BIOTECHNOLÓGIÁK MŰSZAKI HÁTTERE Növényi sejtek által előállított monoklonális antitesttöredékek jellemzése Tárgyszavak: idegen fehérje; monoklonális antitest; fehérjestabilitás; növényisejt-szuszpenzió; hajszálgyökér; antitesttöredék. A transzgénikus növények alkalmazása speciális fehérjék előállítására Manapság úgy vélik, hogy a módosított géneket tartalmazó (transzgénikus) növények gazdaságos lehetőséget kínálnak a növény számára idegen (pl. állati) antitestek, enzimek, hormonok stb. előállítására. Már eddig is számos bakteriális és állati eredetű proteint állítottak elő növényekben, amelyek ára pl. búzacsíra esetében 43 USD/g körül volt. Próbálkoztak azzal a valamivel drágább eljárással is, hogy a fehérjéket növényi sejttenyészetben, bioreaktorban állítsák elő. Erre akkor lehet igény, ha az eljárást szigorúan kontrollált körülmények között kell végezni, vagy ha az igény sürgőssége nem teszi lehetővé a mezőgazdasági ciklusok végigvárását. A szövettenyészeteken végzett mérések jó előtanulmányt jelentenek a későbbi, teljes növényi szervezeten végzett vizsgálatokhoz is. Antitesttöredékek képződése a növényi szövetekben A szövettenyészetben végzett fehérjetermelés gazdaságosságát alapvetően befolyásolja az adott fehérje termelésének hatásfoka, ill. a kívánt termék koncentrációja a biomasszában. Ezért aztán sok erőfeszítést tettek megfelelő promoterek kifejlesztésére, megfelelő transzgénikus vonalak kiválasztására és a „génelhallgatás” jelenségének megakadályozására. Legalább ekkora jelentősége van annak is, hogy megakadályozzák a keletkezett „idegen” fehérje bomlását, mert az így képződött töredékek (fragmentumok) inaktív szennyeződést jelentenek az elválasztásnál, amelytől nehéz elkülöníteni az aktív alkotót. Ahhoz azonban, hogy ezt meg lehessen tenni, meg kell keresni a poszttranszlációs („lefordítás”, azaz m-RNS leolvasás utáni) degradáció helyét, és meg kell érteni annak mechanizmusát. Számos esetben megfigyelték, hogy szövettenyésztés során csökken az idegen fehérje titere és gyakran fragmentumok jelennek meg a tisztított növényi extraktumok Western blot mintáin. A jelenség nem korlátozódik a szövettenyészetekre, vegetatív szövetekben is jelentkezik. Magyarázatképpen többféle lehetőséget felvetettek, pl. a proteázok hatását a minta homogenizálása és
extrakciója során, antitest köztitermékek képződését vagy kiválasztás (szekréció) utáni proteáz aktivitást, de egyik hipotézist sem vizsgálták meg kellő alapossággal. Az ismertetett cikk célja dohány szövettenyészetben előállított egér IgG antitestek sejten belüli és sejten kívüli stabilitásának vizsgálata. Ennek az antitestnek N-glikozilező helyei vannak a Fab és a CH2Fc régiókban, növényekben azonban ez sokkal nagyobb változatosságot mutat. A szerzők hajszálgyökerek, hajtás teratóma-szövetek és szuszpendált növényi sejtek alkalmazását vizsgálták a kérdéses immunglobulin előállítására, és a keletkezett fragmentumokat immunpróbákkal, glikánreaktív anyagokkal, proteintranszportot és glikozilezést gátló inhibitorokkal jellemezték. A szövettenyészetek Az említett szövettenyészeteket vad típusú Nicotiana tabacum és egy olyan transzgénikus N. tabacum alapján fejlesztették ki, amely Guy 13 monoklonális antitestet fejez ki. A Guy 13 olyan egér IgG1 antitest, amely a Streptococcus mutans egy 185 kDa-s sejtfelületi proteinjét ismeri fel. Transzgénikus növények magvaiból indultak ki. Ezt úgy állították elő, hogy dohányleveleket megfertőztek egy Agrobacterium tumefaciens törzzsel, amely tartalmazta a Guy 13 könnyű vagy nehéz láncának cDNS részletét (beleértve a natív /egér/ bevezető szekvenciát is), majd a nehéz láncot expresszáló regenerált növényt keresztezték egy másikkal, amely könnyű láncot állít elő. Az antitestek kinyerése Az antitestet foszfát pufferes sóoldatba (PBS) extrahálták a biomasszából. A puffert 10 µg/ml leupeptint tartalmazó oldattal mozsárban homogenizálták, majd hidegen 14 000 g-vel centrifugálták, és a felülúszót vizsgálták. A hajszálgyökérminták esetében számos egyéb vegyszer hatását is megvizsgálták az antitestek stabilitására. Külön kísérletekben vizsgálták a bacitracin (proteinstabilizátor és proteázinhibitor), poli(vinil-pirrolidon) (360 000, proteinstabilizátor), és egy széles spektrumú növényi proteáz inhibitor elegy hatását a PBS + leupeptin elegyre. Az antitesteket poli(vinil-pirrolidon) és aszkorbát jelenlétében is extrahálták, hogy megkössék a fenolokat és a kinonokat. Megvizsgálták az antitestek stabilitását a növényi extraktumokban szimulált extrakciós kísérletekben is. Monoklonális IgG1 antitesteket adtak vad típusú dohány hajszálgyökér, hajtás teratóma és sejtszuszpenzió mintákhoz, majd hasonló módon őrölték PBS és leupeptin jelenlétében. Az antitestek vizsgálata Az antitestek mennyiségét ELISA (enzimkapcsolt immunpróba) módszerrel mérték és SDS-PAGE elektroforézissel, valamint Western blot technikával vizsgálták a komponensek eloszlását. Összehasonlításra egér IgG és egér IgG Fab és F(ab’)2 fragmentumokat használtak. A teljes antitest mellett az ELISA vizsgálatok fragmentumokat (nehéz és könnyű láncokat) is jeleztek. A Western
blot vizsgálatokban nyúl anti-egér Ig, kecske anti-egér IgG-γ nehéz lánc, kecske anti-egér κ könnyű lánc, kecske anti-egér Fab, kecske anti-egér Fc lánc, biotinilezett concanavalin próbákat használtak. Mérték a biomassza teljes fehérjetartalmát is borjú szérumalbumin standarddal szemben. Vegyszeres kezelések A sejtszuszpenziókat egy rozsdamentes acél szitán átszűrték, hogy eltávolítsák a hámdarabkákat, majd az összegyűjtött sejteket újraszuszpendálták egy megfelelő kezelő közegben, amelyet olyan vad típusú sejtszuszpenzióból nyertek, amelyet előzőleg 10 mM-os benzil-amin, 20 µM-os Brefeldin A (a későbbiekben BFA), 10 µg/ml-es tunicamycin vagy 116 µM-os swainsonin oldatban tenyésztettek. A biomassza- és a közegmintákat ELISA és Western blot vizsgálatoknak vetették alá. Endoglikozidáz H emésztés A hajszálgyökér és a szuszpendált sejtextraktumokhoz és a használt közegmintákhoz részben β-merkapto-etanol-tartalmú puffert adtak és azzal forralták, majd foszfátos pufferben endoglikozidáz H oldat jelenlétében inkubálták. Ellenőrző mintaként ugyanezt a kezelést elvégezték IgG1 mintákon is. Antitest-stabilitás a használt tenyésztési közegben Rázólombikos kísérletekben 8 és 12 napos vad típusú szuszpendált sejtkultúra tenyészetekhez monoklonális egér IgG1 mintákat adtak, majd Western blot vizsgálatnak vetették alá. A növekedésre és az antitest-felhalmozódásra vonatkozó adatok A hajszálgyökér-kultúrák jóval lassabb fejlődtek, mint a hajtás teratóma vagy a szuszpendált sejtkultúra minták (1. ábra). A teratómaminták hiperhidricitást (vetrikfikációt) mutattak, és csak 6 hónapig használták őket. A hajszálgyökér és a szuszpendált sejtkultúra mintákban az antitestmennyiség maximuma hasonló volt a biomasszában és a kultúra közegében, míg a teratómaminták esetében a közegben mérhető maximum jóval kisebb volt, mint a biomasszában. Az 1b ábra tanúsága szerint a hajszálgyökér és a hajtás teratóma minták esetében antitestveszteség mutatkozott már a növekedési fázisban, ami a szuszpendált sejteknél is jelentkezett a stacioner fázisban. A szuszpendált sejtek esetében a közegben elég magas volt az antitest-koncentráció a közegben a növekedési fázis első felében, de ezt gyors csökkenés követte.
biomassza (g, száraz tömeg) teljes antitesttartalom (µg) antitestmennyiség a közegben (µg)
idő (nap)
1. ábra Növekedési ráta (a), teljes antitestmennyiség (b), antitestek mennyisége a kultúra közegében (c). Mindegyik minta dohányból készült, (●) hajszálgyökér, (○) teratóma, (■) szuszpendált sejtkultúra.
A fragmentumok analízise alapján kirajzolódó kép Az ELISA, Western blot és egyéb vizsgálatok eredményeinek részletes bemutatása nélkül, itt csak a belőlük levonható főbb következtetések állnak. A transzgénikus növényekben jelentkező több antitest-fragmentum keletkezésének többféle oka lehet. Az ok lehet az, hogy a szövet őrlése és a mintakészítés során tördelődnek az antitestek, lehet glikozilezési különbségek eredménye, a fragmentumok lehetnek az antitestképződés köztitermékei, keletkezhetnek úgy, hogy a növény génjei és az idegen gének által termelt könnyű és nehéz láncok különböző kombinációi, vagy származhatnak a kiválasztás során fellépő proteolitikus folyamatokból is. Nem extrakciós hiba A proteázinhibitorok és proteinvédő szerek alkalmazása a mintakészítés során, valamint a szimulált extrakciós kísérlet (IgG1 és vad szövet alkalmazásával) azt mutatta, hogy a szövethomogenizálás és a sejten belüli anyagok felszabadulása nem okozott roncsolódást az antitestekben a rutin extrakció körülményei között. Azt is figyelembe kell venni, hogy a kultúrák közegében is ki lehetett mutatni azon sávok többségét, ami később a homogenizálás után jelentkezett az extraktumban. A BFA kísérletekben sem jelentkezett volna kevesebb sáv az elektroforézis során, ha a fragmentumok kizárólag a mintafeldolgozás melléktermékei lettek volna. Ez a hibaforrás tehát kizárható. Nem glikozilezési eltérés A tunicamycinnel végzett kísérletek azt mutatták, hogy az antitestfragmentumok nem a glikozilezési különbségek eredményei. Az N-glikozilezésgátlás igen kis móltömeg-változást okozott, ezért a 135 és 120 kDa-os fragmentumok nem lehetnek a H2L2 antitest glikozilezett variánsai. Hasonlóképpen a 43 és/vagy 33 kDa-os egységek a gyökér- és a hajtásmintákban reduktív körülmények között nem lehetnek glikozilezési variációk. Nem antitestképződési köztitermékek A megfigyelt fragmentumok mérete többé-kevésbé összeegyeztethető különböző állati IgG antitest-köztitermékekével: H2L (130–140 kDa), H2 (100–110 kDa), HL (80–85 kDa), H (50–55 kDa), de ennek sok adat ellentmond. A fragmentumsávok megjelentek a hajszálgyökér és a szuszpendált sejtkultúrák közegében, azaz kiürültek az ép sejtekből, és az endoplazmatikus retikulum (ER) általában visszatartja a köztitermékeket, nem engedi őket kilépni a sejtből. Az endo H kísérletekből pedig világosan kiderült, hogy a fragmentumok egyértelmű aktív kiürítés, és nem sejtroncsolódás eredményei. Inkább úgy tű-
nik, hogy a fragmentumok a Golgi-apparátus által részben feldolgozott bomlástermékek. Valószínű eredet: sejten kívüli és sejten belüli proteolízis Az 50 és 80 kDa-os fragmentumok lehetnek olyan degradációs termékek, amelyekben a nehéz lánc CH2 és/vagy a CH3 régiói részben tönkrementek. A minták közötti eltérések arra utalnak, hogy az 50 kDa-os fragmentum sejten kívüli degradáció terméke. Ez a fragmentum csak a hajszálgyökér és a hajtás teratóma mintákban jelent meg, az apoplazmában levő proteolitikus enzimek működésének eredményeként. A 80 kDa-os fragmentum ugyancsak sejten kívüli degradáció eredménye. A 43 kDa-os egység (ami megegyezik a nehéz lánc tömegével) ugyancsak a hajszálgyökér- és a teratómamintákban volt jelen, a szuszpendált sejt mintákban nem, feltételezhetően ugyancsak az apoplazma jelenléte miatt (talán a 80 kDa-os rész további fragmentációjának terméke). Eddig úgy gondolták, hogy az apoplazma stabil környezetet jelent a kiválasztott antitestek számára, de ezt a képet felül kell vizsgálni. Fel kell hívni a figyelmet arra a tényre, hogy az immun-fluoreszcencia-mikroszkópia nem tud különbséget tenni az aktív antitestek és a fragmentumok között, úgyhogy az apoplazmában való felhalmozódás még nem jelenti azt, hogy az antitestek épek is. Szükséges lenne kifejleszteni olyan módszereket, amellyel ez a sejten kívüli degradációs folyamat megakadályozható. A cikkben ismertetett bacitracin adagolás mindenesetre nem bizonyult hatékonynak. Ennek oka lehetett a diffúzió gátlása is az apoplazmában. A nehezebb, 135 és 120 kDa-os fragmentumok megjelenése a mintákban kevésbé biztos, mint a 80 és 50 kDa-os fragmentumoké, és ezek a gyenge sávok megjelennek egér IgG1 Western blot eredményeiben is. A 120 kDa-os egység ugyan együtt mozgott a F(ab’)2 fragmentummal, nem lehetett azonos vele, mert Fc fragmentumot is tartalmazott. A 135 és a 120 kDa-os egységek esetében esetleg olyan nem teljes H2L2 egységek jelenlétére utal, amelybe eltérő tömegű komponensláncok épülnek be. Ennek azonban ellentmondanak a BFA-kísérletek eredményei, ezért inkább a sejten belüli proteolitikus folyamatok eredményének tekinthetők. A különböző vizsgálatok szerint a fragmentumok nem a vakuólumokban, hanem az endoplazmatikus retikulum és a Golgiapparátus között képződnek. Az endoplazmatikus retikulumban való felhalmozódás hasznos is lehet, mert ezzel meg lehet akadályozni a faj-specifikus glikánok képződését a Golgi-apparátusban. A fragmentumok képződésének legvalószínűbb oka tehát a proteolitikus degradáció. Fragmentumok képződése volt kimutatható a hajszálgyökerek és a hajtás teratómák esetében az apoplazmában, illetve a szuszpenziókban a sejtek közötti térben. Bizonyos fragmentumok felhalmozódása inkább a sejten belül, az ER-ben és/vagy a Golgi-apparátusban mutatható ki, amivel elkerülik a fő destruktív proteázokkal való érintkezést a kiválasztási folyamatban. Ezek a
vizsgálatok jelentősen hozzájárulhatnak a növényekben előállított speciális állati fehérjék termelési hatásfokának javításához. (Bánhegyiné Dr. Tóth Ágnes) Sharp, J. M., Doran, P. M.: Characterization of monoclonal antibody fragments produced by plant cells. = Biotechnology and Bioengineering, 73. k. 5. sz. 2001. jún. 5. p. 338–346. Allard, G.; Lemieux, R.; Vézina, L. P.: Production of a diagnostic monoclonal antibody in perennial alfalfa plants. = Biotechnology and Bioengineering, 64. k. 3. sz. 1999. p. 135–143.
EGYÉB IRODALOM Martin, V. J. J.; Yoshikuni, Y.; Keasling, J. D.: The in vivo synthesis of plant sesquiterpenes by Escherichia coli. (Növényi szeszkviterpének in vivo szintézise Escherichia coliban.) = Biotechnology and Bioengineering, 75. k. 5. sz. 2001. dec. 5. p. 497–503. Ravinder, T.; Swamy, M. V. stb.: Clostridium lentocellum SG6 – a potencial organism for fermentation of cellulose to acetic acid. (Clostridium lentocellum SG6 mint potenciális szervezet a cellulóz ecetsavvá fermentálásához.) = Bioresource Technology, 80. k. 3. sz. 2001. dec. p. 171–177. Rebuffat, A.; Bernasconi, A. stb.: Selective enhancement of gene transfer by steroidmediated gene delivery. (A géntranszfer szelektív növelése szteroiddal közvetített génszállítással.) = Nature Biotechnology, 19. k. 12. sz. 2001. p. 1155–1161. Schueler, M. J.: Higgins, A. W. stb.: Genomic and genetic definition of a functional human centromere. (Funkcionális humán centomer genomikai és genetikai definíciója.) = Science, 294. k. 5540. sz. 2001. okt. p. 109–115. Stevens, R. C.; Yokoyama, S.; Wilson, A.: Global efforts in structural genomics. (Globális kutatási erőfeszítések a szerkezeti genomika területén.) = Science, 294. k. 5540. sz. 2001. okt. p. 89–92.
