2 3
Koeficienty rozptylu uvnitř jednoho měření, n=20 Průměrná hodnota (extinkce) CV (%) 0,499 5,4 0,519 8,4 1,111 4,2
Koeficienty rozptylu mezi jednotlivými měřeními, n=4 x 6 sérum Průměrná hodnota (poměr) CV (%) 1 60 8,6 2 72 9,8 3 165 6,8 Specifita: Předkládaný ELISA test detekuje protilátky třídy IgM proti EBV-EA. Nebyly nalezeny žádné křížové reakce. Referenční rozsah: Hladiny protilátek (IgM) proti EBV-EA byly analyzovány testem Euroimmun ELISA ve skupině 172 zdravých dárců krve. S hodnotou pro horní hranici poměru 1,0; bylo prokázáno, že 1,7 % dárců bylo anti-EBV-EA (IgM) pozitivní .
Klinické studie: Séra 14 pacientů ve stadiu akutní infekční mononukleosy byla testována pomocí dostupných EUROIMMUN anti-EBV- ELISA testů: Preva-
n
Anti-
Anti-
Anti-
Anti5
Anti-
Anti-
Anti-
lence Akutní infekční mononukleosa
14
EBVCA (IgA) 50%
EBVCA (IgG) 86%
EBVCA (IgM) 86%
EBVEA (IgA) 14%
EBVEA (IgG) 43%
EBVEA (IgM) 64%
EBNA1 (IgG) 0%
V sérologické diagnostice infekční mononukleosy se obvykle určují protilátky proti EBV-CA (IgG a IgM třídy), stejně tak protilátky proti EBNA-1 (IgG). V provedené studii byly protilátky proti EBV-CA přítomny ve všech 14 vzorcích sér, a to buď IgG, nebo IgM třídy. Kromě toho, všech 14 sér bylo negativních v anti- EBNA-1 ELISA (IgG). Dvě séra byla v anti-EBV-CA ELISA pouze IgG pozitivní. Pro definitivní určení akutní infekční mononukleosy byla zkoumána avidita těchto IgG protilátek. V obou případech měly protilátky pouze nízkou aviditu, což indikovalo časné stadium infekce. Klinický význam: Virus Epstein-Barrové je kauzativním agens vyvolávajícím infekční mononukleosu, horečnaté onemocnění se zánětem hltanu a lymfadenopatií (zvětšením lymfatických uzlin), které je často doprovázeno hepatosplenomegalií a řidčeji s exanthemem. Kromě toho jsou infekce EBV často spojovány také s Burkitovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Infekční mononukleosa musí být odlišována od cytomegalie a toxoplasmosy a v případě netypického průběhu nemoci také od HIV a dalších infekcí. Imunitní odpověď zprostředkovaná IgM proti EBV-CA, která se projeví v heterofilních protilátkách nejdříve a zvýšení titru protilátek třídy IgG, indikuje přítomnost nedávno proběhlé infekce EBV. Jsou-li přítomny protilátky proti jadernému antigenu viru EpsteinBarrové (EBNA), jedná se o pozdní stadium infekce. Ačkoli se EBNA antigeny označené 1 až 6 syntetizují dříve, než další EBV antigeny ( časné antigeny a antigeny virového obalu) v průběhu infekce, jsou prezentovány imunitnímu systému až po destrukci B buněk. Chronologický sled událostí tedy potom je takový, že se protilátky proti obalovým virovým antigenům a časným antigenům objeví dříve, než protilátky proti EBNA. Protilátky proti časnému EBV antigenu (EA) se vyskytují u 70 až 80 % pacientů s infekční mononukleosou, i když jen dočasně v akutní fázi. Vysoké titry protilátek proti EA indikují chronické stadium, či reaktivaci nemoci. Nalézáme je ale také ve spojení s Burkitovým lymfomem a rakovinou nosohltanu. Sérologická diferenciace mezi primární infekcí EBV a reaktivací nemoci není vždy zcela možná. Jsou-li v séru přítomny pouze protilátky proti EBV-EA a nikoli proti EBV-CA a EBNA, předpokládáme výskyt primární infekce. Jsou-li současně detekovány protilátky proti EBNA, jedná se o reaktivaci infekce. Diferenciace mezi právě probíhající infekcí a infekcí, která již po určitou dobu probíhala, je pro sérologii největší výzvou. Dnes se nejvíce používá diferenciace založená na určení specifických protilátek třídy IgM, které se obecně projevují pouze během počátečních stadií infekce, ale jejichž určení je nejisté a problematické. Interferujícím faktorem může být přetrvávající imunitní odpověď protilátek IgM, nedetekovatelná nebo zpožděná tvorba IgM, či tvorba nespecifických IgM způsobená polyklonální stimulací B buněk. Ve 20 % všech případů právě probíhající infekce EBV nebyly nalezeny protilátky IgM proti EBV obalovému proteinu (EBV-CA), u 15 % případů byla tvorba těchto púrotilátek zpožděna, na druhé straně u 4 % pacientů protilátky třídy IgM přetrvávaly. V posledních letech se pro bezpečné určení právě probíhající infekce provádí určení avidity protilátek třídy IgG: první reakcí imunitního
6
systému na právě probíhající infekci je tvorba protilátek s nízkou aviditou. Jak infekce postupuje, dochází k tvorbě protilátek IgG, které jsou již více přizpůsobeny danému antigenu a avidita roste. Pokud nejsou v séru detekovány protilátky s vysokou aviditou, můžeme předpokládat, že infekce je doposud v ranném stadiu. (EUROIMMUN testovací systém pro určení avidity protilátek IgG proti EBV-CA, objednací číslo EI 2791-9601 G). Literární odkazy: 1. Koch H.G.: Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Deutsches Arzteblatt 7: 140 –144 (1995). 2. Dopakta H.D., Schuy W.: Compact Epstein-Barr virus diagnosis based on defined antigen mix and specific IgA. Res.Virol. 147: 53-66 (1996). 3. Selgneurin J.-M.: Diagnostik von Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus. Diagnose und Labor 42: 83 –89 (1992). 4. Dolken G., Weitzmann U., Boldt C., Bitzer M., Brugger, Lohr W.: Enzyme-Linked Assay for IgG Antiboduies to Epstein-Barr-Virus – Associated Early Antigens and Viral Capsid Antigen. J. Immunol.Meth. 67: 225-233 (1984). 5. Porstmann T.: Epstein-Barr-Virus. Diagnostische Bibliothek 6/7 (1992). 6. Lennette E.T.: Epstein-Barr-Virus. Virology 74: 905-909 (1987).
7
