Növényi biotechnológia és géntechnológia Dudits, Dénes Heszky, László

Növényi biotechnológia és géntechnológia

Dudits, Dénes Heszky, László

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényi biotechnológia és géntechnológia írta Dudits, Dénes és Heszky, László Publication date 2014 Szerzői jog © 2014 Agroinform Kiadó Szerzői jog © 2014 Educatio

Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Tartalom Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz ......................................................................... viii Köszönetnyilvánítás ............................................................................................................................ x 1. I. Bevezetés ..................................................................................................................................... 1 1. 1. A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjai (Heszky L.) .................................... 1 1.1. 1.1. Fogalma ............................................................................................................. 1 1.2. 1.2. Tárgya ................................................................................................................ 2 1.3. 1.3. Célja és gazdasági jelentŐsége .......................................................................... 7 1.4. 1.4. Módszereinek csoportosítása ............................................................................. 9 1.5. 2.1. A szövettenyésztés alapjainak megteremtése (1900–1950) ............................. 13 1.6. 2.2. A tenyésztett sejtek totipotenciájának bizonyítása és a szomatikus sejtgenetika kialakulása (1950–1980) ................................................................................................ 14 1.7. 2.3. A növényi géntechnológia kialakulása és felhasználása (1980-tól) ................. 16 1.8. 2.4. Hazai története ................................................................................................. 17 1.8.1. 2.4.1. A növényi biotechnológia pionírjai (1930–1980) ............................ 17 1.8.2. 2.4.2. A növényi sejtgenetika és szövettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) ............................................................................................................. 18 1.8.3. 2.4.3. A növényi géntechnológiai kutatások kezdete és az első eredmények 19 2. 3. Növény-sejt-növény rendszer in vitro (Heszky L. és Dudits D.) .................................... 21 2.1. 3.1. Dedifferenciálódás és redifferenciálódás ......................................................... 22 2.2. 3.2. Az in vitro morfogenezis alternatív útjai ......................................................... 22 2.3. 3.3. Növények felnevelése tenyésztett sejtekBŐl ................................................... 23 2.4. 3.4. Organogenezis ................................................................................................. 24 2.5. 3.5. A járulékos szervek differenciálódása ............................................................. 29 2.5.1. 3.5.1. A virág morfogenezise in vitro ......................................................... 29 2.5.2. 3.5.2. Gumóindukció in vitro ..................................................................... 30 2.6. 3.6. Szomatikus embriógenezis .............................................................................. 30 2.7. 3.7. Az in vitro szerv- és embriódifferenciálódás molekuláris háttere .................... 32 2.8. 3.8. A növényregenerálás eredményei ................................................................... 35 2. II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA ........................................................................... 38 1. 4. Az ivaros szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) ....................................................... 38 1.1. 4.1. Embriókultúra .................................................................................................. 38 1.1.1. 4.1.1. Az embriógenezis jellegzetességei in vivo ....................................... 38 1.1.2. 4.1.2. Története .......................................................................................... 40 1.1.3. 4.1.3. Módszere .......................................................................................... 40 1.1.4. 4.1.4. Az embriókultúrák csoportosítása és felhasználása .......................... 42 1.1.5. 4.1.5. A proembrió kultúrák céljai, módszerei és eredményei ................... 43 1.1.6. 4.1.6. A fejlett-embrió tenyészetek céljai, módszerei és eredményei ......... 50 1.1.7. Felhasználási területei: ............................................................................... 50 1.1.8. A csíranyugalom megszüntetése és a generációváltás gyorsítása. ............. 50 1.2. 4.2. Portoktenyésztés (in vitro androgenezis) ......................................................... 51 1.2.1. A mikrogametogenezis jellegzetességei in vivo ......................................... 51 1.2.2. Története .................................................................................................... 52 1.2.3. 4.2.1. Pollenembriógenezis indukcója ........................................................ 53 1.2.4. 4.2.2. A pollenhaploidok ontogenezise ...................................................... 53 1.2.5. 4.2.3. Androgenetikus poliploidia .............................................................. 58 1.2.6. 4.2.4. Módszere .......................................................................................... 58 1.2.7. In vitro androgenezis .................................................................................. 61 1.2.8. In vitro ginogenezis .................................................................................... 63 1.2.9. In vitro parthenogenezis ............................................................................. 63 1.2.10. Távoli keresztezés .................................................................................... 63 1.2.11. 4.2.6. Genetikai és nemesítési jelentőség ................................................ 63 1.3. 4.3. Generatív szervtenyészetek .............................................................................. 67 1.3.1. 4.3.1. Virágtenyésztés ............................................................................... 67 1.3.2. 4.3.2. Ováriumtenyésztés ........................................................................... 69 1.3.3. 4.3.3. Ovulumtenyésztés ............................................................................ 72 1.3.4. 4.3.4. Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben ................................... 75

iii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényi biotechnológia és géntechnológia 1.4. 4.4. Generatív szövettenyészetek ............................................................................ 78 1.4.1. 4.4.1. Endospermium-tenyésztés ................................................................ 78 1.4.2. 4.4.2. Nucellusztenyésztés ......................................................................... 79 1.5. 4.5. Generatív sejttenyészetek ................................................................................ 79 1.5.1. 4.5.1. Izolált mikrospóra tenyésztés ........................................................... 79 1.5.2. 4.5.2. Ivarsejtek izolálása és in vitro fúziója .............................................. 81 1.6. 4.6. Az apomixis biotechnológiája ......................................................................... 85 1.6.1. 4.6.1. Típusai .............................................................................................. 85 1.6.2. 4.6.2. Biológiája ......................................................................................... 86 1.6.3. 4.6.3. Biotechnológiai lehetőségei ............................................................. 87 2. 5. Az ivartalan szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) ................................................... 92 2.1. 5.1. Az in vitro mikroszaporítás alapjai .................................................................. 92 2.1.1. 5.1.1. Története .......................................................................................... 93 2.1.2. 5.1.2. A zárvatermők apikális merisztémájának anatómiája ..................... 94 2.2. 5.2. Merisztématenyésztés ...................................................................................... 95 2.3. 5.3. Rejuvenilizáció ................................................................................................ 96 2.4. 5.4. A mikroszaporítás módszerei ........................................................................... 97 2.4.1. 5.4.1. Hajtástenyésztés ............................................................................... 98 2.4.2. 5.4.2. Járulékos hajtástenyésztés ................................................................ 99 2.4.3. 5.4.3. Járulékos szervtenyészetek ............................................................. 101 2.5. 5.5. Kórokozó-mentesítés ..................................................................................... 102 2.5.1. 5.5.1. Hőkezelés ...................................................................................... 104 2.5.2. 5.5.2. Hidegkezelés ................................................................................. 104 2.5.3. 5.5.3. Merisztématenyésztés ..................................................................... 105 2.5.4. 5.5.4. Kemoterápia ................................................................................... 105 2.5.5. 5.5.5. Kombinált kezelés ......................................................................... 106 2.6. 5.6. Az in vitro mikroszaporítás technológiája ..................................................... 106 2.7. 5.7. Az üzemi mikroszaporítás gazdasági jelentősége ......................................... 107 2.7.1. 5.7.1. A steril mikroszaporítás előnyei ..................................................... 107 2.7.2. 5.7.2. A steril mikroszaporítás hátrányai .................................................. 108 2.7.3. 5.7.3. Üzemi mikroszaporítás a világon és hazánkban ............................. 108 2.8. 5.8. A mikroszaporítás a XXI. században ............................................................. 110 2.8.1. 5.8.1. Rita tenyésztési rendszer ................................................................ 110 2.8.2. 5.8.2. Vitron 501 mikroszaporító robot .................................................... 111 2.8.3. 5.8.3. Fotoautotróf mikroszaporítás ......................................................... 112 2.8.4. 5.8.4. Mikroszaporítás bioreaktorban ....................................................... 112 2.9. 5.9. A mesterséges mag ....................................................................................... 113 2.9.1. 5.9.1. Érett szomatikus embriók előállítása ............................................. 114 2.9.2. 5.9.2. A mesterséges mag előállítása, típusai .......................................... 117 2.9.3. 5.9.3. A mesterséges mag csírázása ......................................................... 119 2.9.4. 5.9.4. Gazdasági jelentősége .................................................................... 120 2.10. 5.10. In vitro génbank ......................................................................................... 121 2.10.1. 5.10.1. Az in vitro tárolás feltételei ........................................................ 122 2.10.2. 5.10.2. Az in vitro tárolás technikái ....................................................... 123 2.10.3. 5.10.3. Gyakorlati alkalmazás ................................................................ 124 2.11. 5.11. Kriobank (krioprezerváció) ........................................................................ 126 2.11.1. 5.11.1. Fagyásvédő előkezelések ........................................................... 127 2.11.2. 5.11.2. Fagyasztás, tárolás, olvasztás ..................................................... 128 2.11.3. 5.11.3. Az in vitro génbankok nemzetközi hálózata .............................. 129 3. III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK ................ 134 1. 6. A genetikai variabilitás növelése (Dudits D. és Heszky L.) .......................................... 134 1.1. 6.1. Szomaklonális variabilitás ............................................................................. 134 1.1.1. 6.1.1 Biológiai alapja és története ............................................................ 134 1.1.2. 6.1.2. Genetikai variabilitás a növényben in vivo .................................... 137 1.1.3. 6.1.3. A szövettenyészetek in vitro variabilitásának okai ........................ 138 1.1.4. 6.1.4. A szomaklonális variabilitás módszere ......................................... 143 1.1.5. 6.1.5. Fajhibrid szomaklónok ................................................................... 144 1.1.6. 6.1.6. Gyakorlati jelentőség és alkalmazás ............................................... 145 1.2. 6.2. Mutánsok izolálása sejt- és szövettenyészetekben ......................................... 147 1.2.1. 6.2.1. Az in vitro mutánsizolálás metodikai alapjai ................................. 148 iv Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényi biotechnológia és géntechnológia 1.2.2. 6.2.2. Aminosav analógokkal szembeni rezisztencia ............................... 149 1.2.3. 6.2.3. Kondicionális letális mutánsok: auxotrófok ................................... 150 1.2.4. 6.2.4. Herbicidrezisztencia ....................................................................... 150 1.2.5. 6.2.5. Szelekció betegségekkel és stresszhatásokkal szembeni rezisztenciára 151 1.3. 6.3. Szomatikus hibridizáció protoplasztfúzióval ................................................. 151 1.3.1. 6.3.1. Az ivaros keresztezés lehetőségei és korlátai ................................. 151 1.3.2. 6.3.2. Protoplasztokból felnevelt növények ............................................. 152 1.3.3. 6.3.3. A protoplasztok egybeolvadása – mesterséges sejthibridek .......... 158 1.3.4. 6.3.4. A szomatikus fajhibridek főbb sajátosságai ................................... 163 1.3.5. 6.3.5. Extrakromoszómális tulajdonságok átvitele – cibridek .................. 168 1.3.6. 6.3.6. A paraszexuális távoli hibridizáció lehetőségei ............................. 172 1.3.7. 6.3.7. Izolált sejtmagok és metafázis kromoszómák mint a génátvitel eszközei 176 2. 7. Transzgénikus növények létrehozása DNS-transzformációval .................................... 180 2.1. 7.1. A növényi genom mérete és a sejtmagi DNS szerveződése .......................... 181 2.2. 7.2. Genomikus növényi géntárak ........................................................................ 182 2.2.1. 7.2.1. Fág vektorokba történő klónozás ................................................... 183 2.2.2. 7.2.2. Nagyméretű genomikus DNS-szakaszok izolálása és klónozása – YAC és BAC génbankok ................................................................................................. 187 2.3. 7.3. Komplementer DNS-molekulák szintézise és klónozása ............................... 191 2.3.1. 7.3.1. A transzkripciós mintázat összehasonlításával történő génizolálás további módszerei ........................................................................................................... 195 2.3.2. 7.3.2. Növényi genomprogramok: DNS-szekvenciától a funkcióig ......... 197 2.4. 7.4. A növényi gének molekuláris szerkezete és aktivitásának szabályozása ....... 201 2.4.1. 7.4.1. Egy növényi gén főbb szerkezeti elemei ........................................ 201 2.4.2. 7.4.2. A génaktivitás – promoterműködés – mérésének módszerei ......... 202 2.4.3. 7.4.3. A folyamatos génkifejeződést biztosító konstitutív promoterek .... 204 2.4.4. 7.4.4. Hormonok által szabályozott illetve szövet-, és szervspecifikus génműködés molekuláris háttere ............................................................................................. 207 2.4.5. 7.4.5. Környezeti faktorok által irányított promoterek ............................. 207 2.4.6. 7.4.6. Vegyszeres kezeléssel aktiválható promoterek .............................. 208 2.4.7. 7.4.7. Génkifejeződést befolyásoló tényezők a transzgénikus növényekben 210 2.5. 7.5. Agrobacteriumplazmidok mint természetes génátviteli rendszerek ............... 211 2.5.1. 7.5.1. A tumorképződés molekuláris háttere Agrobacterium-fertőzés során 211 2.5.2. 7.5.2. A Ti-plazmidokra épülő vektormolekulák főbb elemei ................. 214 2.5.3. 7.5.3. Kétplazmidos, ún. bináris vektorok ................................................ 216 2.5.4. 7.5.4. A transzformáció lépései ................................................................ 217 2.6. 7.6. Közvetlen DNS-bevitel .................................................................................. 220 2.6.1. 7.6.1. Plazmidmolekulák bejuttatása protoplasztokba ............................. 220 2.6.2. 7.6.2. A DNS keresztüljuttatása a növényi sejtfalon: génpuska ............... 223 4. IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták ........................... 228 1. 8. Genetikailag módosított (GM) növények (Heszky L.) .................................................. 228 1.1. 8.1. A GM növény ............................................................................................... 228 1.1.1. 8.2. Molekuláris növénynemesítés ........................................................... 229 1.1.2. 8.2.1. A molekuláris és a hagyományos nemesítés kapcsolata ................. 231 1.2. 8.3. A növényi géntechnológia és a globalizáció .................................................. 232 1.3. 8.4. A fontosabb géntechnológiai stratégiák ......................................................... 232 2. 9. Biotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) ............. 237 2.1. 9.1. Vírus eredetű molekulák a virális patogénekkel szembeni rezisztencia kialakításában 237 2.1.1. 9.1.1. A köpenyfehérje gén kifejeztetésével kialakított rezisztencia ........ 239 2.1.2. 9.1.2. Módosított mozgási fehérjékre épített ellenállóság ........................ 240 2.1.3. 9.1.3. A replikázgén kifejeztetése ............................................................ 241 2.1.4. 9.1.4. Nukleinsav-molekulák által közvetített rezisztencia ...................... 241 2.1.5. 9.1.5. Vírusrezisztencia és transzkripció utáni génelhallgattatás ............. 241 2.2. 9.2. Bakteriális fertőzéssel szemben rezisztens transzgénikus növények ............. 243 2.2.1. 9.2.1. Antibakteriális fehérjék túltermeltetése a transzformáns növényekben 246 2.2.2. 9.2.2. A patogenitási és virulencia faktorok gátlása ................................. 246 2.2.3. 9.2.3. A növények természetes védekezési mechanizmusait serkentő géntechnológiák ................................................................................................. 246 v Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényi biotechnológia és géntechnológia 2.2.4. 9.2.4. A reaktív oxigéngyökök képződésének befolyásolása génbeépítéssel 247 2.3. 9.3. Gombarezisztens transzgénikus növények .................................................... 250 2.3.1. 9.3.1. Gombaellenes enzimek .................................................................. 252 2.3.2. 9.3.2. Patogenezishez kapcsolt növényi fehérjék és peptidek .................. 253 2.3.3. 9.3.3. Aktív oxigénfajták ......................................................................... 254 2.3.4. 9.3.4. Állati eredetű fehérjék és peptidek ................................................. 254 2.4. 9.4. Rovarrezisztens transzgénikus növények ...................................................... 254 2.4.1. 9.4.1. Mikroorganizmus eredetű gének .................................................... 255 2.4.2. 9.4.2. Növényi eredetű gének ................................................................... 258 2.4.3. 9.4.3. Állati eredetű gének ....................................................................... 260 3. 10. Abiotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) ........ 261 3.1. 10.1. Herbicidrezisztens transzgénikus növények ................................................ 261 3.1.1. 10.1.1. A géntechnológiával kialakított herbicidrezisztencia jelentősége 261 3.1.2. 10.1.2. Géntechnológia stratégiái ............................................................. 262 3.1.3. 10.1.3. Glifozát rezisztencia ..................................................................... 264 3.1.4. 10.1.4. Szulfonilurea rezisztencia ............................................................ 265 3.1.5. 10.1.5. Imidazolinon rezisztencia ............................................................. 266 3.1.6. 10.1.6. Foszfinotricin rezisztencia ............................................................ 267 3.1.7. 10.1.7. Bromoxinil rezisztencia ................................................................ 269 3.1.8. 10.1.8. Atrazin rezisztencia ...................................................................... 269 3.2. 10.2. Szárazság és ozmotikus stresszrezisztencia a transzformáns növényekben . 270 3.2.1. 10.2.1. A sejtstruktúra megőrzését szolgáló fehérjék ............................... 271 3.2.2. 10.2.2. Ozmotikus védelmet biztosító vegyületek (ozmolitok) szintetizáltatása 272 3.2.3. 10.2.3. Károsító molekulák hatástalanítását biztosító mechanizmusok .... 274 3.2.4. 10.2.4. A vízhiányt kísérő jelátviteli és génexpressziós szabályozás: az abszcizinsav szerepe .......................................................................................... 275 3.3. 10.3. Szélsőséges hőmérsékleti viszonyokat tűrő transzgénikus növények .......... 278 3.4. 10.4. A reaktív oxigéngyökök károsító hatását mérséklő anyagcsere-folyamatok 281 4. 11. Anyagcseréjükben módosított transzgénikus növények .............................................. 284 4.1. 11.1. A fehérje és aminosav anyagcsere módosítása ............................................ 284 4.1.1. 11.1.1. Az aminosav bioszintézis módosítása .......................................... 285 4.1.2. 11.1.2. Metioninban gazdag fehérjék termeltetése ................................... 286 4.1.3. 11.1.3. A búzaliszt minőségének javítása ................................................. 288 4.2. 11.2. A szénhidrát anyagcsere módosítása ........................................................... 290 4.2.1. 11.2.1. A keményítő bioszintézise (11/3. ábra) ........................................ 291 4.2.2. 11.2.2. A keményítő mennyiségének módosítása .................................... 294 4.2.3. 11.2.3. Amilóz és amilopektin arány módosítása ..................................... 294 4.2.4. 11.2.4. Cukortartalom módosítás ............................................................. 294 4.3. 11.3. A zsírsav bioszintézis módosítása ................................................................ 295 4.3.1. 11.3.1. A zsírsavak bioszintézise ............................................................. 296 4.3.2. 11.3.2. Rövid- és közepes láncú zsírsavak arányának növelése ............... 299 4.3.3. 11.3.3. Hosszú láncú zsírsavak arányának növelése ................................ 299 5. 12. Fejlődésben módosított transzgénikus növények (Heszky L. és Dudits D.) ............... 301 5.1. 12.1. Transzgénikus hímsterilitás és hibrid előállítás ........................................... 301 5.1.1. 12.1.1. Citoplazmás és génikus hímsterilitás ........................................... 301 5.1.2. 12.1.2. Hímsteril transzgénikus növények előállítása .............................. 302 5.1.3. 12.1.3. A hímsteril transzgénikus növények fenntartása és felszaporítása 303 5.1.4. 12.1.4. Fertilis F1 vetőmag előállítás ...................................................... 304 5.1.5. 12.1.5. Hímsterilitás kémiai kezeléssel GM növényekben ....................... 305 5.1.6. 12.1.6. Gyakorlati alkalmazás .................................................................. 305 5.2. 12.2. A növények növekedését, fejlődését és morfológiai felépítését érintő géntechnológiai beavatkozások ................................................................................... 307 5.3. 12.3. A terminátor technológia ............................................................................. 309 6. 13. Transzgénikus növények, mint bioreaktorok (Heszky L.) .......................................... 313 6.1. 13.1. Idegen fehérjék, peptidek génjeinek működtetése GM növényekben .......... 314 6.2. 13.2. Idegen fehérjék termeltetése rekombináns vírusokkal fertőzött növényekben 315 6.3. 13.3. A gazdaságos fehérjetermelés feltételei ....................................................... 316 6.4. 13.4. ,,Ehető vakcinák” termeltetése ..................................................................... 317 6.5. 13.5. Antitestek termeltetése ................................................................................. 318 vi Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Növényi biotechnológia és géntechnológia 6.5.1. 13.5.1. Ex situ felhasználás (egészségügy, ipar stb.) ................................ 319 6.5.2. 13.5.2. In situ felhasználás növényekben (növényvédelem) .................... 320 6.6. 13.6. Heterológ fehérjék és peptidek termeltetése ................................................ 321 6.6.1. 13.6.1. Bioaktív peptidek ......................................................................... 321 6.6.2. 13.6.2. Emberi fehérjék ............................................................................ 321 6.6.3. 13.6.3. Ipari enzimek ................................................................................ 322 6.7. 13.7. Ciklodextrin termelés ................................................................................... 323 6.8. 13.8. Műanyag termelés ........................................................................................ 323 5. V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái ............................................ 325 1. 14. Transzgénikus fajtákkal és termékekkel kapcsolatos kockázatok ............................... 325 1.1. 14.1. A géntechnológia és az evolúció ................................................................. 325 1.2. 14.2. A géntechnológia és a horizontális rekombináció ....................................... 325 1.3. 14.3. Biológiai (ökológiai) rizikótényezők ........................................................... 326 1.3.1. 14.3.1. Transzgén hatások ........................................................................ 326 1.3.2. 14.3.2. A transzgén termékének (fehérje) hatásai (14/1. ábra) ................. 327 1.4. 14.4. Gazdasági (szociális) hatások (14/2. ábra) ................................................... 330 1.5. 15.1. A ,,lényegi azonosság elve” ......................................................................... 331 1.6. 15.2. Törvényi szabályozás az USA-ban és az EU-ban ........................................ 331 1.7. 15.3. Törvényi szabályozás Magyarországon ....................................................... 332 2. 16. A növényi-biotechnlógia növekvő szerepvállalása a fenntartható fejlődés feltételeinek megteremtésében: hazai lehetőségek és feladatok ................................................................ 334

vii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz ,,És megáldá Isten őket és mondá nékik Isten: Szaporodjatok és sokasodjatok és töltsétek be a földet és hajtsátok birodalmatok alá; és uralkodjatok a tenger halain, az ég madarain és a földön csúszó-mászó mindenféle állatokon. És mondá Isten: Imé, néktek adok minden maghozó füvet az egész föld színén és minden fát, amelyen maghozó gyümölcs van; az legyen néktek eledelül.” Mózes első könyve 1. 28., 29. (Károli Gáspár fordításában) A növénytermesztés, kertészet és erdészet állítja elő az emberiség számára – a nap sugárzó energiájának megkötésével – a primer szervesanyagokat, az alapvető élelmiszereket és az állati takarmányokat, emellett az ipari termelés számára sokféle alapanyagot, valamint energiát is szolgáltat. A világ népessége rohamosan nő, ennek következtében drámaian csökken annak a területnek a nagysága, melyen egy ember szükségleteit meg kell termelni. Az egy főre jutó termőterület a világon 1950-ben 0,51 ha volt és ez 2025-re 0,17 ha-ra fog csökkenni. Az alap- és alkalmazott növénytudományok feladata, hogy eredményei olyan mértékű fejlődést váltsanak ki a termelésben, ami lehetővé teszi a szükségletek 0,17 ha-on való kielégítését. E probléma végleges megoldása a klasszikus növénytudományoktól önmagukban nem várható, azokkal a növények genetikai termőképessége már nem fokozható olyan mértékben, amennyire szükség lenne. Erre csak a molekuláris biológia, biotechnológia és géntechnológia legújabb eredményeit és módszereit felhasználó és azokat továbbfejlesztő alkalmazott növénytudományok – beleértve a növénynemesítést is – lesznek képesek. Az 1980-as évektől, a molekuláris biológia rendkívül gyors térhódításával az alap- és alkalmazott növénytudományok módszertani megközelítéseiben forradalmi változás következett be. A molekuláris módszerek alkalmazása amellett, hogy racionális megközelítéseket tesz lehetővé a kutatásban, várhatóan meg fogja változtatni az emberiség szemléletét a mezőgazdasági termeléssel kapcsolatban is. A molekuláris megközelítésben a növénytermesztés végül is nem több, mint néhány tucat növényfaj életfolyamatainak hasznosítása a társadalom számára. Napjaink növénytermesztését, kertészeti és erdészeti termelését felfoghatjuk úgy is, hogy nem búzát, kukoricát, zöldséget, gyümölcsöt, fát stb., hanem cukrot, fehérjét, olajat, cellulózt, alkaloidokat stb. termelünk. A vegyi üzemek, melyek ezeket az anyagokat előállítják, a növények, pontosabban a növényi sejtek. A termelőfolyamat pedig a növények anyagcseréje. A modern mezőgazdaság és az azt szolgáló tudományok az elmúlt évszázadok során igyekeztek a maximumot kihozni azokból a biológiai rendszerekből (szántóföldi, kertészeti, erdészeti fajok), melyeket a természet felkínált. A XX. században a növénynemesítés eredményeinek alkalmazása biztosította azt a fejlődést, mely képes volt élelmiszerrel ellátni a Föld gyorsan növekvő (1999. október 12-én elérte a 6 milliárd főt) lakosságát. Nem tették meg azonban azt a kicsi, de mégis óriási lépést, mely a növények képességeinek, tulajdonságainak

viii Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Előszó a harmadik, átdolgozott, bővített kiadáshoz mesterséges megváltoztatását tette volna lehetővé. Az évszázad végétől viszont a tudományos lehetőség már adott. A molekuláris megközelítésre alapuló tudományok lehetővé teszik, hogy az élő szervezetek – jelen esetben a növények – működését (életét) vezérlő genetikai programot mi emberek változtassuk meg, az emberiség (a gazdaság) igényeinek megfelelően. Ez az új biotechnológia és géntechnológia lényege, lehetősége és stratégiája. A növényi biotechnológia és géntechnológia a növénynemesítés lehetőségeinek kiszélesítésével járul hozzá a fenntartható fejlődés megvalósításához, különös tekintettel

ix Created by XMLmind XSL-FO Converter.

Köszönetnyilvánítás A könyv szerzőinek külön örömére szolgál, hogy a bemutatott példák nagy számban hazai kutatások eredményeire épülnek. Ezért külön köszönetet mondanak a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjában (Szeged) és a Gödöllői Szent István Egyetem Genetika és Növénynemesítés Tanszékén (Gödöllő), valamint a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban (Gödöllő), a Gabonatermesztési Kutató Khtben (Szeged) és a Mezőgazdasági Kutatóintézetben (Martonvásár) dolgozó kollégáknak, hogy a tudományos eredményeiket bemutató ábrákat rendelkezésünkre bocsátották. Külön köszönet és elismerés illeti Keczánné Czakó Zsuzsannát (MTA SZBK) a kézirat elkészítésében nyújtott alkotó közreműködéséért. Köszönet illeti Kiss Józsefet, Zámbó Lászlónét, Pongrácz Sándornét, Bakos Györgynét, Tóth Péternét, Bellusné Daniek Ágnest (SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöllő) és a tanszék doktoranduszai közül Veres Anikót, Debreczeni Dianát és Galli Zsoltot a kézirat összeállításában, valamint az ábrák elkészítésében nyújtott áldozatkész segítségükért. A szerzők köszönetet mondanak továbbá Barnabás Beátának az MTA doktorának és Balázs Ervinnek az MTA lev. tagjának, szakmai lektoroknak, a kézirattal kapcsolatos megjegyzéseikért és értékes szakmai tanácsaikért, valamint Sági Ferencnek, a biológiai tudomány kandidátusának javító észrevételeiért. E könyv megjelenését támogatták: Aventis Crop Science, Magyarország, Monsanto

x Created by XMLmind XSL-FO Converter.

1. fejezet - I. Bevezetés 1. 1. A növényi biotechnológia és géntechnológia alapjai (Heszky L.) 1.1. 1.1. Fogalma A növényi biotechnológia és különösen a növényi géntechnológia nemzetközileg is új fogalomnak tekinthető, melyet sokféleképpen értelmeznek, ezért pontos és egyértelmű definíciója rendkívül fontos. A klasszikus biotechnológia vagy biológiai technológia „olyan gyártási eljárást jelent, melyben valamilyen élő szervezet vagy annak alkotórészei (pl. enzimek) végzik a termék előállítását”. E megfogalmazásból azonnal kitűnik, hogy ezt műszaki aspektusból értékelték, tehát olyan ipari gyártási eljárásokat neveztek biotechnológiának, melyben bizonyos lépéseket mikroorganizmusok vagy enzimek végeznek. Mivel ezek az iparágak (gyógyszeripar, élelmiszeripar stb.), illetve a takarmánytartósítás viszonylag régen kialakultak, a biotechnológia fogalmát kizárólagosan e területeken használták a 70-es évek végéig. Ezek a zömében mikrobiális fermentációra, erjesztésre stb. alapozott technológiák – nem lebecsülve gazdasági jelentőségüket – a hagyományos vagy klasszikus biotechnológiának tekintendők. Az új és hagyományos biotechnológia között a határvonalat a genetikai módosítás jelenti. Az új biotechnológiai eljárásokban tehát az ember által bizonyos célból megváltoztatott, genetikailag módosított élő szervezetek vesznek részt. Ezek az élő szervezetek pedig már a mikroorganizmusokon kívül lehetnek növényi vagy állati sejtek, sőt növények, vagy állatok is. Az új biotechnológiai technikák gyors elterjedése a kutatásban és egyre növekvő gazdasági jelentősége szükségessé tette a 80-as évek elején a biotechnológia fogalmának módosítását. Az újra csak műszaki szempontból megfogalmazott nemzetközi nómenklatúra szerint az új biotechnológia: „a biokémia, a mikrobiológia és a műszaki tudományok olyan integrált alkalmazása, amelynek célja a mikroorganizmusok, tenyésztett növényi, állati sejtek vagy azok valamely részének technológiai felhasználása”. E megfogalmazás ugyan jelentett valamilyen előrelépést, azonban bonyolult, hiányos és nehezen értelmezhető a mezőgazdaság oldaláról. A növényi biotechnológia: a növények, növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását és az így kialakított új képességeik technológiai felhasználását jelenti. A növényi biotechnológia tehát az új biotechnológiák közé tartozik és két fő lépésből áll. Az elsőben új tulajdonságokkal rendelkező egyedeket (sejt vagy növény) állítunk elő, melyeket a második lépésben a gyakorlatban használunk fel. A gyakorlat a növényi biotechnológia esetében a növénynemesítést, a növényvédelmet és a szaporítóanyag-előállítást, illetve a növénytermesztési technológiákat jelenti. A növényi biotechnológia végeredményben nem tekinthető önálló diszciplínának, hanem különböző tudományok, tudományterületek eredményeit szintetizáló, módszereit gyakorlati cél érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatnak. A fogalomban jelzett két lépés összhangban van magának a biotechnológiának, mint szónak az összetéte-lével is. A növényi biotechnológia fogalmának első lépésében jelzett genetikai módosítás jelenti tulajdonképpen a „bio” oldalt. Azokat a kísérletes biológiai diszciplínákat, amelyek elméleti eredményeinek és módszereinek alkalmazásával új értékek hozhatók létre. Ezek három csoportba sorolhatók: a szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia. A szaporodás (reprodukció) biotechnológiája: a növények ivaros (szexuális) és ivartalan (aszexuális) szaporodásának módosítását jelenti a növényi sejtek, szövetek, vagy szervek in vitro tenyészeteiben. A szomatikus sejtgenetika a növényi sejtek genetikai programjának megváltoztatását jelenti, közvetve sejtszintű manipulációval, sejt- és protoplaszttenyészetekben. A géntechnológia a növényi sejtek, sejtorganellumok genetikai programjának megváltoztatását jelenti, molekuláris genetikai módszerekkel. 1 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

A géntechnológia tehát része a növénybiotechnológiának. Tudományos és gazdasági jelentősége azonban felülmúlja a másik két megközelítést. A hazai és nemzetközi törvényi szabályozásnak megfelelően csak a géntechnológiával megváltoztatott sejtek és növények tekintendők genetikailag módosítottnak, azaz GM-nek. A GM növények (géntechnológiával módosított növények, transzgénikus növények, transzformáns növények stb.) tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába), a géntechnológia molekuláris módszereivel idegen gént (transzgén) juttatnak be és az integrálódik, működik és öröklődik. A transzgénikus növények, illetve fajták (GM fajták) tehát abban különböznek a hagyományostól, hogy a növény minden sejtje sejtmagjában általában egy vagy több transzgént és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott fehérjéket tartalmaz. A fentiek alapján egyértelmű a különbség a növényi biotechnológia és a hagyományos biotechnológia között, valamint az újabb biológiai eljárások (pl. biotermesztés, biokert, biohumusz stb.), illetve a bioaktív anyagokat (serkentők és gátlók) felhasználó technoló-giák között. Erre a megkülönböztetésre rendkívül nagy szükség van, mert a növényi biotechnológia végül is nem a már ismert és más fogalmakkal bevezetett eljárások átkeresztelése, hanem minőségileg újat, új piacot és értéket teremtő molekuláris és sejtgenetikai, valamint sejtés szövettenyésztési eljárások, illetve azok eredményeit felhasználó technológiák összessége. E könyv következő fejezeteiben a sejt- és szövettenyésztés, valamint a sejt- és molekuláris genetikai módszereket, azok fejlesztési lehetőségeit, eredményeit és gazdasági jelentőségét ismertetjük, három fő egységben (szaporodás biotechnológiája, szomatikus sejtgenetika és géntechnológia), utalva a technológiai vonatkozásra ott, ahol ez már napjainkban is lehetséges.

1.2. 1.2. Tárgya A növénybiotechnológiának biológiai oldalról két meghatározó eleme van: az első a genetikai módosítás, a második a növényi sejt. Ebből logikusan következik, hogy a növényi biotechnológia tárgya nem lehet más, mint a növények örökítő anyaga (DNS), illetve az azt hordozó legkisebb totipotens élő egysége, a növényi sejt. A növényi biotechnológia központjában tehát a sejt (ivarsejt, szomatikus sejt) áll, függetlenül attól, hogy a genetikai manipulációt molekuláris, sejtvagy egyedszintű megközelítéssel végezzük. Ennek oka, hogy a sejt a növénynek az a legkisebb része, amelynek teljes genetikai információkészlete van, tehát totipotens. Másképpen fogalmazva nem ismerünk olyan, a sejtnél kisebb egységet, amelyből intakt növényt lehetne regenerálni. Ebből az következik, hogy molekuláris megközelítés (géntechnológia) esetén is sejtszintű molekuláris transzformációra van szükség ahhoz, hogy a transzgén integrációját – az in vitro rekombinációt – követően genetikailag módosított növényt kaphassunk. Ebből logikusan következik, hogy a GM sejtből regenerált GM növény minden sejtje tartalmazni fogja a transzgént.

2 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

1/1. ábra: A növényi sejt (A) és az abból izolált protoplaszt (B) sematikus ábrázolása, különös tekintettel az örökítő vagy genetikaianyag lokalizációjára Biotechnológiai szempontból a növényi sejt (1/1. ábra) néhány specialitással rendelkezik. Először is a szilárd, általában másodlagosan vastagodott sejtfala tűnik szembe, amely – az állati sejttel szemben – nehezíti idegen információt hordozó molekulák, sejtorganellumok bejuttatását. Enzimkezeléssel eltávolítva a sejtfalat, sejtfal nélküli növényi sejteket, úgynevezett protoplasztokat kapunk (1/1. ábra), melyek ideális objektumai a genetikai beavatkozásnak. A DNS legnagyobb része (90–99%) a kettős hártyával, membránnal határolt sejtmagbantalálható. A DNS szerkezete lineáris és az eukariótákra jellemző szerveződést mutat. Hosszúsága néhány centimétertől néhány méterig terjed. A genom mérete megközelítőleg 1 x 10 8 és 10 x 1010 bázispár között változik, ami 0,07–100 pg értéknek felel meg. A kultúrnövények genomjának mérete elérheti, sőt jelentősen meghaladhatja az emberi genomét (3 x 109). Ennek oka részben a poliploidia, részben az ismétlődő (repetitív) szekvenciák nagy aránya (25–95%). A genomiális DNS kromoszómákba csomagolva található a sejtmagban, melyek száma általában 2n = 10–48 között van (1/2. ábra).


I. Bevezetés

1/2. ábra: A növények minden sejtje a sejtmagban tartalmazza a teljes genomot, melynek hosszúsága fajonként jelentős eltérést mutat A gének száma 30–50 ezerre tehető. A növényi genom analízisét az ún. Genom Projektek végzik. Céljuk a genomokban lévő genetikai információ megfejtése. Az információt a DNS 4 építőelemének, a nukleotidoknak (A,T,G,C) sorrendje határozza meg. Az első lépésben – a DNS szekvenálás során – a különböző kultúrfajok genomiális DNS-ének nukleotid sorrendjét határozzák meg. Ez időigényes feladat, hiszen a kukorica genomja 3,9 milliárd (3,9 x 10 9), a búzáé 17 milliárd (1,7 x 1010) nukleotidból áll. A második lépésben kell majd a gének helyét meghatározni (térképezni) a láncban (funkcionális genomanalízis). Ami a szekvenálást illeti, a növények közül az Arabidopsis genomja, mely a legkisebb (1 x 108 bp) áll a legközelebb a befejezéshez, de előrehaladottnak tekinthető a kukorica és a rizs (1 x 109 bp) genomanalízise is. A genetikai anyag 1–10%-a található a sejtorganellumokban, tehát a plasztiszokban (átlag 20–40 db/ sejt) és a mitokondriumokban (átlag 100–200 db/ sejt). Az organellum DNS prokarióta típusú és több, átlagosan 10–40 másolata található egy organellumban. Ennek következtében az organellum genom kópiáinak száma egy sejtben meghaladhatja az ezret, tehát az organellum DNS-nek ,,populációi” találhatók egy-egy növényi sejtben (1/1. táblázat).


I. Bevezetés

A kloroplasztisz genom egy kópiájának átlagos mérete a kultúrnövények esetében 100–200 kb, amelyen 50–100 gén található. A mitokondrium genom egy példányának mérete átlagosan 100–2500 kb. A kódolt fehérjék száma kevesebb vagy hasonló a kloroplasztiszéhoz. Végeredményben a növény tulajdonságai részben a sejtmagban, részben az egyes organellumokban lévő DNSben kódoltak. Az utóbbiak az extrakromoszomális tulajdonságok hordozói, amelyek ún. anyai öröklésmenetet mutatnak. A géntechnológiai módosításra tehát három egymástól elkülönült helyen, a sejtmag- (genom) DNS-ben, a plasztisz-DNS-ben, illetve a mitokondrium-DNS-ben kerülhet sor. A növényi biotechnológia sikerének és alkalmazhatóságának másik elemét az a követelmény jelenti, hogy a genetikai módosítást követően a transzformált, fúzionált, szelektált stb. sejtekből növényeket lehessen felnevelni. Ennek lehetőségét a növényi sejt- és szövettenyésztésnek az utóbbi évtizedekben elért eredményei teremtették meg. A növényi sejt totipotenciája in vitro realizálásának lehetősége viszont szemléletmódosítást igényel (1/3. ábra).


I. Bevezetés

1/3. ábra: A növényi biotechnológiaés a sejt-növény rendszer két alaptechnikája, a kallusztenyésztés (A és B) és a sejttenyésztés (C és D) A: kallusz szövet, mely differenciálatlan parenchima sejtekből áll; B: dohány növényregenerálás organogenezissel; C: sejtszuszpenzió, mely sejtaggregátumokból áll; D: sárgarépa növényregenerálás szomatikus embriógenezissel (Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növén nemesítés Tanszék, Gödöllő) A növénybiotechnológiában a sejt egyenlőnek tekinthető a növénnyel. Gyakorlatilag ez azt jelenti, hogy a növénybiotechnológus, amikor sejtekkel dolgozik, tulajdonképpen növénnyel dolgozik. A biotechnológia szempontjából a sejt azért tekinthető egyenlőnek a növénnyel, mert genetikai anyaga minden olyan információt tartalmaz, amely az intakt növényre jellemző, és a sejtekből in vitro növények regenerálhatók. A sejtszintű rendszer tehát elvben bármikor növényszintre hozható (1/4. ábra).


I. Bevezetés

1/4. ábra: Biotechnológiai eredetű fajta előállításának sémája. A genetikai módosítás a kiválasztott növények in vitrotenyészeteiben történik. Ezt követően a kultúrákból (sejt, protoplaszt) növényeket kell regenerálni, majd szántóföldi kísérletekkel kell igazolni a genetikai módosítás növényszintű manifesztációját és stabil öröklődését. Ezt követően a genetikailag manipulált növények a klasszikus nemesítés, fajtaminősítés rendszereken keresztül válhatnak minősített fajtává, ami a növénytermesztési alkalmazás feltétele

1.3. 1.3. Célja és gazdasági jelentŐsége A növényi biotechnológia különböző tudományok eredményeit szintetizáló, azok módszereit piaci célok érdekében komplexen felhasználó, új tudományos és gazdaságfejlesztési irányzatként jellemezhető. Ebből a megközelítésből kiindulva a növényi biotechnológia célja nem lehet más, mint a növények genetikai információjának módosításával új, gazdaságilag értékes fajták, hibridek előállítása, valamint új növénytermesztési technikák, szabadalmak és technológiák kifejlesztése (1/5. ábra).


I. Bevezetés

1/5. ábra: A géntechnológiai megközelítés lényege, hogy a gének megfelelő módosításával lehetővé teszi a kapcsolt fehérjék megváltoztatását úgy, hogy azokkal a kívánt fenotípus elérhető legyen Gazdasági jelentősége miatt külön kell említenünk a géntechnológiát és az abban rejlő tudományos és gazdasági lehetőségeket. Elöljáróban piaci szempontból néhány alapvető kérdést kell tisztáznunk. A Földön élő valamennyi szervezet, így a növények összes tulajdonsága is, az örökítő anyagban, a DNS-ben (30–50 ezer génben) van kódolva (lásd előző pontban). A gén fogalmát a géntechnológia szempontjából úgy definiálhatjuk, hogy a DNS azon szakasza, mely egy vagy több fehérje kódját és annak megnyilvánulásához szükséges regulációs szekvenciákat tartalmazza. Végeredményben a gén egy olyan programcsomagot jelent, mely – a tárolt információ szempontjából – szerkezeti és működési egységet alkot. A növényi géntechnológia során tulajdonképpen ilyen programcsomagokat viszünk át a donor fajból a recipiens növénybe. A transzgénikus növények tehát azok, melyek sejtmagjába (genomjába) – géntechnológiával – idegen gént (transzgén) juttatunk be és az integrálódik, működik és öröklődik. A Földön az élet információja minden élőben többé-kevésbé azonos rendszer szerint van kódolva. Ezért a transzgén származhat vírusból, baktériumból, gombából, rovarból, állatból, sőt emberből is. Bárhonnan származik a gén, alapvető feltétel az, hogy azt a növényben működő szabályozó szekvenciákkal kell ellátnunk. A GM növényfajta genetikailag tehát abban különbözik a hagyományos fajtától, hogy genomjában egy vagy több géntechnológiával kialakított „idegen gént” és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott egy vagy több új fehérjét tartalmaz. Ennek következtében a GM fajta néhány tulajdonságban eltér a hagyományos fajtáktól. Ezeknek a tulajdonságoknak azonban komoly termesztéstechnológiai, kereskedelmi és ipari értékük lehet.


I. Bevezetés

Végül is a géntechnológia molekuláris eszköztára az emberiség kezébe adta azt a lehetőséget, hogy a növényfajokat olyan új tulajdonságokkal, képességekkel ruházza fel, melyek az adott fajban az evolúció során nem, vagy nem az ember által kívánt mennyiségben és minőségben alakulhattak ki. Ennek a lehetőségnek a kihasználására a világon az elmúlt évtizedben géntechnológiai verseny alakult ki a transzgénikus növényfajták XXI. században várható piacainak megszerzéséért. E verseny a globalizáció jegyében zajlik, mely során vegyipari konszernek fúzionálnak vagy vásárolnak fel biotechnológiai, illetve vetőmag vállalatokat. Ennek következtében – eddig nem ismert méretű – tőkekoncentráció jött, és jön létre a vetőmagiparban, mely évente dollármilliárdokat képes befektetni a gazdaságilag jelentős transzgénikus növények előállításába, a gének, eljárások, fajták, termékek, szabadalmi védelmébe és bevezetésébe az egész világon.

1.4. 1.4. Módszereinek csoportosítása A növényi biotechnológia mint diszciplína, tárgyának (növényi sejt) és céljának (genetikai módosítás) megfelelően három nagy egységre osztható. A csoportosítás alapelve az, hogy az örökítő anyagban közvetlenül vagy közvetve hozunk-e létre információváltozást. Ennek megfelelően a molekuláris szintű megközelítést a géntechnológia, a sejtszintű technikákat a szomatikus sejtgenetika, továbbá a szövet- és szervszintű módszereket a szaporodás biotechnológiája jelentik. Géntechnológia A géntechnológia az örökítő anyag közvetlen molekuláris módosítását teszi lehetővé. A molekuláris biológia, sejtgenetika és szövettenyésztés különböző módszereit alkalmazza, melyek lehetővé teszik: a/ az egyes tulajdonságokért felelős gének izolálását, jellemzését és felszaporítását (klónozását); aa/ a gazdaságilag jelentős gén olyan vektorba építését, mellyel lehetővé válhat a gén átvitele a recipiens sejtbe, biztosítja továbbá a genomba való integrációját és működését; aaa/ a genetikailag módosított sejtekből a kifejlett szervezet (transzgénikus növény) előállítását (regenerációját). Szomatikus sejtgenetika A géntechnológiával szemben ezeknek a technikáknak a tárgya nem közvetlenül az örökítő anyag, a DNS, hanem a sejt vagy a sejtorganellum. Ennek ellenére alkalmazásuk közvetve molekuláris szintű változásokat okoz a genomban, illetve a plazmonban. A sejtgenetika a protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció, cibridizáció, sejtszintű mutánsizolálás, szomaklonális variabilitás stb. különböző sejtszintű és sejttenyésztési módszereit alkalmazza. A szaporodás biotechnikája A genetikai módosítás az ivaros és ivartalan szaporodás laboratóriumi manipulációjával történik általában sejt-, szövet- és szervtenyészetekben. Módszerei a haploidia, az embriókultúra, az in vitro termékenyítés, a ginogenezis, a merisztémakultúra, a vegetatív mikroszaporítás, a szomatikus embriógenezis stb. E csoportba tartoznak azok a módszerek is, amelyek felhasználásakor a genetikai módosítással nem a megváltozást, hanem ellenkezőleg, a genetikai stabilitást, a homozigóta állapotot, a genetikai homogenitást kívánjuk elérni és azt változatlan formában fenntartani, valamint megőrizni, illetve felszaporítani.


I. Bevezetés

1/6. ábra: A növényi biotechnológia és géntechnológia fontosabb területei, valamint módszerei Az 1/6. és 1/7. ábrán az izolátum jellege szerinti, az irodalomban leggyakrabban használt csoportosítást mutatjuk be. Újabban a gyakorlati alkalmazás egyre jobban elkülönülő területei is bizonyos csoportosítást jelentenek (pl. növénynemesítési biotechnológia, növényvédelmi biotechnológia, vegetatív mikroszaporítás stb.). Sőt napjainkban növénycsoportok, illetve növényfajok szerinti elkülönülés is tapasztalható (gabonafélék biotechnológiája, burgonya biotechnológiája, erdészeti fajok biotechnológiája stb.). Végeredményben a növényi biotechnológia egyre bővülő ismeretei, széleskörű gyakorlati elterjedése egyre specializáltabb csoportosítást eredményez, de a genetikai módosítás szintje alapján történő hármas tagolódás minden esetben érvényesül.


I. Bevezetés

1/7. ábra: A sejt- és szövettenyésztés fontosabb technikái. 1. In vitro ginogenezis: ovárium, ovulum izolálás táptalajra és növényregenerálás haploid sejtből. 2. In vitro termékenyítés: ovárium izolálás táptalajra, megtermékenyítés kémcsőben tömlőt hajtó pollennel, magfejlődés és csírázás. 3. Embriótenyésztés: proembriók fejlődésének fenntartása kémcsőben és növényregenerálás. 4. Vegetatív szaporítás: járulékos embriógenezis indukcióval. 5. Vegetatív szaporítás merisztématenyésztéssel: izolált merisztémacsúcsból járulékos merisztémák nevelése, feldarabolás növényregeneráció. 6. Kalluszkultúra: a növény osztódó kambiális szöveteiből kalluszindukció, majd növényregenerálás. 7. Protoplaszt tenyésztés: protoplasztok izolálása levél mezofillum sejtekből, növényregenerálás. 8. Szomatikus hibridek: izolált protoplasztok fúziója, növényregenerálás. 9. Portok, mikrospórakultúra: portokokban táptalajon a pollenből haploid növényregenerálás androgenezissel Felhasznált és ajánlott irodalom Altman, A. et al. eds. (1999): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht–Boston–London. Altman, A. ed. (1998): Agricultural Biotechnology. Marcel Dekker, Inc. New York–Basel–Hong-Kong. Dudits D., Dohy J. szerk. (1998): Biotechnológia, lépéstartás Európával. MTA, Budapest. Dudits D., Heszky L. (1990): Növényi biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest. Heszky L. (1995): Növényi biotechnológia. Az Agrárgazdaság jövőképe. Agro 21. Füzetek 5, 37–56. Maróti M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó, Budapest. Skjervold, H. (1989): Biotechnológia. Mg. Kiadó, Budapest. A növényi biotechnológia története tulajdonképpen a növények sejt- és szövettenyésztésével kezdődik. Ismertetésekor csak a fejlődés fő vonulatát követjük nyomon, utalva a legfontosabb személyekre, eredményekre, megvilágítva néhány összefüggést. E fejezetben nem kívánunk az egyes technikák történetével és különböző


I. Bevezetés

fajokon való felhasználásával foglalkozni. Ezeket a könyv későbbi fejezeteiben az adott technika bemutatásakor részletezzük. A növényi sejtek és szövetek tenyésztésének történetét – talán nem túlzás, – de 1838-ban kell indítanunk, amikor is két német kutató, a botanikus SCHLEIDEN és a biológus SCHWANN nyilvánosságra hozta sejtelméletét. A mi szempontunkból nem azon a megállapításukon van a hangsúly, hogy minden szervezetet sejtek, szövetek és szervek építenek fel, hanem azon, hogy a soksejtű szervezetek minden egyes differenciálódott sejtje valószínűleg megtartja mindazon ,,információt”, amely a kiinduló egyetlen sejtben, a megtermékenyített petesejtben jelen van. Néhány évtizeddel később, a múlt század hetvenes éveiben WÖCHTING a keltike (Corydalis solida) gumójának vágásfelületén megfigyelt organizációval (levél- és gyökérfejlődés) in vitro kísérletesen bizonyította ezt a hipotézist. Tulajdonképpen már csak egy lépésnek tűnt a növényi szomatikus sejtek totipotenciájának in vitro bizonyítása. Ennek gondolatát elsőként az 1854-ben, a Mosonmagyaróváron született német HABERLANDT vetette fel 1902-ben.

Végeredményben tehát a századfordulón kezdődött a mai értelemben vett növényi sejt- és szövettenyésztés története (2/1. táblázat). Az elmúlt évszázad növényi biotechnológiával kapcsolatos eredményeit 3 fő szakaszra osztva mutatjuk be. Az első, amely az 1940-es évek végéig tartott, a steril technika és a legalapvetőbb módszerek kidolgozásának időszaka volt. A másodikban, 1950–1980 között a különböző szervek, merisztémák, haploid és szomatikus sejtek, valamint protoplasztok totipotenciáját sikerült bizonyítani, mely utóbbi eredményekre alapozva, indult a növényi szomatikus sejtgenetika kialakulása. Ezt a harmadik szakasz követte 1980-tól, mely napjainkban is tart


I. Bevezetés

és a növényi géntechnológia forradalmi és látványos előretörését, sőt a GM növények köztermesztésbe kerülését eredményezte, a 90-es évek közepén.

1.5. 2.1. A szövettenyésztés alapjainak megteremtése (1900– 1950) HABERLANDT 1902-ben közölt munkájában elsőként próbálkozott a növények vegetatív sejtjeinek tenyésztésével egyszerű táptalajon. Abból indult ki, hogy ha tényleg létezik a totipotencia, akkor megfelelő feltételek között olyan fejlődés tartható fenn, ami intakt növény kialakulásához vezet. Természetesen ennek bizonyítása – az akkori tenyésztési feltételek, táptalajok és a konkrét izolátum (epidermisz-, sztóma-, és szőrsejtek) miatt – neki még nem sikerülhetett. Ez azonban nem keserítette el és bízott abban, hogy egyszer valakinek sikerülni fog embriókat felnevelni a növények vegetatív sejtjeiből. HABERLANDT-tal egyidőben, 1904-ben sikeres kísérleteket végzett HANNIG, retekembriókkal. A kipreparált embriók – ásványi sókat és szacharózt tartalmazó tápközegben – tovább folytatták fejlődésüket, s belőlük növényeket kapott. Nyilvánvalóvá vált, hogy a további kutatásokat nem a sejt-, hanem az egyedfejlődés előrehaladottabb szervezettségi szintjén kell folytatni, amelyet az embrió, illetve gyökér- és hajtásmerisztéma jelentett. A HANNIG eredményes munkáját követő három évtized a növényi szövettenyésztés módszereinek megalapozó évtizedei voltak. LAIBACH 1925-ben képes volt táptalajon hibrid embriókat is életben tartani és belőlük hibrid növényeket felnevelni. A fejlődés fő vonalát azonban nem az embriók mesterséges felnevelése (embriótenyésztés vagy embriókultúra), hanem a szervkultúrák jelentették. Az 1920-as évek elején Amerikában ROBBINS, Európában egy HABERLANDT-tanítvány, KOTTE sikerrel oldotta meg a gyökérmerisztémák növekedéséhez szükséges mesterséges feltételek kialakítását. A szervetlen sókat és glükózt tartalmazó tápoldatban az izolált borsó- és kukorica-gyökércsúcsok intenzíven növekedtek és elágazó gyökérré fejlődtek. Folyamatos tenyésztésüket azonban a tenyészetek algás, bakteriális és gombás fertőződései megakadályozták. Ezek a tapasztalatok vezettek el a mai értelemben vett steril szövettenyésztési módszerek kidolgozásához. Nyilvánvalóvá vált ugyanis, hogy a növényi szövetek, szervek mesterséges tenyésztése más táptalajokat és más feltételeket kíván, mint az akkoriban példának tartott állati szövettenyésztés. Teljesen steril (csíramentes) feltételek nélkül az izolált növényi részek tartós tenyésztése megoldhatatlan. Az új módszerek kidolgozását végül is siker koronázta és ezzel elérkeztünk az 1930-as évek végéhez. A harmincas években két szövettenyésztési iskola hívta fel magára a figyelmet, az egyik White körül az USAban, a másik Gautheret körül Franciaországban. Talán nem tévedünk, ha a mai értelemben vett szövettenyésztés kezdetét e két csoport munkásságától számítjuk. White 1932-ben már sikerrel tenyésztett ovulumokat. A fejlődés szempontjából azonban sokkal fontosabb volt 1934-es vizsgálata, amikor paradicsom- (Lycopersicon esculentum) gyökércsúcsból indított gyökértenyészetben szervetlen sókat, szacharózt és élesztőkivonatot tartalmazó – mely utóbbit később B-vitaminokkal helyettesített – folyékony táptalajban teremtette meg a folyamatos tenyésztés feltételeit. E munka lett a későbbi szervtenyészetek (levél, hajtás, virág) kiindulópontja is. A sikeres paradicsom gyökértenyészet – amelyet 7 naponta kellett az oldalgyökerekről átoltani, és amely White 1968-ban bekövetkező halálakor már 1726 passzálást ért meg – tekinthető a korlátlan idejű növényi szövettenyészetek első állomásának. Közben Gautheret elsőként indukált kalluszt in vitro és a szintén francia Nobécourt-ral együtt 1939-ben kidolgozott egy hathetente folyamatosan átoltható, jól osztódó sárgarépa kalluszkultúrát. A módszer kidolgozásakor a kor legújabb kutatási eredményeit használta, a táptalajt agarral szilárdította és White-féle vitaminokkal (tiamin, piridoxin, niacin) egészítette ki, továbbá felhasználta az 1937-ben Went és THIMANN által felfedezett auxint, az indolecetsavat (IES) is. White szintén 1939-ben számolt be a Nicotiana glauca és N. langsdorffii keresztezéséből származó hibridből indított, folyamatosan növekvő kalluszról. A kallusz az in vitro tenyésztett differenciálatlan, folyamatosan osztódó növényi sejtek tömege. E két növény, a dohány és a sárgarépa, valamint in vitro tenyészeteik azóta a növényi sejt- és szövettenyésztési alapkutatások gyakran használt tesztobjektumaivá váltak. Most egy pillanatra térjünk vissza Haberlandt posztulátumára. A kutatóknak tehát 1939-ben sikerült, ha nem is izolált egyes sejteket, de sejtek tömegét mesterséges feltételek között életben tartani, növekedésük és osztódásuk


I. Bevezetés

feltételeit biztosítani. A következő lépéshez, a totipotencia in vitro bizonyításához azonban még további felfedezésekre volt szükség és csak 20 évvel később sikerült.

1.6. 2.2. A tenyésztett sejtek totipotenciájának bizonyítása és a szomatikus sejtgenetika kialakulása (1950–1980) Van Overbeek, Conklin és Steward az embriókultúrákban tesztelt kókuszdiótejjel és az időközben szintetikusan előállított auxinnal – a 2,4-D-vel (2,4-diklórfenoxi-ecetsav) – képesek voltak kalluszt indukálni a már differenciálódott sejtekből is. Ezek a kísérletek új növényi növekedési hormoncsoport, a citokininek felfedezésén keresztül a totipotencia in vitro bizonyításához vezettek. Elérkeztünk egy újabb jelentős név, Skoog (USA) munkásságához. Skoog megállapította, hogy a dohánykallusz in vitro fejlődését a heringspermából kivont friss DNS nem befolyásolja, viszont bizonyos idő után („régi minta”) serkenti. A friss DNS aktiválható volt autoklávozással, enyhén savas közegben. Egy évvel később sikerült izolálni az osztódás serkentéséért felelős vegyületet, amelyet Skoog 6-furfurilamino-purinként határozott meg és kinetinnek nevezett el. A kés–bbi kutatások igazolták, hogy a citokininek a növények természetes növekedésszabályzó anyagai, és a zeatin volt az első citokinin, amit növényből sikerült izolálni. Az auxinok és a citokininek használata a táptalajban már bizonyos organizációt eredményezett a kalluszban. Elsőként White és Nobécourt figyelt meg véletlenszerű gyökér- és hajtásdifferenciálódást a tenyésztett kalluszban. Skoog egyik munkatársával, Miller-rel 1957-ben számolt be – a ma már klasszikussá vált – kísérletéről, a dohánykallusz hajtás- és gyökérregenerációjának hormonális szabályzásáról. Ennek lényege, hogy a kallusztenyésztéshez szükséges optimális auxin-kinetin arány csökkentésével hajtásfejlődés, növelésével pedig gyökérfejlődés indukálható. E munka alapján napjainkig számos más faj esetében is sikerült a növényregeneráció tenyésztett sejtekből, bár bebizonyosodott, hogy a fajok többségénél a morfogenezis indukciója sokkal bonyolultabb, mint az első látásra Skoog kísérletéből következett. Skoog professzornál és iskolájánál maradva feltétlenül említést kell tennünk az indiai származású Murashige kollégájával dohánykalluszon 1962-ben kidolgozott – de azóta szinte minden növényfajnál széles körben használt – táptalajáról, az MS-táptalajról. Az MS alaptáptalajon és módosított változatain érték el a kutatók azokat az eredményeket, amelyek a növényi szövettenyésztés utolsó, csaknem három évtizedét fémjelzik. Visszatérve azonban Haberlandt gondolatához, tehát az ötvenes évek második felére sikerült a kalluszsejtek totipotenciáját in vitro bizonyítani. A kutatók azonban nem rendelkeztek olyan módszerekkel, amelyek izolált egyedi (single) sejtek tenyésztését tették volna lehetővé. Az első lépéseket ebbe az irányba Hildebrandt munkatársai tették. 1954-ben sikerült kalluszból folyékony táptalajban olyan sejtszuszpenziót létrehozniuk, amely különálló sejtekből és néhány sejtes aggregátumokból állt. Az első folyamatosan fenntartható sejtszuszpenzióról NICKELL 1956-ban számolt be, objektuma a bab (Phaseolus vulgaris) volt. A szuszpenziós kultúrák módszertanát Melchers és Bergmann 1959-ben tökéletesítette. Ez azóta sem sokat változott. A szuszpenziós kultúrák tehát részben már egyedi sejtek tenyészetét jelentették. Az ötvenes évek végén és a hatvanas évek elején ezek totipotenciáját is sikerült bizonyítani. A növényregeneráció azonban a dohányon megfigyelt szervdifferenciálódás helyett egy új ontogenetikai utat követett, az embriógenezist. A berlini Reinert és a New York-i Steward munkássága nyomán (1958) vált ismertté a szomatikus embriógenezis, amely a sárgarépa sejtszuszpenzió egyedi sejtjeiből indult. Steward a Cornell Egyetemen az 1960-as évek közepén csaknem százezer embriót kapott egy lombikban, miután enzimes kezeléssel egy fejlődő sárgarépa embriót sejtjeire bontott, majd a különálló sejtekben indukálta az embriógenezist. E munka már ténylegesen megfelelt Haberlandt posztulátumának és – a zigótához hasonló embriógenezissel – bizonyította a tenyésztett egyedi sejtek totipotenciáját. Ez a sejtszintű klónozás alapja, amelyet Taylor a világszerte ismertté vált ,,Biológiai pokolgép” c. könyve kiinduló gondolataként használt 1968-ban. Ezek az eredmények azonban a szomatikus vagy testi (diploid 2n) sejtek totipotenciáját bizonyították. A haploid (n) ivarsejtek kipreparálása és tenyésztése – az állatoktól eltérően – a növényeknél rutinszerűen még nem volt megoldott. Ezért a tenyésztést magával az ivarszervvel együtt végezték. 14 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

Portokkultúrából haploid növényeket először a hatvanas évek közepén a Delhi Egyetemen az indiai MahesHwari körül csoportosuló fiatal kutatóknak sikerült regenerálniuk 1965-ben. A tesztnövény a Datura volt. Eredményüket 1968-ban sikerrel ismételte meg a francia Nitsch dohányon és a japán Ono rizsen. Azóta több száz faj pollenhaploid alakjait állították elő a világon. Végeredményben az ötvenes és hatvanas évek gyors fellendüléssel jellemezhetők a növényi szövettenyésztés történetében, aminek során a növényregeneráció feltételeit sikerült megteremteni. Erre az időszakra tehető – a gyakorlati szempontból is rendkívül jelentős technika – a merisztématenyésztésre alapozott vegetatív mikroszaporítás kidolgozása is. Ezt azonban megelőzte a különböző szervek sikeres in vitro tenyésztése (2/2. táblázat).

Lehetővé vált 1945-ben az izolált hajtások (Loo); 1947-ben a merisztémák (MoReL); 1951-ben az ováriumok (Nitsch); 1957-ben pedig a levelek (Steeves) tenyésztése, sőt 1960-ban az in vitro termékenyítés (Kanta) is. A francia Morel vírusmentesítési kutatásai során – amelyeket különböző Orchidea fajok merisztémáival 1947től folytatott – 1960-ban a Cymbidium nemzetségben az izolált hajtáscsúcson járulékos merisztéma fejlődést figyelt meg. Az in vitro csírázó orchidea magvakon fejlődő protokormokhoz hasonló járulékos merisztéma differenciálódáson alapuló mikroszaporítási eljárását 1965-ben ismertette. A módszer azóta a világon széles körben elterjedt, és ma már közel egy milliárdra tehető évente az e módszerrel előállított növények száma (2/2. táblázat). A hatvanas évek végére tehát a szövettenyésztés fontosabb tesztnövényei esetében (dohány, sárgarépa, rizs, árpa stb.) készen állt a növény–sejt–növény rendszer arra, hogy a kutatók az egyedszintű genetikai és élettani kutatásokat a sejtszintre is kiterjeszthessék. A sejtszintű genetikai kutatásokat – az állati sejtekkel ellentétben – a növényeknél a kemény poliszacharid sejtfal gátolja, illetve nehezíti. Ezért már a hatvanas években elkezdődtek a kutatások sejtfalnélküli növényi sejtek, az ún. protoplasztok előállítására. Cocking elsőként tenyésztett protoplasztokat 1960-ban, melyeket a paradicsom gyökércsúcs sejtjeiből celluláz enzim segítségével izolált. Növényt azonban csak 10 évvel később, 1971-ben sikerült regenerálniuk Nagata és Takebe japán kutatóknak. Felfedezésüket követően csak egy évet kellett várni az első szomatikus hibridre.


I. Bevezetés

Carlson az USA-ban, munkatársaival 1972-ben sikerrel fúzionáltatta a Nicotiana glauca és a N. langsdorffii protoplasztjait és a hibrid sejtekből sikerült növényt is regenerálnia. Az első szomatikus nemzetséghibridet Melchers munkatársaival 1978-ban állította elő a burgonya (Solanum tuberosum) és a paradicsom (Lycopersicon esculentum) protoplasztjainak fúziójával. Eredménye nagy feltűnést keltett és nagy publicitást kapott, főleg a nem szakmai sajtóban. A lakosságban számos téves elképzelés és túlzott elvárás alakult ki a növényi biotechnológia gyakorlati lehetőségeivel kapcsolatban. Természetesen az azóta eltelt időszak alatt számos fajból izoláltak protoplasztokat, regeneráltak növényt és állítottak elő szomatikus hibrideket. A távoli szomatikus hibridizáció igen ígéretes és gyakorlati eredményekkel is biztató módja az aszimmetrikus hibridizáció, amellyel az első nemzetséghibridet Dudits és munkatársai 1980-ban állították elő. A protoplasztfúzióra alapozott szomatikus hibridizáció szükségessé tette és felgyorsította a mutáns sejtvonalak in vitro izolálását, amelyre Melchers 1959-es eredményeivel már felhívta a figyelmet. Binding sztreptomicinrezisztens petúnia kalluszokat, Carlson pedig auxotróf dohány sejtvonalakat állított elő. A hetvenes évek elején Maliga és munkatársai regenerálták az első mutáns növényt, sztreptomicinrezisztens dohányszövetekből. Napjainkig több száz spontán és indukált mutánst szelektáltak, illetve írtak le. A protoplasztfúzió azonban lehetőséget ad arra is, hogy a sejtmagtól függetlenül csak a citoplazmát hibridizáljuk, illetve cseréljük ki a fúziós termékekben, amelyekből ún. cibrid sejteket, illetve növényeket kaphatunk. Ezek a módszertani lehetőségek és eredmények a hetvenes évek közepétől GALUN és MALIGA munkásságának eredményeként az ún. növényi extrakromoszomális genetika fellendülését, és sikeres kloroplasztisz- és mitokondrium-transzferhez, valamint -rekombinációhoz vezettek. A sejtfúzióra alapozott genetikai információátvitel tökéletesítését jelentették azok a kutatások, amelyek már az izolált organellumok átvitelére irányultak. Izolált sejtmagokat elsőként Potrykus 1973-ban Svájcban, kloroplasztiszokat Davey és munkatársai Angliában, kromoszómákat Szabados és munkatársai 1981-ben hazánkban voltak képesek protoplasztokba átvinni. A mutáns sejtek, illetve növények in vitro szelekciója már a hetvenes években felhívta a figyelmet a tenyésztett sejtek genetikai instabilitására. Először ezt a tényt a szövettenyésztés hátrányaként értékelték. A módszerek gyakorlati alkalmazása szempontjából Larkin és Scowcroft ausztrál kutatók a jelenséget a meglévő természetes variabilitást növelő új módszerként értelmezték. A szomaklonális variabilitás létezéséről és annak genetikai magyarázatáról azonban még napjainkban is sok vita van a kutatók között. A növénynemesítők azonban egyre szélesebb körben alkalmazzák a genetikai variabilitás új forrásaként.

1.7. 2.3. A növényi géntechnológia kialakulása és felhasználása (1980-tól) A nyolcvanas években gyors előrehaladás volt tapasztalható a növényi sejtfermentáció területén. Hatóanyagok kinyerésének gondolata sejttenyészetekből már a hatvanas években felmerült. Az 1970-es években azonban csak néhány sejttenyészetben észlelték a kívánt hatóanyag szintézisét. A nyolcvanas évek közepére már legalább 50 sejttenyészet rendszer vált ismertté, amelyekkel speciális anyagcseretermékeket lehetett előállítani. Az ipari méretű fermentálás elsőként a japánoknak sikerült. A Mitsui cég kétlépcsős eljárást dolgozott ki és vezetett be a Lithospermum erytrorhizon tenyésztésével, a színezékként és gyógyszerként is használható sikonin előállítására. Megkezdődött a vegetatív mikroszaporítás automatizálása, megjelentek az első fajták (rizs, búza, repce), amelyeknek nemesítésében biotechnológiai módszereket (androgenezis, szomaklón) is alkalmaztak. A biotechnológia és ezen belül a növényi biotechnológia a nemzetgazdaságok, a gazdaságfejlesztési programok és stratégiák részévé vált. A növényi biotechnológia története harmadik szakaszának meghatározó területe azonban a növényi géntechnológia. Az első kísérleti eredményekről a kutatók 1979-ben Edinburgh-ban számoltak be. Ezen a konferencián már körvonalazódtak a molekuláris növénygenetikai kutatások fő irányai. Megindult a növényi genom molekuláris szerveződésének analízise, növényi gének izolálása. A nyolcvanas évek elején már intenzíven folytak a kutatások a Ti-plazmidokra épülő transzformációs rendszerek kifejlesztésére is. Az első transzgénikus növényekről (dohány) 1983– 84-ben egyidőben több kutatócsoport is (FRALEY és mtsai, HORSCH és mtsai, DE BLOCK és mtsai) beszámolt. Ezekben az években tökéletesítették a transzformációs technikát is (bináris vektor, marker gén stb.). Az igazi áttörést az 1986-os év jelentette, amikor a Science és a Nature hasábjain szinte egyidőben számoltak be vírus- (POWEL és mtsai, BAULCOMBE és mtsai), rovar- (VAECK és mtsai) és herbicidrezisztens (SHAH és 16 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

mtsai) GM növények sikeres előállításáról. Ezt követően 1986-tól először az USA-ban, később 1988-tól Európában is elkezdődtek a GM növények első szántóföldi kísérleti kipróbálásai. Az első transzgénikus növény 1994-ben került forgalomba. A GM növényfajták termőterülete a 90-es évek végén – főleg az amerikai kontinensen – már elérte a több tízmillió hektárt. A GM növények előállítása és felhasználása gyors karriert futott be az elmúlt 15 évben. Tudományos szempontból e rövid időszak alatt rendkívül sokféle transzgénikus növényt állítottak elő és szinte követhetetlen a különböző molekuláris stratégiák, valamint megközelítések változatossága. A napjainkig előállított gazdaságilag is jelentős transzgénikus növények három nagy csoportba sorolhatók: Az első generációs transzgénikus növények esetében a cél a mezőgazdasági termelés segítése volt. A konkrét genetikai módosítások céljait a biotikus stressz (vírus, gomba, baktérium, rovar) rezisztencia, illetve az abiotikus stressz (herbicid) rezisztencia kialakítása jelentették. Napjainkig tulajdonképpen rovarrezisztens és herbicidrezisztens növények azok, melyeket a legnagyobb területen termesztenek a világon. Különösen sikeresnek tekinthetők a GM fajták gyapot, szója, repce és kukorica fajok esetében. Az 1995–96-os bevezetésüket követően termőterületük az USA-ban és Kanadában, a nulláról 30–60%-ra emelkedett és nagyságrendjük több tízmillió hektárt ért el. A zöld és környezetvédő mozgalmak ellenállása és aktivitása miatt az első generációs transzgénikus növényfajták elterjedése a világon azonban sok akadályba ütközött és ütközik. A kutatók és a multinacionális cégek figyelme ezért a zárt rendszerben – főleg ipari feldolgozás céljára – termelhető GM növények előállítása felé fordult, melyek már a második generációs transzgénikus növényeket jelentik. A második generációs transzgénikus növények előállításakor a konkrét genetikai módosítások célja a növények anyagcseréjének (fehérje, zsírsav, szénhidrát stb.) és fejlődésének (érés, hímsterilitás stb.) módosítása volt. Ezek közül az anyagcseréjükben módosított paradicsom, repce és burgonya már köztermesztésbe kerültek. Terjedésük azonban lényegesen lassúbb, mint az első generációs GM növényfajtáké volt. A harmadik generációs transzgénikus növények esetében a stratégiát speciális anyagok előállítása jelenti főleg ipari (gyógyszeripar, élelmiszeripar, műanyagipar stb.) felhasználásra. Köztermesztésbe kerülésük a 21. században várható.

1.8. 2.4. Hazai története 1.8.1. 2.4.1. A növényi biotechnológia pionírjai (1930–1980) A hazai szövettenyésztési kutatások története kis jóindulattal egyidősnek tekinthető a növényi sejt és szövettenyésztés nemzetközi történetével, hiszen HabErlandt professzor Altenburgban, a mai Mosonmagyaróvárott született 1854-ben. Az in vivo szervdifferenciálódást karalábén Orsós Ottó már 1938-ban vizsgálta és oktatta. Az első ténylegesen in vitro vizsgálatokat GIMESI NÁNDOR és munkatársai végezték a Lilium portokjainak tenyésztésével. Az ötvenes években, több kutatólaboratóriumban foglalkoztak szövettenyésztéssel. RÉDEl GYÖRGY 1955ben, búzaembriók majd ováriumok in vitro tenyésztésével, MARÓTI MIHÁLY bab gyökér- és hajtáskultúrával, FALUDI BÉLA munkatársaival a burgonya kalluszkultúráival foglalkozott. A három laboratórium közül azonban csak egy, a MARÓTI MIHÁLY által vezetett folytatta a szövettenyésztési kutatásokat az elkövetkező évtizedekben is. Így 1956–1970 között az ELTE Növényélettani Tanszékén, majd az ELTE Biológiai Állomásán végzett kutatások elévülhetetlen jelentőségre tettek szert a hazai növényi biotechnológia alapjainak megteremtésében. MARÓTI professzor vegetatív mikroszaporítási kutatásaira és oktatómunkájára alapozva létesültek az első üzemi (Óbuda Tsz, Sasad Tsz, Kertészeti Mgtsz, Szombathely és Rozmaring Tsz) mikroszaporító-laboratóriumok a hatvanas évek végén és a hetvenes évek elején az orchideák, a szegfű és a gerbera stb. szaporítására. Ő írta az első hazai szövettenyésztési jegyzetet (1972) és könyvet (1976) is. A hatvanas évek utolsó és a hetvenes évek első felében több kutatólaboratórium is alakult, amelyek közül az Országos Agrobotanikai Intézetben HESZKY LÁSZLÓ által vezetett csoport az embriótenyésztésben, az androgenezisben és a genetikai tartalékok in vitro tárolásában, az MTA Genetikai Intézetében alakult, majd az MTA Szegedi Biológiai Központjába áttelepült, MALIGA Pál által vezetett csoport a mutáns szelekcióra és a 17 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

protoplasztfúzióra alapult organellum átvitelben, az ELTE Genetikai Tanszékén KOVÁCS ERVIN által vezetett csoport a tenyésztett sejtek genetikai instabilitásában, valamint az MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézetében DUDITS DÉNES csoportja a szomatikus hibridizációban ért el nemzetközileg is figyelemreméltó eredményeket. A kertészeti növények közül a csonthéjas gyümölcsfajokkal a Kertészeti Kutatóintézetben, Budatétényben VÉRTESSY JUDIT, a bogyósgyümölcs-fajokkal a Fertődi Kutató Állomáson ZATYKÓ JÓZSEF és munkatársai, a gyógynövényfajokkal a SOTE Gyógynövény- és Farmakológiai Intézetében VERZÁRNÉ PETRI GIZELLA és SZőKE ÉVA végeztek úttörő jellegű munkát ebben az időszakban.

1.8.2. 2.4.2. A növényi sejtgenetika és szövettenyésztés módszereinek alkalmazása (1980-tól) Az alkalmazott biotechnológia kialakulásában fontos esemény volt a nyolcvanas évek elején a szövettenyésztési laboratóriumok megszervezése a két legjelentősebb, nemesítéssel foglalkozó hazai intézetünkben a Gabonatermesztési Kutató Intézetben Szegeden, (SÁGI FERENC, Mórocz Sándor, Pauk János és Purnhauser LászLó) és az MTA Mezőgazdasági Kutató Intézetében Martonvásárott (Barnabás Beáta, Kovács Géza, KARSAI ILDIKÓ és Galiba Gábor). Ma már mindkét intézetben a sikeres nemesítési munkát szolgálják ezek a laboratóriumok. A 90-es években nemzetközi színvonalú eredményeket értek el Polgár Zsolt és munkatársai (1999) a Keszthelyi Egyetem Burgonyakutatási Osztályán a S.tuberosum x S.brevidens szomatikus hibridek jellemzésében, Zatykó József és munkatársai (1997) a Fertődi Gyümölcs és Dísznövénytermesztési Kutató Állomáson az in vitro nitrogénkötő szamóca előállításában, a Nyíregyházi Mezőgazdasági Kutató Intézetben Dobránszki Judit és munkatársai (1999) a burgonya in vitro gumóindukálásában. A szőlőbiotechnológia kifejlesztése HAYDU ZSOLT és munkatársai nevéhez fűződik Kecskeméten a Szőlészeti és Borászati Kutató Intézetben. A Gödöllői MBK-ban Mitykó Judit-nak és munkatársainak (1995) a világon elsők között sikerült paprika androgenetikus haploidokat előállítani. Bánfalvi Zsófia csoportja (1996) a burgonyagumó abiotikus stresszspecifikus fehérjéinek azonosításában és izolálásában ért el nemzetközileg jegyzett eredményeket. FárI Miklós több szabadalommal és műszerrel gazdagította az in vitro technika eszköztárát, melyek közül a Propamatic és Clonmatic mikroszaporító automaták érdemelnek figyelmet. Az utóbbi berendezés Párizsban Moet-Henessy díjat is kapott. Mórocz Sándor munkatársaival (1990) jól regeneráló kukorica sejt-protoplaszt-növény rendszert dolgozott ki, mely európai szabadalmat kapott és évekig egyetlen működőképes regenerációs rendszer volt a világon. Ugyan abban az intézetben (Gabonatermesztési Kutató Kht, Szeged) Pauk János munkatársaival (1997) állította elő az első magyar DH búzafajtát (Délibáb), Purnhauser László munkatársaival (1987) pedig bizonyította az ezüst ionok meghatározó szerepét az in vitro növényregenerációban, ami szintén nemzetközi szabadalom. Az MTA Szegedi Biológiai Központban Dudits Dénes munkatársaival, Deák Máriá-val, Bögre László-val, Györgyey János-sal a lucerna szomatikus embriógenezis kísérleti rendszerét fejlesztették tovább. Ebben a laboratóriumban Fehér Attila és Preiszner Johanna a burgonya protoplasztrendszert használták Solanum tuberosum x S. brevidens szomatikus hibridek előállítására. Nemzetközi szintű kutató csoport működik Barnabás Beáta (1999) irányításával a búza és kukorica ivaros folyamatainak biotechnikai módosításában, az izolált gamétái mikromanipulációjában, a pollen krioprezervációjában és az in vitro genom-duplikációs módszer kidolgozásában Martonvásárott az MTA Mg. Kutatóintézetében. Ugyanott Galiba Gábor, Sutka József (1997) a hidegtűrésekért és jarovizációért felelős géneket azonosított és térképezett búzában. Jámborné Benczúr Erzsébet munkatársaival (1997) különböző cserepes levél és virágos, valamint évelő dísznövények, díszfák mikroszaporítási technikáját dolgozta ki és oktatja a Kertészeti Egyetemen. A zöldségnövényekből G. Juhász Anikó és mtsai állítottak elő sikeres andro- és ginogenetikus haploidokat. A GATE Genetika és Növénynemesítés tanszékén HESZKY LÁSZLÓ vezetésével a Növényi biotechnológia és Géntechnológia oktatására 1992-től nappali szakirányú képzés indult, emellett „Növénynemesítés genetikai és biotechnológiai módszerekkel” c. doktori program is szolgálja a növénybiotechnológus tudományos utánpótlás nevelését. Kutatási eredményeik közül figyelemreméltó az első magyar biotechnológiai úton előállított növényfajta (DAMA rizs 1992) állami elismerése, valamint a tenyésztett növényi sejtek sikeres krioprezervációja (JEKKEL ZS.), szomaklónok (GYULAI G.) továbbá az antiszensz transzgénikus alma, szegfű és paradicsom (KISS E.) és DH nyár (KISS J.) előállítása. 18 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

A fenti felsorolás közel sem teljes, de bizonyítja, hogy a hazai növényi biotechnológiai és géntechnológiai kutatások a század végén is nemzetközi színvonalon vannak.

1.8.3. 2.4.3. A növényi géntechnológiai kutatások kezdete és az első eredmények A rekombináns DNS-módszerek alapjainak kidolgozása mikroorganizmusokban történt, de már a hetvenes években általánossá vált a restrikciós endonukleázok, ligázok használata, génbankok készítése. Így természetes, hogy a növénybiológusok is éltek az új módszerek nyújtotta lehetőségekkel. 1979-ben került sor az első, növényi gének izolálásával foglalkozó tudományos rendezvény megszervezésére Edinburgh-ban. Ezzel egy teljesen új fejezet kezdődött a növények életjelenségeinek, funkcióinak kutatásában. Idehaza az első növényi génizolálási program elindítása Koncz Csaba nevéhez fűződik, aki frissen végzett biológusként az SZBK Genetikai Intézetében, Dudits Dénes csoportjában kezdett el dolgozni. Hosszabb vizsgálódás után a kukorica mitokondriumban található plazmid megklónozása fogalmazódott meg, mint érdekes kutatási téma, ami egyben alapot adhatott transzformációs vektor kifejlesztéséhez is. A plazmid jellemzéséről Koncz és mtsai közleménye 1981-ben jelent meg. A klónozási munkák lucerna cDNS-bank elkészítésével folytatódtak, amelyet Györgyey János szomatikus embriók felhasználásával hozott létre. Az első növényi gének, amelyeket Magyarországon izoláltak, lucerna hisztonfehérjéket kódoltak (WU és mtsai, 1988). Ehhez a genomikus génbankot Kiss Gy. Botond és mtsai készítették. A 90-es évek elején már intenzíven folytak a lucerna gének izolálására épülő kutatások. A sejtosztódás szabályozásában és a stresszválaszban szerepet játszó génekről jelentek meg az első közlemények (HIRT és mtsai, 1991; GYÖRGYEY és mtsai, 1991). Jelentős eredmény volt a lucerna genetikai térképének elkészítése, amelyhez számos molekuláris markert is felhasznált Kiss Gy. Botond és csoportja (KISS és mtsai, 1993). Nagy Ferenc amerikai tanulmányútja után az SZBK Növényélettani Intézetében folytatta a klorofill a/b kötőfehérjét (Cab1) kódoló gén promoterének részletes funkcionális vizsgálatát (FEJES és mtsai, 1990). Gödöllőn, a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban a burgonyagumó fejlődésével kapcsolatos gének sorában egy patatin cDNS klónozására került sor (BÁNFALVI és mtsai, 1994). A rekombináns DNStechnikák igen fontos szerepet kaptak a virológiai kutatásokban. Több növényi vírus szerkezetének feltárását tették lehetővé ezek a kutatások (BURGYÁN és mtsai, 1993; SALÁNKI és mtsai, 1994). A hazai géntechnológiai kutatás és fejlesztés szempontjából igen jelentős eredmény volt az első, idegen gént hordozó növény előállítása. Deák Mária és mtsai 1986-ban közölték azt a cikket, amely beszámolt transzgénikus lucerna előállításáról. Az Agrobacterium-fertőzésre alapozott génbeépítés tárgya a kanamicin-rezisztenciáért felelős gén volt. Az idegen gén működését a transzformáns növényekben különböző molekuláris módszerekkel lehetett igazolni. Már agronómiai hasznosítási célja is volt annak a transzformációnak, amelynek során a burgonya X-vírus köpenyfehérjegén bevitelére került sor (FEHÉR és mtsai, 1992). A burgonya transzformánsok virológiai jellemzését Balázs Ervin végezte. Mérései szerint a transzformánsok kimutatható vírusellenállósággal rendelkeztek. Kukorica és repce transzformánsok előállítására is sor került Szegeden a Biológiai Központban. (OMIRULLEH és mtsai, 1993; STEFANOV és mtsai, 1994). A transzformációhoz szükséges metodikai háttér több intézetben is rendelkezésre áll. Génpuskával folyik a génbeépítés rizsbe, búzába, a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban és a szegedi Gabonatermesztési Kht-ben. A Jenes Barnabás által kifejlesztett génbelövési rendszer több hazai és külföldi laboratóriumban is felhasználásra került. Így többek között az MTA Mezőgazdasági Kutatóintézetben, Martonvásáron. Agrobacterium közvetítésével létrehozott burgonya Y-vírus rezisztens dohány növények (BALÁZS ERVIN, Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ) vagy az etilén anyagcserében megváltoztatott szegfű (GATE Genetikai és Növénynemesítési Tanszék, Gödöllő) szabadföldi és üvegházi értékelése folyamatban van. A géntechnológiai módszerekre épülő növénynemesítés eredményeinek hasznosítását az 1998. évi géntechnológiai törvény elfogadása nagymértékben elősegíti. Megalakult a Géntechnológiai Bizottság Venetianer Pál elnökletével. Balázs Ervin több nemzetközi bizottság munkájában vesz részt a biztonsági kérdések vizsgálata céljából. Felhasznált és ajánlott irodalom Bánfalvi Zs., A. Molnár, G. Molnár, L. Lakatos, L. Szabó (1996): Starch synthesis-, and tuber storage protein genes are differenctly expressed in Solanum tuberosum and in Solanum brevidens. FEBS Letters 383, 159–164. BÁNFALVI, ZS., KOSTYÁL, ZS., BARTA, E. (1994): Solanum brevidens possesses a non-sucrose-inducible patatin gene. Mol. Gen. Genet., 245, 517–522. Barnabás B. (1999): Biotechnology of reproductive processes in cereals. J. Plant Biotechnol. 1, 56–60.


I. Bevezetés

BURGYÁN, J., TAVAZZA, M., DALMAY, T., LUCIOLI, A., BALÁZS, E. (1993): Consequences of gene transfer between distantly related tombusviruses. Gene, 129, 191–196. Conger, B. V. (ed.) (1986): Cloning Agricultural Plants via in Vitro Techniques. CRC Press. Inc., Boca Raton, Florida DEÁK M., KISS GY. B., KONCZ CS., DUDITS D. (1986): Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Rep., 5, 97–100. Dobránszki J, K. M. Tábori, A. Ferenczy (1999): Light and genotypes effects on in vitro tuberization of potato plantlets. Potato Res. (in press) Dudits D. (1982): Fuzionált sejtek. hibrid növények. Korunk tudománya sorozat. Akadémiai Kiadó, Budapest. Dudits D., Maliga P., Farkas G. (szerk.) (1979): Növényi sejtgenetikai és szövettenyésztési módszerek alkalmazása. Akadémiai Kiadó, Budapest. Dudits D., Heszky L. (1990): Növénybiotechnológia Mg. Kiadó, Budapest. Dudits, D., BÖGRE, L. and GYÖRGYEY, J. (1991): Molecular and cellular approaches to the analysis of plant embryo development from somatic cells in vitro J. Cell Sci. 99, 473–482. Evans, A. D., Sharp. R. W., Ammirato. P., Yamada,. Y, (eds.) (1983): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1– 4. McMillan Publ. Comp., New York. FEHÉR, A., SKRYABIN, K. G., BALÁZS, E., PREISZNER, J., SHULGA, O. A., ZAKHARYEV, V. M., DUDITS, D. (1992): Expression of PVX coat protein gene under the control of extensin-gene promoter confers virus resistance on transgenic potato plants. Plant Cell Rep., 11, 48–52. FEJES, E., PÁY, A., KANEVSKY, I., SZÉLL, M., ÁDÁM, É., KAY, S., NAGY, F. (1990): A 268 bp upstream sequence mediates the circadian clock-regulated transcription of the wheat Cab-1 gene in transgenic plants. Plant Mol. Biol., 15, 921–932. Galiba G., I. Kerepesi, J. W. Snape, J. Sutka (1997): Location of a gene regulating cold induced carbohydrate production on chromosome 5A of wheat. Theor. Appl. Genet., 95, 265–270. Gautheret, R.J. (1959): La culture des tissues végétaux techniques et réalisations. Masson, Paris. GYÖRGYEY, J., GARTNER, A., NÉMETH, K., MAGYAR, Z., HIRT, H., HEBERLE-BORS, E., DUDITS, D. (1991): Alfalfa heat shock genes are differentially expressed during somatic embryogenesis. Plant Mol. Biol., 16, 999–1007. Heszky L. (szerk.) (1982): A növényi szövettenyésztés és a gyakorlat szimpózium. Agrártudományi Közlemények 41, 203–262. Heszky L., Dudits D. (szerk.). (1986): Növénybiotechnológia. in: Napjaink biotechnológiája sorozat, OMIKK OMFB. Budapest, 1–199. Heszky L.E., Simon-Kiss I. (1992): ‟DAMA‟ the first plant variety of biotechnology origin in Hungary, registered in 1992. Hungarian Agricultural Res. 1, 30–32. HIRT, H., PÁY, A., GYÖRGYEY, J., BAKÓ, L., NÉMETH, K., BÖGRE, L., SCHWEYEN, R. J., HEBERLEBORS, E., DUDITS, D. (1991): Complementation of a yeast cell cycle mutant by an alfalfa cDNA encoding a protein kinase homologous to p34cdc2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1636–1640. Jámbor-BenCzúr E., Batiz E., Imre Cs., Nagy T., Dlusztus M., Csillag A. (1997): In vitro culture of Microsorum punctatum ‟Grandiceps‟ investigation of the alternation of generations and induction of sprouts. Horticultural Sci., 29, 5–9. KISS, G. B., CSANÁDI, G., KÁLMÁN, K., KALÓ, P., ÖKRÉSZ, L. (1993): Construction of a basic genetic map for alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Mol. Gen. Genet., 238, 129–137.


I. Bevezetés

KONCZ, CS., SÜMEGI, J., UDVARDY, A., RAMCSÁNY, M., DUDITS, D. (1981): Cloning of mtDNA fragments homologous to mithochondrial S2 plasmid-like DNA in maize. Mol. Gen. Genet., 183, 449–458. Maróti M. (1976): A növényi szövettenyésztés alapjai. Akadémiai Kiadó. Budapest. Mitykó J., A. Andrásfalvy, G. Csilléry and M. Fári (1995). Anther-culture response in different genotypes and F1 hybrids of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Breeding 114, 78–80. Mórocz S, G. Donn, J. Németh, D. Dudits (1990): An improved system to obtain fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture. Theor. Appl. Genet, 80, 721–726. OMIRULLEH, S., ÁBRAHÁM, M., GOLOVKIN, M., STEFANOV, I., KARABAEV, M., MUSTÁRDY, L., MÓROCZ, S., DUDITS, D. (1993): Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol., 21, 415–428. Pauk J, Z. Kertész (1997): Production and evaluation of doubled haploid wheat lines. J. Appl.Genet. 28, 425– 435. Polgar Zs., S. M. Wielgus, S. Horvath, J. P. Helgeson (1999): DNA analysis of potato x Solanum brevidens somatic hybrid lines. Euphytica 105, 103–107. Preininger É., J. Zatykó, P. Szűcs, P. Korányi, I. Gyurján (1997): In vitro establishment of nitrogen-fixing strawberry (Fragaria x Ananassa) via artificial symbiosis with Azomonas insignis. In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 33, 190–194. Purnhauser, L., Medgyesi P., Czakó M., Dix P. J., Mátzon L. (1987): Stimulation of shoot regenerating in Triticum aestivum and Nicotiana plumbaginifolia Viv tissue cultures using ethylene inhibitor AgNO3. Plant Cell Rep. 6, 1–4. Reinert, J., Bajaj Y. P. S. (eds.) (1977): Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer Verlag, Berlin. SALÁNKI, K., BALÁZS, E., BURGYÁN, J. (1994): Nucleotide sequence and infectious in vitro transcripts of RNA 3 of tomato aspermy virus pepper isolate. Virus Res., 33, 281–289. Sreet,.H. E. Dawey, M.R. (ed.) (1974): Tissue Culture and Plant Science. Acad. Press., London. STEFANOV, I., FEKETE, S., BÖGRE, L., PAUK, J., DUDITS, D. (1994): Differential activity of the mannopine synthase and the CaMV 35S promoters during development of transgenic rapeseed plants. Plant Science, 95. 175–186. Steward F. C., Mapes, M. O., Mears, K. (1958): Growth and organized development of cultured cells. II. Organization in cultures growth from freely suspended cells. Am. J. Bot. 45, 705–708. Thorpe, T. A. (ed.) (1981): Plant Tissue Culture. Methods and Application in Agriculture. Academic Press, Inc., New York. Vasil, I. K., Scowroft, W R., Frey K. J. (eds.) (1982): Plant Improvement and Somatic Cell Genetics. Academic Press. New York. White, P. R. (1954): The Cultivation of Animal and Plant Cells. Ronald Press, New York. WU, S. C., BÖGRE, L., VINCZE, E., KISS, GY. B., DUDITS, D. (1988): Isolation of an alfalfa histone H3 gene: structure and expression. Plant Molec. Biol., 11, 641–649.

2. 3. Növény-sejt-növény rendszer in vitro (Heszky L. és Dudits D.) A növényi biotechnológia talán legnagyobb előnyét és lehetőségét – az állati és humán kutatásokkal szemben – napjainkban a kifejlett növényi szervezet regenerálásának lehetősége jelenti tenyésztett szomatikus sejtekből. A bevezetésben (1. fejezet) már utaltunk rá, hogy a biotechnológia központjában a sejt áll, függetlenül attól, hogy a 21 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

genetikai manipulációt molekuláris vagy sejtszintű megközelítéssel végezzük. Ennek oka, hogy a sejt tekinthető a földi élet azon legkisebb egységének, amely genetikailag totipotens és amelyből egy intakt szervezet (növény, állat, ember) reprodukálható. Ennek a folyamatnak az indukciója napjainkig csak a növények és néhány alacsonyabbrendű állat esetében sikerült laboratóriumi körülmények között.

2.1. 3.1. Dedifferenciálódás és redifferenciálódás A tenyésztett növényi sejtekből való növényregenerálás az in vitro ontogenezist jelenti, amely folyamat egyik végén a tenyésztett, dedifferenciálódott szomatikus sejt, a másik végén pedig a hajtás vagy gyökér, illetve intakt növény van. E folyamat magába foglalja a tenyésztett sejtek determinációját, ami azok bizonyos fejlődési útra, differenciálódási folyamatokra való programozódását jelenti, továbbá differenciálódásukat, amelynek során az eltérő gének működése következtében különbségek alakulnak ki a sejtek között. A differenciálódás további lépéseiben a sejtek szövetekbe és szervekbe tömörülnek, mely utóbbi folyamatot – szupracelluláris jellege miatt – morfogenezisnek nevezzük. A többsejtű (esetenként trillió sejtből is álló), magasabbrendű növények minden egyes szerve adott feladatokat lát el, a feladatra specializálódott szövetei, illetve sejtjei révén. A differenciálódott sejtekben a teljes genetikai információnak csak a töredéke működik. Az, hogy egy adott pillanatban éppen melyik részét realizálja – tehát mely génjei vannak bekapcsolt vagy kikapcsolt állapotban –, attól függ, hogy a sejt milyen feladatra specializálódott. Ebből következik, hogy amikor a növényből sejttenyészetet létesítünk, osztódó, még nem differenciálódott merisztéma szöveteket tartalmazó izolátumokat célszerű a táptalajra helyezni. Ilyen sejtek nagy számban találhatók a kambiális és a merisztéma szövetekben, illetve a fejlődő proembriókban. Abban az esetben, ha már differenciálódott sejteket tartalmazó szövetet izolálunk táptalajra, először annak sejtosztódásokon keresztüli dedifferenciálódását kell indukálnunk és fenntartanunk. Erre a célra általánosan használt vegyület a 2,4-D (2,4-diklórfenoxi-ecetsav). A dedifferenciálódás sikeres indukcióját követően a táptalajra helyezett szövet sejtjeinek intenzív osztódása során kapjuk a kalluszt, amely differenciálatlan, osztódó sejtek tömege. A kalluszosodás természetes és szintetikus citokininekkel, auxinokkal indukálható. A szilárd táptalajra izolált inokulumból fejlődő elsődleges kallusz többszöri átoltással – passzálással – folyamatosan fenntartható és szaporítható. A kallusz folyékony táptalajban való rázatásával elérhető a sejtek leválása, elkülönülése, majd sejtszuszpenzió kialakulása. Növényi sejttenyészeteken általában a rázatott szuszpenziós kultúrákat értjük, de sejttenyészet létesíthető sejtvagy protoplaszt szuszpenzió táptalajra való szélesztésével, illetve a növényi sejtek fermentálásával is. A sejtek differenciálódásának indukciója szintén lehetséges in vitro. Ezt nevezzük redifferenciálódásnak, mely folyamat eredménye a növényregeneráció.

2.2. 3.2. Az in vitro morfogenezis alternatív útjai A növényregeneráció folyamán az a cél, hogy a differenciálatlan sejtekből növényt kapjunk, tehát az egyedfejlődést (ontogenezist) kívánjuk indukálni. Ez a folyamat a természetben a megtermékenyített petesejtre jellemző, a szomatikus sejtekre – amiből a sejttenyészet is áll – nem. Az in vitro növényi rendszerben az ontogenezis két fő, alternatív módját sikerült indukálni és fenntartani, a szomatikus embriógenezist és az organogenezist (3/1. ábra).


I. Bevezetés

3/1. ábra: A morfogenezis alternatív útjai a magasabbrendű növények sejt- és szövettenyészeteiben A szomatikus embriógenezis, amely mindig egyetlen sejtből indul, morfológiailag eltér a zigotikus embriógenezistől. Nincs, vagy rövidebb a szuszpenzor, nincs vagy kisebb, esetleg több a sziklevél stb. A merisztéma differenciálódás (organogenezis I.) általában egyszerre több kalluszsejt egyidejű differenciálódásának eredménye (tracheida, merisztéma). A hajtás- vagy gyökérmerisztéma determinációja az auxinok és citokininek arányának változtatásával szabályozható. A szervdifferenciálódás (organogenezis II.) általában nem közvetlenül a kalluszsejtek, hanem a tenyészetben már differenciálódott merisztéma-, szár-, illetve gyökérsejtek további morfogenezisének az eredménye. A morfogenezis alternatív útjai nagy előnyt jelentenek a növénybiotechnológusok számára az állati sejtek lehetőségeihez képest, ahol a jelen pillanatban úgyszólván csak az ivarsejt vagy csírasejt az, amely totipotensnek tekinthető. A növények esetében viszont az ivarsejteken kívül a szomatikus sejtek is manipulálhatók, és ezek a sejtek az in vitro tenyészetekben százezres, sőt milliós nagyságrendben állnak rendelkezésre.

2.3. 3.3. Növények felnevelése tenyésztett sejtekBŐl A növényi sejtek totipotenciája és annak in vitro realizálhatósága eddigi szemléletünk módosítását igényli. Ennek lényege, hogy biotechnológiai nézőpontból elméletileg egyenlőségjelet kell tennünk a sejt és a növény közé.


I. Bevezetés

A sejtszintű manipulációt követően a növény – a morfogenezis különböző útjainak indukálásával – regenerálható. A kérdés csak az, hogy a növény-sejt-növény rendszer funkcionál-e az adott faj esetében. A növényi biotechnológia történetének tárgyalásakor már utaltunk az első sikeres növényregenerációra. Több mint harminc évvel ezelőtt számolt be SKOOG a ma már klasszikussá vált kísérletéről dohánykalluszban. A legtöbb tankönyvben megtalálható szemléletes kísérletével bebizonyította a dohány hormonfüggő organogenezisét. Lényege az, hogy a 2,0 mg/l indolecetsavhoz adott 1,0 mg/l kinetin hajtásfejlődést, a 0,02 mg/l kinetin gyökérfejlődést eredményez a kalluszban. Kísérlete annyira hatásos volt, hogy az azt követő évtizedben a kutatók a növényregenerálásnak csak egyetlen útját tartották lehetségesnek, az organogenezist. Ezt az elméletet vallók még az 1965-ös wageningeni kongresszuson is elvetették egyéb alternatív utak, pl. a szomatikus embriógenezis lehetőségét. Természetesen állításuk tévesnek bizonyult, és visszamenőleg igaznak tekinthetők a New York-i STEWARD és a berlini REINERT professzor 1958–59-es eredményei, amelyek a sárgarépa in vitro embriófejlődését bizonyították. Végeredményben az ötvenes évek második felétől elvileg adott volt a növény–sejt–növény rendszer in vitro kidolgozásának lehetősége a különböző fajoknál. Az azóta eltelt időben több száz fajnál számoltak be embriógenezissel, illetve organogenezissel kiváltott sikeres növényregenerációról. Az adatok szerint organogenezissel több növényt (200 faj) regeneráltak, mint szomatikus embriógenezissel (70 faj). Az organogenezis különösen a Cruciferae és a Compositae családokra jellemző. A szomatikus embriógenezis az Umbelliferae család speciális ontogenetikai útjának tekinthető. A legjobban regeneráló családok közül a Solanaceae, a Fabaceae és a Gramineae (3/2. ábra) azok, melyekben mind a két fejlődési változat egyaránt előfordul. Miután röviden áttekintettük a növényregenerálás lényegét és eredményeit, nézzük meg közelebbről azokat az eseményeket, amelyek az ontogenezis sikeres indukcióját követően a tenyészetekben lejátszódnak.

2.4. 3.4. Organogenezis Az organogenezis vagy szervdifferenciálódás két fő csoportra osztható, az ún. járulékos merisztémák (hajtás- és gyökér tenyészőkúpok), illetve a járulékos szervek kialakulására (3/1. ábra). Az utóbbiak még további két csoportot alkothatnak, lehetnek vegetatív (gumó, hagyma) és generatív (virág) szervek. A járulékos (adventív) merisztémák differenciálódása a morfogenezis leggyakoribb útja. A táptalajra helyezett növényi rész sejtjei az indukciót követően intenzíven osztódnak, aminek során a dedifferenciálódott sejtek tömege, a kallusz alakul ki.


I. Bevezetés

3/2. ábra: A kallusz szelekció hatása a Pucinellia distans tenyészetek morfogenezisére. Organogén kallusz (A1) és gyökérfejlődés (A2); embriogén kallusz (A3) és hajtás- valamint gyökérfejlődés (A4); zöld és albinó növényregeneráció a kallusz szelekció előtt (B) és után (C és D) (Heszky L, Binh D. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöllő) E folyamatban az izolátum főleg kambiális- és parenchimasejtjei, de még az olyan specializálódott sejtek is, mint a kollenchima, vesznek részt. A differenciálatlan állapot azonban nagyon labilisnak tekinthető, ezért a tenyésztési feltételek változtatásával a kalluszban különböző differenciálódási folyamatok indukálhatók. A tenyésztés során leggyakrabban vakuolizált parenchimasejtek, illetve tracheasejtek alakulnak ki, de tracheidák, kambium- és floémsejtek is differenciálódhatnak. A kallusz- vagy sejtszuszpenzió tehát részben differenciálatlan, részben már differenciálódott sejtekből áll, amelyek morfogenetikai potenciálja különböző. Ez az alapja az organogén vagy embriogén típusú kalluszszelekciónak. A sikeres indukciót követően a differenciálatlan parenchimasejtekből (3/3A. ábra) hálózatos sejtfalvastagodással először tracheidák (szállítószövet-elemek) differenciálódnak (3/3B. ábra). A tracheidává differenciálódott kalluszsejtek vagy nyalábszerűen, vagy centrálisan csoportosulva helyezkednek el (3/3D. ábra).


I. Bevezetés

3/3. ábra: Hajtásmerisztéma differenciálódás dohány kalluszból (60–250 x). Differenciálatlan kallusz sejtek (A), tracheida (B), merisztematikus sejtek (C). Indeterminált merisztémák kialakulása a tracheida központok körül (D). Hajtáscsúcs differenciálódás során kialakul az epidermisz a szőrképletekkel (E), illetve megjelennek a levél - kezdemények (F) (Heszky L. 1975 nyomán) 26 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

Az utóbbi esetben a tracheida központok körül – a második lépésben – apró, kerek, nagymagvú merisztémasejtek differenciálódnak, amelyekből intenzív osztódás eredményeként eumerisztematikus központok (merisztemoidok) alakulnak ki a kalluszban (3/3C–D. ábra). Ez az állapot megfelel az általános vagy indeterminált primordium fejlődési stádiumnak. Tehát ebben a fejlődési fázisban még nem dőlt el, hogy végül is gyökér- vagy hajtásmerisztéma alakul-e ki. A következő lépésben – a táptalajban levő hormonoktól függően – dől el a szerv típusa, tehát a morfogenezis iránya. A hajtásdifferenciálódás esetében az általános merisztéma kerületi (tunika) és központi (korpusz) tájra különül. A tunika külső sejtrétegéből az egy sejtsoros felületi merisztéma, a protoderma differenciálódik (3/3E. ábra), amelyen később a szőrképletek is megjelennek. A kerületi merisztémákból, a tenyészőkúp csúcsa közelében levélprimordiumok differenciálódnak (3/3F. ábra). Ezt követően megindul a prokambiális, illetve szállítónyaláb-kezdemények differenciálódása. A továbbfejlődés eredménye a levélkezdeményekkel részben takart hajtástenyészőkúp (3/4A-B. ábra).


I. Bevezetés

3/4. ábra: Hajtás- és gyökérfejlődés dohány kalluszból (25–40x). Differenciálódó hajtás tenyészőkúp és levélkezdemény (A), szállítóelemek körül egyidőben differenciálódó hajtáscsúcsok (B). Kalluszban differenciálódott hajtás tenyészőkúp két levélprimordiummal (C), szállítóelemek körül egyidőben differenciálódó gyökércsúcsok (D), kalluszból fejlődő gyökér (E) (Heszky L. 1975 nyomán) 28 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

A gyökérdifferenciálódás esetében az általános merisztémából a gyökértenyészőkúpot felépítő hisztogének alakulnak ki. A 3/4D-E. ábrán a kalluszból fejlődő gyökerek szerkezetében felismerhető a kaliptra, a peribléma, a pleroma és a dermatogén. A gyökérszőrös zóna és a megnyúlási szakasz élesen nem különíthető el. A pleromában a kallusz tracheida központjához kapcsolódó szállítónyalábok fokozatos kialakulása is megfigyelhető (3/4D. ábra). Egy-egy tracheida központ körül egyszerre több merisztéma is differenciálódhat, amit gyökér esetében a 3/4D. ábrán, a hajtás esetében a 3/4B. ábrán mutatunk be. Végeredményben az organogenezis során egypólusú tenyészőkúpok alakulnak ki, melyekből vagy hajtások, vagy gyökerek fejlődnek. Az ellentétes pólus differenciálódását általában külön táptalajon kell indukálni (3/5CB. ábra).

3/5. ábra: Az organogenezis dohány (A) levélkorong tenyészetben, levélkorong eredetű kallusz- (B); gyökér(C); hajtás (D); és virágdifferenciálódás (E). (Gyulai G., Heszky L. és mtsai 1995 nyomán)

2.5. 3.5. A járulékos szervek differenciálódása Az in vitro hagyma differenciálódást lásd a Járulékos szervtenyészetek c. (5.4.3) fejezetben.

2.5.1. 3.5.1. A virág morfogenezise in vitro


I. Bevezetés

Virágok in vitro differenciálódását elsőként két francia kutatónak sikerült indukálnia. Módszerüket KIEM TRAN THANH VAN munkacsoportja fejlesztette tovább 1975-ben. Lényege, hogy virágzó dohánynövényekről a virágzati szárból felületi nyúzatot – mely az epidermisz- és a szubepidermisz-rétegen kívül két-három parenchimasejtsort is tartalmaz – izolálnak táptalajra. Az indukció extrém alacsony auxin (naftilecetsav, 10 -6 mol) és citokinin (benziladenin, 10-6 mol) koncentráció vagy oligoszacharidok hatására következik be. Első lépésben merisztéma fejlődik, ami második lépésben virágkezdeménnyé differenciálódik, majd in vitro kialakul a virág (3/5E. ábra). Az eredményekből az valószínűsíthető, hogy a generatív merisztéma differenciálódásának determinációja a sejtekben már az izolálás előtt in vivo bekövetkezett. Az in vitro feltételek megfelelő körülményeket teremtettek az ontogenezis e generatív irányához. Ezt erősítették meg az Eleusine coracana vegetatív merisztémájának in vitro eredményei is. A vegetatív merisztémán anélkül alakultak ki a virágrügy kezdemények majd virágok, hogy előtte bekövetkezett volna a dedifferenciálódás. Az indukciót a táptalajba adagolt zeatin váltotta ki, ezt követően a folyamat autonóm módon ment végbe, tehát a virágmerisztéma, virágprimordium kialakulás, majd az egyes virágrészek fejlődése. Ebből arra lehetett következtetni, hogy a vegetatív merisztéma a vegetatív fejlődés helyett képes a generatív (virág) fejlődés információját is realizálni. Végeredményben a merisztéma morfogenetikai szempontból többféle programot is tartalmaz és azok szerencsés körülmények között in vitro ki- vagy bekapcsolhatók.

2.5.2. 3.5.2. Gumóindukció in vitro Az in vitro gumófejlődés a burgonya hajtástenyészeteiben gyakran megfigyelhető folyamat. A gumónak, mint módosult szárnak a kialakulása in vitro feltételekkel befolyásolható. A kereskedelmi volumenű (Tajvan, ÚjZéland) mikrogumó előállítási technológia lényege, hogy a gumóindukciót háromhetes hajtástenyészeteken (30– 50 hajtás lombikonként) végzik sötétben. A tenyészetekre folyékony MS-táptalajt öntenek 4 napra. A táptalaj 21% szacharózt, 3,2 x 10-6 mol benziladenint és aminosavakat (3,5-szeres töménységben) tartalmaz. A kezelést követő 14. naptól – a szórt fényben, 16 óra megvilágításban és 25 °C-on inkubált tenyészetekben – hajtásonként egy mikrogumó differenciálódása indul meg a 4. vagy 5. nóduszon. A mikrogumó az adott nódusz levele hónaljrügye helyén alakul ki. Növekedésük általában 6–8 hétig tart. Végül is mindegyik hajtáson 1 db 0,3–1,0 cm átmérőjű mikrogumót lehet kapni, tehát számuk lombikonként az eredeti hajtásszámnak megfelelően 30–50 db. A módszer hatékonysága jelentősen javítható a Rita-rendszer alkalmazásával (részletesen lásd a Mikroszaporítás a XXI században c. (5.8.1) fejezetben). A Rita-val egy nóduszos rügyből 10 hét alatt 3 gumó állítható elő. A gumók 50%-a 0,5 g-nál nagyobb volt és belőlük 3–4 hajtás fejlődött. Annak ellenére, hogy a 3 mm-nél nagyobb átmérőjű mikrogumókból is normális növények fejlődnek, a legnagyobb termés a 7 mm-es mikrogumókkal érhető el. Az in vitro fejlődött gumók nem minden esetben hajtanak ki azonnal. Nyugalmi periódusuk 70–140 napig tart szobahőmérsékleten tárolva. Hazánkban a nyolcvanas években a Meriklón GT dolgozott ki és alkalmazott egy mikrogumó indukciós rendszert, amelyet a hazai vetőgumó előállítás technológiájába akartak beépíteni, sajnos sikertelenül. Jelenleg Keszthelyen (POLGÁR ZS.) és Nyíregyházán (DOBRÁNSZKY J.) foglalkoznak mikrogumó előállítással.

2.6. 3.6. Szomatikus embriógenezis A szomatikus embriógenezis létezésével kapcsolatos vitát a hatvanas években végül is maguk a felfedezők, STEWARD és REINERT professzorok döntötték el, különálló sejtből fejlődő sárgarépa embriók teljes ontogenezise folyamatának bemutatásával. A 2,4-D megvonásával indukált sárgarépa-embriógenezis első lépéseként a kalluszban nem embriók, hanem az organogenezishez hasonló merisztematikus központok alakulnak ki. A szomatikus embriógenezis ezeknek a merisztemoidoknak a felületi sejtjeiből indul. Elektronmikroszkópos vizsgálatok bizonyították, hogy a néhány sejtes proembrió már teljesen elkülönül a környező sejtektől, rajta plazmodezmákat nem lehet megfigyelni.


I. Bevezetés

3/6. ábra: Szomatikus embriogenezis szója sziklevél eredetű kalluszban (SEM méretjelzés 10 μ) A sziklevél explantumok korai kalluszosodása, ep: sziklevél epidermisz, me: mezokotil (A); I. kallusz típus: megnyúlt, nem embriogén kallusz sejtek (B, x155); II. kallusz típus: ekválisan osztódó, nem embriogén kallusz sejtek (C, x155); III. kallusz típus: inekválisan osztódó kalluszsejtek (D, x550); kétsejtes (E, x1000) ap: apikális, ba: bazális; háromsejtes (F, x1000); és négysejtes (G, x1000) proembrió; gömb- (H, x20) és szívstádiumú (I, x20) szomatikus embriók (Gyulai G. Kiss E., Heszky L. 1993. Acta Biol. Hung. 44, 189–196 nyomán) Az embrionálissá vált sejtek (3/6C és D. ábra) először transzverzálisan osztódnak, létrehozva a kétsejtes proembriót (3/6E. ábra). Az apikális sejt longitudinálisan osztódva két utódsejtet hoz létre, így a háromsejtes proembrió T alakú (3/6F. ábra). A két terminális sejt ezután transzverzális fallal kvadránst (3/6G. ábra), majd periklinális fallal oktánst alakít ki, miközben a szuszpenzorsejt is osztódik. A továbbiakban az embriókezdemény sejtjei periklinálisan osztódnak, melynek eredményeképpen centrális és periferiális merisztématáj különül el. Az in vivo embriógenezishez hasonlóan a hipofízissejt is osztódik.


I. Bevezetés

A fejlődő embrió fokozatos szerveződésének következtében előbb a soksejtes gömb alak (3/6H. ábra), majd a szív- és torpedóstádium (3/6I. ábra) figyelhető meg. Közben az embrió bipolárossá válik, és a szuszpenzor felőli oldalon a gyökércsúcs, az ellentétes oldalon pedig a sziklevelek kezdenek differenciálódni. A radikula- és a hipokotilkezdemények megnyúlása torpedóstádiumú embriókat eredményez. Ezt követően a sziklevelek fejlődése általában megáll, és megindul az embrió szöveteinek differenciálódása.

3/7. ábra: Növényregenerálás szomatikus embriógenezis indukcióval a Puccinellia distans kalluszból (SEM) Puccinellia kallusz sejtjei (A, 300x); differenciálódó egyszikű embrió, s = szkutellum, p = plumula, k = koleoptil (B, 150x); csírázó szomatikus embrió, növekvő koleoptillal (C, 150x); kalluszban differenciálódott nagyszámú szomatikus embrióból fejlődött zöld és albinó növények (D). (Binh D, Heszky L., Gyulai G., Kiss E., Csillag A. 1989 nyomán) Az egyszikű növények szomatikus embriógenezise szintén indukálható in vitro. Az embriók ontogenezisének főbb morfológiai és anatómiai fázisai e növénycsoportok esetében sem térnek el lényegesen a zigotikus folyamatoktól (3/7. ábra). A szomatikus embriógenezist követően a tenyészetekben hajtással és gyökérrel rendelkező növények fejlődnek, de előfordulhat, hogy az egyik pólus fejlődése gátolt. A gátlás a táptalaj módosításával megszüntethető, és a pólus fejlődése könnyen kiváltható.

2.7. 3.7. Az in vitro szerv- és embriódifferenciálódás molekuláris háttere Napjaink növényi biotechnológiájának eredményessége nagymértékben függ a tenyésztett sejtekből történő növényfelnevelés sikerességétől. A több évtizedes múltra visszatekintő szövettenyésztési kutatások jelentős tömegű empirikus információt halmoztak fel. Ennek ellenére a növényfelnevelés gyakorlata számtalan bizonytalansági tényezővel terhelt. Nagy kutatási kapacitásokat kíván a módszerek optimalizálása. Egy adott 32 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

gazdasági növény esetében genotípusonként igen eltérő lehet a regenerációs képesség. Megdöbbentő különbségekhez vezethet a szövettenyészetek viselkedésében a táptalaj összetevőinek megváltozása, a fény- és hőmérsékleti viszonyok módosítása, a kiindulási inokulum megválasztása, a reagáló genotípusok kiszelektálása. A kutatók igen sok energiát fordítanak a táptalajok főbb alkotóelemei közül a növekedési anyagok, a hormonok hatásának tanulmányozásásra. Természetesen hasonlóan fontos az ásványi elemek, a vitaminok illetve szénforrások szerepének tisztázása. Az értékelendő kombinációk száma végtelen, ami méginkább indokolttá teszi általános elvek lefektetését, a molekuláris folyamatok leírását. A technológiai megbízhatóság, a hatékonyság a szövettenyészeti módszerek esetében is megkívánja a próbálgatásos megközelítésektől való elmozdulást. Ezt segíthetik a növények növekedését és fejlődését szabályozó gének izolálása, a hormonok hatásait megvalósító jelátviteli mechanizmusok feltárása, a sejtek osztódását illetve differenciálódását biztosító szabályozó elemek felfedezése. Ezekkel a kérdésekkel részletesen foglalkozik egy, a közelmúltban megjelent tanulmány (DUDITS, 1999), ezért a jelen analízis csak néhány fontosabb szempontot emel ki.

3/8. ábra A szója knotted (KN1) homeotikus gén cDNS-ének kifejeztetése fodros levelek kialakulásához vezetett dohány transzformánsokban A jobb oldali levél az SR1 kontroll növényről származik. (Török Katalin kísérlete, SZBK, Szeged) A helyhez kötött életmódból fakadóan a növények esetében az egyedfejlődési program nagyfokú rugalmasságára van szükség, ami részét képezheti egy általános alkalmazkodóképességnek, a mechanikai sérülések vagy a szélsőséges környezeti hatások okozta károsodások mérséklésének. A növekedés és szervképzés flexibilitásának letéteményesei az osztódó sejtekben gazdag merisztématikus szövetek. A gyökérés hajtásmerisztéma-kezdemények kialakulása már az embriogenezis korai fázisában bekövetkezik, és ezek a merisztémaszövetek biztosítják a növényi test kialakulását, amely folyamat a növény egész életciklusát végigkíséri (lásd RAGHAVAN, 1997). Lényegében merisztémák szerveződésével veszi kezdetét a lombikban történő növényregeneráció is. Merisztématikus struktúrák közvetlenül tenyészetbe vihetők, illetve differenciált szövetek tenyésztése esetén a sejtek osztódásának aktiválásával kell megteremteni a merisztémák kialakulásának feltételeit. Az in vitro lejátszódó szervdifferenciálódás, az organogenezis folyamatának közelebbi megismerését segítheti a gyökér- illetve hajtásmerisztémák működésében szerepet játszó gének felfedezése. Ezek közül kiemelt figyelmet érdemelnek az ún. homeotikus gének, amelyek DNS-kötési képességgel rendelkező ún. homeodomain régiót tartalmazó fehérjéket kódolnak. A hajtásmerisztéma morfogenezisével kapcsolatos homeotikus gének családjának jellegzetes képviselői a KNOTTED (KN1), SHOOT MERISTEMLESS (STM) vagy a MERISTEM L1 LAYER (ATML1) gének, melyek funkciójára mutánsok analíziséből lehet következtetni. A kukorica, a rizs vagy a szója KN1 gének kifejlesztése erős, konstitutív promoterrel dohányilletve Arabidopsis növényekben növekedésgátláshoz, az apikális dominancia mérsékléséhez és a levelek 33 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

fodrosodásához vezetett (3/8. ábra). Több esetben hajtáskezdemények fejlődése figyelhető meg a transzformánsok levelein. Fontos észrevétel, hogy ezekben a transzformáns növényekben megemelkedett citokinin-szintet lehetett kimutatni. Ennek tudható be, hogy csökkenthető a táptalajba adott kinetin szintje, ami szükséges a hajtások differenciálódásához (3/9. ábra). A növényi hormonok és a hajtásregeneráció közötti kapcsolatot a szövettenyésztési eredmények már sokoldalúan igazolták. A KN1 génnel kapcsolatos eredmények azt mutatják, hogy a hajtásképződés folyamatát a fejlődési programot meghatározó gének is meghatározzák, talán éppen a hormonháztartás befolyásolása révén.

3/9. ábra A szója knotted (KN1) gént hordozó dohány transzformánsokban megváltozott a hormonok mennyisége. Így már a táptalaj hoz kis mennyiségben (0,2 mg/l) adott kinetin több hajtáskezdemény differenciálódását indukálta (Miskolczi Pál kísérlete, SZBK, Szeged) A gyökérmerisztéma kialakulását szabályozó gének működésére szintén mutánsok vizsgálatával következtethetünk. Az Arabidopsis ROOT MERISTEMLESS (RML1,2) gének mutációját hordozó növények esetében az embriogén gyökérfejlődés normális, de a későbbi gyökérnövekedés jelentősen gátolt a sejtek osztódásának hiánya miatt. A tenyésztett szövetekben lejátszódó gyökérfejlődés sok vonatkozásban hasonló tényezők befolyása alatt áll, mint amelyek az oldalgyökerek kialakulását idézik elő. Mindkét esetben az auxinok, mint az indolecetsav (IES), kulcsszerepet játszanak. Az ABERRANT LATERAL ROOT FORMATON (ALF) mutánsok segíthetnek az IES szerepének megértésében. Így az ALF1-1 gén hibája folytán túlzott mértékű oldalgyökér-kialakulás figyelhető meg, amely IEStúltermelésre vagy emelt auxinérzékenységre vezethető visz-sza. Az ALF4-1 gén terméke szükséges lehet ahhoz, hogy a periciklus sejtjei érzékeljék az auxinhatást vagy képesek legyenek válaszreakcióra. Ezek a mutánsok érdekes kísérleti anyagot adhatnak a szövettenyészetekben lejátszódó gyökér-differenciálódás tanulmányozásához is. A növények tenyésztett testi sejtjeiben lejátszódó embriógenezis az egyik legizgalmasabb fejlődésbiológiai jelenség, amely alapvetően megkülönbözteti a növényeket a többi magasabb rendű eukarióta szervezettől. Gondoljunk csak arra, hogy milyen bonyolult beavatkozásokra volt szükség a totipotencia kialakításához a juh differenciált sejtjeiben (WILMUT és mtsai, 1997). A növények esetében a sejtek átprogramozhatósága, az egyedfejlődési program újraindíthatósága széleskörűen megfigyelt, általános képesség. Az előző fejezetben a sárgarépa-embrió kialakulásához szükséges szövettenyésztési lépéseket láthattuk. Szomatikus embriók természetesen a gabonafélék szövettenyészeteiben is kialakulhatnak. Éretlen embriók, a fiatal levelek alsó régiói vagy a kalászorsó kitűnő kiindulási anyagnak bizonyultak embriogén tenyészetek létrehozásához. Kérdés az, hogy a szövettenyésztési tapasztalatokat értékelve tudunk-e közös, kulcsfontosságú faktorokat megjelölni, amelyek az embriogén-program elindításához szükségesek. A kísérletek végeláthatatlan sora demonstrálta, hogy a szintetikus auxin, a 2,4-diklórfenoxiecetsav (2,4-D) nélkülözhetetlen 34 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

I. Bevezetés

az embriogén tenyészetek létrehozásánál. A 2,4-D azon túl, hogy a folyamat elindításában játszik szerepet, fajtól, tenyészettől függően gátolhatja az embriók végső kifejlődését. Ezért szükséges a 2,4-D megvonása vagy alacsonyabb koncentráció használata. Az auxinok, így a 2,4-D, a sejtekben bonyolult jelátviteli hálózatot aktiválnak, amelyek kezdve a membránok polarizáltságának megváltoztatásával, receptorok, GTP-kötő fehérjék közreműködésével az inozitol-1,4-biszfoszfát szintjének emelkedését okozzák, ami Ca2+-t szabadít fel az endoplazmatikus retikulumból. Lényeges a pH-változás szerepe az embriogén aktivációban. A Ca2+ jel továbbításában Ca2+-kötő fehérjék, enzimek (kalmodulin, Ca2+ függő kinázok, foszfatázok) vesznek részt. A jelátviteli út végén a transzkripciós változások – gének kikapcsolása, új gének aktiválása – következnek be. Igen jelentős a c itoszkeleton átstrukturálódása. A mikrotubulus-hálózat rendezettsége fellazul, majd bekövetkezik a hormonkezelt sejtek osztódása. A hormonaktivált sejtosztódás alapvető feltétel ahhoz, hogy a tenyésztett sejtekben az embriogén program elinduljon. További nagyon lényeges követelmény, hogy az osztódás aszimmetrikusan játszódjon le és polaritás alakuljon ki. Az embriogén sejtek kisebbek, sűrű citoplazmával rendelkeznek, és az egymás utáni osztódások kompakt, térfogatában behatárolt, többsejtű, gömb formájú embriogén struktúrák kialakulásához vezetnek. Ezzel szemben az embriogén indukció hiányában a nagyobb térfogatú sejtekből szimmetrikus osztódásokon keresztül organizálatlan kalluszszövetek alakulnak ki. Ivaros megtermékenyítéskor a zigóta első osztódása szintén aszimmetrikus. Az apikális sejt biztosítja az embrió, míg a bazális sejt a szuszpenzor kialakulását (lásd 3/6. E ábra). Feltételezhető, hogy a morfológiai hasonlóságon túl az embrió-differenciálódást biztosító jelátviteli mechanizmusok, a fejlődési programot megvalósító gének hasonló szerepet töltenek be a két sejtrendszerben. A 2,4-D-vel kiváltott embriogén sejtállapot egyrészt visszavezethető az auxinhatásra, a sejten belüli auxinszint megemelkedésére, a pH-változásra. Másrészt kísérletesen igazolható a stressztényezők fontos hozzájárulása az embriogenezis elindításához. Sebzés, hő- vagy ozmotikus sokk, fémion-toxicitás egyaránt elősegítheti az embriók kialakulását. Ezzel összefüggésben megfigyelhető számos stresszgén aktiválódása az embriogén indukció során. A hősokkgének mellett a ferritin vagy méregtelenítő enzimek génjei szintén működésbe lépnek. Természetesen Northern hibridizációval kimutatható az auxin-aktivált gének mRNS-szintjének megemelkedése. Ugyanígy működésbe lépnek a sejtosztódást szabályozó ún. sejtciklus gének is. Megjelennek az embriogén sejtekre jellemző extracelluláris fehérjék. A szív és torpedó stádiumú embriókon megfigyelhető a merisztémák kialakulása. Az embriógenezis egyes fázisai igen hasonlóak a zigótikus és szomatikus embriók esetében. A szomatikus embriók alapját képezhetik hatékony szaporítási technológiák kidolgozásának. A feltárt molekuláris folyamatok ismeretében új lehetőségek nyílhatnak olyan megtermékenyítés nélküli magképződés biztosításához, amelyek az apomixis jelenségén alapulnak. Mind az apomixis, mind a szomatikus embriógenezis felhasználható a hibridhatás rögzítésében és új szaporítóanyag-előállító módszerek kifejlesztésében.

2.8. 3.8. A növényregenerálás eredményei A különböző biotechnológiai eljárások objektumai a szomatikus sejteken kívül haploid ivarsejtek, illetve protoplasztok is lehetnek. A haploid morfogenezis különböző útjaival, az androgenezissel (4.2.1; 4.2.2 fejezetek), a ginogenezissel (4.3 fejezet) stb. az „Ivaros szaporodás biotechnológiája” c. 4. fejezetben, a protoplasztnövény rendszerrel pedig a „Szomatikus hibridizáció protoplasztfúzióval” c. 6.3. fejezetben foglalkozunk. Ebben a pontban a legfontosabb kultúrnövényekre vonatkozóan összefoglalva mutatjuk be a növényregenerálás helyzetét szomatikus sejtből, ivarsejtből és protoplasztból (3/1. táblázat).


I. Bevezetés

A 3/1. táblázat alapján nyilvánvaló, hogy napjainkban még nem minden kultúrnövény esetében állnak készen a rendszerek a gyakorlati alkalmazásra. A szomatikus sejt-növény rendszer készen áll a búza, árpa, rizs, repce, lucerna, dohány, burgonya esetében. A haploid rendszer jól alkalmazható a búzánál, árpánál, rizsnél, repcénél, lucernánál, dohánynál, nyárnál, paprikánál stb. A legszűkebb keresztmetszetet a protoplaszt-növény rendszer jelenti, melynek gyakorlati felhasználása emiatt visszavonulóban van a 90-es években. A morfogenezis sikeres indukciójában jelenleg nagyfokú bizonytalanság van a növényi biotechnológia körében. Ennek lényege, hogy anatómiai szempontból ugyan pontosan ismerjük azokat a folyamatokat, amelyeket in vitro indukálnunk kell akkor, amikor a tenyészetekből növényeket akarunk felnevelni, de még jórészt ismeretlenek és csak részben tisztázottak ezeknek a molekuláris előzményei. Amit nem tudunk, nem több, mint az, hogy nem ismerjük a morfogenezis indukciójában, determinációjában, illetve folyamatában részt vevő, azt szabályozó géneket és azokat az endogén feltételeket, amelyeket a sejtben biztosítani kell ezeknek a géneknek a bekapcsolásához, működéséhez. Ha tudnánk, hogy molekuláris szinten milyen feltételek szükségesek ahhoz, hogy a sejteket a totipotencia realizálására állítsuk át, akkor a növényregenerálás ténylegesen tervezhető és könnyen reprodukálható mérnöki módszer lenne. Amíg nem leszünk ezeknek az ismereteknek a birtokában, addig a sikeres regenerálás jórészt a szerencse és a közvetett tapasztalatok bizonytalan és empirikus megközelítésének függvénye marad. Felhasznált és ajánlott irodalom Ammirato. P. V. (1983): Embryogenesis. In: Evans, D. A., Sharp, W. R., Ammirato, P. V. Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1, 82–123. McMillan Publ. Comp., New York–London. Binh, D. Heszky, L. E., Gyulai, G., Kiss, e., Csillag, A. (1989): Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 18, 195–200. Binh D. , Heszky L. E. (1990): Restoriation of regeneration potential of long-term cell culture in rice (Oryza staiva L.) by salt pretreatment. J.Plant Physiol. 136, 336–340. Croes, A. F. Derksen, R., Kemp, A., van Wezel, H. Barendse, G. W M. (1986): Influence of the developing fruit on aging of the floral stalk tissue with respect to flower bud regeneration in vitro. J. Plant Physiol., 125, 61–68. DUDITS, D. (1999): A sejtosztódás, differenciálódás és az egyedfejlődési program szabályozásának molekuláris alapjai. In: Balázs, E. és Dudits, D. szerk. Növény Molekuláris Biológia: Szemelvények, Akadémiai Kiadó, Budapest.


I. Bevezetés

Gyulai G., Janovszky J., Kiss E., Lelik L., Csillag A., Heszky L. E. (1992): Callus initiation and plant regenration from inflorescence primordia of intergeneric hybrid Agropyron repens L. Beauv x Bromus inermis Leyss. Cv. Plant Cell Reports 11, 266–269. Gyulai G., Kiss J., Jekkel Zs., Kiss E., Heszky L.E. (1995): A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. J.Plant Physiol., 145, 379–382. Halperin, W. (1969): Morphogenesis in cell cultures. Ann. Rev. Plant Physiol., 20, 395–418. Haydu, Z., Vasil, I. K. (1981): Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf tissues and anthers of Pennisetum purpureum Schum. Theor. Appl. Genet., 59, 269–273. Heszky, L. E. (1973): Investigation at the early stage of embryogenesis into the development of the adventive embryo organized from a cell of the callus tissue in Daucus carota L. Acta Botanica, 22, 303–305. Heszky, L. E. (1975) : Possible ways of morphogenesis in higher plants tissue cultures. Acta Agronomica, 24, 123–141. Heszky, L. E., Do, Q. B., Kiss, E., Gyulai, G. (1989): Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg. Plant Cell Rep., 8: 174–177. Kiss E., Heszky L.E., Gyulai G., Horváth Zs., Csillag A. (1991): Neomorph and leaf differentiation as alternative morphogenetic pathways in soybean tissue culture. Acta Biologica 42, 313–321. Kiss J., Heszky L.E., Kiss E., G. Gyulai (1992): High efficiency adventive embryogenesis on somatic embryos of anther, filament and immature proembryo origin in horse chestnut (Aesculus hippocastanum L.) tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 30, 59–64. RAGHAVAN, V. (1997): Molecular Embryology of Flowering Plants. Cambridge University Press. Reinert, J. (1959): Über die Kontrolle für Morphogenese und Induktion von Adventivembryonen in Gewebekulturen aus Karotten. Planta, 53, 318–333. Skoog, F., Miller, C. O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exper. Biol., 11, 118–131. Thomas, E., Davey, M. R. (1975): From Single Cells to Plants. Wykeham Publ., London. Tran Thanh Van, K. (1973): In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues. Nature, London, 246, 44–45. WILMUT, I., SCHINIEKE, A. A., McWHIR, J., KIND, A. J., CAMPBELL, K. H. S. (1997): Viable offspring derived from fetal and mammalian cells. Nature, 385, 810–813.


2. fejezet - II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 1. 4. Az ivaros szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) A növények szexuális reprodukciójának biotechnológiája, mint összefoglaló fogalom tulajdonképpen azokat a technikákat jelenti, melyekkel a növények reproduktív folyamatait in vitro steril körülmények között befolyásolni, módosítani tudjuk. Ezért ebben a fejezetben a növények ivaros folyamataiban résztvevő haploid és diploid (gametofitikus és sporofitikus) sejtek, szövetek és szervek, valamint a kettős megtermékenyítés eredményeképpen létrejövő zigotikus embriók laboratóriumi tenyésztésének módszereit és eredményeit foglaljuk össze. Ezek a technikák voltak azok, melyekkel a növényi biotechnológia a XX. század elején elindult és melyek az első sikereket jelentették az 1910–50-es években. A 60-as, 70-es években a pollenhaploid növények felnevelésével – átmenetileg – a figyelem újra e módszerekre terelődött. Napjainkban az izolált gaméták (OP) tenyésztése és mesterséges fúziója az, ami új lendületet adott a növényi biotechnológia e klasszikus területe fejlődésének.

1.1. 4.1. Embriókultúra Az embriótenyésztés az embriógenezis különböző stádiumában lévő zigotikus embrió kipreparálását, ontogenezisének fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között. Célja, hogy az embriók növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges feltételek mesterséges biztosításával kifejlett ,,csírázóképes” embriókat kapjunk, mely feltétel megvalósulása esetén számos gyakorlati cél elérése is lehetővé válhat.

1.1.1. 4.1.1. Az embriógenezis jellegzetességei in vivo Mielőtt részletesen rátérnénk a növényembriók tenyésztésére, röviden tekintsük át a zárvatermők embriógenezisének és magfejlődésének főbb jellegzetességeit. Folytassuk ott, hogy a kettős megtermékenyítést követően mi is történik az ováriumban az érett mag kialakulásáig. Az embriógenezis a zárvatermőkben különböző típusú lehet. A megtermékenyült petesejt a falregenerációt követően inekválisan osztódik. A nagyobbik, bazális sejtből az egysejtsoros csírafüggesztő (szuszpenzor) alakul ki, a kisebb apikális sejtből pedig az embrió differenciálódik. Míg az embriógenezis első lépései közel azonosak a különböző taxonokhoz tartozó növényeknél, addig a későbbi lépésekben jelentős különbségek mutatkoznak. Ezzel azonban részletesen nem foglalkozunk.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/1. ábra: Kétszikű növények in vivo embriógenezisének és magfejlődésének vázlata. A virágban (1) egy magház (ovárium) (o) fejlődik, amelynek belsejében gyakran több magkezdemény (mk) helyezkedik el; a megtermékenyítést követően a magkezdemények embriózsákjaiban a zigóta első osztódásából az embrióiniciális (ei) és a szuszpenzoriniciális (szi) sejt keletkezik; az utóbbiból alakul ki a szuszpenzor (sz), illetve a bazális sejt (szb); az embrióiniciális sejt további osztódása során az embriófejlődés kezdeti szakaszai (ek); a gömbstádium (6–7–8), a szívstádium (9) és a torpedóstádium (10) figyelhetők meg; ez utóbbi két stádiumban az embrió polárissá válik a gyökér (gy) és a hajtás (h)merisztématájak szétválásával; az érett magban (3) az embriót tápláló szövetek, az endo-, illetve a perispermium (ps) veszik körül A kétszikű embriók fejlődése – a néhány sejtes proembrió állapotot követően – jellegzetes morfológiai stádiumokkal (gömb, szív, torpedó stb.) jellemezhető (4/1. ábra). Ezt a szövetdifferenciálódás (protoderma, prokambium, alapmerisztéma stb.) kíséri, illetve követi, mely folyamat végén az embrió eléri csírázóképességét. Az embrió polaritását az egyik póluson a gyökércsúcs (gyökérmerisztéma), a másikon a hajtáscsúcs (hajtásmerisztéma) és a két sziklevél adja. Az egyszikű embrióé több tekintetben eltér az előbbi fejlődéstől. Egy sziklevél (scutellum) alakul ki, amelyen fekszik az embrió (4/2. ábra). A mezokotiltól oldalirányban helyezkedik el a koleoptil által fedett rügyecske (plumula), másik irányban pedig a koleorrhiza által fedett gyököcske (radicula).

4/2. ábra: Az egyszikű növények in vivoembriógenezisének és magfejlődésének vázlata A virágban (1) egy magház (2) és azon belül egy magkezdemény (mk) helyezkedik el; a megtermékenyülést követően a zigóta osztódásával keletkező egyik sejtből (szi) a csírafüggesztő (sz) a másikból (ei) az embrió (e) alakul ki; ennek további szerveződésével alakul ki a csíra teste (9); csak egy sziklevél (s) alakul ki, amelyen fekszik az embrió; az embrió a nem végálló rügyecskéből (plumula) (h) csíratengelyből (mesocotyl) (m) és a gyököcskéből (radicula) (gy) áll. Ezeket zárt hüvely, a koleoptil és a koleorrhiza takarja (10). A kifejlett embrió (11) a szemtermés (3–4) alapi pólusán helyezkedik el és az endospermiummal (e) való kapcsolatát a sziklevél (scutellum) (s) biztosítja A különböző fajok embriógenezisének időtartama eltérő (15–150 nap). Az érett magban az embriók helyzete, mérete, fejlettségi állapota is jelentősen eltérhet, melyeknek ismerete a sikeres izolálás szempontjából különösen fontos (4/3. ábra). Az embriók egy része a teljes anatómiai és élettani fejlettség elérését követően csíraképes, egy másik részének további érésre, nyugalmi periódusra, száradásra stb. van szüksége a csírázóképesség megszerzéséhez.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA

4/3. ábra: A kifejlett embrió (fekete szín) mérete, fejlettsége és elhelyezkedése különböző fajok érett magvaiban E vonatkozásban meg kell különböztetnünk a fiziológiás nyugalmi állapotot a valódi (dormancia, dormancy) nyugalomtól. Az embrió fiziológiás nyugalmi fázisa (quiescence) tulajdonképpen a vízvesztés eredménye (a mag beérik), mely állapot azonnal megszűnik, amikor a mag (embrió) újra vizet vesz fel. A valódi nyugalmi állapot során az embrió csírázásának gátlása a magban felhalmozódó növekedésgátló anyagok következménye. Ez a nyugalom – fajtól függően – évekig is tarthat.

1.1.2. 4.1.2. Története Többek szerint valószínűleg BLOCINEVSKl 1876-ban volt az első, aki – SACHS 1862-es sikertelen próbálkozása után – sikerrel nevelt fel – még nem aszeptikus körülmények között – zab- és rozsembriókat. Az első, mai értelemben vett modern embriókultúrát HANNIG alkalmazta 1904-ben. A végső méretük (8 mm) 1/4ére nőtt Raphanus és Cochlearia embriókat sikerrel tenyésztett cukorral kiegészített ásványi tápközegben, steril körülmények között. Húsz évvel később DIETRICH 1924-ben különböző fűfajok fejlődő embrióit sikerrel nevelte agaros és cukros Knop-oldaton. Ő észlelte először a ,,künstliche Frühgeburt” jelenségét, vagyis azt, hogy az in vitro nevelt embrió – még nem teljesen kifejlett (nem érett) állapotban lévő – csíranyugalom nélkül csírázik. Néhány évvel később LAIBACH 1925-ben és 1929-ben már hibrid embriók sikeres tenyésztéséről számolt be. A Linum perenne x L. austriacum keresztezésekből alig 2 hetes hibrid embriókat sikerrel nevelt 10– 15%-os cukortartalmú tápoldattal átitatott vattán. Az ezt követő 30 évben (1930–1960) az embriótenyésztés a növényi szövettenyésztés eredményes kutatási területévé vált. Ez idő alatt számos táptalajt, komplex növényi kivonatot, metodikát próbáltak ki, aminek során tisztázódtak az embriótenyésztés fizikai, kémiai, élettani feltételei. Ennek az időszaknak legismertebb kutatói, a teljesség igénye nélkül, WHITE, TUKEY, RANDOLPH, RAppApORT, BLAKESLEE, VAN OvERBEEK, LA RUE, NORSTOG, MAHESHWARI, JOHRI, RAGHAVAN voltak.

1.1.3. 4.1.3. Módszere a) Izolálás Az embriótenyésztés technikája fő vonalaiban megegyezik a virágszervek kultúráival. Az izoláláskori sterilitás bizonyos értelemben könnyebben megoldható, hiszen az embriók in vivo az ováriumon és a magkezdeményen belül is tulajdonképpen steril körülmények között fejlődnek. Az izolálandó proembrió mérete a fajtól és a megtermékenyítéstől eltelt napok számától függ (3–30 nap). Az embriógenezis korai fázisában (gömb, korai szív) levő proembriókat általában az ovulumnedvből, illetve a fejlődő folyékony endospermiumból kell kiemelnünk. E műveletet csak mikroszkóp alatt végezhetjük, hiszen méretük ekkor még 50–500 µm. Túlélésük általában 0–40%. E fejlődési állapotban lehetőség szerint a szuszpenzorral (egysejtsoros csírafüggesztő) együtt kell táptalajra helyezni a proembriókat, mert bebizonyosodott, hogy a tápanyagfelvételben a szuszpenzornak in vitro is szerepe van. A fejlődés későbbi fázisában (torpedó, szikleveles, sétabot stb.) a fejlődő sziklevél veszi át ezt a szerepet. Méretük akkor már elérheti, sőt fajtól függően meg is haladhatja az 1 mm-t. Kipreparálásuk a magkezdeményből már könnyebb. Az embriók kompaktabbak, nem áttetszők, könnyen megkülönböztethetők és


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA elválaszthatók a fejlődő endospermiumtól, illetve a magkezdemény többi szövetétől (4/4. ábra). Túlélésük már eléri a 80–100%-ot.

4/4. ábra: A vöröshere (Hungaropoly 2n=4x) embriójának in vivo fejlődése a gömb stádiumtól a sétabot fokozatig a megporzást követő első 20 napon. A fejlődő embriók a következő főbb stádiumba sorolhatók; gömb (1–2), előszív (3–4), szív (5–6), korai torpedó (7–9), torpedó (10–12), késői torpedó (13–16), sétabot (17–20); az embrió 20 nap alatt 0,1 mm-ről 2,8-mm-re növekedett (H. Enyingi K., Heszky L.E. 1973). b) Táptalaj Az embriók mesterséges felnevelésének, pontosabban az embriógenezis feltételeinek in vitro biztosítása az embriófejlődés élettani és biokémiai hátterének alaposabb ismeretét igényli. Az embriókultúra szempontjából az embriógenezis két fő szakaszra osztható, az első heterotróf és a második autotróf szakaszra. E kétféle fejlettségű embrióban az anyagcsere egyes folyamatai más utakat követnek. Szervetlen sók. A heterotróf stádiumú proembriók korai abortálását in vitro legegyszerűbben a KCl és a CaCl 2 koncentrációjának növelésével lehet elkerülni. A fiatal embriók túlélését javítja továbbá az ammóniumsók és a Fe-EDTA mennyiségének csökkentése, a mikroelemek koncentrációjának növelése. Szénhidrátok. A legáltalánosabban használt szénhidrát az embriókultúrában is a szacharóz. A szénhidrátoknak jelen esetben azonban egy speciális szerepük is van, a táptalaj megfelelő ozmolaritásának biztosítása a tenyésztett embrió számára. Az éretlen magkezdemény nedve és a fejlődő endospermium ozmotikus értéke az embriógenezis során általában csökken. A kezdeti érték gyapotnál 980 kPa, a Capsella-nál 823 kPa, a babnál 69 kPa, in vivo. A kísérletek bebizonyították, hogy in vitro ezeknél az értékeknél nagyobb ozmotikus nyomást kell a táptalajban biztosítani. Ez általában 8–15%-os kezdeti szacharóz koncentrációt jelent a korai szív stádiumú embriónál, amelyet fokozatosan csökkenteni kell 4%-ra (korai torpedó stádium), majd 1%-ra (torpedó stádium), 0,1%-ra az érés során, és végül 0% ra az érett embrió állapotban. E módszer tökéletesített változatában a szacharóz koncentráció végig 2% marad, és a megfelelő ozmózisos nyomást a sejt anyagcseréje szempontjából inaktív szénhidráttal, a mannit koncentrációjának változtatásával érhetjük el. Nitrogén. A napraforgó tenyészetekben a nagy ozmolaritás mellett biztosítani kell a megfelelően alacsony nitrogén koncentrációt (C/N=10,0 körüli érték) más fajok esetében, pl. szója, árpa viszont növelni kell a nitrogén koncentrációt úgy, hogy ammóniumvegyülettel részben helyettesítjük a cukrokat a megfelelő ozmotikus érték elérésében. Az embriótenyészetekben leggyakrabban az NH 4NO3 és a KNO3 szolgál szervetlen nitrogénforrásként. A különböző aminosavak és azok amidjai közül a glutamin stimulálja legjobban az embriók fejlődését. Néhány Cruciferae fajnál az aszparagin is hasonlóan serkentő hatású volt. Az aminosavak komplex keverékét tartalmazó


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA kazeinhidrolizátum (CH) szintén általánosan használt. Önmagában egy aminosavval sem tudták elérni a CH kedvező hatását, de 20 aminosav keverékével már igen, ami az aminosavak szinergista hatására is utal. A CH mint ozmotikum képes helyettesíteni a szénhidrátok hasonló hatását (nagy ozmózisos érték), azonban a fejlődésüket befejezett embriók csírázását gátolja. Természetes növényi kivonatok. Az embriótenyésztés módszerében fordulópontot jelentett VAN OVERBEEK munkássága, aki a 40-es évek elején elsőként használta fel a kókuszdiótejet (CM), torpedóstádiumú Datura embriótenyészetekben. Ezt követően általánosan használt kiegészítés lett. Hatását valószínűleg a benne található cukrok, aminosavak, növekedésserkentő és más anyagok okozzák, amelyek sok esetben a táptalajból egyébként hiányozó vegyületeket jelentenek az embriónak. Ezeket az anyagokat ,,embriófaktor”-nak nevezték el, és hőstabilnak bizonyultak. Természetesen számos más növekedésserkentőt is kipróbáltak, mint pl. fejlődő kukoricaszem, banán- és datolyakivonatok, paradicsomlé, rozsendospermium, valamint endospermium tenyészet stb. Az endospermium tenyészetek, mint táplálóközegek az elmúlt évtizedben különböző hibrid embriók (Trifolium, Triticum, Lotus stb.) túlélését tették lehetővé. Növekedésszabályozó anyagok. A növekedésszabályozó anyagok alkalmazása nem feltétele a sikeres embriótenyésztésnek. Talán ezzel is magyarázhatók az embriókultúra sikerei századunk elején. Ezeknek az anyagoknak a szerepe különösen az embriók csírázásában ismert. Az abszcizinsavról (ABA) bebizonyosodott, hogy használatával meggátolható az in vitro nevelt embriók korai csírázása. Ha a táptalajban ABA is van, nincs szükség a fiatal embriók tenyésztése közben nagy ozmózisértékre. Ezzel szemben a gibberellinek serkentik az embriók korai in vitro csírázását. Az auxinok, a citokininek nem nélkülözhetetlenek, bár kis koncentrációban az embriógenezist serkentették. A kifejlett embriók tenyésztése során általában már nincs szükség hormonokra. c) Tenyésztési feltételek A táptalajok szilárdítására általában 0,5–1,5% agart használnak. A kisebb koncentráció, amely gélszerűen képes az embriót körülvenni, kedvezőbbnek bizonyult. A folyékony táptalajok kis oxigénkoncentrációja serkentette a sziklevelek fejlődését és meggátolta a korai csírázást, csökkentette a hipokotil megnyúlását, végül is elősegítette a normális embriófejlődést. Ez a hatás feltehetőleg az in vivo körülményekhez leginkább hasonló feltételeknek az eredménye. Az optimális pH 4,5–5,5, a tenyésztési hőmérséklet 15–30 °C között van. A proembriókat első időszakban sötétben, majd folyamatos vagy periodikus megvilágításban inkubálják. Az embriógenezis későbbi fázisaiban lévő embriók tenyésztésekor azonnal folyamatos, vagy periodikus lehet a megvilágítás. Természetesen fajtól és kísérleti céltól függően eltérések lehetnek.

1.1.4. 4.1.4. Az embriókultúrák csoportosítása és felhasználása Az embriókultúrák felhasználási lehetősége az embriók fejlettségétől és az alkalmazott módszertől függ. Az embriókultúrák szempontjából az embriógenezis in vitro két fő szakaszra és 3 stádiumra osztható: I. heterotróf szakasz: a proembriónak a táptalajban kell biztosítani minden szervetlen és szerves tápanyagot; II. autotróf szakasz: az embriógenezis annyira előrehaladott, hogy az embrió pusztán szervetlen sókat és szénforrást tartalmazó tápközegben is továbbfejlődik; 1. autonóm stádium: fejlődésben lévő embrió, mely azonban már képes a csírázásra; 2. élettani érettség stádiuma: az embrió elérte teljes embrionális differenciáltságát, de nem képes a csírázásra (csíranyugalom); 3. ökológiai érettség stádiuma: teljesen kifejlett, érett és csíraképes embrió. Az embriógenezisnek az embriókultúra szempontjai szerinti leírt stádiumai azért lényegesek, mert RIJVEN javaslatára – az izolált embriók fejlettsége alapján – az embriótenyésztést két típusra osztják fel. Az egyik a proembrió (pregerminal) kultúra, a másik a tulajdonképpeni fejlett-embrió (postgerminal) kultúrák. E kettős csoportosítást a táptalaj összetételének és ozmózisos nyomásának eltérései is indokolják.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A proembrió tenyésztés esetében az embriókat az embriógenezis heterotróf fázisában, vagy az autotróf fázis autonóm, illetve élettani érettségű stádiumában excizálják. Ez általában a gömb- és szívstádiumú proembriók tenyésztését jelenti. A fejlett-embrió tenyésztés létesítésekor viszont már vagy ökológiai érettségű, vagy teljesen kifejlett embriókat izolálnak. A torpedó- és szikleveles stádiumú embriók tartoznak ebbe a csoportba.

1.1.5. 4.1.5. A proembrió kultúrák céljai, módszerei és eredményei A proembrió tenyésztés célja az izolált proembriók embriógenezisének fenntartása in vitro és a kifejlett embriók, valamint növények felnevelése. A nemesítési és a genetikai célok is életképes növények előállítását igénylik. A heterotróf fázisban izolált proembriókat – amelyek embriógenezise csak csírázást gátló táptalajon tartható fenn – az embriógenezis végén csírázást indukáló táptalajra kell helyezni. E célra kiválóan megfelel a DifcoOrchid tápközeg. Az autotróf fázis autonóm, illetve élettani érettségű stádiumában izolált proembriók fejlődése olyan táptalajon is fenntartható, amelyen az embriógenezis után az embrió azonnal csírázik. Mindezekből következik, hogy a proembrió kultúrákat olyan esetekben kell használni, amikor a petesejt megtermékenyül, azonban – in situ – az életképes csírák (embriók) kialakulásának valamilyen akadálya van. Ebben az esetben az embriókultúra felhasználásának célja – a normális embriógenezist akadályozó posztzigotikus endogén és exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén keresztül – életképes növények felnevelése (4/5. ábra).

4/5. ábra: Az embriókultúra felhasználásának vázlata haploidok és távoli fajhibridek előállítása céljából. Az in situ keresztezést (1) követően az ováriumban (2) a „bulbosum”-technika esetében a zigóta első osztódásai során az egyik keresztezési partner kromoszómái eliminálódnak (3). Ezért az in vitro felnevelt embriók (5–6) és növények (7–8) haploidok lesznek. A távoli hibridizáció során kapott hibrid embriók (9) az ovulum- (anya) 43 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA szövettel való inkompatibilitásuk miatt elpusztulnának. Az embriógenezis korai stádiumában kipreparált (10– 11) hibrid embriókból in vitro hibrid növények (12–13) regenerálhatók Felhasználási területei: – fajkeresztezés, – nemzetségkeresztezés, – valenciakeresztezés, – bulbosum technika, – minden olyan esetben, amikor in situ a normális embriógenezisnek valamilyen akadálya van. A valencia-, faj- és nemzetségkeresztezések túlnyomó részében, valamint az idegentermékenyülő növények öntermékenyítésekor, a megporzás után a petesejt megtermékenyül, azonban az embriógenezis során zavarok lépnek fel az embrió és az endospermium fejlődésében, amelyek gyakran az embrió abortálásához vezetnek (posztzigotikus inkompatibilitás). Ha az embriót a degenerálódás előtt sikerül kipreparálni és olyan mesterséges környezetbe helyezni, amelyben a további növekedés és fejlődés feltételei biztosítottak, normális sporofitonok nevelhetők fel. E megállapítást számos kutatási eredmény igazolta. a) Faj- és nemzetséghibridek előállítása Az azonos vagy különböző nemzetségekbe tartozó fajok keresztezésének leggyakoribb célja valamilyen értékes tulajdonság génjének átvitele (introgressziója) vad fajokból valamilyen kultúrfajba. Fajhibridek. A fontosabb nemzetségek, melyeken belüli fajok keresztezéséhez sikerrel alkalmazták az embriókultúrát HESZKY (1972), COLLINS és GROSSER (1984), DUNWELL (l986), HU és WANG (1986), Pickersgill (1993) összefoglaló munkái alapján a következők: Abelmoschus Corchorus Iris Oryza Agropyron Cucumis Lathyrus Phaseolus Allium Cucurbita Lilium Pinus Arachis Datura Linum Rubus Brassica Diospyros Lotus Solanum Bromus Glycine Lycopersicon Trifolium Carica Gossypium Medicago Triticum Carthamus Helianthus Melilotus Vigna Cerasus Hordeum Nicotiana Chrysan-themum Impatiens Ornithopus A fajkeresztezésekben az embrió abortálásának különböző okai lehetnek. A hibrid embriók korai abortálásának legfontosabb oka, hogy a proembriót tápláló endospermium hiányzik, vagy fejlődésében zavarok lépnek fel. Az embrió abortálásának időpontja szoros összefüggésben van azzal, hogy az endospermium fejlődésében a zavarok mikor kezdődnek. A Vicia keresztezésekben ennek időpontja a megtermékenyítést követő 3. nap volt, ezért a hibrid embriók még nem érhették el azt a stádiumot, amikor már preparálhatók és tenyészthetők. A Phaseolus fajkeresztezésekben az endospermium degenerálódódása 3 héttel a megporzás után kezdődik, amikor az embriók már a szívstádiumot is elérték, ezért a hibridek (P.vulgaris x P.acutifolius) proembrió tenyésztéssel előállíthatók voltak. A harmadik típust a Triticale jelenti, melyben az endospermium fejlődése zavart ugyan, de nem annyira, hogy a hibrid embriók abortáljanak.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Az endospermium fejlődésében bekövetkező zavarok okai lehetnek genetikaiak (zavarok a sejtosztódásban, pl. Triticale), vagy élettaniak (eltérések a növekedésszabályozó anyagok koncentrációjában, pl. Phaseolus hibridek). A hibrid embriók abortálását az anyai szövetben bekövetkező fejlődési zavarok is okozhatják. Ilyen pl. a Lycopersicon és Capsicum esetében az integumentum szövet legbelső sejtsorának – az endotél sejteknek – proliferációja. Ennek következtében ez a szövet az embriózsákba türemkedik. Mivel e sejtrétegnek jelentős szerepe van a táplálásban, degenerációja az embrió elhalását eredményezi. Végül is a proembriótenyésztés azokban a hibrid kombinációkban vezethet sikerre, ahol az embrió abortálása a gömbstádiumot követően, pl. korai szívstádiumban következik be. Ezek az embriók már az autotróffá válás határán vannak. A gömbstádiumú embriók még teljesen differenciálatlanok, polarizációjuk még nem teljes, ezért könnyen kalluszosodnak, illetve belőlük gyakran anatómiailag torz embriók fejlődnek. Ennek elkerülése érdekében dolgozták ki a két lépéses ,,in vitro in ovulo” embriótenyésztést. In vitro in ovulo embriótenyésztés. Az első lépésben a gömbstádiumú hibrid embriót tartalmazó ovulumokat kipreparálják és ovulumtenyésztéssel tartják fenn a normális embriógenezist, steril körülmények között, táptalajon. Az ovulum izolálás ideje fajtól függően a megporzást követő 2.–12. napon történhet. Az ovulumban a proembriók fejlődése és táplálása egyrészt még ,,természetes” úton történik, továbbá a nagy ozmolaritást is az ovulumnedv biztosítja. Természetesen ezt a táptalajjal is biztosítani kell, ezért azok fajtól függően 10–120 g/l szacharózt tartalmaznak. Az ovulumtenyészetekből akkor kell kipreparálni a hibrid embriókat, amikor azok elérték a táptalajon való tenyészthetőség stádiumát. Az in vitro in ovulo embriókultúra felhasználásával sikerrel neveltek fel fajhibrideket a Helianthus, Glycine, Gossypium és Allium nemzetségeken belül.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/6. ábra: A Lolium perenne L. (2x) és a Festuca arundinacea Screb. (6x) nemzetséghibridjének előállítása a hibrid embriók mesterséges felnevelésével. A megporzás után kipreparált 6–7 napos proembriók (A–B) folytatják fejlődésüket a kazeinhidrolizátummal kiegészített Nitsch-táptalajon (C), és a tenyésztés 10. napján csírázásnak indulnak (D). A fejlődő hibrid növények (E–F) jelentős vegetatív heterózist mutatnak a két szülőfajhoz képest (G); balról jobbra: Lolium perenne, hibrid, Festuca arundinacea (Heszky L.E., 1972: Agrobotanika, 14. 71–76). Fontosabb nemzetséghibridek, amelyeknek előállításában az embriókultúrát sikerrel használták fel, HESZKY (1972), COLLINS és GROSSER (1984), Hu és Wang (1986), Molnár–Láng (1999) összefoglaló munkái alapján a következők: Aegilops squarrosa x Triticum boeoticum Aegilops squarrosa x Triticum aestivum Agropyron ciliare x Triticum aestivum Agropyron trachycaulum x Triticum aestivum Agropyron tsukushiense x Triticum aestivum Hordeum californicum x Secale cereale Hordeum jubatum x Secale cereale Hordeum geniculatum x Triticum aestivum Hordeum vulgare x Secale cereale Hordeum vulgare x Triticum timopheevi Hordeum vulgare x Triticum aestivum Lolium perenne x Festuca arundinacea (4/6. ábra) Lolium temulentum x Festuca pratensis Triticale x Triticum monococcum Triticum aestivum x Agropyron distichum Triticum aestivum x Agropyron scirpeum Triticum aestivum x Agropyron junceum Triticum aestivum x Agropyron intermedium Triticum aestivum x Hordeum bulbosum Triticum aestivum x Hordeum vulgare (4.7. ábra) Triticum aestivum x Secale cereale Triticum aestivum x Triticale Triticum durum x Secale cereale Triticum turgidum x Agropyron distichon Triticum durum x Elymus arenarius Tripsacum dactyloides x Zea mays



4/7. ábra: Búza-árpa transzlokációk kimutatása genomikus in situ hibridizációval, a búza x árpa nemzetséghibridek búzával kétszer visszakeresztezett utódaiban A teljes árpa DNS jelölése fluorogreennel történt. A hibridizáció eredményeként az árpa kromoszómák és kromoszóma szegmentumok jelölődtek és zöldessárgára színeződtek. A kontraszt festést propidium- jodiddal (A és B) és DAPI-val (4´–6´diamidinofenilindol) (C és D) végezték, így a búzakromoszómák vörösek (A és B) vagy kékek (C és D) (Lángné Molnár M. és mtsai kísérlete, MTA Mg. KI, Martonvásár) b) Valenciakeresztezések Egy faj különböző ploidszintű változatainak keresztezésekor a fajkeresztezéshez hasonló embrióabortálás figyelhető meg. A Lolium, a Trifolium és a Primula különböző autopoliploid alakjainak keresztezésekor sikerrel alkalmazták az embriótenyésztést. c) Haploidok előállítása bulbosum technikávalA genom elimináción alapuló haploidok előállításának – 1971ben KASHA és KAO által felfedezett – speciális módszere. Lényege, hogy a H. vulgare (O) x Hordeum bulbosum (P) keresztezését követően, a hibrid zigóta osztódásai során a H. bulbosum kromoszómái eliminálódnak. Ezért a fejlődő embrió csak a H. vulgare haploid (n) – jelen esetben monoploid (n = x) – genomjával rendelkezik. A haploid (n=x) embrió csak egy ideig tud fejlődni a diploid ovulumban (2n=2x) és általában 7–14 nap után abortál. Ezeknek az embrióknak mesterséges felnevelésével haploid H. vulgare növények állíthatók elő.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A módszer tehát a H. bulbosum kromoszómáinak eliminációján alapul, ezért kromoszóma eliminációs technikának is nevezik. Maga az elimináció az inkubációs hőmérséklettől is függ. A kritikus hőmérséklet 23 °C. Ez alatt a regenerált növények között csökken a haploidok száma a hibridekhez képest. Módszere. A H. vulgare növényeket a megporzás előtt célszerű 16 órán keresztül 18 °C-on, majd 8 órán keresztül 12 °C-on tartani. A H. bulbosum-ot előzőleg vernalizálni (10 °C, 8–10 hét, 8–10 órai megvilágítás) kell azért, hogy virágozzon. A kasztrálást követően diploid H. bulbosum pollennel végezzük a megporzást. A megporzott kalászokat gibberellinsavval (217 µM) kezelhetjük. A megporzás után 14 nappal az embriókat kipreparáljuk és szilárd táptalajra (1/2 MS) helyezzük. A kéthetes sötétben végzett inkubációt követően fényre helyezzük a tenyészeteket (12–15 óra). A regenerálódó csíranövénykéket kolchicinnel kezeljük [2,5 µM kolchicin + 2% dimetil-szulfoxid (DMSO), 5 óra, 20 °C-on]. A kezelést követően a növények kiültethetők, fajtól függően vernalizálandók. A módszer felhasználásával 1980 és 1990 között több új árpafajtát állítottak elő Kanadában, Angliában és ÚjZélandon. A tetraploid H.bulbosum-mal a Triticum aestivum haploid alakjai is előállíthatók. A haploidok gyakorisága azonban a búza esetében kisebb a portokkultúrához képest. A távoli keresztezésen és genom elimináción alapuló ún. bulbosum technika napjainkban más keresztezési kombinációkban is használhatónak bizonyult. Ilyen például a búza x kukorica keresztezés, mellyel haploid búza ma már rutinszerűen állítható elő (4/8. ábra). Ezenkívül sikerült haploid búzát a kölessel keresztezve is előállítani.



4/8. ábra: Bulbosum technika. Távoli keresztezések során bekövetkező kromoszóma eliminációra alapuló haploid növényelőállítás főbb lépései A különböző haploid indukciós módszerek hatékonyságát összefoglalóan a Portokkultúra c. fejezetben, a 4.2.5 pontban mutatjuk be. d) Egyéb esetek, amikor a normális embriógenezisnek valamilyen akadálya van


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A nemesítési és genetikai kutatások eredményességének egyik sarkalatos feltétele, hogy sok esetben csak 1–2 növényből álló különleges értékű anyagból utódnemzedékeket lehessen felnevelni. A szántóföldi termesztés során ezeket az értékes növényeket azonban számos olyan hatás érheti (pl. viharkár, fagykár, vakond kár, kártevők stb.), amelyektől vagy az egész növény, vagy a generatív szervek elpusztulnak a magvak érése előtt. Ezekben az esetekben a pusztuló növényekből izolált embriók in vitro felnevelése megmentheti az értékes genotípust. A faj- és nemzetség-, valamint a valenciakeresztezések során felhasználható az embriókultúra olyan esetekben is, amikor nagyszámú keresztezés esetén in situ is kaphatunk életképes csírát tartalmazó magvakat (pl. Triticale). Ilyen esetekben az embriókultúra célja a meghatározott keresztezési variációból minél több növény felnevelése, ami sok esetben elengedhetetlen tartozéka a további sikeres munkának (pl. amfidiploidok előállítása).

1.1.6. 4.1.6. A fejlett-embrió tenyészetek céljai, módszerei és eredményei Az embriókultúrák e típusának célja az izolált, részben vagy teljesen kifejlett embriók csírázásának indukálása és növények felnevelése. Táptalajai a proembrió kultúrák összetételéhez képest egyszerűbbek. Általában makroés mikroelemeken kívül csak glükózt és szacharózt tartalmaznak. A kultúrák létesítésekor élettani vagy ökológiai érettségű embriókat, vagy érett magvakból teljesen kifejlett embriókat (csíra) izolálnak. DIETRICH már 1924-ben megfigyelte, hogy a kis ozmózisos nyomású táptalajra helyezett embriók az embriógenezis befejezése után – nyugalmi periódus nélkül – azonnal csíráznak. Mindezekből következik, hogy a fejlett-embrió kultúrákat olyan növényfajoknál érdemes használni, amelyeknél a magvak érési ideje, illetve a csíra nyugalmi szakasza hosszú. Ezért a fejlett embrió tenyésztésének célja a csírázást gátló endogén és exogén faktorok hatásának kiküszöbölésén és a csírázás indukálásán keresztül életképes növények felnevelése.

1.1.7. Felhasználási területei: a mag hosszú érési idejének lerövidítése és ezzel a generációváltás gyorsítása; csíranyugalom megszüntetése és ezzel a generációváltás meggyorsítása; steril magfejlődés megakadályozása; minden olyan eset, amikor a normális csírázásnak in situ valamilyen akadálya van.

1.1.8. A csíranyugalom megszüntetése és a generációváltás gyorsítása. A csíranyugalmat – pontosabban azt a tényt, hogy a mag rövidebb-hosszabb ideig vagy egyáltalán nem tud csírázni – több tényező okozhatja: a/ a mag kiszáradása (vízvesztése), aa/ csírázásgátló anyagok felhalmozódása a magban, aaa/ a mag keményhéjúsága. A fejlődő magból az embriókat a teljes érés előtt, a beszáradást és a gátló anyagok felhalmozódását megelőzve kell kipreparálni és azok embriótenyészetekben hamarosan kis csíranövénnyé fejlődnek. Az érés időtartama elérheti egy növény tenyészidejének 50–60 %-át (pl. szója, napraforgó, tavaszi gabonák, kukorica stb.), tehát jelentős időmegtakarítást érhetünk el, ha a következő generáció egyedeit az embriók mesterséges felnevelésével állítjuk elő. Ez az időmegtakarítás az egynyári növények esetében 1–3 hónap, évelő növények esetében 1–3 év, sőt több is lehet (4/9. ábra).



4/9. ábra: A generációváltás gyorsítása a mag érési és a fiziológiás csíranyugalmi, valamint a dormancia fázisok kiiktatásával E módszer felhasználásával kukoricából évente 2 generációt, gabonafélékből 2–3 generációt is felnevelhetünk. Ennek nagy jelentősége van a növénynemesítésben azoknál a módszereknél, melyek sok generáció felnevelését igénylik, ilyenek pl: single seed descent (SSD) módszer, introgressziós nemesítés (rezisztenciagén, hímsterilitás átvitele), backcross módszer, transzgén átvitele egyik fajtából a másikba stb.

1.2. 4.2. Portoktenyésztés (in vitro androgenezis) A portokkultúra a fejlődés meghatározott stádiumában lévő pollent tartalmazó portokok (antérák) kipreparálását, a mikrospórában pedig az androgenezis indukcióját és fenntartását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között. Célja a gamétákból redukált ploidszintű növények (pollenhaploidok) felnevelése in vitro. Az androgenezis a növények esetében a mikrospórából, vagy a fiatal pollen valamelyik haploid sejtjéből történő növényfejlődés folyamatát jelenti.

1.2.1. A mikrogametogenezis jellegzetességei in vivo A növények sporofita fejlődési szakasza a mikrospóra-anyasejtekben végbemenő meiózissal lezárul. Eredménye a tetrád, amelyben 4 haploid, egymagvú mikrospóra található (4/10. ábra). A mikrospórák további fejlődése a mikrogametogenezis, amely során az érett (2 vagy 3 sejtes), tömlőhajtásra és termékenyítésre alkalmas pollenszemek alakulnak ki.



4/10. ábra: A mikrogametogenezis folyamata in vivo (magyarázat a szövegben) A posztmeiotikus mikrospóra további fejlődése a pollenszem falának (exine és intine) kialakulásával kezdődik. Mivel ekkor citoplazmaszintézis még nincs, a mikrospórában egy nagy központi vakuólum keletkezik. Az ún. egymagvas vakuólumos fejlődési állapot alakul ki, melyet a mikrospórasejtmag első mitotikus osztódása (pollenmitózis-I) követ. Ez in planta aszimmetrikus osztódást jelent, amelynek során ún. vegetatív és generatív sejtek keletkeznek. Ez a kétsejtes fiatal állapot. Ezt követően a vegetatív mag (vsm) G1 fázisban marad, és az intenzív plazmaszintézis eredményeként a vakuólum lassan eltűnik. A generatív mag (gsm) fajtól függően vagy a pollenkiszóródás (antézis) előtt vagy a tömlőhajtáskor osztódik (3 sejtes állapot), létrehozva a kettős megtermékenyítésben résztvevő hím ivarsejteket. Az ,,érett” pollenszem tehát citoplazmával telt, és két vagy három sejtmagot tartalmaz. A mikrogametogenezis pontos ismerete azért fontos, mert korai szakaszában a fejlődés sporofitikus irányba (androgenezis) is kiváltható.

1.2.2. Története A portoktenyésztéssel kapcsolatos kutatások az 1930-as években kezdődtek. A kutatások célja ekkor még nem a növényregenerálás, hanem a mikrosporogenezis és a mikrogametogenezis folyamatainak fenntartása és vizsgálata volt. Ezekben a kísérletekben azonban a mikrospóra fejlődése az ,,érett” pollenszem kialakulásával lezárult. Ezért nem meglepő, hogy amikor LA Rue 1952-ben egy nemzetközi botanikai kongresszuson néhány nyitvatermő faj pollenjének szövetszerveződéséről számolt be, a kutatók azt ,,a képzelet vad szárnyalásának” tartották. Csaknem egy évtizedet kellett várni, amikor is 1965–66-ban két indiai kutató GUHA és MAHESHWARI elsőként számolt be azokról a vizsgálatokról, amelyeknek során nagyszámú haploid embrioidot (embrió), illetve növényt tudtak felnevelni a Datura innoxia pollenjéből portokkultúrában. Részletes citológiai vizsgálatokkal bizonyították a soksejtes pollenszem és az ,,embriószerű struktúrák” polleneredetét. Eredményeikre alapozva széleskörű kutatás kezdődött az egész világon, amelynek során először 1967-ben a francia Nitsch-nek különböző Nicotiana fajok, majd 1968–1969-ben Niizeki és Oono japán kutatóknak az Oryza sativa haploid alakjait is sikerült előállítani. Napjainkig már mintegy 80 nemzetség csaknem 300 növényfajának pollenjéből sikerült az in vitro androgenezis indukciójával haploid kalluszt, embriót, illetve növényt előállítani.



1.2.3. 4.2.1. Pollenembriógenezis indukcója A portokkultúra – az embrió, ovárium, ovulum stb. kultúrákkal szemben, ahol a tenyésztés célja az in vivo fejlődési folyamatok fenntartása – minőségileg új utat jelent, nevezetesen, hogy a tenyésztett sejtek (pollen) fejlődését egy teljesen új pályára, a gametofitonról a sporofitonra kell átállítani in vitro. Ez természetesen csak a génműködés regulációjába való beavatkozással lehetséges. Molekulárisan egy sejtet csak abban az esetben lehetséges egy másik differenciálódási útra állítani, ha a korábbi determinációt töröljük (a génaktivitást leállítjuk), illetve az új determinációt, tehát az új irányú fejlődést meghatározó gének működését ki tudjuk váltani. Tehát az in vitro sikeres androgenezisnek két feltétele van, az egyik (A), hogy a tenyészetben legyenek olyan mikrospórák melyekben a gametogenezis determinációja még nem következett be, a másik pedig (B), hogy ezekben a mikrospórákban az ontogenezis programját indukálni lehessen. (A) Androgén mikrospórák. A mikrospóra fejlődésének ismert az a rövid periódusa (egysejtes vakuólumostól a korai kétsejtes pollen állapotig), melyben a gametogenezis determinációja még nem következett be. Tehát ezekben a sejtekben nem kell törölni más programot, ezek a sejtek elvileg totipotensnek tekinthetők, továbbfejlődésük bármilyen irányba indukálható. Ha ez így igaz lenne, akkor minden izolált mikrospórából haploid növényt lehetne felnevelni. Azonban nem így van. Ennek magyarázatára felállított hipotézis szerint nem minden mikrospóra alkalmas az androgenezisre, hanem csak azok, melyek fejlődése a portokban ,,hibás” volt. Ezek a pollenszemek kicsik, kevés és nehezen festődő citoplazmát tartalmaznak, keményítő nem vagy alig halmozódik fel bennük. Ez az alapja a pollendimorfizmus elméletnek, mely alapján androgenezisre képes és nem képes mikrospórákat különböztetnek meg és melyek egyaránt előfordulnak a portokban. Tehát csak a pollenszemek egy része (S vagy P-pollen) az, amely genetikailag alkalmas (nem determinált a gametogenezisre) arra, hogy belőle egy embrió, majd növény alakuljon ki. (B) Ontogenezis indukálása. Abból a célból, hogy a pollen sporofita fejlődése – az arra alkalmas pollenszemekben – ténylegesen be is következzen, a folyamatot kiváltó indukcióra van szükség. Napjainkra egyre inkább bizonyítottnak vehető, hogy a totipotens sejtnek valamilyen stresszre van szüksége ahhoz, hogy az ontogenezis programja aktivizálódjon. A pollen esetében ezt jelentheti a többhetes hideg (5 °C) előkezelés, a több napos ,,éheztetés”, a nagy 2,4-D koncentráció, a hőstressz (32 °C), az ozmotikus stressz (pl. só, cukor), stb. A stressz esetében is csak akkor tud a mikrospóra ontogenezis választ adni, ha a sejtciklus megfelelő fázisában van. Ez a G2-fázis, mely néhány napos N éheztetéssel érhető el a mikrospóra tenyészetekben. A stressz indukciót követően az androgén típusú mikrospórák fejlődése egy új irányban, az ontogenezis irányában folytatódik, mely végül is pollen eredetű, zömében haploid embriók vagy kallusz és azokból növények differenciálódását eredményezi.

1.2.4. 4.2.2. A pollenhaploidok ontogenezise Az előbbiek alapján a zárvatermők mikrospórája morfogenetikai szempontból még labilis sejtnek tekinthető. A mikrosporogenezis bizonyos szakaszában tehát még nincs determinálva a továbbfejlődés iránya, ami lehetővé teszi a sporofita fejlődés, az ontogenezis indukcióját. A haploid sporofita fejlődés szempontjából az egy sejtmagvas vakuólumos mikrospóra állapot körüli (4/11. ábra) izolálás a legkedvezőbb.



4/11. ábra: A búza mikrospóra androgenetikus fejlődése in vitro. Az egymagvas vakuólumos pollenszem stádiumban (A) történő izolálás esetén a pollenmitózis I. (B) kétféle leánysejtet eredményezhet, egy vegetatív és egy generatív sejtet (C) vagy két vegetatív típusú sejtet (D); a soksejtes pollen kialakításában mindkét esetben csak a vegetatív sejtek vesznek részt (E,F), az első esetben keletkező generatív sejt nem osztódik, fokozatosan elszeparálódik (E) (Heszky L. E.–Mesch J., 1976 nyomán) 54 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Az izolálást követően az átmenet a gametofita fejlődésből a sporofita irányába általában néhány órától néhány napig tarthat a fajtól, a hőmérséklettől, a sporofita fejlődés típusától stb. függően. A sporofita osztódások során minden esetben soksejtes pollenszemek alakulnak ki portokokban (4/12. ábra). Vannak ettől eltérő fejlődési formák, amelyek azonban nem vezetnek embrió vagy növény kialakulásához. A soksejtes pollenszemek három (A, B, C), egymástól jól elkülöníthető úton alakulhatnak ki.



4/12. ábra: Haploid és dihaploid (DH) növények felnevelésének alternatív útjai portokkultúrában. A táptalajra izolált egymagvas vakuólumos mikrospóra sporofita fejlődés alternatív útjai (1–7, 1–9, 1–11) során soksejtes pollenszem (12) alakul ki. Az abortív utakat a tömlőt hajtó (4), az összezsugorodott (3), a soksejtmagvas (2) és a 56 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA hipertrófiás (5) pollen kialakulása jelentik. A soksejtes pollenből közvetlenül pollen embriógenezissel (13–14) vagy közvetve, kalluszfázison keresztül embriógenezissel (15–17), vagy organogenezissel (18–21) regenerálhatók a növények Az A típusú fejlődés (4/12/6–7. ábra) a mikrospóra sejtmagjának aszimmetrikus mitózisával kezdődik és a soksejtes pollenszem a pollenmitózis-I után a vegetatív sejt további osztódására vezethető vissza (4/11/A–C–E ábra). A generatív sejt maximum egyszer osztódik, de általában nem funkcionál, degenerálódik. A B típusú fejlődés (4/12/8–9. ábra) magosztódással kezdődik, amelynek során két hasonló diffúz sejtmag alakul ki, a generatív és a vegetatív mag helyett. Ha az osztódást a sejtfal kialakulása is kíséri, a két haploid sejt egyaránt részt vehet a sporofita fejlődésében (4/11/B–D–F ábra). A C típusú fejlődés (4/12/10–11. ábra) az A–B pályához hasonlóan mitózissal kezdődik, és a pollenmitózis-I után kialakuló két sejtmag fuzionál. A fúziót követően doubled haploid (DH) sejt (2n) keletkezik. Ezekből közvetlenül DH embriók és növények fejlődhetnek. Az A, B és C pályákon kialakult soksejtes pollenszemek (4/12/12. ábra) további differenciálódása pollenembriókat (4/12/13. ábra) vagy proliferációja pollenkalluszt (4/12/15. ábra) eredményezhet. A pollen embriógenezist követően – általában még a primer tenyészetekből – haploid, illetve doubled haploid növényeket nevelhetünk fel (4/12/14. ábra). A haploid kallusz tenyészetekben általában külön táptalajon kell indukálni a növényregenerálódást, amelynek a szomatikus tenyészetekhez hasonlóan két útja lehetséges: embriógenezis (4/12/16. ábra) vagy organogenezis (4/12/18–21. ábra). Összefoglalva megállapítható, hogy a haploid sporofita fejlődés általában a mikrospóra sejtmagra vagy a vegetatív sejtre vezethető vissza, amelyeknek további osztódásai során soksejtes pollenszemek alakulnak ki (4/13/A–D ábra). A soksejtes pollenszemekből pollen embriógenezis (4/13/E–F ábra) vagy pollenkallusz- és organogenezis-indukcióval nevelhetők fel haploid növények.

4/13. ábra: Pollenembriógenezis a dohány portokkultúrájában. A mikrospóra sporofita fejlődése a pollenembriógenezis néhány napos lag-periódusa után indul meg. Az izolálást követő 6. naptól két- (A), három57 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA (B), hét- (C) sejtes pollenszemek figyelhetők meg a portokban. Ezt követően az exine felreped (D) és a soksejtes proembrió az izolálást követő 3–5. héten eléri a gömb (E), a szív és a torpedó stádiumokat (F) (Heszky L. kísérlete Agrobotanikai Intézet, Tápiószele) Az androgenezis típusainak és fejlődési fázisainak ismeretére alapozva BARNABÁS és mtsai (1991–1999) in vitrokolchicinkezelési módszert dolgoztak ki az egymagvas mikrospóra haploid kromoszómaszerelvényének megduplázására. A módszer lényege, hogy a portokkultúra táptalaját 0,01–0,04% kolchicinnel kell kiegészíteni. A kolchicin hatására az első pollen mitózis doubled haploid sejteket eredményez. A kolchicin a búza esetében növelte a szimmetrikus osztódás gyakoriságát, a kukorica esetében azonban ez nem volt megfigyelhető. Az androgenezis későbbi fázisában a kolchicinnek semmiféle káros hatása már nem mutatható ki. Javítja viszont a pollenembrió gyakoriságot. A módszerrel a DH növények gyakoriságát a búza esetében 20%-ról 60%-ra, a kukorica esetében 0%-ról 100%-ra lehetett növelni. A módszert sikerrel alkalmazták a doubled haploidok közvetlen felnevelésére különböző fajok portok és pollen tenyészeteiben.

1.2.5. 4.2.3. Androgenetikus poliploidia Az in vitro androgenezis B és C pályáinak (4/12. ábra) citológiai vizsgálata megerősítette a portok kultúrából regenerálható különböző ploidszintű növények polleneredetét. A fontosabb fajok, amelyek tenyészeteiből n, 2n, 3n, 4n és 8n alakokat is regeneráltak, a következők: Atropa belladonna, Datura innoxia, Datura metel, Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum, Oryza sativa, Petunia hybrida, Solanum nigrum és Solanum verrucosum. A poliploidia a pollenszemben az androgenezis indukcióját követő osztódások során előforduló endoreduplikációra, illetve a sejtmagok fúziójára vezethető vissza. Mivel az így kapott poliploid növények végeredményben haploid sejtekből keletkeznek, homozigótáknak (autodiploid) tekinthetők. Néhány faj (Solanum tuberosum, Secale cereale) portokjaiban viszonylag nagy gyakorisággal fordulnak elő redukálatlan mikrospórák. Az ezekből felnevelt diploidok viszont heterozigóták, az eredeti genotípus klónjainak tekinthetők, ezért nemesítési értékük nincs.

1.2.6. 4.2.4. Módszere A portokkultúra módszere technikailag viszonylag egyszerűnek tűnik. A megfelelő fejlődési stádiumban lévő pollent tartalmazó portokok steril izolálásából, táptalajon való tenyésztéséből és a haploid növények regenerálásából áll. A módszer alkalmazásának eredményességét azonban több tényező is befolyásolja, melyek a következők: a) A donor növények genotípusa A genotípusos függőség azt jelenti, hogy azonos módszerek alkalmazása mellett is egy fajon belül – a fajták, törzsek és vonalak között – nagy eltérések lehetnek az androgenezis gyakoriságában. Ezt számos fajnál (búza, rizs, árpa stb.) bizonyították. Az ún. reszponzív (válaszadó) genotípusokra történő szelekcióval, a táptalajok optimalizálásával, a regenerálóképesség keresztezéssel való átvitelével a genotípusos determináltság csökkenthető. A jó és rossz válaszadó genotípusok keresztezése általában intermedier utódokat eredményezett a búzában, az árpában, a kukoricában, a burgonyában és a repcében. Búza diallél kísérletben bizonyították, hogy a haploid gyakoriság legalább 3 függetlenül öröklődő gén által meghatározott. b) A donor növények környezeti feltételei és kora Különböző növényfajok (dohány, olajrepce, búza stb.) részletes vizsgálataiból nyilvánvaló, hogy annak a környezetnek a jellemzői, amelyben a donor növények fejlődnek, jelentősen befolyásolhatják a kultúrák eredményességét. Ezek közül a fotoperiódus, a fényintenzitás és az alacsony hőmérséklet hatását már bizonyították. A virágzás elején izolált virágok androgénebbek, mint a végén izoláltak. A nitrogénhiány viszont egyértelműen kedvezőnek bizonyult az optimális műtrágyázással szemben. c) A donor virágok, virágzatok előkezelése Az előkezelés általában hidegkezelést jelent, pl. burgonyánál 2 °C és 2 nap, árpánál 4 °C és 3–28 nap, repcénél 4–5 °C és 3 óra. 58 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA d) A portokok, mikrospórák előkezelése Az előkezelés során a kipreparált és táptalajra helyezett portokokat vagy mikrospórákat az inkubáció előtt rövidebb-hosszabb időre stressz körülmények közé helyezzük. Ezt jelentheti a magas (32 °C) hőmérséklet, nagy 2,4–D koncentráció, nagy NaCl koncentráció vagy más ozmotikus stressz a táptalajban, pl. glutamin mínuszos, vagy szerves és szervetlen nitrogén hiányos táptalajon való éheztetés (5–6 nap) stb. Természetesen az egyes értékek és időtartamok fajtól függően változnak. e) Táptalaj Annak ellenére, hogy dohány pollenből vizet és agart tartalmazó táptalajon is – bár rendkívül kis hatékonysággal – növényt lehet regenerálni, a regenerált haploid növények számára a táptalaj többi komponensének is jelentős hatása van. A makro- és mikroelemek sóinak koncentrációját a legáltalánosabban használt táptalajok esetében, mint pl. MS (dohány) és az N6 (gabonafélék), célszerű a felére csökkenteni. Különösen a vas koncentrációja fontos azoknál a fajoknál, amelyeknél a pollenembriógenezis indukciója vasfüggőséget mutat. Ezeknél a fajoknál (kivétel a dohány), a Fe-EDTA koncentrációját célszerű 40–150 µmol-ra növelni. A szacharóz koncentráció attól függ, hogy az érett pollen hány sejtmagvú. A hárommagvas fajoknál (Gramineae, Cruciferae) a nagyobb (6–15% ), míg a kétmagvasoknál (Solanaceae), a kisebb (2–5% ) az optimális. A maltóz javította az embriógenezis indukciót petúniánál és a búzánál. Hasonló a helyzet a 2,4–D-vel is. A Gramineae és a Cruciferae fajok általában igénylik az auxin kiegészítést, a Solanaceae fajok nem. Fajtól függően az aktív szén, az inozit, a glutamin stb. alkalmazásával növelni lehetett az androgenezis gyakoriságát. A táptalaj szilárdítására agar helyett célszerű a szervetlen Gelrite-t, esetleg keményítőt használni. f) Inkubáció A portoktenyészeteket a pollenkallusz vagy a pollenembriók megjelenéséig célszerű sötétben tartani. A hőmérséklet általában 25–30 °C. A Brassica fajoknál 1–2 napos 35 °C-os tenyésztés serkentőleg hatott. A búzánál a 26 °C, a kukoricánál a 29 °C az optimális. A kevés adat ellenére úgy tűnik, hogy a tenyészedényben lévő portokok számának (denzitás), az etilén, a nitrogén és a széndioxid koncentrációjának növelésével fokozható a pollenembriók száma. A növényregeneráláskor legalább 3000–10000 lux erősségű megvilágítás szükséges. A megvilágítás erősségének mindig korrelációban kell lennie a hőmérséklettel. g) Doubled haploid (DH) növények előállítása A portokkultúra gyakorlati jelentőségét az esetek többségében nem a haploid növények jelentik, hanem a belőlük előállítható doubled haploid alakok (4/14. ábra). A nemesítő szempontjából tehát amellett, hogy rendelkezünk egy módszerrel, amellyel a korábbiakhoz képest nagyobb gyakorisággal tudunk haploidokat indukálni, legalább olyan fontos, hogy rendelkezzünk olyan módszerekkel is, amelyekkel a haploidokból egyszerűen, viszonylag gyorsan és főleg megbízhatóan lehet homozigóta növényeket (DH-vonalakat) előállítani.




II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/14. ábra: Virágzó haploid (n = 24) (A) és diploid (2n = 48) (B) dohánynövények és kromoszóma-számuk (C, D) (Heszky L.E. – Paál H., 1972: Bot. Közlemények, 59. 125–127. nyomán) DH növényeket kaphatunk a tenyészetekben spontán rediploidizációval vagy kolchicin kezeléssel. A portok tenyészetekben bekövetkező spontán rediploidizáció esetén bizonyítanunk kell a közvetlenül felnevelt DH növények haploid eredetét. Spontán rediploidizáció előfordulhat még a haploid növények virágzataiban is (árpa, rizs). Az így kapott DH magvak valószínűleg a haploid (n) növényeken kialakuló redukálatlan gaméták (n) keletkezésének és fúziójának (2n) eredményei. A haploid sejteket, tenyészeteket kezelhetjük kolchicinnel in vitro (lásd 4.2.2. pontnál). A rediploidizálás klasszikus módja a haploid növények, illetve azok hajtás- vagy virágrügyeinek, virágzatának kolchicin kezelése. 4.2.5. Androgenezis, ginogenezis, parthenogenezis, távoli keresztezés módszerek hatékonysága Az ivaros szaporodás biotechnikáinak bemutatásakor már utaltunk arra, hogy az használható-e és hogyan a haploid növények előállítására. E pontban összefoglaljuk és összehasonlítjuk a korábban bemutatott módszereket a növénynemesítés szempontjából. A 4/1. táblázat 4 különböző megközelítést és 8 különböző technikát tartalmaz.

1.2.7. In vitro androgenezis A mikrospóra eredetű haploidok felnevelhetők portok és mikrospóra tenyészetekben. Az in vitro androgenezisen alapuló technikával állították elő a legtöbb (több száz) növény haploid alakját. Felhasználási köre tulajdonképpen elvileg nem korlátozott. A portokban a pollenszemek száma 1000-től (árpa) 40000-ig (dohány) változhat (4/15. ábra). A regenerálható haploid növények gyakorisága 0,065 (árpa) – 5,0 (dohány) a mikrospórák százalékában. Hátránya, hogy a nem haploid növények pollen eredete nehezen bizonyítható, továbbá, hogy bizonyos növénycsoportokban (pl. Triticum fajok) az albinók aránya nagyon magas. A Triticum durum faj tenyészeteiben a pollenhaploidok 100%-a albinó. Az árpán végzett molekuláris vizsgálatok bizonyították, hogy az albinizmusért a plasztisz genomban bekövetkező változások (replikációs hibák, deléciót és egyéb átrendeződéseket eredményező rekombinációk) a felelősek. Mások nukleáris gének hatását is feltételezik. Jelenleg csak a tenyésztési feltételek optimalizálásával lehet javítani a zöld növény kihozatalt. Az utóbbi jelentősége egyre fokozódik, mert a magasabbrendű növények sejttenyészetei közül egyedül az izolált mikrospóra szuszpenzió jelent a szó igazi értelemében különálló sejteket (single cell) tartalmazó tenyészetet. Sajnos még kevés azon fajok száma, melyekre a mikrospóra tenyésztés módszere rutinszerűen kidolgozott lenne. A portok kultúra viszont univerzális technikának tekinthető a legfontosabb kultúrfajok vonatkozásában.




II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/15. ábra: Repce portoktenyészetek SEM elemzése. A tenyészetbe vont portok (A) és hosszmetszeti képe (B). A porzó keresztmetszeti képe a négy pollenzsákkal (C). Egy pollenzsák közeli képe (D). A több sejtsoros (epidermisz, rostos réteg, köztes réteg, tapétum) portok fala a fejlődő pollenekkel (E). Repce pollen 14 napos inkubáció után (F). (Gyulai G, Kiss E. és Heszky L. 1993, Magyarország kultúrflórája VI. 4: 56–62).

1.2.8. In vitro ginogenezis A petesejt (embriózsák) eredetű haploidok felnevelhetők termékenyítetlen ováriumok és ovulumok tenyészeteiben. Az androgenezistől eltérően az embriózsák állapotának a szerepe még nem bizonyított az indukció sikerében. Egy ovulumból (ováriumból) több növény is fejlődhet (pl. árpa). Hatékonysága 1–10% (pl. búza, hagyma), az izolált ovulumokra vonatkoztatva. A cukorrépa ováriumában viszont 100 ovulum is fejlődhet. A módszer hátránya hasonló a portok kultúráéhoz, azaz a diploid és poliploid regeneránsok haploid eredetét nehéz bizonyítani.

1.2.9. In vitro parthenogenezis A parthenogenezis a női gametofiton (embriózsák) valamelyik haploid sejtjéből kiinduló embriófejlődést jelenti. A folyamat lényege, hogy a haploid sejt valamilyen külső hatásra osztódni kezd és haploid embriót hoz létre. Az in vitro parthenogenezis jelenlegi technikái az embriózsák eredetű haploidok felnevelését jelentik a csökkent életképességű pollennel megporzott ováriumokból és ovulumokból. A pollen életképessége csökkenthető besugárzással (1000 Gy) vagy kémiai úton toluidinkékkel (nyár, cukorrépa).

1.2.10. Távoli keresztezés E módszer alkalmazása esetén haploidokat kétféle úton kaphatunk, s parthenogenezissel (phureja-technika) és posztzigotikus kromoszóma eliminációval (bulbosum-technika). a) Phureja-technika. A burgonya (Solanum tuberosum) tetraploid faj 2n=4x= 48 (haploidjai dihaploidok 2n= 2x=24) előállítására dolgozták ki a diploid S. phureja speciális mutánssal való (2n= 2x=24) keresztezés módszerét. A S. phureja genotípus érdekessége, hogy a pollenjének fejlődése során elmarad a II. pollenmitózis, ezért csak 1 generatív sejtje van. Ez a sejt a fejlődő pollentömlőn keresztül bejutva a S. tuberosum embriózsákjába, annak vagy a petesejtjével vagy a központi sejtjével fúzionál. Az esély 50–50%. Abban az esetben, ha a központi sejtet termékenyíti meg, a fejlődésnek indult endospermium kiváltja a haploid petesejt osztódását, parthenogenezisét. Ennek eredménye az lesz, hogy a fejlődő magvak egy része (10–40%) ginogenetikus eredetű haploid lesz. b) A bulbosum technika (részletesen lásd a 4.1.5. pontban) alkalmazásával azokban a keresztezési kombinációkban lehet haploid embriókat előállítani, melyekben a megporzást követően van termékenyülés, de a zigóta első osztódásai során az apa faj genomja 100%-ban eliminálódik, viszont a hibrid embriók fejlődése folytatódni tud olyan fejlettségi stádiumig, amikor embrió, illetve „in vitro in ovulo” embriótenyészetben életben tarthatók. Az embriókultúrákban felnevelt növények haploidok lesznek. E technika különösen alkalmas haploid tavaszi árpa (H. vulgare x H. bulbosum), illetve haploid búza (T. aestivum x Zea mays) előállítására. Az utóbbi esetében a hibrid embriók túlélése kalászka kultúrával javítható. Kalászonként átlag 30 virág porozható meg és ebből 3–5 haploid növény (10–17%) nevelhető fel.

1.2.11. 4.2.6. Genetikai és nemesítési jelentőség Az előzőekben bemutatott in vitro módszerek – az élővilágban szinte egyedülállóan – a magasabbrendű növényekben lehetővé teszik a ploidszint redukcióját. A növénynemesítőnek tehát nemcsak a növények ploidszintjének növelésére (poliploidizáció), hanem annak a csökkentésére is lehetősége van. A gaméták a meiózis során lejátszódó rekombináció (crossing-over, homológ kromoszómák véletlenszerű szétválása) miatt genetikailag különbözőek. A haploidia lehetővé teszi, hogy a gaméták szintjén jelentkező genetikai változatosságot, tehát a gametoklonális variabilitást – a másik gaméta hatása (megtermékenyítés) nélkül – az intakt növények szintjére hozzuk. A kifejlett egyed szintjére hozott gametoklonális variabilitás ma még egyedülálló az élővilágban. Haploid és DH növényekben lehetőség van a különben rejtve maradó recesszív tulajdonságok fenotípusos manifesztálódására és az ezekre irányuló szelekcióra, továbbá jelentősen növelhető a sejtszintű mutánsizolálás hatékonysága is. 63 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


4/16. ábra: A GK Góbé, GK Délibáb búza fajták és dihaploid vonalaik összehasonlítása RAPD analízissel. A monomorf mintázat a fajták és DH vonalaik homogenitását bizonyítja. A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) elemzés során véletlenszerűen megválasztott 10 bázisból álló random oligonukleotid primerrel PCR amplifikációt hajtottunk végre a növényi DNS mintával. Az ábrán összesen 72 egyedi DNS templáttal futtatott RAPD mintázat látható a következő sorrendben: M: 1000–100 bp molekulatömeg marker, 1– 3: GK Góbé, 4–6: GK Góbé DH vonalak, 7–9: GK Délibáb, 10–12: GK Délibáb DH vonalak. A nyílheggyel jelölt DNS fragmentum a vizsgált 18 GK Góbé és a 18 GK Góbé dihaploid vonalban egyöntetűen jelen van, de hiányzik a GK Délibáb eredeti fajta egyedeiből és a GK Délibáb DH vonalakból. (Kiss E., Törjék O., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő) A haploidokból reduplikációval kapott dihaploidok (doubled haploid) röviden DH-növények elvileg homozigótáknak tekinthetők (4/16 és 4/17. ábrák). Ezzel az idegentermékenyülő növények beltenyésztésének ideje – amely fajtól függően 6–10 generáción keresztül folyó öntermékenyítést jelent – végül is 1 generációra redukálható. A beltenyésztett vonalak előállításának ideje tehát jelentősen 3–6 évvel (pl. kukorica) csökkenthető.

4/17. ábra: GK Góbé és GK Délibáb búza fajták és dihaploid vonalaik összehasonlítása egyedi AFLP mintázat alapján. A várakozásnak megfelelően a vizsgált markerekre mind a fajták, mind a dihaploid származékaik homogénnek bizonyultak. Az AFLP (Amplicon Fragment Length Polymorphism) analízis során az egyes növényekből izolált DNS-t egy ritkán és egy gyakran hasító restrikciós enzimpárral, EcoRI és MseI enzimekkel emésztettük, majd adaptereket kapcsoltunk a kapott DNS fragmentumokra. Ezt követően a hasítóhelyre és az adapterre specifikus primerekkel nem-szelektív amplifikációt hajtottunk végre. A PCR termékekkel EcoRI és


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA MseI specifikus, szelektív bázist tartalmazó primerekkel szelektív amplifikációt végeztünk. A DNS fragmentumokat szekvenáló gélen (6% poliakrilamid) választottuk szét. Az autoradiográfiás detektálás az EcoRI-szelektív primer 33P izotópos (33P-ATP) jelölésével történt. 1–6: GK Góbé, 7–16: GK Góbé DH vonalai, 17–26: a GK Délibáb, 27–36: GK Délibáb DH vonalai. Nyilak jelölik azokat a DNS sávokat, amelyekben a GK Góbé és DH vonalai különböznek a GK Délibáb fajtától és DH származékaitól (Törjék O., Kiss E., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő. A vizsgálat feltételeit Bánfalvi Zs. MBK, Gödöllő biztosította Az öntermékenyülő fajok F1 és F2 növényei, vagy F6 –F7-ben még hasadó vonalai, törzsei egy generáció alatt rögzíthetők (4/18. ábra). Az androgenezis lehetőséget ad a gametoklonális variabilitás nemesítési felhasználásához. A dohány szelektált gametoklónjai felülmúlták a kiinduló vonalat terméshozamban, koraiságban, rezisztenciában és a dohány minőségében.

4/18. ábra: Homozigóta vonalak előállítása androgenezissel búzában (Pauk J. és mtsai 1999 nyomán) A különböző faj- és nemzetségkeresztezésekben a haploidia lehetővé teszi addíciós és szubsztitúciós hibridek előállítását (pl. Triticale). Autotetraploid (4x) növényekből dihaploidok (2x), majd azokból monoploidok (x) állíthatók elő (4/19. ábra). A monoploidok fúziójával a legkülönbözőbb variációkban állítható újra össze az autotetraploid genom és növény. Előállíthatók komplett homozigóták és heterozigóták. Az egyes monoploid vonalakba gének beépítésével, majd


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA a különböző monoploidok fúziójával 2–4 fontos tulajdonság egyesíthető a diploidokban (pl. árpa), illetve tetraploidokban (pl. burgonya).

4/19. ábra: Különböző biotechnológiai (parthenogenezis, androgenezis, protoplasztfúzió) módszerek kombinált felhasználásának lehetőségei a burgonya „analitikai-szintetikus” nemesítésében (Wenczel és mtsai 1979, TAG 55, 49–55 nyomán). Transzgénikus növényekből a transzgénre nézve homozigóta növények állíthatók elő. Ivari kromoszómákkal (XY) rendelkező fajokból szuperhím (YY) alakok állíthatók elő (pl. spárga). Genetikailag tiszta vonalakat biztosítanak a molekuláris markerek keresésére, kapcsoltságuk kimutatására és térképezésére. Az első fajták (rizs, búza), amelyeknek előállításában az in vitro haploidia (androgenezis) módszerét használták, a hetvenes évek végén Kínában születtek. Ezeket az eredményeket néhány évvel később követték az európai és kanadai fajta bejelentések. Franciaországban egy búzafajtát, Kanadában egy repcefajtát minősítettek 1986-ban, amelyeknek előállításában szintén a haploid androgenezis módszerét használták fel. Bulbosum technikával előállított DH árpafajtákat Új-Zélandon, Angliában és Kanadában minősítettek 1980 és 1984 között. Hazánkban az első androgenetikus haploid szomaklón eredetű fajtát a DAMA nevű rizsfajta állami minősítése jelentette 1992-ben, melyet Heszky L. és Simonné Kiss I. állított elő. Pauk J., Kertész Z. és nemesítő csoportjuk állította elő az első DH eredetű búzafajtát (GK Délibáb), mely 1993-ban kapott állami elismerést (4/20. ábra). Ezt több szegedi és martonvásári DH búzafajta követte 1996-ban.



4/20 ábra: In vitro haploid módszer alkalmazása a búzanemesítésben. A: egysejtmagvas vakuólumos mikrospóra, B: embrioidok és kalluszok a portokok felületén az indukció 5. hetében. C: járulékos embriógenezissel regenerált növénykék üvegházi kiültetés és citologiai ellenőrzés előtt. D: haploid kromoszómaszámú sejt (n=3x=21). E: kolchicin kezelt és spontán rediploidizálódott növények üvegházi nevelése és felszaporítása. F: a haploid módszer felhasználásával előállított első magyar DH búzafajta, a ‟GK Délibáb‟ kalászállománya virágzáskor. G: a kiváló sütési minőségű ‟GK Délibáb‟ szemtermése és a lisztjéből sütött kenyér (Pauk J. és mtsai kísérlete, GK Kht, Szeged)

1.3. 4.3. Generatív szervtenyészetek 1.3.1. 4.3.1. Virágtenyésztés A virágtenyésztés virágkezdemények vagy virágok izolálását, fejlődésük fenntartását, illetve befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között. Nem tekinthetjük virágtenyészetnek azokat a kultúrákat, amelyekben a virágokat, virágrészeket egyéb kísérleti célokból – pl. jól regenerálódó kallusz (pl. búza, rizs), vegetatív szaporítás (pl. hagyma) stb. – helyeznek táptalajra. E tenyészetekben a virágok csak kiinduló izolátumnak számítanak, fejlődésük a táptalajra helyezést követően más ontogenetikai utakra terelődik. Az in vitro virágtenyésztés legfontosabb célja a virágdifferenciálódás és -fejlődés morfogenetikai, fiziológiai, biokémiai vizsgálata és módosítása szabályozható körülmények között. Természetesen amikor már egy faj 67 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA virágkezdeményeinek további fejlődéséhez az in vitro módszer kidolgozott, e technika sikeresen használható fel különböző alkalmazási célból is (pl. ivardetermináció). Módszere A virágtenyésztés egészen fejletlen virágrügyek (virág primordiumok) kipreparálásával és táptalajra való izolálásával kezdődik, lehetőleg még az ivardetermináció előtti fejlődési szakaszban. A táptalajt (Nitsch 1951; White 1954) a szokásos makro- és mikroelemek mellett gyakran komplex anyagokkal (pl. kókuszdiótej stb.) kell kiegészíteni. A tenyésztés folyamán a virágzáskori, továbbá az azt megelőző hő- és fényviszonyokat célszerű biztosítani. A virágok kialakulása, majd az in vitro megporzás után zigotikus embriók és magvak fejlődése is biztosítható. Eredményei, alkalmazása, jelentősége A virágfejlődés indukciója, a ,,nagy távolságra” kiterjedő szignálátviteli rendszer jó példája a magasabbren-dű növényekben. A növényekben a vegetatív merisztéma fejlődésében a változást a környezeti tényezők váltják ki, melyet a növények különböző részei érzékelnek. Az endogén változások következménye végül is az lesz, hogy a növények egyes vegetatív hajtásmerisztémáinak további növekedése, fejlődése generatív típusú lesz, ami végül a virág/virágzat kifejlődését eredményezi. A külső (exogén) hatások közül – legtöbb faj esetében – a nappal hosszúsága, a hőmérséklet és a háttérsugárzás a meghatározó. Ezek a fizikai hatások a növények különböző részein – a nappal hosszúsága a levélen, a hőmérséklet a hajtáscsúcson, az egyes stressztényezők (pl. víz, ásványi anyagok) a gyökéren – keresztül hatnak. A gyökérből és a levélből a jelátvitel csak úgy lehetséges, ha létezik egy nagyobb távolságra is kiterjedő biokémiai rendszer a növényekben. A hajtáscsúcsban a virágdifferenciálódás indukcióját kiváltó molekuláknak meg kell jelenniük a növényi tápanyagszállító rendszerben, tehát a gyökérnedvekben és a levélnedvekben is. Az in vitro rendszerek kiválóan alkalmasak arra, hogy a virágindukciót követően a növénynedveket a táptalajba adagolva, azok tényleges morfogenetikai hatását kontrollált és reprodukálható körülmények között, kísérletesen vizsgálni lehessen. A Pharbitis-ből virágindukció előtt izoláltak (nem ,,virág indukált”) hajtáscsúcsokat táptalajra. Ezekben a vegetatív hajtáscsúcsokban a ,,virág indukált” növények phloéma nedvével a virágdifferenciálódás kiváltható volt. Ezeket az eredményeket sikerrel ismételték meg dohány és Sinapis fajokon. Feltételezték, hogy a levél exszudátum megnövekedett szénhidrát (szacharóz), illetve citokinin (izopentenil-adenin) tartalma felelős a virágindukcióért. A gyökérnedvben a transz-zeatin ribozid volt a meghatározó komponens. Természetesen ezek hatása is tesztelhető in vitro virágkultúrában. Nyilvánvaló, hogy a végső megoldást a virágfejlődésben résztvevő gének azonosítása, jellemzése és izolálása fogja jelenteni. Arabidopsis-nál és Antirrhinum-nál transzpozon mutagenezissel több olyan gént (DEF-gén, AGgén) azonosítottak, melyekkel a virágok száma és formája módosítható volt. Az in vitro tenyésztett Chenopodium rubrum csíranövényeket akkor hoztak teljesen kifejlett virágokat, amikor 6 napig rövidnappalos és 9 napig hosszúnappalos megvilágítást kaptak. A táptalajhoz adagolt indolecetsav és benziladenin 40%-kal csökkentette az in vitro fejlődött virágok számát. A virágos növények 4%-a ivari dimorfizmussal rendelkezik és egyes egyedei egyivarú virágokat tartalmaznak. A virágkultúrák alkalmasak a kétlaki (dioecious) növények egyivarú virágainak kialakulását, és fejlődését meghatározó bioaktív anyagok hatásának tényleges vizsgálatára (pl. datolyapálma, Silene alba). A Silene alba ivarát heteromorf ivari kromoszómák határozzák meg. A hím növények a 22 autoszóma mellett 2 ivari (X és Y) kromoszómával is rendelkeznek (2n = 24 XY). A nőivarú egyedek 22 autoszómát és 2 db X kromoszómát tartalmaznak (2n = 24 XX). A kísérletek bebizonyították, hogy a virágok ivardeterminációjára az abiotikus környezet semmiféle hatással nincs. Más a helyzet azoknál a fajoknál, ahol a virágok ivari jellegzetességei nem genetikailag, hanem élettanilag determináltak (pl. dinnyefélék, tökfélék, stb.). E területen a GALUN, HESLOP-HARRISON és EVANS által vezetett kutatócsoportok munkássága érdemel figyelmet. Az uborkára (Cucumis sativus) például háromféle szexexpresszió a jellemző:


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA – monoikus (egylaki) növény, ha a növényen megtalálhatók mind a hím, mind a nővirágok, és a virágok egyivarúak; – ginoikus növény, amelyen csak a nővirágok fejlődnek; – hermafrodita növény, amelyen csak hímnős virágok fejlődnek. E három vonal virágainak in vitro tenyésztése során a következőket állapították meg: – hímvirág kezdeményekben auxin, pl. indolecetsav (IES) hatására magház (ovárium) fejlődik, tehát nővirággá alakítható. Ez azonban gibberellinsavval (GA3) megszüntethető; – a nő- és hermafrodita virág kezdemények ivari determinációját sem az IES, sem a GA3 nem befolyásolta. E munkák kiindulópontjai voltak a szexdetermináció hormonális szabályozottsága, fiziológiás háttere tisztázásának, ami elvezetett annak üzemi alkalmazásához. Napjainkban már néhány zöldségnövénynél speciális szerek állományra permetezésével a hím- és nővirágok aránya mesterségesen befolyásolható.

1.3.2. 4.3.2. Ováriumtenyésztés Az ováriumtenyésztés a termékenyítetlen vagy in situ már megtermékenyült virágokból a fejlődő magházak kipreparálását, táptalajra helyezését és fejlődésének fenntartását, valamint befolyásolását jelenti steril, klimatizált körülmények között. Általános célja a gyümölcs- és termésfejlődés fiziológiai, morfogenetikai és biokémiai folyamatainak vizsgálata reprodukálható és szabályozható környezetben (4/21. ábra), melynek ismeretében számos gyakorlati felhasználási cél fogalmazható meg. Az ovárium és szerepe in vivo Az ovárium vagy magház a zárvatermők virágtengelyének végén helyezkedik el és az embriózsákot tartalmazó magkezdemények védelmére szolgál. Lehet egy- vagy többüregű, belsejében egy vagy több (több száz is) magkezdemény található. Az egyszikű fajok ováriumai általában egy magkezdeményt tartalmaznak. Falában szállítónyalábok haladnak (magléc vagy placenta), amelyek behatolnak a magkezdeménybe és annak táplálását biztosítják. Egyik felét a vacok zárja le, a másik fele általában a bibeszálban folytatódik. Története Az első ováriumtenyészeteket, LA RUE létesítette a negyvenes évek elején. Kísérleteiben néhány faj izolált ováriumai kismértékben növekedtek. Erre alapozva Nitsch az ötvenes években továbbfejlesztette a technikát, és kiterjesztette a gyümölcsfejlődés élettanának tanulmányozására. A dohány, a paradicsom, a bab, az uborka és a szamóca fajok ováriumkultúrájában elért eredményeire alapozva arra a következtetésre jutott, hogy a megporzás és a megtermékenyülés stimulusát bizonyos növekedésserkentő anyagok [pl. 2-naftoxi-ecetsav (NOA), 2,4diklórfenoxi-ecetsav (2,4–D), 2,4,5–triklórfenoxi-ecetsav (2,4,5–T)] képesek pótolni in vitro, és ez mag nélküli, ún. partenokarp termések kialakulásához vezet. Módszere Az ováriumok izolálása általában a megporzást követő 2–15. napon (fajtól függően) történik. Izolálhatunk ováriumokat azonban a megporzás előtt is. Ez utóbbi esetben 1–2 nappal a portokok felpattanása előtt célszerű a még meg nem termékenyült ováriumokat táptalajra helyezni. A táptalaj általában NITSCH (1951) vagy WhItE (1954) és módosított változataik, amelyeket hormonokkal, továbbá komplex növekedésserkentőkkel (élesztőkivonat, kazeinhidrolizátum, kókuszdiótej stb.) egészítenek ki. A tenyészeteket 25 °C körül és 50–60% páratartalomban, néhány hétig sötétben, majd folyamatosan vagy 16 órás megvilágítás mellett inkubálják. Eredményei, alkalmazása, jelentősége Abban az esetben, ha az ovárium fejlődését sikerül in vitro biztosítani, az ovárium megnyúlik, és növekedési üteme általában szigmoid típusú görbével jellemezhető. További tenyésztés során az érés is bekövetkezhet, ami a termések elszíneződését (pl. paradicsom) vagy íz- és zamatanyagok kialakulását (pl. szőlő) eredményezheti. Az ováriumok (gyümölcsök, termések) mérete azonban rendszerint jelentősen elmarad a természetestől, amit a tenyészedények korlátozott méretének is tulajdonítanak. Ezért egy olyan részlegesen steril módszert dolgoztak ki, amelyben a fejlődő gyümölcs a tenyészedényen kívülre került és csak a kocsány érintkezett a táptalajjal. Ezt követően indiai kutatók megfelelő kiegészítések (kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat) felhasználásával a 69 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA természetes méretet is meghaladó terméseket nyertek az Iberis amara, a Ranunculus sceleratus és az Althaea rosea tenyészeteiben. Az auxin az egyik legfontosabb gyümölcsfejlődést stimuláló anyag in vivo és in vitro. Az auxinszintézist a megporzás során a bibére jutó pollen stimulálja. A megtermékenyítést követően a fejlődő magvak biztosítják a viszonylag magas endogén auxinszintet, amely a gyümölcs fejlődéséhez szükséges. Ezt legjobban az aszimmetrikus termések bizonyítják, amelyeknek egyik felében az ovulumok abortálása miatt magvak nem fejlődnek. Ez a termés egyik felében kis auxinkoncentrációt okoz, ami jelentősen lassítja azon az oldalon a gyümölcs fejlődését. Az auxinok túladagolása in vitro azonban gátolhatja a magvak fejlődését, ezért tenyészedényekben nagy gyakorisággal csak partenokarp termések alakulnak ki. Az in vitro fejlődő ováriumokban a ,,magkötés” mértéke általában jelentősen elmarad az in vivo értékektől. Ennek legfontosabb oka az embrió, a magkezdemény, illetve az endospermium korai degenerálódása. Ennek ellenére számos fajnál (Lycopersicon esculentum, Iberis amara, Ranunculus sceleratus, Dendrobium nobile) teljesen érett magvakat kaptak, amelyek in vitro csíráztatva növénnyé fejlődtek. a) Fajkeresztezések Az ováriumkultúrát RÉDEI sikerrel alkalmazta Triticum fajkeresztezései során. A T. aestivum x T. spelta hibrid embriók az embriógenezis korai fázisában abortáltak akkor, amikor a proembriók még nem voltak kipreparálhatók az embriózsákból. Ezért 4–6 nappal a megporzás után az ováriumokat táptalajra izolálta. Abban az esetben, amikor az ováriumot borító pelyvaleveleket nem távolította el, a hibrid embriók tovább növekedtek és 8–12 napos tenyészetekben már olyan fejlettséget értek el, hogy azokat ki lehetett preparálni, majd embriókultúrában tovább lehetett nevelni. Egyes virágrészek, pl. csészelevelek, magfejlődést serkentő hatásáról számoltak be az Althea rosea, Iberis amara és az árpafajok ováriumtenyészeteiben is, megerősítve RÉDEI eredményeit. Ezt később ún. ,,héjfaktornak” nevezték el, amely nélkülözhetetlen az embrió normális fejlődéséhez ováriumkultúrában. NITSCH a hatvanas évek közepén feltételezte, hogy a virágrészek (pl. a csészelevelek), mint szerves nitrogénvegyületek forrásai, nélkülözhetetlenek a tenyészetekben. b) Az in vitro megporzás (4/21. ábra) Az ováriumkultúra in vitro megporzásra és termékenyítésre is alkalmas. A hatvanas évek közepén sikerrel izoláltak dohány ováriumokat bibével együtt. Egy nappal az izolálást követően aszeptikus pollent helyezve a bibe felületére, 2%-os termékenyülést értek el. A tenyésztett ováriumban fejlődött magvak egy része kicsírázott és növénnyé fejlődött.



4/21. ábra: Az ovárium- és az ovulumkultúrák, valamint az in vitro termékenyítés felhasználásának vázlata, haploidok és fajhibridek előállítása céljából. A ginogenezis indukciója céljából a megporzatlan ováriumokat, illetve ovulumokat táptalajra helyezzük (1–6–7); haploid embriók, növények (8-9) csak apomixissel (pl. ginogenezis) keletkezhetnek; az in vitro megtermékenyítés esetén a táptalajra helyezett (1–2–3) ováriumokat, illetve ovulumokat sterilen gyűjtött pollennel kémcsőben porozzuk és termékenyítjük meg (2–3); a magvak csírázását követően hibrid növényeket kapunk (4–5) c) Poliembriónia Néhány fajnál, különösen az Umbelliferae családba tartozóknál, poliembrioniát figyeltek meg az ováriumkultúrában (pl. Anethum graveolens, Foeniculum vulgare, Trachyspermum, Ammi majus, Coriandrum sativum stb.). E fajok ováriumában fejlődő embriók egyes sejtjeiből újabb embriók differenciálódtak in vitro. Ezért az embriózsákban a járulékos embrioidok tömege alakult ki, amelyek továbbfejlődve felszakították a perikarpiumot és általában növénnyé fejlődtek. d) Ginogenezis (haploid apomixis, 4/21. ábra) A növények női gametofitonját – hasonlóan a portokokhoz – potencionális haploid forrásnak kell tekintenünk. A ginogenezis azt a folyamatot jelenti, mely során a termékenyítetlen ovárium, pontosabban embriózsák (ovulum) valamelyik haploid sejtjéből embrió, illetve növény fejlődik.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A fontosabb kultúrnövények közül napjainkig az árpa, a búza, a rizs, két dohányfaj (N. tabacum és N. rustica), a kukorica, az olaszperje, a csomós ebír ovárium tenyészeteiben sikerült ginogenezist indukálni és fenntartani. Hazánkban JUHÁSZ G. és mtsai nemzetközileg is elsők között állítottak elő hagyma és cukkini növényeket ginogenezissel. Néhány fajnál (pl. hagymafélék) várhatóan a ginogenezis lesz az a haploid indukciós módszer, amit az androgenezis jelent napjainkban pl. a búzánál, a rizsnél, a dohánynál stb. A hagymánál (Allium cepa L.) nem lehetett in vitro androgenezissel haploidokat előállítani. Keller közel 100 ezer portokot izolált és egy haploidot sem kapott. Az izolált 50 ezer ováriumból ginogenezissel (50 fajta) összesen 457 növényt (5 fajta) tudott felnevelni, melyek közül 62% haploid, 32% diploid és 6% mixoploid volt. A ginogenezis az ovulumok in vitro tenyészeteiben is kiváltható, amelyről a következő, ,,Ovulumkultúra” c. pontban számolunk be. A ginogenezis hatékonyságát a többi haploid indukciós módszerrel együtt a ,,Portok- és pollenkultúra” c. (4.2.5) pontban hasonlítottuk össze. Összefoglalva, az ováriumkultúra lehetővé teszi: a termés (gyümölcs, mag) fejlődésnek kísérletes vizsgálatát kontrollált feltételek között; ginogenetikus haploidok előállítását; a partenokarpia élettanának vizsgálatát ; hibridek előállítását inkompatibilis keresztezésekből; poliembriónia indukcióját.

1.3.3. 4.3.3. Ovulumtenyésztés Az ovulum (magkezdemény) tulajdonképpen az embriózsákot tartalmazó magkezdeményt jelenti, amely az ováriumban a placentán helyezkedik el. Az ovulumkultúra a fiatal termékenyítetlen vagy termékenyült magkezdemények izolálását, fejlődésének fenntartását és befolyásolását jelenti táptalajon, steril, klimatizált feltételek között. Az ovulumkultúra általános célja a proembriók fejlődéséhez szükséges feltételek biztosítása in vitro, ami további számos gyakorlati cél elérését teszi lehetővé. Az ovulumkultúra módszerének kidolgozására a kényszer vezette a kutatókat. A zárvatermők szívstádiumnál fiatalabb proembrióinak kipreparálása és életben tartása az ismert embriótenyésztési eljárásokkal kivitelezhetetlen volt. Célszerűnek látszott a proembriót tartalmazó ovulum kipreparálása és tenyésztése. Feltételezhető volt továbbá, hogy hibrid embriók esetén, ha az ovulumot táptalajra helyezik, az inkompatibilitást okozó embrióabortálás időpontja kitolható addig az időpontig, melytől az embriók már embriókultúrában is folytatni tudják fejlődésüket (lásd az in vitro in ovulo embriótenyésztést a 4.1.5 pontban). Az ovulum és szerepe in vivo A zárvatermők ováriumában egyesével vagy többesével fejlődő, tojásdad alakú szerv az ovulum (magkezdemény), amely a megtermékenyülést követően maggá alakul (4/22. ábra).



4/22. ábra: A zárvatermők magkezdeményének vázlatos ábrázolása 8 magvas Polygonum típusú embriózsákkal. A: mikropyle (csírakapu), B: külső magkezdeményburok (integumentum), C: belső integumentum, D: embriózsák, E: nucellusz, F: köldökzsinór (funiculus); 1 – petesejt, 2–3 – segítő (szinergida) sejtek, 4 – központi sejt két poláris maggal, 5 – ellenlábas (antipodális) sejtek, 1–2–3 – petekészülék A gabonafélék virágjában a magház általában egy ovulumot tartalmaz, így abban egy mag fejlődik. Kétszikű fajoknál számuk rendkívül változó lehet. A tápanyagokat az ovárium placentaszövete biztosítja, melyhez köldökzsinórral (funiculus) kapcsolódik. Kívülről egy- vagy kétrétegű burok (tunica) borítja, amelynek nyílása a csírakapu (mikropyle), ahol a pollentömlő bejuthat a magkezdeménybe. A magkezdemény belsejében található az embriózsák (csírazsák, női gametofiton), mely a haploid női ivarsejtet (petesejt) és további haploid sejteket tartalmaz. Kialakulása különböző típusú lehet. A zárvatermők 80%-ára a Polygonum-típusú monospórás szerveződés a jellemző, mely 7 haploid sejtes (8 sejtmagos). Története White 1932-ben elsőként végzett kísérleteket Antirrhinum magkezdeményekkel. A következő évtizedekben a kísérletek főleg arra irányultak, hogy megismerjék azokat a tényezőket, amelyek a zigóta első osztódásaitól kezdve szabályozzák az embrió fejlődését, különösen az embriógenezis korai fázisában. Az első sikeres ovulumkultúráról 1958-ban MAHESHWARI számolt be. A Papaver somniferum 4 sejtes proembrióit tartalmazó ovulumokat izolálva 23 nap alatt érett magvakat kapott, amelyek csíraképesek voltak. Ezt követően az ovulumtenyésztés alkalmassá vált az in vitro termékenyítés kivitelezésére is. További története az in vitro termékenyítés részévé vált, ezért azt a ,,Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” (4.3.4) c. alatt mutatjuk be. Módszere Az azonos fejlődési fázisban lévő ovulumok biztosítása céljából a fejlődő virágokat célszerű izolátor alatt mesterségesen megporozni. A megporzást követő 1–12. napon, az ovárium felvágását követően a fejlődő magkezdemények kipreparálhatók és táptalajra helyezhetők. Abban az esetben, ha termékenyítetlen ovulumokat kívánunk tenyészteni, az ováriumokat 1–2 nappal a portokok felpattanása előtt célszerű a virágokból eltávolítani és belőlük a fejlődő magkezdeményeket kipreparálni. Az ovulumok kipreparálhatók placentaszövettel együtt vagy anélkül. A placentával együtt történő tenyésztéssel általában kedvezőbb eredményeket értek el. Általában makro- és mikroelemeket, auxinokat, citokinineket és más komplex növekedésserkentő anyagokat (kókuszdiótej, kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat, különböző gyümölcskivonatok) tartalmazó táptalajokat (NITSCH, 1951 és WHITE, 1954) használnak. A táptalaj kiegészítésein kívül annak ozmotikus értéke különös 73 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA jelentőségű a tenyésztés sikere szempontjából. Ez a szacharóz, a mannit, a glicerin, a KCl stb. mennyiségének növelésével érhető el a legegyszerűbben. A megtermékenyülést követően az ovulum üregét kitöltő nedv ozmózisértéke nagy, amely az embrió fejlődésével párhuzamosan fokozatosan csökken. Ennek minél pontosabb szimulálása a tenyésztés során a siker fontos feltétele. A tenyésztés további körülményei megegyeznek az ováriumkultúráknál leírtakkal. Eredményei, alkalmazása, jelentősége Az orchideáknál (Epidendrum-, Cattleya-fajok) a megtermékenyülés és a magérés között eltelt időt ovulumkultúra felhasználásával sikerült jelentősen lerövidíteni már a negyvenes években. MAHESHWARI sikeres kísérletét követően, amelyben a Papaver somniferum 4 sejtes proembriót tartalmazó ovulumai érett maggá fejlődtek, a hatvanas években széleskörű kutatások indultak. Ezek bebizonyították, hogy az alkalmazott tenyésztési feltételekkel – fajtól függően – különböző korú ovulumok tarthatók életben. A dohány esetében 9 napos ovulumok tenyésztése sikertelen volt, de a 12 naposak már normálisan fejlődtek. Ennek oka valószínűleg a táptalaj kis cukorkoncentrációja (ozmózisértéke) volt. A Petunia hybrida esetében ugyanis a hetvenes években bebizonyították, hogy a 4 napos ovulumok 6%, a 3 napos ovulumok pedig csak 8% cukortartalom esetében folytatták fejlődésüket. a) Inkompatibilis keresztezések A hetvenes években sikerrel alkalmazták az ovulum kultúrát inkompatibilis keresztezésekhez (pl. Lolium és Festuca fajok) olyan esetekben, amelyekben az embrió a termékenyülést követően korai (gömb, korai szív) fázisban abortált. Napjainkban a Nicotiana repanda (2n = 2x) rezisztenciagénjeinek (pl. nematóda) N. tabacum-ba (2n = 4x) való átviteléhez használták a módszert. Először a N. repanda tetraploid (2n = 4x) alakját állították elő, majd azt keresztezték a N. tabacummal. A megporzást követően kipreparált fejletlen magkezdeményeket MURASHIGE és SKOOG (MS) táptalajon tenyésztették. A táptalaj ozmolaritását a szénhidrátok koncentrációjának változtatásával csökkentették. E technikával a hibrid embriókat tartalmazó ovulumok fejlődését sikerült fenntartani és hibrid növényeket előállítani. b) Ginogenetikus haploidok (4/21. ábra) A nyolcvanas években ginogenetikus eredetű haploidokat sikerült felnevelni termékenyítetlen ovulumkultúrákból, ami – hasonlóan az ovárium tenyészetekhez – új távlatokat nyit meg a gyakorlati (nemesítési) felhasználás előtt A fontosabb kultúrnövények, amelyeknek ginogenetikus haploidjait nem ovárium-, hanem ovulumkultúrából sikerült előállítani, a cukorrépa, a gerbera, a kukorica és a napraforgó. A répaféléknél (cukorrépa, céklarépa stb.) a haploidokat termékenyítetlen ovulumok tenyésztésével állították elő. Az ovulumokat a virágok portokjainak felpattanása előtt 2–4 nappal izolálták MS táptalajra, melyet 0,25 mg/l benziladeninnel és 0,93 mg/l naftilecetsavval egészítettek ki. A szaharóz tartalom 30–60 g/l között volt. A haploid gyakoriság a válaszadó genotípusok estében 1–10% között változott. Hazánkban POTYONDI L. és mtsai (1992) állítottak elő ginogenezissel haploid cukorrépát. c) In vitro termékenyítés Az ovulumtenyésztés az in vitro termékenyítés alaptechnikájává vált és hozzájárult ahhoz, hogy faj- és nemzetséghibrideket lehessen előállítani in vivo nem termékenyülő kombinációkban. További részleteket lásd a ,,Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” (4.3.4) c. alatt. d) Gazda-parazita kapcsolat Az ovulumkultúrák felhasználásának speciális területe az obligát gyökérparazita növényeknél az embrió morfogenezis gazdanövény függősége. Ezeknek a fajoknak (pl. Orobanche aegyptiaca, Cistanche tubulosa) az embriógenezise ugyanis a fejlődés korai fázisában leáll akkor, amikor a sziklevél, a gyökércsúcs, a hajtáscsúcs és a hipokotil még alig szerveződött. Az embrió további fejlődését a gazdanövény gyökérnedvei stimulálják és ennek vizsgálatához kiváló feltételeket teremt az in vitro ovulumkultúra. Összefoglalva, az ovulumtenyésztés lehetővé teszi: ginogenetikus haploidok előállítását;


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA a zigóta és a proembriók morfogenezisének kísérletes vizsgálatát kontrollált körülmények között ; - az in vivo korai fejlődési fázisban abortáló hibrid embriók megmentését és hibridek előállítását a természetben inkompatibilisnek számító keresztezésekből; - az in vitro megporzás és termékenyítés technikai kivitelezését; - embrió- és endospermium-mutánsok felnevelését.

1.3.4. 4.3.4. Megporzás és megtermékenyítés kémcsőben Az előzőekből nyilvánvaló, hogy szövettenyésztési módszerekkel lehetőség van az ivarsejtet is tartalmazó ovulumok, illetve ováriumok tenyésztésére mesterséges feltételek között. Kézenfekvő volt tehát, hogy a megporzást és a megtermékenyítést is ,,kémcsőben” végezzék el. A kémcsőben végzett megporzás és megtermékenyítés annyiban különbözik az in vitro megtermékenyítéstől, hogy az előbbiben a hím ivarsejteket, illetve a női ivarsejtet tartalmazó szervet (ovulumot, ováriumot) tenyésztjük, míg az utóbbi esetben izolált gamétákkal, tehát magukkal a hím ivarsejttel és petesejttel dolgozunk. Az in vitro termékenyítést a ,,gaméták izolálása és fúziója” (4.5.2) pontban részletezzük. A kémcsőben történő termékenyítés tehát az in vitro tenyésztett ovulumok és ováriumok pollennel való megporzását és megtermékenyítését jelenti ,,táptalajon”, steril, klimatizált feltételek között (4/21. ábra). A megporzás és a megtermékenyülés folyamata in vivo In vivo a megporzás a hímivarsejtet tartalmazó pollenszemek bibére kerülését jelenti. A megtermékenyítés folyamatának első szakaszában a bibére került pollen megtapad, majd tömlőt hajt és növekedik a bibeszálban, az ovárium szövetében, egészen az embriózsákot tartalmazó ovulum ún. csírakapujáig (mikropyle). A kettős megtermékenyítésben résztvevő két hím (generatív) ivarsejt a növekvő tömlőben jut el az embriózsákig, illetve az embriózsákba, a petesejttel szomszédos egyik segítő sejtbe (szinergida), ahol felreped és a hím ivarsejtek szabaddá válnak. A második szakaszban kerül sor magára a megtermékenyítésre, amikor is az egyik hím ivarsejt (sejtmag) egyesül a petesejttel, létrehozva a zigótát. A másik hím ivarsejt az embriózsák két sejtmagvú központi (poláris) sejtjével fúzionál, létrehozva az embriót tápláló szövet, a triploid endospermium iniciális sejtjét. Története A növényi mesterséges megtermékenyítés az ováriumon belüli megporzással és megtermékenyítéssel kezdődött. Ováriumon belüli megporzás (intraovarian fertilization). STRASBURGER 1886-ban – több mint 100 évvel ezelőtt – volt az első, aki az intraováriumi megporzás lehetőségét felvetette és kipróbálta orchideáknál. A 20. század első felében a Codonopsis, Helleborus, Paeonia, Digitalis fajokon végzett vizsgálatok során kifinomult az alkalmazható technika és sikerült is néhány életképes magot kapni, pl. Paeoniánál. Az igazi áttörést azonban MAHESHWARI professzornak és munkatársainak a Papaver rhoeas, a P. somniferum, az Eschscholtzia californica, az Argemone mexicana és az A. ochroleuca fajokon elért eredményei jelentették. A bórsav 0,01%-os oldatával készített pollenszuszpenziót sterilen injektálták a megfelelően előkezelt ováriumba. A megtermékenyítés és a magvak fejlődése normális volt. A sikeren felbuzdulva a módszert fajkeresztezésre is felhasználták. Az Argemone ochroleuca (2n = 56) és az A. mexicana (2n = 28) keresztezése in vivo csak ritkán, a reciprok keresztezés pedig egyáltalán nem lehetséges. Az ováriumon belüli megporzást alkalmazva MAHESHWARI mind a két kombinációból magvakat kapott. Az ováriumon belüli megporzás tehát alkalmas olyan hibridek előállítására, amelyekére in vivo – a bibe, illetve a bibeszál anatómiai és élettani eltérésére visszavezethető inkompatibilitás miatt – nincs lehetőség. A pollenszuszpenzió közvetlenül magházba juttatásával az inkompatibilitásnak ez a formája kiküszöbölhető. A század hatvanas éveire tehát megoldódott az ovulumok és az ováriumok in vitro tenyésztése, valamint az ováriumon belüli megporzás bizonyította, hogy megfelelő termékenyítés érhető el a pollen közvetlenül a magkezdemény felületére juttatásával is. Tehát szinte minden készen állt a kémcsőben való megporzásra és megtermékenyítésre. Magától értetődő – 20 év távlatából – hogy a kutatócsoport nem lehetett más, mint 75 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA MAHESHWARI és tanítványai a Delhi Egyetem Botanikai Intézetében. Valóban, a hatvanas évek elején sikeres megtermékenyítést és magfejlődést értek el a Papaver somniferum, az Argemone mexicana és a Nicotiana tabacum fajoknál. Az azóta eltelt 25 év alatt 14 család 57 faja esetében sikerült in vitro megporzott ovulumokban embrió és magfejlődést elérni. Fontosabb családok és fajok a következők: SolanaceaeBrassicaceae Nicotiana tabacumBrassica napus Nicotiana alataBrassica oleracea Petunia hybridaBrassica campestris Petunia violaceaSinapis arvensis Petunia axillarisSinapis alber PapaveraceaeGramineae Papaver somniferumZea mays Eschscholtzia californicaHordeum vulgare Caryophyllaceae Silene alba Silene rubra Agrostemma githago Dianthus caryophyllus Valószínűleg nem véletlen a siker ezeknél a kétszikű fajoknál, ugyanis közös jellemzőjük, hogy a placentán nagyszámú (több száz is lehet) ovulum található, melyekből kis termékenyülési százalék esetén is több magot kaphatunk. Ezeknek a kétszikű családoknak a pollenje viszonylag könnyen hajt tömlőt magán az ovulumon. A többi család fajaira (pl. Brassica fajok) viszont ez nem jellemző, ezeknél a placentán való pollencsíráztatás szükséges. Módszere A sikeres mesterséges termékenyítés legfontosabb metodikai feltételei a következők: nagyszámú életképes in vitro tenyésztett ovulum; pollen, amely az ovulum felületén vagy a placentán tömlőhajtásra képes; - megfelelő tenyésztési feltételek, melyek a megtermékenyítést követően biztosítják az embriók, illetve a magkezdemények normális fejlődését. A megtermékenyítetlen ováriumok és ovulumok izolálása, fontosabb táptalajai és tenyésztése megegyezik az Ovárium- (4.3.2), illetve az Ovulumtenyésztés (4.3.3) c. pontokban írtakkal, azzal a kiegészítéssel, hogy az ováriumokat a bibével, vagy anélkül, az ovulumokat mindig a placentával együtt preparáljuk ki. Néhány faj esetén (pl. Silene alba, Dianthus caryophyllus) a placentát a virágkocsánnyal, sőt a visszavágott csészelevelekkel együtt célszerű a táptalajra helyezni. A sterilen izolált pollent a tenyésztett és szűrőpapírral szárazon tartott ovulumok felületére kell szórni. A megporzás technikájának különböző változatai ismertek: a pollent a bibe felületére szórjuk (pl. Trifolium fajok);


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA a pollent az ovulum felületére szórjuk úgy, hogy az ováriumot felnyitjuk és a pollent a placentára szórjuk (pl. Brassicaceae és Fabaceae fajok); az ováriumot teljesen eltávolítjuk és a pollent az ovulumok felületére szórjuk (pl. Caryophyllaceae és Solanaceae fajok); izolált ovulumokra szórjuk a pollent; a pollent előcsíráztatjuk in vitro vagy in vivo (egy másik faj bibéjén), majd a megporzás a már tömlőt hajtó pollennel történik. A megtermékenyítés 24–28 óra múlva következik be. A mesterséges termékenyítés mértéke átlagosan 5–50% között van, melyet számos in vivo és in vitro feltétel befolyásol. A megtermékenyült ovulumok szobahőmérsékleten (22–26 °C), természetes megvilágításban tartva folytatják fejlődésüket. Az embriógenezis és a magfejlődés általában 3–5 hét alatt befejeződik. Az érett magvak a tenyészetekben gyakran kicsíráznak és növénnyé fejlődnek. Önmegporzás (beltenyésztés) esetén a fejlődő ovulumok a tenyésztés teljes időtartalma alatt a placentán tarthatók. Fajkeresztezések esetén azonban a hibrid embrió abortálását úgy előzhetjük meg, hogy 6–8 nappal a megporzást követően (korai torpedóstádiumot elért embrióállapotban) az ovulumokat új, szilárd vagy folyékony táptalajra oltjuk át. Eredményei, alkalmazása, jelentősége a) Hibridek előállítása A kémcsőben történő megporzás és megtermékenyítés elvben olyan hibridek előállítását teszi lehetővé, amelyek különböző anatómiai, élettani (elsősorban sporofitikus) inkompatibilitás miatt in vivo nem jöhetnek létre. Ilyen inkompatibilitási okok lehetnek: a pollen tömlőhajtása gátolt a bibe felületén, a bibeszál hoszszabb, mint a pollentömlő, mely utóbbi ezért nem tudja az embriózsákot elérni, továbbá a pollentömlő növekedése gátolt a bibeszálban vagy az ováriumban. Az első olyan interspecifikus és intergenerikus hibrideket, amelyek a természetben nem fordulnak elő, a hetvenes évek közepén Zenkteler és mtsai állították elő. A Silene alba x Silene rubra és a Silene alba x Silene schafta faj hibridjei voltak azok, melyek virágzó növénnyé fejlődtek. Azóta hibrid magvakat kaptak a Brassica pekinensis x Sinapis alba, Brassica napus x Sinapis alba in vitro keresztezésekben is. b) Öninkompatibilitás feloldása Néhány faj szexuális öninkompatibilitását is hasonló tényezők okozzák. Ezekben az esetekben (pl. Petunia axillaris, P. hybrida) a kémcsőben történő önmegporzást követően nagyszámú öntermékenyült magot kaptak. A módszer tehát lehetővé teszi az öninkompatibilis növények beltenyésztését is. c) Haploidia előidézése Ez jelenleg még feltételes alkalmazási lehetőség, olyan kombinációkból, amelyekben a megtermékenyülés csak in vitro következhet be – in vivo nem –, és az egyik faj genomja eliminálódik, hasonlóan a bulbosum technikához (lásd 4.1.5. pontban). Ilyen esetről számoltak be a hetvenes évek közepén, amikor a Mimulus luteus és Torenia fournieri keresztezéséből haploid Mimulus növényeket kaptak in vitro. Összefoglalva, az in vitro termékenyítés lehetővé teszi: új fajhibridek és nemzetséghibridek előállítását; öninkompatibilis fajok beltenyésztését; haploidok előállítását.



1.4. 4.4. Generatív szövettenyészetek 1.4.1. 4.4.1. Endospermium-tenyésztés Néhány család (Orchidaceae, Podostemonaceae, Trapaceae) kivételével minden zárvatermő faj magja tartalmaz endospermiumot. Biotechnológiai szempontból az endospermium azért érdekes, mert ploidszintje a virágos növények több mint 80%-ában triploid, emellett anatómiailag homogén szövetet jelent, mert csak parenchimasejtekből áll. Az endospermiumkultúra a fejlődő endospermium izolálását, táptalajon való tenyésztését és fejlődésének fenntartását, valamint módosítását jelenti steril, klimatizált feltételek között. A szövet sikeres tenyésztése alapja lehet számos más gyakorlati cél elérésének is. Az endospermium és szerepe in vivo Az endospermium (belső táplálószövet, belső magfehérje szövet) az embriózsák két központi (poláris) sejtmagjának és az egyik hímivarsejt fúzióját követően (kettős megtermékenyítés), a magkezdeményben kialakuló triploid raktározószövet. Feladata az embrió táplálása az embriógenezis és a csírázás folyamán (4/22. ábra). Története A kettős megtermékenyítés folyamán a hármas sejtfúzióból származó endospermiumot a kutatók a századforduló körül még ,,másodlagos embriónak” tartották, amely a ,,zigotikus embrió” táplálására módosult. Később tisztázódott, hogy a megváltozott feladat kialakulásáért nem a harmadik sejtmag a felelős, hiszen pl. az Onagraceae család fajaiban az endospermium diploid. Ezek után logikusnak tűnt az a következtetés, hogy in vitro esetleg lehetséges lesz embriók fejlődését indukálni az endospermiumból. Az első endospermium tenyészetet az 1930-as években létesítették kukoricából. LA RUE a Michigani Egyetemen (USA) volt az első, aki 1949-ben folyamatosan növekvő endospermium tenyészetet létesített csemegekukoricából. Növényeket azonban csak a hatvanas évek közepétől sikerült regenerálni, megteremtve ezzel az esetleges gyakorlati célú felhasználás feltételeit. 1998-ban KRANZ és munkatársainak a poláris sejtek és a hímivarsejt in vitro fúziójával már sikerült ,,mesterséges” endospermiumot is létrehoznia. Módszere A tenyészetek létesítéséhez használt inokulum több tényezőtől függ: azoknál a magvaknál, amelyek érett állapotban nem tartalmaznak endospermiumot (pl. alma, citrom), az éretlen magvak a megfelelő explantátumok, amelyekben még sejtes endospermium található; a gabonafélék érett magvaiban az endospermium fiziológiailag ,,élettelennek” tekinthető, ezért azt a megporzást követő 8–11. napon célszerű izolálni a fejlődő szemekből; a kétszikű növények éretlen és érett magvaiból is lehet kultúrákat létesíteni: az érett endospermium dedifferenciálódásának elősegítése végett célszerű azt az embriókkal együtt a táptalajra helyezni, mely utóbbiak az endospermium fejlődésének megindulását követően eltávolíthatók; az embriók hatása (embriófaktor) megfelelő gibberellines előkezeléssel helyettesíthető. Általában a White-féle, illetve annak RANGASWAMY által módosított változatát, továbbá az MS táptalajt használják. A leggyakrabban használt kiegészítések egyszikűek esetében az élesztőkivonat és az auxinok, kétszikűeknél a szerves nitrogén-források (kazeinhidrolizátum, élesztőkivonat), az auxinok és a citokininek. Eredményei, alkalmazása, jelentősége Napjainkig csaknem húsz fajnál sikerült a növényregeneráció. Ezek közül az Oryza sativa, a Prunus persica, a Pyrus malus, a Citrus grandis érdemel említést. A többi faj az Actinidiaceae, Euphorbiaceae, Loranthaceae és a Santalaceae családba tartozik. A Citrus, a Santalum és a Pyrus fajok regenerációjára az embriógenezis volt a jellemző és a kapott növények triploidok voltak.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A triploid növények, különösen a vegetatív úton szaporított gyümölcsfajok, erdei fafajok, zöldségfajok esetében (USA) gazdaságilag is jelentősek. A triploid növényeknek ugyanis számos előnyös tulajdonsága van, amelyek ha találkoznak a piac igényével, különleges gazdasági előnyöket jelentenek. A triploidia napjainkban is fontos piaci értéket jelent, és általánosan használatos az alma, a banán, az eperfa, a cukorrépa, a görögdinnye (mag nélküli) nemesítésében. A triploid rezgőnyár (Populus tremuloides) fája az ipari feldolgozás szempontjából sokkal értékesebb, mint a diploidé. A triploidok előállításának konvencionális módszerei autotetraploidok előállítását, majd azok diploidokkal való keresztezését igénylik, sok apró buktatóval. Az endospermium sejtek in vitro totipotenciája egy lépésben lehetővé teszi a triploid növények előállítását. Mindezeken kívül az endospermiumtenyészet – mivel azonos típusú sejtekből áll – különleges kísérleti lehetőségeket kínál a különböző anyagok bioszintézisének tanulmányozásához is. E célból eredményes kutatások folynak a kukoricakeményítő és a kávé koffein bioszintézisével kapcsolatban, endospermium tenyészetekben. Összefoglalva, az endospermium tenyésztés lehetővé teszi: triploidok előállítását; különböző másodlagos anyagcseretermékek bioszintézisének tanulmányozását kontrollált körülmények között.

1.4.2. 4.4.2. Nucellusztenyésztés A nucellusz tulajdonképpen a magkezdemény teste, szomatikus szövet, amely lehet egy, vagy gyakran több sejtsoros, kitöltve az embriózsák és az integumentum (magkezdemény burok) közötti teret (4/22. ábra). A mag kialakításában általában nem vesz részt – ha igen, akkor a mag perispermiuma lesz. A nucellusztenyésztés ennek a szövetnek kipreparálását, fejlődésének fenntartását, befolyásolását jelenti, steril és kontrollált feltételek között. Tenyésztésével az ötvenes évek végén indiai kutatók kezdtek foglalkozni abból a célból, hogy egy poliembrióniát hatásosan indukáló módszert dolgozzanak ki. Kísérleti növényeik a Citrus-félék voltak. A termékenyült C. japonica ovulumokból a nucellusz csírakapu (mikropyle) felőli részét kipreparálva járulékos embrioid differenciálódást sikerült elérni. Ezt követően három egymagvú Citrus fajnál sikerült poliembrióniát indukálni és növényeket regenerálni. A poliembriónia indukciója a hetvenes évek elején már termékenyületlen ovulumból preparált nucellusz szövetből is sikerült a C. sinensis és C. aurantifolia fajoknál. Eredményei, alkalmazása, jelentősége E módszerrel lehetővé válhat, hogy embriókat kapjunk olyan esetben is, amikor a zigóta eredetű embrió abortál. Ezenkívül sikerrel alkalmazták a nucellusz tenyésztést a különböző Citrus fajok vírusmentesítésére is. A Citrus fajokban elért eredményekre alapozva egyéb gyümölcs- és zöldségfajokkal is sikeres kísérleteket végeztek, melyek közül a „Cabernet Sauvignon‟ szőlőfajta termékenyítetlen ovulumából származó nucellusz sikeres növényregenerációja érdemel említést. Összefoglalva, a nucellusztenyésztés lehetővé teszi: • poliembriónia indukcióját in vitro, • vírusmentes növény előállítását.

1.5. 4.5. Generatív sejttenyészetek 1.5.1. 4.5.1. Izolált mikrospóra tenyésztés A hetvenes években az izolált mikrospóra tenyészetekhez nagy reményeket fűztek. Az első haploid dohányt előállító, és 1972-ben elhunyt francia J. P. Nitsch felesége, C. NITSCH által kidolgozott, majd továbbfejlesztett technika azonban nem tudott elterjedni, mert néhány faj kivételével a haploid gyakoriság azonos vagy kisebb volt az egyszerűbb portokkultúráénál. A 90-es években azonban úgy tűnik, megtörtént az áttörés. A módszerek tökéletesítésével lehetővé vált egy rutinszerűen is alkalmazható módszer kidolgozása és bevezetése.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A portoktenyészetekből regenerált növények felhasználása során sok problémát okozhat – a regeneránsok eredetére vonatkozóan – az a tény, hogy egy tenyészetben egyszerre n és 2n sejtek, szövetek találhatók. Markerek hiányában nagyon nehéz a portokfal diploid szövetéből fejlődött diploid (2n) embrió vagy kallusz és a pollen eredetű (n vagy 2n) embrió vagy kallusz megkülönböztetése. Ez a probléma mikrospóra tenyésztéssel kiküszöbölhető. A portokkultúrának hátránya továbbá, hogy a mikrospórák nem érintkeznek közvetlenül a táptalajjal. A táptalaj és a pollen között mint egy biológiai szűrő helyezkedik el a portok fala. Ez komoly bizonytalansági tényező a portok tenyésztése során, viszont nem jelent problémát a mikrospóra tenyésztés esetén. Az izolált mikrospórákból regenerált növények garantáltan egy sejt eredetűek. Története Az első próbálkozásokról, amelyeket különböző Brassica, Lotus és Petunia fajokon végeztek, az 1970-es évek elején számoltak be. Egyebek között a következő fajok izolált mikrospóra tenyészeteiből regeneráltak növényeket: Atropa belladonna, Brassica napus, Brassica carinata, Datura innoxia, Hordeum vulgare, Hyoscyamus sp., Nicotiana rustica, Oryza sativa, Petunia hybrida, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Triticum aestivum, Triticale, Zea mays. Módszere A sikeres mikrospóra tenyésztéshez a virágokat a legtöbb faj esetében a középső egymagvas és a korai kétmagvas pollenfejlődési állapotban izolálják. Az androgenezis megfelelő indukciója általában szükségessé teszi hideg (pl. 5 °C 1–2 hét), vagy ozmotikus stressz (pl. maltóz) alkalmazását. A virágokat a feldarabolást (1–2 cm) követően homogenizálni kell vagy közönséges háztartási robotgéppel, vagy külön erre a célra kifejlesztett ,,mixerrel” (Waring Micro Blendor). Fontos, hogy e folyamatban a szomatikus szövetekből felszabaduló anyagok minél kisebb stresszt okozzanak a mikrospóráknak. A macerálást ezért célszerű speciális oldatban (pl. 0,3 M mannitol) és/vagy hűtőszekrényben végezni. Az így kapott durva homogenizátumot a pollen méreténél nagyobb pórusátmérőjű szöveten vagy nylonszűrőn kell átszűrni (50 µm– 160 µm). Néhány faj mikrospórájának átmérője: dohány 40 µm paradicsom 25 µm, kukorica 100 µm. Ezután a mikrospórákat tartalmazó szűrletet percenként 1000 fordulattal kell centrifugálni öt percig. Az így kapott mikrospórák már tenyészthetők, azonban célszerű a nem életképes pollent is eltávolítani. Ezért gradiens centrifugálást (pl. táptalajra rétegezett 20%-os Percoll vagy 21% maltózra rétegezett 0,3M mannitol) kell végezni 10 percig, maximum 600/perc fordulatszámon. A centrifugálást követően az alkalmazott oldatok között elhelyezkedő réteg tartalmazza az életképes mikrospórákat. A Percoll 20–30–40 és 50%-os oldatát használva a különböző fejlettségi stádiumban lévő mikrospórák is szétválaszthatók. A kukorica esetében a késői egymagvas mikrospórákat és a korai kétsejtes pollenszemeket a 20 és 30%-os Percoll oldat közötti réteg tartalmazza, ha az oldatot 3 percig 225/perc fordulaton centrifugáljuk. A tenyésztéshez alkalmazott táptalajok nem különböznek a portok kultúráétól. Fontos viszont a megfelelő sűrűség beállítása, ami fajtól függően 7,5 x 103 és 2,5 x 105 mikrospóra/ml kö zött változhat. Tenyészthetők a mikrospórák folyékony táptalajra helyezett 10 µm porózus nejlonhálón is. Az izolálást követő 3–5 héten megjelenő embriószerű struktúrákat szilárd növényregeneráló táptalajra célszerű átoltani. Az androgenezis arányát növelni lehetett árpa és búza esetében az izolált ováriummal való együtt-tenyésztéssel. Pauk és mtsai szerint a mikrospóra izolálást követő első öt napon kell az ováriumokat a táptalajba helyezni és legalább 5 napig együtt kell tenyészteni a mikrospórákkal a kedvező hatás eléréséhez. A pollenembriókat a szomatikus embriókhoz hasonlóan érlelni kell, hogy teljesen kifejlődjenek és csírázóképesek legyenek. Ezért célszerű a táptalaj ozmotikus értékét a tenyésztés elején növelni (pl. 230–240 m Osm/kg H2O), majd a végén felére csökkenteni. Ezután a mikrospórákat tartalmazó szűrletet öt percig percenként 1000 fordulattal kell centrifugálni. Alkalmazása, jelentősége Az izolált mikrospóra tenyésztés előnyei a portokkultúrával szemben a következők:


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA • A tenyészetben csak meiotikus eredetű haploid sejtek vannak, emiatt a regenerált növények haploid eredete biztos, még akkor is, ha azok diploidok, vagy poliploidok. • A tenyésztett mikrospórák közvetlenül érintkeznek a táptalajjal, ami lehetővé teszi az empírián alapuló elemek fokozatos kizárását a technika egyes lépéseiben. • Lehetővé válhat a mikrospórák szelekciója, tehát a szelekció haploid szinten, ami korai fázisban is biztosítja a működő recesszív génekre történő szelekció lehetőségét. • Lehetővé válhat nagyszámú hímivarsejt izolálása az in vitro termékenyítéséhez, amennyiben nem androgenezist indukálunk, hanem a mikrogametogenezist tartjuk fenn in vitro. • Lehetőséget ad pollen transzformációra és egy lépésben homozigóta (DH) transzformánsok előállítására. • Lehetőséget ad krioprezervált, és hosszú ideig tárolt pollenből növények regenerálására.

1.5.2. 4.5.2. Ivarsejtek izolálása és in vitro fúziója Az állatokkal és az alacsonyabbrendű növényekkel ellentétben a magasabbrendű növények gamétáinak izolálása és az ivarsejtek in vitro fúziója majd ,,lombik” növények felnevelése csak a 90-es években vált lehetségessé. A magasabbrendű növények gamétái – az állatokétól eltérően – ugyanis nem szabadon mozgó önálló sejtek, hanem részei az embriózsáknak a petesejt esetében, vagy a pollennek a hímivarsejt esetében. Ilyen értelemben az in vitro termékenyítés ovulumon (embriózsákon) kívüli termékenyítésként is felfogható. A magasabbrendű növények esetében a hím gamétát a pollenben levő két sperma sejt jelenti, a női gaméta alatt az embriózsák csírakapu felé eső oldalán a két szinergida sejt között lévő petesejtet értjük. Az ivarsejtek izolálása azt a folyamatot jelenti, mely során a gamétákat kiszabadítjuk a részben haploid, részben diploid sejtből, illetve szervből, hogy azok az állati ivarsejtekhez hasonlóan szabad sejtekké váljanak. Az in vitro termékenyítés az izolált hím-, illetve női ivarsejt mesterségesen kiváltott fúzióját jelenti folyékony közegben, steril körülmények között (4/23. ábra). E vonatkozásban tehát az in vitro termékenyítés alapvetően különbözik a már bemutatott ,,megporzás és megtermékenyítés kémcsőben” technikától (4.3.4).



4/23. ábra: In vitro termékenyítés Hibrid kukorica növény előállításának vázlata a gaméták izolálásával és fúziójával (Kranz és Dresselhaus 1996 nyomán) Története Először Wageningenben sikerült 1986-ban Spinacea pollenből hímivarsejteket izolálni. Az első sikeres in vitro termékenyítésről Lörz professzor (Köln–Hamburg) kutatócsoportja számolt be, az IAPTC (Növényi Sejt- és Szövettenyésztők Nemzetközi Társasága) VII. Konferenciáján Amsterdamban, 1990-ben. Magát a kariogámiát, tehát a kétféle ivarsejt magjainak fúzióját Faire bizonyította 1993-ban. Módszere Ivarsejtek izolálása (4/24. ábra)


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A hím ivarsejteket leggyakrabban ozmotikus sokk alkalmazásával szabadítják ki a pollenből, melyeket az éppen felpattanó portokokból izolálnak. A fúziós oldatban már kiszabaduló hím ivarsejteket (sejtmagokat) mikrokapillárissal (20 µm átmérő) lehet mikroszkóp alatt elkülöníteni, szelektálni.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/24. ábra: A búza (T. aestivum L.) petesejt mikromanipulációja. A: Az embriózsák mikropyle felőli részlete a petesejttel, B: Mikrosebészeti módszerrel izolált fiatal, vakuolizált petesejt protoplaszt, C: Izolált búza petesejt és hím ivarsejt in vitro elektrofúziója, D: A fúziót követő kariogámia, a sejtmagok egybeolvadása, E: Idegen DNS mikroinjektálása fiatal petesejt protoplasztba, F: GFP (Green-fluorescent protein) gén tranziens expressziója a mikroinjektált búza petesejtben (Barnabás B. és mtsai kísérlete, MTA Mg. KI, Martonvásár) A petesejtek izolálásakor először az embriózsákot is tartalmazó ovulumot mannitol oldatban (70 m Osm/kg H2O) izolálják. Ezt követően az embriózsákot körülvevő szomatikus szövetet (nucellus, integumentum) enzimkeverékkel (pl. 0,75% pektináz, 0,26% pektioláz, 0,5% hemicelluláz és 0,5% celluláz) 24 °C-on, 30 percig emésztik. Az embriózsákok és a petesejtek kiszabadítása mikromanipulátor segítségével mechanikusan, üvegtűkkel történik. Természetesen mikrokapillárissal (200 µm) a szinergidák és a központi sejt is izolálhatók. Ivarsejtek fúziója Az izolált gaméták sejtfal nélküliek, tehát tulajdonképpen protoplasztoknak tekintendők. A kukorica hím ivarsejtjének átmérője 7 µm, a petesejté 77 µm. A fúzió ezért minden olyan módszerrel kivitelezhető, amit a szomatikus protoplasztokra kidolgoztak (lásd a 6.3. fejezetet). A kémiai fúzió esetén tápoldatot használnak a mikrocseppben, nagy kalcium-koncentráció (0,01–0,05M CaCl2) és nagy pH érték (11,0) mellett. Az elektrofúziót mikrocsepptenyészetben célszerű végezni, mely 2 µl mannitololdatot jelent, olajréteggel fedve. A fúziós gyakoriság átlagosan 85%. Az elektrofúzió további előnye a kémiai fúzióval szemben, hogy nagyobb arányban kaphatunk – a fúziós termékek között – mesterséges zigótát, tehát kívánt petesejt-hímivarsejt fúziót (4/24. ábra). In vitro zigóták tenyésztése, növényregenerálás Az in vitro fúziót követően a mesterséges zigóták gyorsan soksejtes struktúrává fejlődnek, ha a megfelelő mikrotenyésztési rendszer rendelkezésre áll. A fúziót követően 40–60 óra múlva a zigóta osztódik. Az első aszimmetrikus osztódást az organellumok egyenlőtlen eloszlása kíséri. A további osztódások során a sejtek mérete csökken, majd kialakul a proembrió, illetve nyomon követhetők az embriógenezis főbb fázisai. A fúziót követő 10–15. napon az embriókat szilárd táptalajra oltják át, a kukorica embriók ekkor már elérik 0,4– 0,5 mm-t. A kis növények a 3–5. héten alakulnak ki. Az in vitro megtermékenyítésből felnevelt növények fertilisek és hibrid fenotípust mutatnak abban az esetben, amikor a szülői gaméták különböző vonalakból származnak. Eredményei és jelentősége Gamétákat sikerült izolálni az utóbbi években Zea, Nicotiana, Torenia, Triticum, Plumbago, Hordeum és Lolium fajokból. Fertilis növényt napjainkig kukoricánál (4/23. ábra), búzánál és árpánál neveltek fel. Külön említést érdemel hazánkban Barnabás Beáta és csoportja, mely a világon elsőként sikerrel izolált és fuzionáltatott búza hímivarsejtet és petesejtet, valamint kidolgozta a növényi izolált petesejt mikroinjektálásának technikáját is. Az utóbbi módszer lényege, hogy a nagyfrekvenciájú (1 MHz) váltakozó áram elektromágneses erőterének (45–50 V/cm) segítségével lehetővé teszi a kezelendő petesejtek immobilizációját és az idegen DNSnek a sejtekbe, illetve a sejtmagba juttatását. Az in vitro termékenyítési módszer jelentősége a következő: • Áthidalja azt a szakadékot, ami az ivaros keresztezés és a szomatikus protoplaszt fúzió között volt. • Lehetővé teszi az intra- és interspecifikus keresztezéseknél fellépő inkompatibilitási tényezők egy részének kiküszöbölését. Heterológ gaméták fúziójával már előállítottak kukorica x cirok, kukorica x Coix, kukorica x búza hibrid sejtkultúrákat. • A genomok és plasztonok különböző kombinációi (pl. cibridek) is előállíthatók, hasonlóan a szomatikus fúzió lehetőségeihez. • A hímivarsejt és a haploid központi sejtek fúziójával triploid endospermium is előállítható. • Lehetőséget ad a zigóta első osztódásának nyomonkövetésére, a gaméták módosítására, a zigótákban és az ivarsejtekben a fúzió előtt és után működő gének (pl. zigóta specifikus gének) vizsgálatára, azonosítására.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA • Lehetőséget ad az ivarsejtek, illetve a zigóta genetikai transzformációjára.

1.6. 4.6. Az apomixis biotechnológiája Általában úgy gondoljuk, hogy a mag a növények ivaros szaporodásának egyetlen lehetséges módja és terméke. Kevésbé ismert, hogy több száz növényfaj magja ivartalan úton keletkezik. Az apomixist régen gyűjtőfogalomként határozták meg, azaz minden beletartozott, ami ivartalan szaporodást jelentett. Napjainkban azt a folyamatot értjük rajta, mely során a virágban csíraképes mag fejlődik megtermékenyítés nélkül (gametofitikus apomixis).

1.6.1. 4.6.1. Típusai A gametofitikus apomixis a növénynemesítés egyik legnagyobb és legérdekesebb lehetősége. A gametofitikus apomixis lényege, hogy a növényen – megtermékenyítés nélkül – olyan mag fejlődik, mely csak az anyanövény diploid genomját (2n) tartalmazza (4/25. ábra). Tehát az ilyen maggal való szaporítás klónozást jelent.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4/25. ábra: A zárvatermő növények szabályos ivaros (A) és apomiktikus (B és C) életciklusa (den Nijs és van Dijk 1993 nyomán). Az apomixis bekövetkeztének két feltétele van. Az egyik feltétel, hogy a meiózis hibájából redukálatlan embriózsák alakuljon ki. Ez kétféle lehet: 1. Diplospória: az embriózsák a redukálatlan megaspóra anyasejtből származik, pl. Eragrostis curvula. A diplospória során a meiózis után nem tetrád (4 haploid sejt), hanem diád (2 diploid sejt) alakul ki. 2. Apospória: az embriózsák a szomatikus nucellusz szövet sejtjéből alakul ki, pl. Panicum maximum. Az apospória típusú embriózsák nem 8, hanem 4 diploid sejtmagot tartalmaz. A másik feltétel a parthenogenezis (a redukálatlan petesejt termékenyülés nélkül fejlődik embrióvá), mely diploid embriót eredményez. Természetesen az apomixis esetén is előfordulhatnak alternatív fejlődési utak, melyek közül a következőket kell megemlíteni: a) Apogámia: a diplospória típusú fejlődésnek az a változata, amikor az embrió nem a petesejtből, hanem az embriózsák valamely másik redukálatlan sejtjéből alakul ki. b) Adventív vagy nucelluszembriónia (poliembriónia): A Citrus-féléknél gyakori fejlődés, mely teljesen eltér az eddigiektől. Ebben az esetben ugyanis nem alakul ki az embriózsák, az embriók közvetlenül a sporofita eredetű (szomatikus) nucellusz szövet sejtjeiből fejlődnek. Az apomiktikus fajok egy részénél egyáltalán nem szükséges a megporzás és megtermékenyítés az endospermium fejlődésének kiváltásához. Ebben az esetben az endospermium vagy az egyik központi sejtből (2n) vagy azok fúzióját követően (4n) indul fejlődésnek. Az apomiktikus növények egy másik csoportja esetében azonban szükség van a megporzásra, hogy mind a petesejt, mind az endospermium fejlődésnek induljon. Ennek a folyamatnak a neve pszeudogámia. c) A pszeudogámia esetében a petesejt nem termékenyül meg, de a redukálatlan poláris sejtek és a központi sejtek igen. Ennek következtében az endospermium ploidszintje 5n lesz, mert az apomiktikus fajok mikrosporogenezise normális, a fertilis pollen haploid (n). d) A haploid parthenogenezis (ginogenezis) az apomixis egyik speciális formája. Ebben az esetben van redukció és megporzás is. Az embriózsák sejtjei haploidok, és a haploid petesejt vagy valamelyik másik sejt parthenogenetikusan fejlődik embrióvá. Ezt azonban a 4.3. fejezetben már részleteztük. e) A fakultatív apomixis azt jelenti, hogy az adott faj egyedein a magvak zöme apomixissel, egy része viszont szexuális úton keletkezhet. Ennek előnye, hogy az így szaporodó populáció vagy fajta genetikai diverzitása nem csökken. f) Az obligát apomixis esetén a növényen csak apomiktikus magvak fejlődnek. A világon 34 növénycsaládban összesen 308 fajnál bizonyították az apomiktikus szaporodást. A jelentősebb családok az Asteraceae (69 faj), Gramineae (95 faj), Liliaceae (7 faj), Rosaceae (68 faj), Rutaceae (7 faj), Urticaceae (9 faj). Az apomiktikus szaporodás különösen gyakori a Panicoidae alcsaládba tartozó trópusi és szubtrópusi füveknél. A kukoricának, ciroknak, kölesnek sok olyan rokonfaja van, melyek apomixissel szaporodnak. Az apomixis fajtája alapján leggyakoribb az apospória típusú (160 faj), de hasonló nagyságrendet képvisel a diplospória típusú (104 faj) fejlődés is. Az adventív embriónia 44 fajra jellemző. Diplospóriával szaporodó fajok közé tartozik az Eragrostis curvula és a Taraxacum officinale. Ismertebb apospóriás fajok a Panicum maximum, a Ranunculus auricomus és az Elymus restisetus.

1.6.2. 4.6.2. Biológiája Apospória esetén – melyet Ranunculus auricomus-nál bizonyítottak – verseny figyelhető meg a kétféle, meiotikus és nucellusz eredetű embriózsák között. Az apospóriánál a redukálatlan embriózsák előbb fejlődik ki


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA és válik alkalmassá a hím ivarsejt, pontosabban a pollentömlő fogadására, mint a meiotikus. Mivel a kétféle embriózsák nyílása, a csírakapu nagyon közel van egymáshoz, a megporzást követően a pollentömlő már az érett embriózsákba fog behatolni. Ebben az embriózsákban viszont nem képes a petesejtet megtermékenyíteni, mert addigra a petesejt sejtfala is kialakul, ami lehetetlenné teszi a megtermékenyítést. Az apospória kialakulása feltételezések szerint azért következhet be, mert egyrészt az embriózsák anyasejtből valamilyen szignálmolekula átjut a szomszédos szomatikus sejtekbe, indukálva azok osztódását, másrészt a megaspóra anyasejtben bizonyos gének működése gátolt, és ennek következtében a meiózis normális lefolyásához szükséges fehérjék hiányoznak. Ez az oka annak, hogy a szexuális embriózsák abnormálisan alakul ki. A fentiek ellenére túlzás lenne azt állítani, hogy az apomixis nem több, mint egy meiotikus mutáns. Ezt támasztja alá az is, hogy a mikrospóra anyasejt meiózisa is zavart. Anatómiailag az apomiktikus és nem apomiktikus növények között az a különbség, hogy az embriózsák anyasejtet körülvevő nucellusz sejtek az utóbbiakban általában vastag sejtfalúak, szemben az apomiktikus növényekkel, ahol a sejtfal sokkal vékonyabb. Az apomiktikus fajok zöme poliploid, melyek között auto- és alloploidok is előfordulnak, bár az utóbbiak gyakoribbak. A fajok zömében a kromoszómaszám variábilis, például a fakultatív apospória típusú apomiktikus Poa pratensis kromoszómaszáma 2n = 28–154 is lehet. A fajok zöme heterozigóta, ennek ellenére az öntermékenyítéssel kapott nemzedékekben általában nem mutatkozik beltenyésztéses leromlás. Az apomixissel szaporodó fajok növényein vagy csak apomiktikus magvak fejlődnek (obligát apomixis) vagy mitotikus és meiotikus eredetű magvak egyaránt fejlődhetnek (fakultatív apomixis). Az utóbbi annak is lehet a következménye, hogy a fakultatív apospória típusú apomixis esetén a mitotikus és meiotikus eredetű embriózsákok ugyanabban az ovulumban foglalhatnak helyet. Bizonyos gyakorisággal előfordulhat, hogy a pollentömlő a meiotikus embriózsákba hatol be.

1.6.3. 4.6.3. Biotechnológiai lehetőségei A növénynemesítés célja az apomixisért felelős gének átvitele a kultúrfajokba. A biotechnológia és molekuláris biológia lehetősége és feladata lenne az apomixisért felelős gének azonosítása és izolálása, transzformációs vektorba építése, illetve átvitele az amfimixissel szaporodó fajokba. Sajnos ettől még távol vagyunk. Napjainkig még nem sikerült az apomixisért felelős gént/géneket izolálni. Többek között azért sem, mert még abban sem egyöntetű a tudomány álláspontja, hogy hány és milyen gén határozza meg az apomixist. Az apomixis kialakulásában résztvevő gének száma fajonként változó (1–4). A génekről bizonyították, hogy lehetnek dominánsak, receszívek és episztatikusak. Azonosításuk a 90-es években kezdődött. Az egy lókuszos modellt vallók szerint az apospóriát egy recesszív letális gén határozza meg. A Panicum maximum genetikai analízise alapján egybehangzó az a vélemény, hogy az apomixist egy domináns gén határozza meg és az monogénikusan öröklődik. Szexuális x apomiktikus kombinációk esetében mindig 1:1-es hasadást kaptak. A Hieracium apomixiséért is bizonyítottan egy gén a felelős. A kétgénes modell ezzel szemben hivatkozik az apomixis két alapvető lépésére, a redukálatlan meiózisra és a diploid embriók autonóm fejlődésére, melyek 1 génnel nehezen magyarázhatók. A diplospóriánál is ezért részben recesszív, illetve domináns géneket feltételeznek. Az a kérdés is részletesebb vizsgálatra szorulna, hogy az apomiktikus embriózsákban hogyan alakulhat ki a fehérjében gazdag raktározószövet, mely az embriót táplálja? A fentiek ellenére az apomixisnek, mint maggal történő vegetatív szaporodásnak (klónozásnak), a lehetősége nagy jelentőségű a jövőre nézve, különösen a heterózis hibrid, illetve transzgénikus formák esetében. Ameddig a molekuláris megközelítés, a géntechnológia alkalmazása nem lehetséges, a szaporodás biotechnikái és a szomatikus sejtgenetika segíthetik: • Az apomiktikus gének introgresszióját embriókultúrával és in vitro termékenyítéssel. • Backcross nemesítés során a generációváltás gyorsítását a fejlett embriók in vitro tenyésztésével.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA • Lehetőség van a további apomiktikus vonalak mikroszaporítással, esetleg szomatikus embriókkal való felszaporítására. • Lehetőség van az apomiktikus vonalak hasadásának megszüntetésére DH-technikával. • Lehetőség van aszimmetrikus protoplaszt fúzióval gének átvitelére, amennyiben szexuális úton a fajok nem keresztezhetők. • Lehetőség kínálkozik ovulum kultúrában in vitro megporzással az apomixis folyamatának kísérletes nyomonkövetésére. Indukált parthenogenezis in vitro A pollenstimuluson alapuló parthenogenezis napjainkra a leghatékonyabb haploid előállítási módszerré vált a petúnia esetében. A haploid növények az 500 Gy gamma sugárdózist kapott pollennel termékenyített növények ováriumainak in vitro kultúrájából nevelhetők fel. A besugárzott pollen a ginogenezis stimulálása mellett résztvehet a megtermékenyítésben is, amely apai eredetű kromoszómafragmentek megjelenésével járhat a regenerált haploidokban. Ezeket haploid plusz növényeknek nevezték el. Hasonlóan, besugárzott pollennel állítottak elő haploidokat a Musa acuminata fajból, melynek beporzó faja a M. balbisiana. Amennyiben ez utóbbi faj pollenje 50–200 Gy gamma sugárdózist (Co60) kapott a megporzást követően, a pollen képes volt tömlőt hajtani, de megtermékenyítés nem történt. A parthenogenetikus embriókat az endospermium hiánya miatt a 80. napon embriókultúrában nevelték tovább. A növények nagy része diploid volt, de két haploidot (n=11) is kaptak. Ováriumkultúra Az első sikeres ováriumkultúrák után a kutatók azt gondolták, hogy az igazi sikert a felhasználásban az apomiktikus fajok fogják jelenteni. Az apomiktikus fajok egy része ugyanis az embriófejlődés indukciójához nem igénylik a kettős megtermékenyítés következményeként jelentkező stimulust. Ezért feltételezték, hogy az apomixist ezeknél a fajoknál in vitro igazán könnyű lesz indukálni és fenntartani. Nem így történt. Napjainkig kevés obligát apomiktikus faj ováriumkultúrájában sikerült embriót, illetve magot kapni. Ezek közé tartozik az Aerva tomentosa (Amaranthaceae) és egy Zephyranthes faj. Nucelluszkultúra A nucellusz szövet tenyésztésével az ötvenes évek végén indiai kutatók kezdtek foglalkozni abból a célból, hogy az apomixis egyik típusát, a poliembrióniát (adventív embrióniát) in vitro indukálják. A nucellusz tulajdonképpen a magkezdemény teste, szomatikus szövet, amely lehet egy, vagy gyakran több sejtsoros, kitöltve az embriózsák és az integumentum (magkezdemény burok) közötti teret (4/22. ábra). A mag kialakításában általában nem vesz részt, vagy ha igen, akkor a mag perispermiuma lesz. A nucellusztenyésztés ennek a szövetnek kipreparálását, fejlődésének fenntartását, befolyásolását jelenti steril és kontrollált feltételek között. Először a Citrus japonica ovulumokból a nucellus, csírakapu (mikropyle) felőli részét kipreparálva sikerült járulékos embrioid differenciálódást elérni. Ezt követően három egymagvú Citrus fajnál sikerült poliembrióniát indukálni és növényeket regenerálni. A poliembriónia indukciója a hetvenes évek elején már megporzás nélküli ovulumból preparált nucellusz szövetből is sikerült a C. sinensis és C. aurantifolia fajoknál. A Citrus fajokban elért eredményekre alapozva egyéb gyümölcs- és zöldségfajokkal is sikeres kísérleteket végeztek, melyek közül a „Cabernet Sauvignon‟ szőlőfajta termékenyítetlen ovulumának nucelluszából elért sikeres növényregeneráció érdemel említést. (lásd: 4.4.2., 87. o). Felhasznált és ajánlott irodalom Armstrong, T. A., T. S. Soong, M. A. W. Hinchee (1987): Culture of detached spikes and early development of fourth floret caryopsis in wheat. J. Plant Physiol. 131, 305–314. Baarlen, P. (1998): What can we earn from natural apomicts? Trends in Plant Science 4, 43–44.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Bajaj, Y P. S., Saini, S. S., Bidani, M. (1980): Production of triploid plants from the immature and mature endosperm cultures of rice. Theor. Appl. Genet., 58, 17–18. Barnabás, B., Fransz, P. F, SChel, J. H. N. (1987): Ultrastructural studies on pollen embryogenesis in maize (Zea mays L.). Plant Cell Rep., 6, 212–215. Barnabás, B., Pfahler, P. L., Kovács, G. (1991): Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihaploid plants in wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 81: 675–678. Barnabás B., B. Obert, Kovács G. (1999): Colchicine an efficient genome-doubling agent for maize (Zea mays L.) microspores cultured in anthero. Plant Cell Rep. 18. 858–862. Bernier G. (1992): The control of flower formation: Exogenous and endogenous. In: Dattée, Y. C.Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 29–38. Springer Verlag, Berlin, New York. Bhojwani, S. S. (1984): Culture of endosperm. In: VASIL, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press Inc., Orlando, Florida, 258–268. Bommineni V. R. Greyson, R. I. 1990: Regulation of flower development in cultured ears of maize (Zea mays L.). Sex. Plant Reprod. 3, 109–115. Chlyah H., S.Cherkaoui, N. Saidi, O. Lamsaouri, M: Mdarhi-Alaoui, H.Benkirane, O. Chlyah, O. Amail: (1999): Green haploid plant production in durum wheat by various haploid methods. In: Altman. A., Ziv M. Izhars S. (eds.): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century 119–122. Kluwer Acad. Publs. Dordrecht– New York–London. Collins, G. B., Grosser, J. W. (1984): Culture of embryos. In: VASIL, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press, Inc., Florida. 241–257. Den Nijs, A. P. M., G. E. van Dijk. (1993): Apomixis. in: Hayward M. D., N. O. Bosemark, I. Romagosa (eds.) Plant Breeding. Principles and Prospects. 229–245. Chapman and Hall, London–New York. Dunwell J. M. (1986): Pollen, ovule and embryo culture as tools in plant breeding. In: Withers L. A., Alderson, P. G. (eds.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 375–404. Dunwell, J. M. (1992): Mechanisms of microspore embryogenesis, in: Dattée Y., C. Dumas, A.Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 121–130. Springer Verlag, Berlin, New York. Faure, J. E., Digonnet, C., Dumas, C. (1994): An in vitro system for adhesion and fusion of maize gametes. Science 243, 1589–1600. Foroughi–Wehr, B. Wenzel, G. (1993): Andro- and parthenogenesis. In. Hayward, M.D., N.O. Bosemark, I. Romagosa (eds): Plant Breeding, Principles and Prospects. 261–278. Chapman and Hall, London. Gengenbach, B. G. (1984): In vitro pollination, fertilization and development of maize kernels. In: Vasil–. I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plant. Acad. Press, Orlando, Florida, 1, 276–282. Greyson R. J. (1996): Maize inflorescence culture. In: Freeling, M.: V.Walbot (eds): The Maize Handbook. 712–714. Springer Verlag, New York, Berlin. Guang Y., H., Korbuly, E., Barnabás B. (1993): High frequency callus formation and regeneration of fertile plants from haploid cell suspensions derived from anther culture in wheat (Triticum aestivum L.). Plant Science, 90, 81–87. H. Enyingi K., Heszky L. E. (1973): A Trifolium pratense L. szívstádiumú embriójának felnevelése embriókultúrában: az in vivo és in vitro embriógenezis eltérései. Botanikai Közlemények, 60, 213–220. Heszky L. (1972): Az embriókultúrának, mint módszernek az alkalmazása a növénynemesítési és genetikai kutatásokban. Növénytermelés 21, 185–190. Heszky L. E., Pauk J. (1975): Induction of haploid rice plants of different origin in anther culture. Il Riso, 24, 197–204.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Heszky L. E., Mesch J. (1976) : Anther culture investigations in cereal gene bank collection. Z. Pflanzenzüchtung, 77, 187–197. Heszky L. E., Li Su Nam, Kiss E., Simon-Kiss I., Lőkös K., Do Q.B. 1991: In vitro production of rice in Hungary in: Y.P.S. Bajaj (ed): Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 6. Rice. 619–641. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg – New York. Heszky L. E., Simon-Kiss I. and Do Q. Binh (1996): Release of rice variety ‟DAMA‟ developed through haploid somaclone breeding in: Y. P .S: Bajaj (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 36. (Somaclonal variation in Crop Improvement II.). 46–54. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–New York. Hu. C., Wang, P. (1986): Embryo culture: Technique and application. In: Evans, D. A., Sharp W. R., Ammirato P. V (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 4. Techniques and Applications. MacMillan Publ. Comp., New York, 41–96. Jafari, A. M., Kiss J., Tőkei K.M, Gergácz J. Heszky L. E. (1995): High efficiency callus induction and haploid plant regeneration in anther culture of two poplar species. Silvae Genetica, 44, 141–145. Kanta, K., Rangaswamy, N. S., Maheshwari, P. (1962): Test-tube fertilization in a flowering plant. Nature, London, 194, 1214–1217. Kanta, K. (1960): Intraovarian pollination in Papaver rhoeas L. Nature, London, 188, 683– 684. Keller, W. A., Arnison, P. J., Brian, J. C. (1987): Haploids from gametophytic cells. Recent developments and future prospects. In: Green, C. E., Somers, D. A., Hackett, W P. Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss. Inc., New York, 231–241. Kovács M., Barnabás B, Kranz E. (1995): Electro-fused isolated wheat (Triticum aestivum L.) gametes develop into multicellular structures. Plant Cell Rep. 15, 178–180. Kranz, E., Bautor, J. Lörz, H. (1990): In vitro fertilization of single, isolated gametes, transmission of cytoplasmic organelles and cell reconstitution of maize (Zea mays L.). In: Nijkamp, H.J.J., L.H.W. van der Plas., J. van Aartrijk (eds): Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 252–257. Kluwer Acad. Publishers. Dordrecht, Boston, London. Kranz, E., Lörz, H. (1993): In vitro fertilization with isolated, single gametes results in zygotic embryogenesis and fertile maize plants. Plant Cell 5, 739–746. Kranz, E., T. Dresselhaus (1996): In vitro fertilization with isolated higher plant gametes. Trends in Plant Science, 1, 82–88. Kranz, E., Wiegen, P., Quader, H., Lörz H. (1998): Endosperm development after fusion isolated single maize sperm and central cells in vitro. Plant Cell 10: 511–524. Maheshwari P., Rangaswamy, N. S. (1965): Embryology in relation to physiology and genetics. Adv. Bot. Res., 2, 219–321. Maheshwari, W. (1958): In vitro culture of excised ovules of Papaver somniferum. Science, 127, 342. Molnár-Láng, M., Sutka J. (1994): The effect of temperature on seed set and embryo development in reciprocal crosses of wheat and barley. Euphytica 78, 53–58. Molnár-Láng, M., Linc G., Sutka J. (1999): Production and molecular cytogenetic identification of wheat-barley hybrid and translocations J. Plant Biotechnol. 1, 8–12. Monostori, T., P. Matti, J. Pauk: 1998. Tritikale in vitro androgenezis izolált mikrospóra tenyészetben. Növénytermelés 47, 371–382. Nitsch J. P. (1951): Growth and development in vitro excised ovaries. Am. J. Bot., 38, 566–577. Nitsch, J. P. (1963):The in vitro culture of flowers and fruits. In: MaheshwariI P., Rangaswamy, N. S. (eds.): Plant Tissue and Organ Culture. Univ. Delhi, India, 198–214.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Nishii, T., Mitsuoka, S. (1969): Occurrence of various ploidy plants from anthers and ovary culture of rice plant. Jpn. J. Genet., 44, 341–346. Pauk J., Kertész Z., Barabás Z. (1988): Búzatörzsek előállítása portoktenyészetből és szereplésük teljesítménykísérletekben. Növénytermelés 37, 197–203. Pauk J., Puolimatka M., Tafti M. N., Mesterházy A. Kertész Z. (1999): Integration of in vitro induced doubled haploids in wheat breeding programs. Proc. Cost 824 Workshop on Gametic Embryogenesis, Jokioinen, Finland, 53–57. Petolino, J. F., A. D. Genovesi (1996) Anther and microspore culture in: Freeling, M.,V.Walbot (eds.): The Maize Handbook 701–704. Springer. New York, Berlin PicKersgill, B. (1993) Interspecific hybridisation by sexual means. In: Hayward, MD. N. O. Bosemark, I. Romagosa (eds): Plant Breeding, Principles and Prospect. 63–78. Chapman and Hall, London. Poulimatka M., J. Pauk (1999): Impact of explant type, duration and initiation time on the coculture effect in isolated microspore culture of wheat. J. Plant Physiol. 154, 367–373. Pólya Z., Timár I., Szabó L., Kristóf Z., Barnabás B. (1999): Morphological characterisation of wheat (T. aestivum L.) egg cell protoplasts isolated from immature and overaged caryopses. Sex Plant Reprod. 11, 357– 359. Potyondi L., Heszky, L. E. (1992) Gynogenic haploids produced in ovule cultures of male sterile, fertile, monoand multigerm sugar beet (Beta vulgaris L.) lines. Acta Agronomica 41, 125–130. Puolimatka M, Laine S., Pauk J. (1996): Effect of ovary cultivation and culture medium on embryogenesis of directly isolated microspores of wheat. Cereal Res. Comm. 24, 393–400. Raghavan, V. (ed.) (1997): Molecular Embryology of Flowering Plants. University Press, Cambridge. Rangan, T. S. (1984): Culture of ovaries. In: Vasil., I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Vol. 1. Acad. Press, Inc., Orlando, Florida, 221–226. Rangaswamy, N. S. (1977): Application of in vitro pollination and in vitro fertilization. In: Reiner, T, J., Bajaj, Y. P. S. (eds.): Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer Verlag, Berlin, 412–425. Rédei, G. (1955): Rearing wheats from ovaries cultured in vitro. Acta Bot. Sci. Hung., 2. 183–185. Ryczkwoski, M. (1962): Changes in the osmotic value of the central vacuolar sap in developing ovules. Bull. Acad. Pol. Sci., 10, 371–374. Sachar, R. C.–Kapoor, M. (1959): Gibberellin in the induction of parthenocarpy in Zephyrantes. Plant Physiol., 34. 168-170. Savidan, Y. H. (1992): Progress in research on apomixis and its iransfer to major grain crops. In Dattée, Y., Dumas, C., Gallais, A. (eds.): Reproductive Biology and Plant Breeding. 269–279. Springer-Verlag, Berlin– Heidelberg–New York. Serieys, H. (1992): In vitro culture of zygotic embryos. Its use in soya and sunflower improvement, in: Dattée Y., C. Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 235–246 Springer Verlag, Berlin, New York. Thennis, C.H. Pierson, E.S., Cresti, M. (1991): Isolation of male and female gametes in higher plants. Sex Plant Reprod. 4, 145–154. Touraev, A., O. Vicence, E. Heberle–Bors (1997): Initiation of microspore embryogenesis by stress. Trends in Plant Science 2, 297–301. Truong, Andre, I., Demarly, Y. (1984): Obtaining plants by in vitro culture of unfertilized maize ovaries (Zea mays L.) and preliminary studies on the progeny of a gynogenetic plant. Z. Pflanzenzücht., 92. 309–320.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Venczel G., Mitykó J., Zatykó J., Fári M. (1996): Utilization of androgenic doubled haploid (DH) lines in the improvement of an open pollinated pepper (Capsicum annuum L.) variety. Horticul. Sci. 28, 14–18. Wakizuka, T., Nakajima, T. (1974): Effect of cultural condition on the in vitro development of ovules of Petunia hybrida Vilm. J. Breed, 34. 182–187 White, P. R. (1954): The Cultivation of Animal and Plant Cells. Roland Press, New York Zenkteler, M. (1992): Wide hibridization in higher plant by applying the method, of test tube pollination of ovules, in: Dattée Y., C. Dumas, A. Gallais (eds): Biology and Plant Breeding. 205–214. Springer Verlag. Berlin, New York. Zenkteler, M. (1999): Self and cross pollination of ovules in test tubes. In: Terzi, M., Cella R., Falavigua A. (eds): Current Issues in Plant Molecular and Cellular Biology 191–199. Kluwer Acad. Publishers. Dordrecht, Boston, London. Zivanovic, B., L. Culafic: 1992. Hormonal regulation of flowering in vitro of green and photobleached Chenopodium rubrum L. plant. Proc. XIII. Cong. EUCARPIA Reproductive Biology and Plant Breeding. Anger, France pp. 24–30.

2. 5. Az ivartalan szaporodás biotechnológiája (Heszky L.) 2.1. 5.1. Az in vitro mikroszaporítás alapjai A kertészeti növények hagyományos vegetatív szaporítása az elmúlt évszázadok során kifinomult és mindig is viszonylag fejlett technológiai szinttel párosult. Valószínűleg ezzel is magyarázható a steril mikroszaporítási eljárások meglepően gyors térhódítása az egész világon. A steril vegetatív mikroszaporítás a növényi biotechnológiának az a területe, amelyet széles körben alkalmaznak a gyakorlatban, illetve az üzemi technológiák részévé vált. Elméleti szempontból maga a szaporítás elve tulajdonképpen azonosnak tekinthető a hagyományos in situ technikákkal. Az elkülönítést az indokolja, hogy a szaporításra felhasznált inokulumok olyan kicsik, hogy csak steril körülmények között tarthatók életben, illetve nevelhetők fel. A vegetatív mikroszaporítás fő technikái a merisztéma- és hajtáskultúrák, a század végére a járulékos szervek, illetve a szomatikus embriók tenyészeteivel bővültek. A módszerekkel elvben korlátlan (milliós, milliárdos) nagyságrendű szaporulat érhető el évente. Az in vitro kultúrák kiváló feltételeket teremtettek a kórokozómentesítésre, továbbá a kórokozó-mentesített tenyészetek tartós tárolására (génbank) is. Mivel az említett technikák ma már az üzemi technológia részévé váltak, e fejezetben a mikroszaporítás különböző technikáinak bemutatásán kívül foglalkozunk a vírusmentesítés új eljárásaival és az in vitro génbankokkal is (5/1. ábra).



5/1. ábra: A kórokozómentes mikroszaporítás és szaporítóanyag előállítás fontosabb technológiai egységei (1– 4), és azokban használatos fontosabb biotechnológiai módszerek Növényklónozás in vitro A vegetatív szaporítás ivartalan szaporodást jelent, tehát az új egyed nem a zigótából, hanem a testi (szomatikus, vegetatív) sejtekből alakul ki. Ennek természetes következménye, hogy az utódok genetikailag azonosnak tekinthetők, elvben sem egymástól, sem a kiinduló növénytől nem különbözhetnek. A magasabbrendű növények egy részének hagyományos szaporítási eljárásai hagymával, gumóval, hajtással, rüggyel, gyökérsarjjal, tőosztással stb. ivartalan, ún. vegetatív szaporításnak (klónozásnak) tekinthetők. Az in vitro mikroszaporítás a növény különböző vegetatív (testi, szomatikus) szerveinek, szöveteinek, illetve sejtjeinek tenyésztését jelenti steril és kontrollált feltételek között. A klónozás elvi lehetőségét az adja, hogy a növények különböző részei, rügyei, merisztémái, bizonyos szövetei, illetve sejtjei – megfelelő in vitro feltételek között – teljes növény regenerációjára képesek. A mikroszaporítás célja a tenyésztett vegetatív szervekből, szövetekből, illetve sejtekből a lehető legtöbb növény regenerálása. Az utóbbi csaknem harminc év során a mikroszaporításnak számos módszere alakult ki, amelyek bizonyos téren eltérnek egymástól a főbb növénycsoportokat (pl. dísznövények, zöldségfélék, fás növények stb.), és fajokat (pl. burgonya) illetően.

2.1.1. 5.1.1. Története Loo volt az első, akinek 1945-ben sikerült folyamatosan növekedő és fejlődő merisztématenyészetet előállítania. Az aszparágusz viszonylag nagy, 5 mm-es hajtáscsúcsát sikerrel nevelte szervetlen sókat és szacharózt tartalmazó táptalajon. A folyamatos tenyésztést az in vitro fejlődött hajtások 5 mm-es csúcsi részeinek 23 naponkénti átoltása tette lehetővé. Később, 1946-ban BALL sikerrel tenyésztette a Lupinus albus három levélprimordiumot is tartalmazó merisztémáját, azonban még ez is túl nagy izolátumnak tekinthető. Kisebb hajtáscsúcsok, ténylegesen a merisztémák tenyésztése azt követően vált lehetővé, hogy alkalmazni kezdték a kókuszdiótejet, majd a gibberellinsavat a táptalajban. A negyvenes évek végén és az ötvenes évek elején e kutatások két irányban folytatódtak. A kutatók egy része a vegetatív merisztémák in vitro továbbfejlődésével foglalkozott, különös tekintettel a generatív merisztémák és a virágfejlődés in vitro indukciójára és fenntartására. A másik kutatási irány a merisztéma tenyésztésen alapuló vírusmentesítés volt. A kutatók feltételezték, hogy a hajtáscsúcsok merisztémáinak legfiatalabb részei vírusmentesek akkor is, ha a növény fertőzött. Ezekből a merisztémákból tehát vírusmentes növények regenerálhatók in vitro. Ezt az elméletet igazolva, az ötvenes években sikerrel vírusmentesítettek különböző Solanum, Dahlia és Dianthus fajokat.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A vírusmentesítéssel kapcsolatos kutatások vezettek a mikroszaporítás felfedezéséhez 1960-ban. A francia MOREL egy orchideafaj, a Cymbidium vírusmentesítése során az izolált merisztémákon olyan szervek (protokormok) kialakulását figyelte meg, amelyek a csírázó orchidea magvakra voltak jellemzőek. MOREL később azt is bebizonyította, hogy ezeknek a protokormoknak a feldarabolásával a Cymbidium szaporítható, mert mindegyik kis darab újabb protokormokat regenerált. Az így szaporított protokormokból a táptalaj módosításával bármikor növényeket tudtak regenerálni. A módszert már a hatvanas évek végén, a hetvenes évek elején az egész világon és hazánkban is széles körben alkalmazták a virágtermelő üzemek. A módszer hazai adaptálója, továbbfejlesztője és terjesztője MARÓTI professzor volt. Az orchideák mellett több száz azoknak a kertészeti, erdészeti és szántóföldi fajoknak a száma, amelyekre mikroszaporítási módszert dolgoztak ki. A primer merisztéma tenyészeteket követően a szaporítás már általában nem a merisztémák átoltásával történik. Legalább olyan jelentőségre tettek szert a hajtástenyészetek, amelyek nodális szegmentekkel, járulékos vagy oldalhajtással, vagy a járulékos szervtenyészetek (hagyma, gumó), továbbá a sejt- és embriótenyészetek, amelyek járulékos embriókkal klónozhatók. Mikroszaporítási célból az utóbbi évtizedben speciális kereskedelmi laboratóriumok alakultak az egész világon és hazánkban is. Évente a világon előállított növények száma 1987-ben már meghaladta a 200 milliót, és a század végére elérte az 500 milliót (Európa és Észak-Amerika).

2.1.2. 5.1.2. A zárvatermők apikális merisztémájának anatómiája A zárvatermők csúcsmerisztémáinak felépítésére sokáig a klasszikus tunika-corpus elméletet használták. Ennek lényege, hogy a tenyészőkúp csúcsi részéhez egy jól elkülönülő kerületi merisztématáj, a kizárólagosan antiklinális falakkal osztódó, egy vagy több sejtsoros tunika, s ez alatt a minden irányban osztódó központi merisztéma, a korpusz található. Az elmélet – részben az in vitro merisztématenyésztés eredményeinek hatására – módosult. Eszerint a tunika és a korpusz iniciális anyasejtjeinek csoportján kívül a kétszikűek hajtástenyészőkúpjában további, legalább 5 iniciálissejt-csoport működik (prokambium iniciális, protoderma iniciális, kéreg iniciális, szubprotoderma iniciális és bélsugár anyasejtek), amelyekből a hajtáscsúcs további merisztémazónái alakulnak ki (átmeneti merisztéma, bélmerisztéma, oldalmerisztéma, protoderma és prokambium, 5/2. ábra).

5/2. ábra: Zárvatermők hajtáscsúcs-merisztémájának vázlatos anatómiai ábrázolása. ti – tunika- (protoderma-), iniciális ki – kéreg iniciális, bas – bélsugár-anyasejtek, pk – prokambium, om – oldalmerisztéma, pki – prokambium iniciális, pt – protoderma, km – kéregmerisztéma, bm – bélmerisztéma A belső alaktani elmélet fejlődése tehát egyre jobban közelít az in vitro tenyésztés által felvetett gondolathoz, nevezetesen, hogy az apikális merisztémában hol helyezkednek el az osztódó, illetve az organogén régiók. Ez utóbbi szempontból a zárvatermők hajtásmerisztémája három fő részre osztható (5/3. ábra):



5/3. ábra: Zárvatermők hajtáscsúcs-merisztémájának a szövettenyésztés szempontjából legfontosabb régiói 1 – centrális zóna (merisztéma iniciális), 2 – organogén zóna (oldalmerisztéma), 3 – bélmerisztéma 1. Csúcsi axiális zóna (centrális zóna), amelynek mitotikus aktivitása kicsi, általában vastagfalú, a sejtmegnyúlás fázisában levő vakuólumos sejtekből áll. 2. Oldalmerisztéma, amely apró, citoplazmával telt merisztémasejtekből áll. Ez az ún. iniciális gyűrű (iniciális hélix), amelynek sejtjei intenzíven osztódnak. Az in vitro morfogenezis szempontjából a legorganogénebb területnek tekinthető, egyben a levélprimordiumok organizációs helye is. 3. Bélmerisztéma, amely a centrális zóna alatt helyezkedik el. Ez a terület általában a virágindukcióig inaktív.

2.2. 5.2. Merisztématenyésztés A merisztématenyésztés mint kifejezés – sajnos a szakmai körökben is – a mikroszaporítás szinonimájaként használatos. Ez több szempontból is téves, mert a merisztémakultúra nemcsak mikroszaporításra, hanem vírusmentesítésre, fenntartásra, fagyasztásra és sok más kísérleti célra is használható. Helytelen továbbá azért is, mert a mikroszaporításnak a merisztémakultúrán kívül más módszerei is vannak (hajtástenyésztés, járulékoshajtás-differenciálás, szomatikus embriógenezis stb.). Ma már nem tévedünk, ha azt állítjuk, hogy a mikroszaporítás konkrétan nem is merisztématenyésztést jelent. A merisztématenyésztés nem több, mint néhány mikroszaporítási módszer első lépése (tenyészetek indítása), amelyet a szaporítás során többet nem kell alkalmazni. Ezen indokok alapján a merisztématenyésztés úgy tekintendő, mint a mikroszaporítás, a vírusmentesítés, és a tartós megőrzés céljából létesített tenyészetek indítására alkalmazott in vitro módszer. A nyitva- és zárvatermő növények földfeletti részeinek növekedése a csúcsmerisztémákban lejátszódó osztódások, sejtmegnyúlás és differenciálódás következménye. A merisztéma átmérője átlagosan 0,1 mm, hoszszúsága 0,25–0,3 mm. A növény élete folyamán az első apikális merisztéma az embrióban alakul ki, és általában a növény egész élete folyamán megtartja növekedését és fejlődését. Az apikális merisztémák megtartják továbbá totipotenciájukat is, amely a merisztématenyésztés egyik elvi lehetőségét adja. A másik lehetőség a merisztematikus sejtek feltételezett genetikai stabilitása, amely az identikus klónozás alapja. A merisztématenyésztés a generatív és a vegetatív úton szaporított fajoknál egyaránt alkalmazható módszer, amelynek sikerét a következőkben tárgyalt főbb körülmények befolyásolják. Merisztémaizolálás a) A generatív úton szaporított fajoknál a sterilizált és sterilen csíráztatott magvakból fejlődő 4–5 napos hajtásokból általában 0,2–0,5 mm hoszszúságú apikális merisztémákat kell kipreparálni, steril körülmények között, sztereomikroszkóp alatt. A leggyakrabban használt táptalajok az MS és a B5 szilárd változatai. A hajtásés a gyökérfejlődést különböző komplex serkentőkkel, növekedésszabályozó anyagokkal és a tenyésztési feltételekkel lehet befolyásolni. b) A vegetatív úton szaporított fajoknál, fajtól függően, hajtásmerisztémákat izolálhatunk fejlődő hajtásból (burgonya), hajtás hónaljrügyből (dísznövények), hajtásrügyből (gyümölcsfajok) stb.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A csúcsmerisztéma mérete a tenyésztés kritikus pontja. Az izolálható merisztéma mérete a fajtól és a tenyésztési céltól függ. Vírusmentesítéskor azt a legkisebb méretet kell választani, amelyből még növényt tudunk felnevelni. Ez a méret a manióka esetében 0,2 mm, a szója esetében 0,4 mm. E méretek alatt a merisztémák elkalluszosodnak, illetve csak gyökereket regenerálnak. E méretek felett a hajtás regenerálása általában nem jelent nehézséget. Táptalaj. A legáltalánosabban használt táptalaj az MS és a B5, amelyet 0,6–0,8% agarral szilárdítanak. Azoknál a fajoknál, amelyek viszonylag nagy mennyiségű fenolvegyületet vagy pigmentet választanak ki a táptalajba, folyékony tápoldat alkalmazása célszerű. Ez utóbbi esetben a növekedésserkentők koncentrációit csökkenthetjük. Az optimális pH 5,6–5,8 között van. Növekedésserkentő anyagok. A merisztémák proliferációja, a hajtásfejlődés általában az auxinok és a citokininek megfelelő arányának a függvénye. Mivel az izolátum endogén hormontartalma és annak változása a tenyésztés folyamán nem ismert, az irodalomban javasolt koncentrációk csak megközelítő adatul szolgálhatnak. Ezért most csak felsoroljuk azokat az anyagokat, amelyekkel kedvező eredményeket értek el: naftilecetsav, indolecetsav, indolvajsav, gibberellinsav, benziladenin, zeatin és kinetin. Tenyésztési feltételek. Általánosan a tenyészeteket 26 °C-on, 16 órás megvilágítással, 3000–4000 lux fényintenzitáson inkubálják. A növényregenerációt növelni lehet a hőmérséklet változtatásával. A fényben alkalmazott 20–26 °C-kal szemben sötétben 15 °C-ra célszerű csökkenteni a hőmérsékletet. A hajtásindukciót a kék, a gyökérfejlődést a vörös fény stimulálja.

2.3. 5.3. Rejuvenilizáció A donor növényekről származó merisztémák morfogenetikai potenciálja a növény egyedfejlődésének különböző szakaszaiban, illetve szezonálisan változhat. A szezonalitás a donor növények kontrollált körülmények közötti nevelésével (fitotron) kiküszöbölhető. Az egyedfejlődés korai, intenzív vegetatív növekedési szakaszában az izolált merisztémák általában sokkal jobban regenerálnak, mint a virágzáskori vagy az azt követő szakaszban. Fás növények mikroszaporítása során bebizonyosodott, hogy a teljesen kifejlett (termőre fordult) növényekről izolált tenyészetek lassú növekedést, rossz gyökeresedést és néha eltérő fenotípust is mutatnak. Napjainkban a fás növények mikroszaporításának egyik legnagyobb akadályát a felnőtt korú és termőrefordult fák izolátumainak rossz tenyészthetősége jelenti. A problémát a fák, vagy tenyészetek visszafiatalításával vagy más néven rejuvenilizálásával próbálják megoldani. A fás növények termőre fordulása (maturation) átmeneti folyamatot jelent, mely során a fiatal növényekből termőképes fák lesznek. E folyamat során a fás növényekben morfológiai és fiziológiai változások következnek be, melyek végeredménye a termőképesség (termőre fordulás). Ezek a változások különösen a hajtásmerisztémákban kifejezettek. A Sequoia és Hedera fiatalkori hajtáscsúcsainak – az idős fákkal szemben – kisebb a merisztematikus zónája, a csúcssejtek nagyobbak, a sejtek a hajtáscsúcs egész felületén osztódnak és több levélkezdemény alakul ki stb. A juvenilis fázis – leegyszerűsítve – addig tart, ameddig a növény virágozni nem kezd. A juvenilis szakasz hosszúsága növénycsoportonként különböző. Legrövidebb az egyéves lágyszárú növényeknél és folyamatosan nő a következő sorrendben: évelő lágyszárú növények, cserjék és végül leghosszabb a fák esetében. Biotechnológiai értelemben a rejuvenilizálódás (visszafiatalodás) azt jelenti, hogy az in vitro tenyészetek elveszítik a kifejlett fákra jellemző tulajdonságaikat. Ez a változás azokban a járulékos hajtás-, illetve sejttenyészetekben következett be, melyekben a szaporítást dedifferenciálódás előzte meg. Genetikai szempontból a fák termőrefordulása (maturation), illetve a felnőtt fák visszafiatalítása (rejuvenation) tulajdonképpen csak génexpresszió változást jelent és nem magukban a génekben következik be változás. A génműködés szabályozásának megváltozása viszont nem öröklődő genetikai, hanem epigenetikai módosítást jelent. A dedifferenciálódást majd redifferenciálódást igénylő in vitro technikák esetében az izolátum eredeti sejtjeiben törlődik az izoláláskori génregulációs mintázat. Ezt követően a szomatikus embriógenezisnek, illetve organogenezisnek (járulékos hajtástenyészetek) megfelelő gének kapcsolnak be. Ilyen értelemben egy új élet indul, mely természetesen juvenilisnek tekinthető. Azokban a tenyészetekben viszont, melyekben ezek a folyamatok nem következnek be, mint pl. merisztématenyészet és hajtáskultúra, a ,,maturation” okozta problémák továbbra is fennmaradnak. A növekedési erély rövidebb vagy hosszabb ideig visszaállhat a tenyésztési feltételek és a táptalajhoz adagolt hormonok hatására, de ez a problémát tartósan nem oldja meg.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Összefoglalva, a felnőtt fák izolátumai a tenyészetekben járulékos embriógenezissel (szomatikus embriótenyésztés) vagy járulékos organogenezissel (járulékos hajtástenyésztés) visszafiatalíthatók. Maga a folyamat epigenetikai változást jelent, viszont a tenyésztett sejtek genetikai instabilitása miatt az ilyen típusú tenyészetekben tényleges genetikai változások következhetnek be (lásd szomaklonális variabilitás, 6.1 pont). E két módszert sikerrel alkalmazták a tenyészetek visszafiatalítására az alábbi fajokon (AH=adventív hajtás, SE = szomatikus embrió): Asparagus officinalis AH Betula pendulaA H Brassica spp. AH Cardamine pratensis AH Citrus spp. SE Coffea arabica SE Elaeis guineensis SE Eucalyptus longan SE Hedera helix AH Larix spp. AH Malus domestica AH Musa spp. AH Myriophylium heterophyllum AH Phoenix dactylifera AH Populus ciliata SE Prunus cerasus SE Pyrus communis AH Quercus petraea SE Sequoia sempervirens AH Thuja plicata AH Vitis vinifera SE

2.4. 5.4. A mikroszaporítás módszerei A vegetatív mikroszaporítás fő technikái napjainkra kialakultak és az üzemi technológiák részévé váltak. A steril technikák egyes lépései fajonként, fajtánként, szaporító laboratóriumonként változhatnak, és a kisebbnagyobb eltérések miatt az összkép rendkívül gazdag. Egyes technikai lépések vagy egész technológiák szabadalmakat és know how-kat jelentenek, ezért jórészt titkosak. A könyv terjedelme nem teszi lehetővé, hogy a legfontosabb növénycsoportokra, -fajokra kidolgozott módszereket részletesen ismertessük. A következőkben a legújabb összefoglaló munkákat soroljuk fel, amelyekben ezek megtalálhatók: Vasil (1984), Conger (1986), Whithers és Anderson (1986) Green et al. (1987), Bajaj (1991, 1992 a,b,c, 1997a,b).


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Bármilyen növénycsoporttal, illetve fajjal is dolgozunk, a mikroszaporítás négy jól megkülönböztethető tenyésztési eljárásra alapulhat és ötféle módon történhet (5/4. ábra).

5/4. ábra: A mikroszaporítás módszereinek csoportosítása a szaporításra használt izolátum alapján Hajtástenyészetek. Általában merisztéma izolálással indulnak, és a szaporítást az in vitro fejlődött hajtásokon kialakult hónaljrügyekkel, illetve a fejlődő hajtásokkal végzik. Járulékos hajtástenyészetek. A növény szöveteinek izolálásával indulnak, a szaporítás – kalluszfázison keresztül – a differenciálódó hajtásokkal vagy oldalhajtással történik. A járulékos szervtenyészetek általában valamilyen primer hajtástenyészetből indulnak. A cél a járulékos szervek differenciálódása (pl. gumó, hagyma stb.), melyekkel a szaporítás történik. Szomatikus embriógenezis. A növény szöveteinek, sejtjeinek tenyésztésével indul. A szaporítást a sejtszuszpenzióban indukált és fejlődött szomatikus embriókkal végzik. A következőkben a hajtástenyésztést, a járulékos hajtás- és szervtenyésztést mutatjuk be. A szomatikus embriógenezist a Mesterséges mag (5.9) c. fejezetben részletezzük.

2.4.1. 5.4.1. Hajtástenyésztés A hajtástenyészet általában gyökér nélküli hajtások növekedését és fejlődését jelenti táptalajon, steril és kontrollált feltételek között. Az izolátumok merisztémáiból közvetlenül hajtások fejlődnek. A mikroszaporítás a tenyészetekben fejlődő hajtásokon, illetve az azok levélhónaljában differenciálódó rügyeken alapul. A hajtástenyészetek legfontosabb jellemzője, hogy a tenyésztés folyamán a hajtások normális növekedését tartjuk fenn, illetve serkentjük. Tehát nincs de-, illetve redifferenciálódás. Napjainkban a hajtástenyésztés és a mikroszaporítás az in vitro génbank legáltalánosabban használt módszerévé vált, mind a kertészeti (dísznövények, gyógynövények és burgonya), mind az erdészeti fajok között. Néhány fontosabb nemzetség a


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA következő: Anthurium, Chrysanthemum, Dianthus, Fuchsia, Gerbera, Gloxinia, Phlox, Saxifraga, Allium, Asparagus, Rheum, Fragaria. Inokulum A hajtástenyészeteket általában merisztémát tartalmazó explantátumokból (embrió, mag, hajtáscsúcs, nódusz) indítjuk. A magvak steril csíráztatása során fejlődő hajtásokat, illetve csíranövényeket általában a hipokotilnál, illetve az epikotilnál vágjuk el és helyezzük táptalajra. A hajtáscsúcsból vagy hónaljrügyből a merisztémákat kell kipreparálni; méretük elérheti az 5 mm-t is. A ,,természetes” izolátumok mellett létesíthetünk hajtástenyészeteket olyan in vitro kultúrákból is, amelyekben embriók, illetve hajtáscsúcsok differenciálódtak. Ez utóbbiak szolgálhatnak a hajtástenyészetek kiinduló izolátumaként. Táptalaj és tenyésztési feltételek A hajtástenyészetek leggyakoribb táptalaja az MS, de jó eredményeket értek el a White, LS-, B5-, N6 és SHtápközegekkel is. Az általánosan használt kiegészítések a tiamin és a mezoinozit. Az inkubáció átlagos jellemzői: 8000 lux, 16 órás megvilágítás, 18–30 °C-os hőmérséklet. Szaporítás A szaporítás az in vitro fejlődött hajtásokkal, oldalhajtásokkal, illetve azok hónaljrügyeit tartalmazó nodális szegmentekkel történik. Az átoltások gyakorisága 3–5 hét, amely a szaporítási ciklusban 10 napra is csökkenhet. Fás növényeknél a csúcsdominanciát meg kell szüntetni ahhoz, hogy a hónaljrügyek kihajtsanak, majd a szaporítást a fejlődött oldalhajtások átoltásával végzik. Genetikai szempontból a változások valószínűsége a hónaljrügyek és a hónaljhajtások esetében a legkisebb, tulajdonképpen a spontán rügymutáció szintjén tartható. A veszélyt a hajtástenyészetek alapi részén kialakuló interkaláris kallusz jelentheti. Az ezekből regenerálódott ,,járulékos” hajtások genetikai azonossága – a kalluszsejtek genetikai instabilitása miatt – már megkérdőjelezhető. A genetikai változások bekövetkezésének valószínűsége a tenyészetek öregedésével növekszik. Az a tény, hogy a tenyészetekben a hajtások és a levelek morfológiája jelentősen eltérhet a faj-, illetve a fajtabélyegektől, önmagában nem jelent genetikai változást. E modifikációk általában epigenetikaiak, és az eltérő élettani környezet által meghatározottak. Ezekben az esetekben a növények a kiültetést követő néhány hét után (pl. burgonya) általában már a megfelelő fenotípust mutatják. Ez az idő azonban néha 1–2 év is lehet (pl. szőlő). Gyökereztetés A felszaporított hajtásokat a kiültetés előtt gyökeresíteni kell. Erre azért van szükség, mert az intenzív hajtásfejlődéshez szükséges kiegészítések általában gátolják a gyökerek differenciálódását és növekedését. Sok esetben a gyökeresedés hormonelvonással egyszerűen kiváltható, más esetekben gyökeresítő kiegészítések (pl. naftilecetsav, indolvajsav stb.) szükségesek. Abban az esetben, ha a gyökeresítés sem in vitro, sem in situ nem sikerül, egyetlen megoldás marad, az oltás. Alkalmazás A hajtástenyészet viszonylag egyszerű és megbízható technika, mely a többi módszerhez képest genetikailag a legstabilabb klónozást biztosítja. Az eltérő színű virág megjelenésének gyakorisága a gerbera in vitro növényeiben 1:5000 és 1:500000 között van, genotípustól függően.

2.4.2. 5.4.2. Járulékos hajtástenyésztés A járulékos hajtástenyészetek annyiban térnek el a klasszikus hajtástenyészetektől, hogy a hajtásregenerálódás nem az eredeti inokulumokból, hanem a belőlük fejlődött kalluszból történik. Szomatikus növényi tenyészetekben a tenyésztett sejtekből, szövetekből a növényregenerálásnak kétféle alternatív útja lehet, az organogenezis és az embriógenezis. Elvben mindkettő felhasználható mikroszaporítási célokra. A járulékos hajtástenyészetek organogenezissel alakulnak ki.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Az organogenezis a növényregenerálás leggyakoribb útja, amely nemcsak izolált sejtből, hanem különböző szervekből és szövetekből is indukálható. A mikroszaporítási felhasználás szempontjából a járulékos hajtásfejlődésre alapozott technika a meghatározó, amely a következő főbb szakaszokra osztható: − a hajtáscsúcs differenciálódásának indukciója; − a hajtáscsúcsok fejlődése és sokszorozódása; − a hajtások gyökereztetése. Természetesen a különböző fajok és felhasználási célok alapján jelentős eltérések lehetnek a módszerekben, ezért az általános érvényűeket ismertetjük. Inokulum Tulajdonképpen a növények minden olyan része használható inokulumként, amely merisztéma-, kambiális, parenchima- stb. szövetet tartalmaz. A leggyakrabban használt izolátumok a következők: levél-, szár- vagy gyökérszegmentum, virágrészek, embriók, sziklevél, epikotil, hipokotil stb. Minél fiatalabbak ezek a szervek, annál könnyebb a szervdifferenciálódás indukciója. A tenyészetek indításának kritikus pontja a sterilitás. Ennek biztosítása azért is nehéz, mert általában viszonylag nagy és in situ fejlődött, tehát ,,fertőződött” növényi részeket kell sterilen táptalajra helyezni. A különösen nehezen sterilizálható részeket célszerű rövid ideig antibiotikumot, illetve fungicidet tartalmazó táptalajon tenyészteni. Kórokozókkal (vírus, baktérium, gomba) fertőzött izolátum esetén a tenyészetek is vírusfertőzöttek lesznek, ezért a mentességre, illetve mentesítésre különösen kell ügyelni. Táptalaj A leggyakrabban használt táptalajok közül a legrégebbiek, a White-1943, Heller-1953, továbbá a megnövelt sókoncentrációjú MS és annak különböző módosított változatai, így a B5 és az SH érdemelnek említést. Az organogenezis sikeres indukciója és a hajtások normális fejlődése céljából a táptalajoknak tartalmazniuk kell: − makro- és mikroelemeket (MS, B5); − szén- és energiaforrást (szacharóz 2–4%) ; − vitaminokat (tiamin, nikotinsav, piridoxin stb.) ; − redukált formájú nitrogént (kazeinhidrolizátum, glutamin, adenin stb.); − növekedésserkentőket és -gátlókat (2,4-diklórfenoxi-ecetsav, naftilecetsav, indolecetsav, indolvajsav, benziladenin, kinetin stb.); − komplex kiegészítéseket (pl. kókuszdiótej 2–15%). Az eddigi tapasztalatok azt bizonyítják, hogy a járulékos hajtásfejlődésre legnagyobb hatással a növényi hormonok vannak. A vizsgált növényfajok csaknem 75%-ában a hajtásdifferenciálódást a citokininek (kinetin és benziladenin) 0,05–46 µM-os, az auxinok (indolecetsav, naftilecetsav) 0,06–0,27 µM-os koncentrációtartományában lehetett sikeresen indukálni. Az egyszikű növények hajtásindukciójához általában kisebb citokinin koncentráció szükséges. Különböző fajoknál sikerrel használták a purinokat, a pirimidineket, az ureát, a gibberellinsavat, abszcizinsavat, fólsavat stb. a hajtásdifferenciálódás kiváltására, illetve fenntartására. A fejlődő hajtások gyökereztetéséhez általában az indolvajsav és a naftilecetsav használható sikerrel. Exszudátumok okozta nekrózis Számos zárvatermő faj izolátuma megbarnul, vagy belőle nagy mennyiségű exszudátum diffundál a táptalajba. Ennek gyakori következménye az izolált szövet részleges vagy teljes elhalása. Ez a probléma a következő módszerekkel küszöbölhető ki: – az explantátum izolálás előtti áztatása antioxidánsok (aszkorbinsav, citromsav, cisztein, glicin) oldatában; 100 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA – a táptalaj kiegészítése egy vagy több antioxidánssal 1 µM – 10 mmol koncentrációban, amelyet a tenyésztés folyamán az izolátumok rendszeres átoltásával folyamatosan csökkentünk; – a tenyésztés elején a táptalaj kiegészítése aktív szénnel (3%), amelyről az izolátumokat aktív szénmentes táptalajra kell átoltani, mivel a táptalaj néhány fontos komponensét (cukor, hormon) is megköti. Ennek ellenére néhány fajnál állandó kiegészítésként, kis koncentrációban alkalmazott aktív szénnel jelentősen serkenthető a járulékos szervek fejlődése; – folyékony táptalaj használata és gyakori cseréje. Tenyésztési feltételek Leggyakrabban 0,6–1% agarral szilárdított táptalajt használnak. A folyékony táptalaj általában lassú rázatást igényel, és pH-ja alacsonyabb (5,0) a szilárd változat pH-értékénél (5,8). A tenyészetek nagy relatív páratartalmát és a bizonyos mértékű folyamatos steril légcserét általában nem nehéz elérni a megfelelő záró eszközök (vatta, alumíniumfólia, parafilm, háztartási fólia, műanyag tető stb.) felhasználásával. Célszerű azonban a tenyésztőhelyiségben – a fertőzések kiküszöbölése végett – száraz légteret biztosítani. A különböző gázok (etilén, széndioxid, acetaldehid) koncentrációjának növekedése a tenyészetekben – megfelelő gázcsere hiányában – általában gátolja a morfogenezist. A megvilágítás nagyon fontos tényező, különösen a szervdifferenciálódás időszakában. A gyökérfejlődéshez és a kallusztenyésztéshez vagy sötét, vagy gyenge világítás (néhány száz lux) szükséges. A többi tenyészet általában igényli a megvilágítást. Hatása függ az erősségtől, az időtartamtól és a spektrális összetételtől. Az organogenezis folyamán 1000–3000 lux, a hajtástenyészetek edzésekor 3000–10 000 lux fényerősség a célszerű. Általában megfelelő a 16 órás megvilágítás. A fény minősége annál jobb, minél jobban megközelíti a természetes fény összetételét. A kék tartomány inkább a differenciálódási folyamatokat, a vörös pedig a megnyúlást serkenti. A tenyésztés optimális hőmérséklete fajonként és a tenyésztés céljától függően változik, általában 20–30 oC között van. Szaporítás A járulékos hajtásokkal, oldalhajtásokkal, vagy egy- esetleg többrügyes hajtásdarabbal történik, hasonlóan a klasszikus hajtástenyészetekhez. A genetikai megváltozás nagyobb valószínűsége a járulékos hajtásfejlődésre alapozott szaporítás során a következőkkel magyarázható. Az organogenezis sejtszinten redifferenciálódást jelent. Ahhoz, hogy a redifferenciálódást indukálni lehessen, differenciálatlan sejtekre van szükség. Az izolátumban tehát először dedifferenciálódásnak kell bekövetkeznie. A dedifferenciálódás, a differenciálatlan sejtes állapot és a redifferenciálódás folyamán pedig gyakoriak a genetikai változások. Növényregenerálás Az organogenezis az egyik leggyakoribb formája a növényregenerálásnak. Napjainkban talán az ezret is elérte azoknak a fajoknak, genotípusoknak a száma, amelyeknek szomatikus szövetéből, szervéből járulékos hajtásfejlődéssel növényt regeneráltak. Ezekre az eredményekre a gyakorlati alkalmazás ismertetésekor még visszatérünk. Részletes faj- és fajtaszintű felsorolások a dísznövényekre, a gyümölcsfajokra, a zöldség- és szántóföldi növényekre, továbbá az erdei fás növényekre vonatkozóan CONGER (1986) és JÁMBORNÉ (1993) összefoglaló munkájában találhatók.

2.4.3. 5.4.3. Járulékos szervtenyészetek A járulékos szervtenyészetek mint másodlagos tenyészetek a hajtástenyészetekre alapulnak. A szervek egy része ugyanis módosult hajtás, tehát in vitro is csak hajtások felhasználásával indukálható. A szaporítás az in vitro fejlődött szervekkel (protokorm, hagyma, gumó) történik. A legismertebb így szaporított fajok az orchideák, a fokhagyma és a burgonya. Protokorm tenyészet


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A mikroszaporítás története tulajdonképpen a járulékos szervek in vitro differenciálásával kezdődött. Az orchideák mikroszaporítása folyékony táptalajban fejlődött protokormokkal történt és történik. A protokorm tulajdonképpen sok rügyet, rügykezdeményt tartalmazó aggregátum, mely folyékony tenyészetben differenciálódik. A szaporítás a protokormok feldarabolásával és tenyésztésével történik. Végül a protokorm rügyeiből szilárd táptalajon hajtások fejlődnek. Abból a célból, hogy a folyékony tenyészeteken ne fejlődjenek hajtások vagy levelek, célszerű a táptalajba növekedésgátlókat adagolni. A protokorm-típusú mikroszaporítás kivitelezhető bioreaktorban is, mellyel jelentős költségmegtakarítás érhető el (pl. Gladiolus). Mikrogumó előállítás A burgonya mikrogumó differenciálódás folyamata és technikája a 3.5.2 fejezetben ,,A járulékos szervek differenciálódása” cím alatt került bemutatásra. Ezért itt csak a mikroszaporítási alkalmazására térünk ki. A mikrogumóval (1 cm átmérő) való szaporítás előnyei a következők: • a mikrogumók bármikor előállíthatók, • kórokozómentes inokulum esetén garantáltan kórokozómentes szaporítást biztosít a visszafertőződés veszélye nélkül, • a mikrogumók hónapokig tárolhatók és • könnyen szállíthatók. Mikrohagyma előállítás A hagyma differenciálódást a fokhagyma tenyészetek 4-6 hónapos hidegkezelésével (4 oC) lehet kiváltani. A hagymák kialakulása a fokhagyma hajtástenyészetekben általában a tenyésztés 2–15. hónapjában következik be. Optimális tenyésztési feltételek esetén ez az idő 2–4. hónapra csökkenthető. A hagymák fejlődését a magasabb hőmérséklet (25 oC), erősebb megvilágítás és nagy szacharóz koncentráció (12%) is gyorsítja. A növényi növekedésszabályozóknak nincs hatása az indukcióra, velük a fejlődő hagymák mérete és száma befolyásolható. Az in vitro fejlődött hagymák nyugalmi periódust igényelnek. A kisebb hagymák (150 mg alatt) 1 hónapos, 4 o C-on való tárolás után is csíráztak. A 150 mg feletti hagymák nyugalmi periódusának megszakítása 2 hétig 35 o C-on, 2 hétig 20 oC-on, majd 4 hétig 4 oC-on való tartással érhető el. Az in vitro hagymákkal való szaporításnak a vírusmentes fokhagyma szaporítóanyag tömeges előállításában van jelentősége. Előnye, hogy közvetlenül vethető a földbe, mert nem igényel akklimatizációt. Az in vitro hagymával a szántóföldi termelés ezért olcsóbb, mint in vitro növényekkel. A hagyományos technológiával szemben hátránya az, hogy az in vitro fejlődött hagymák kisebbek, mint a kereskedelmi szaporításban használatosak és előállításuk drágább. Ezért üzemi felhasználásuk a következő években nem várható.

2.5. 5.5. Kórokozó-mentesítés A kórokozó-mentesítés fertőzött növényekből vírus-, baktérium- és gombamentes növények előállítását jelenti hagyományos (hőkezelés, kemoterápia) és biotechnológiai (merisztématenyésztés) módszerekkel, illetve azok kombinált felhasználásával (5/5. ábra).



5/5. ábra: Kórokozó (vírus) mentes növény előállításának módszerei Az egészséges növényanyag előállítása különösen a vegetatív úton szaporított szántóföldi (burgonya, csicsóka), kertészeti (gyümölcsfajok) és erdészeti fafajok esetében általában nehézségekbe ütközik. Ennek oka, hogy a kórokozók a fertőzött növények szaporításra használt vegetatív részeiben is jelen vannak. Tehát klónjaik elvben 100%-ban fertőzöttek lesznek, ami jelentős terméskieséssel járhat. Ezért különös jelentőségű a szaporítás kiinduló anyagául szolgáló növények vírus-, baktérium- és gombamentesítése és a mentesség pontos diagnosztizálása. A maggal szaporított növényeknél, az esetek többségében ez azért nem olyan nagy horderejű probléma, mert az ismert vírusok többsége maggal nem terjed. Ez azt jelenti, hogy a vírusfertőzött növények magjaiból kelt csíranövénykék nagy valószínűséggel vírusmentesek lesznek. Természetesen ez a probléma nem újkeletű, és ennek megfelelően megoldására különböző technikákat (pl. hőterápia) dolgoztak ki és alkalmaztak. A biotechnológiai mentesítési és diagnosztizálási technikák áttörést jelentettek és jelentenek e területen. Felhasználásukkal lehetővé válhat vírusmentesítési nemzeti programok realizálása a legfontosabb fajoknál, törzsanyagok, törzsültetvények kórokozó-mentesítése, kórokozómentes felszaporítása, a kórokozómentes nemzetközi szaporítóanyag-kereskedelem stb. A kórokozó-mentesítés két fő területre osztható, mentesítésre és diagnosztizálásra. Mivel a diagnosztizálás kivitelezése nem tartozik a biotechnológiai eljárások közé, ezért azokkal e könyvben nem foglalkozunk. A mentesítés technikái a kórokozók eltávolítását, a diagnosztizálás technikái pedig a mentesség, illetve a fertőzöttség pontos meghatározását teszik lehetővé a kórokozó detektálásával és azonosításával.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A mentesítés módszerét tulajdonképpen különböző vírusokra dolgozták ki, ezért a közhasználatban a vírusmentesítés kifejezés terjedt el. A vírusmentesítés nagy valószínűséggel baktérium- és gombamentességet is jelent, tehát teljes kórokozó-mentességgel járhat. A növényeket károsító vírusok egy része nem okoz tüneteket, és a jelenlegi módszerekkel nem mutatható ki. Tehát amikor vírusmentességről beszélünk, az mindig az ismert vírusoktól való mentességet jelenti. Szakmai szempontból talán helyesebb lenne ezért a vírusmentes kifejezés helyett a vírustesztelt növények terminológiát használni. A vírusmentesség nem jelent immunitást a vírusokkal szemben. A mentesített állomány ellenállóképessége, illetve fogékonysága a kórokozókkal szemben e módszerek hatására elvben nem változik. Azért csak elvben, mert előfordult, hogy a vírusmentes növények fogékonyabbá váltak a gombás fertőzésekre. A burgonya esetében megfigyelték, hogy az X- és Y-vírustól mentes állományban a gumók Fusarium-ellenállósága csökkent a vírusfertőzöttekéhez képest. A vírusmentesítés módszerei A jelenleg alkalmazott terápiákat a hőkezelés, a merisztématenyésztés, az antivirális anyagok, illetve ezek kombinált felhasználása jelenti.

2.5.1. 5.5.1. Hőkezelés A hőterápia a fertőzött növényeknek, illetve azok különböző vegetatív részeinek inkubációját jelenti a vírusok számára kritikus (36–52°C) hőmérsékleten. Hatására a kezelt anyagokban a vírus részlegesen vagy teljesen eliminálódik, illetve inaktiválódik. A hőkezelés (30 percig 50–52 °C-os vízben) kedvező hatásáról elsőként cukornádnál számoltak be a múlt század kilencvenes éveiben. A 20. század első évtizedeiben sikerrel alkalmazták a módszert különböző gyümölcsfajoknál. Ebben az időben bizonyították be, hogy a rövid ideig tartó 50 °C-os vízben való áztatás helyett eredményesebb, és a növényeket kevésbé károsítja a 35–38 °C-os léghőmérsékleten való hosszabb ideig (2–4 hét) tartó kezelés. Ezek a kísérletek azonban még csak feltételezték a hőkezelés virológiai következményeit. Az első tényleges bizonyítékot a burgonya levélsodródás vírus (PLRV) hőkezeléssel kiváltott inaktivációja jelentette a burgonyagumókban az 1950-es években. Azóta 100-nál is több azoknak a vírusoknak a száma, melyekkel szemben sikeres hőkezelésről számoltak be a világon. Az elmúlt évtizedek kutatásai azonban bebizonyították, hogy hőkezeléssel csak az izometrikus vírusok eliminálhatók, a nem izometrikusak kevésbé vagy egyáltalán nem (pl. dohány–mozaikvírus). A sikeres terápia megfelelő hőmérséklete 35–40 oC között változhat, időtartama pedig néhány naptól néhány hónapig tarthat. A vírusok legkönnyebben a hajtáscsúcsból eliminálhatók. Gyümölcsfajoknál a kezelést követően a hajtáscsúcsokat célszerű gyökereztetni, vagy vírusmentes alanyra oltani. A hagyományos hőterápia tehát eljutott a hajtáscsúcs kezelésig. A kezelt ,,merisztémák” in vitro gyökereztetése, illetve oltása azonban csak a növényfajok egy részénél alkalmazható. Kézenfekvő volt tehát, hogy azt az évszázad második felében a gyorsan fejlődő in vitro technikákkal kombinálják. Ezek közül különösen a merisztématenyésztés jelentett kapcsolódási lehetőséget, amely azonban hőkezelés nélkül is alkalmas bizonyos vírusoktól való mentesítésre.

2.5.2. 5.5.2. Hidegkezelés A hőkezelés eredménytelennek bizonyult a burgonya borsós gumójúságát okozó viroiddal (PSTVd) szemben. Az utóbbi években előrehaladást jelentett az a felismerés, hogy a viroid koncentrációja függ a hőmérséklettől és a fényintenzitástól. Fertőzött burgonyahajtásokban a viroidok mennyiségét sikerült a kimutathatósági szint alá csökkenteni, ha a hajtásokat 3–6 hónapig 5 °C-on nevelték. A teljes elimináció azonban csak akkor volt sikeres, ha a fertőzött növényeket 6 hónapig 5 oC-on nevelték, majd a kezelt hajtásokból merisztématenyészeteket létesítettek. A merisztématenyésztéssel kombinált hidegkezelés végeredményben lehetőséget adott a viroidmentesítésre. A módszer további tökéletesítését jelentheti a jövőben a fényintenzitás csökkentése a tenyésztés során, mert a viroidkoncentráció – hasonlóan a hőmérséklet hatásához – arányban áll a fényintenzitással is.



2.5.3. 5.5.3. Merisztématenyésztés A merisztématenyésztés történetét, fontosabb módszertani kérdéseit, eredményeit az előzőekben már tárgyaltuk. Ezért e helyen csak a vírusmentesítési célból történő alkalmazás speciális kérdéseire térünk ki. WHITE 1943-ban dohány–mozaikvírussal fertőzött, in vitro fejlődő dohány gyökérszegmentumok vizsgálata alapján arra a megállapításra jutott, hogy a tenyészőkúp vírusmentes. Később a hajtástenyészetek hajtáscsúcsain is igazolták ezt az eredményt. Erre alapozva állította fel elméletét a francia MOREL 1952-ben, amely szerint a vírusfertőzött növényekből a hajtáscsúcsok izolálásával és tenyésztésével a kiinduló növényekkel identikus, vírusmentes növények állíthatók elő. Feltételezését dálián sikerült bizonyítania. A merisztémákból fejlődő kis, gyökér nélküli hajtásokat vírusmentes növényekre oltva egészséges egyedeket kapott. Úttörő munkásságát követően a módszer széles körben elterjedt. Azóta bebizonyosodott, hogy minél kisebb merisztémát izolálunk, annál valószínűbb a vírusmentesség. Az ideális méret a 0,1 mm átmérő és a 0,25 mm hosszúság. Ennek az izolátumnak a túlélése és gyökeresedése azonban nagyon csekély, illetve nagy a valószínűsége a kalluszosodásának, ezért a gyakorlatban a nagyobb izolátumok preparálása terjedt el. Az elimináció azonban vírusfüggőséget és fajtafüggőséget mutat. A burgonya – egy levélprimordiumot is tartalmazó – merisztémái a levélsodródásvírustól általában 100%-ban mentesek, 70–80%-uk mentes továbbá az A- és az Y-vírustól, de nem mentesek az X- és S-vírusoktól. Fajtafüggő eliminációt figyeltek meg a szamócánál, a krizantémnál és a szegfűnél. A víruselimináció hatékonyságát befolyásolja még az izolált merisztémák eredete (csúcsrügy, hónaljrügy), a szezonális hatás, a tenyésztési feltételek stb. is. Összefoglalva megállapítható, hogy néhány vírus, mint pl. a burgonya levélsodródás vírusa, amely a merisztémákban nincs jelen, merisztématenyésztéssel is eliminálható. Vannak azonban olyan vírusok, melyek a 0,1 mm-nél kisebb merisztémákban is kimutathatók (pl. burgonya A-, Y-, X- és S-vírus). Ezek egy része szerencsés esetben a tenyésztés során eliminálódhat. Víruselimináció az in vitro tenyésztés folyamán A merisztémaizoláláson alapuló mentesítés a vírusok egyenlőtlen eloszlásán alapul a fertőzött növényekben. Ez a megállapítás azonban a vírusoknak csak egy részére vonatkozik. A 0,1 mm-nél kisebb merisztémacsúcsokban is jelen lévő vírusok eliminációjához más módszerekre van szükség. Az első sikeres eliminációt a burgonya A- és Y-vírusa esetében figyelték meg a hetvenes években. Négyhetes tenyésztést követően elektronmikroszkópos vizsgálatokkal már nem lehetett vírusrészecskéket kimutatni a merisztéma 0,1 mm-nél kisebb csúcsi részében. Ebből arra következtettek, hogy a tenyésztés során a vírus eliminálódott, mely folyamatra jelenleg még nincs egyértelmű magyarázat. Feltételezik, hogy maga az explantátum termel inaktiváló anyagot, de nem zárható ki a táptalaj egyes komponenseinek hatása sem. A jelenleg elfogadott nézet szerint a rendkívül kicsi merisztémákban az izolálás és a tenyésztés hatására a sejtek anyagcsere- és növekedési folyamatai megváltoznak. Ennek lehetséges következménye, hogy a vírus replikációjához szükséges feltételek módosulnak a sejtekben, ami a vírus szaporodásának gátlását eredményezheti.

2.5.4. 5.5.4. Kemoterápia A vírusokat szelektíven pusztító vegyületek jelenleg nem állnak a mezőgazdaság rendelkezésére. A különböző vírusok megjelenése és terjedése ezért is jelent különös veszélyt. A kemoterápia a fertőzött növényekben antivirális vegyületekkel próbálja a víruskoncentrációt csökkenteni, illetve a vírusok teljes eliminációját elérni. Az antivirális vegyületek széleskörű felhasználásának jelenleg az a legnagyobb akadálya, hogy általában magát a növényi sejtet, illetve annak anyagcserefolyamatait is károsítják. Mivel a vírusok tulajdonképpen nukleinsavból (DNS, RNS) és fehérjéből állnak, az antivirális anyagok nem hathatnak másra, mint a nukleinsavakra vagy a fehérjékre, illetve ezek szintézisére. A használt vegyületek, a 8-azaguanin (purinanalóg), 5-fluorouracil és 2-tiouracil (pirimidin-analógok), a para-fluorofenilalanin sajnos nem vírusspecifikusan hatnak a sejtben lévő makromolekulák szintézisére. Magától értetődő, hogy a vírusszintézis gátlásával egyidejűleg a növényi sejt anyagcserefolyamatai (nukleinsav- és fehérjeszintézis) is jelentősen károsodnak.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A nyolcvanas években előrelépést jelentett egy szintetikus ribozidnak (nukleozid analóg), a virazolnak vagy más néven ribavirinnek az alkalmazása. Sterilen szűrve, 205 µM-os koncentrációban alkalmazva a fertőzött burgonyamerisztémák táptalajában, a 100%-os fertőzöttséget 9-29%-ra sikerült csökkenteni az X-, Y-, S- és Mvírusok esetében. Annak ellenére, hogy a virazol hatásával és alkalmazásával kapcsolatos néhány éves eredmények még ellentmondásosak, annyi bizonyos, hogy sikeres kezelés esetén a vírusok viszonylag széles spektrumára hat.

2.5.5. 5.5.5. Kombinált kezelés Továbbra is a burgonya példánál maradva, folytassuk ott a vírusmentesítést, hogy a burgonyán – mai ismereteink szerint – legalább 23 vírus és viroid okoz betegséget. Ezek közül a levélsodródás vírus (PLRV) hőkezeléssel, az A- és Y-vírus pedig 0,3 mm-nél kisebb merisztémák izolálásával és tenyésztésével eliminálható. Önmagában azonban egyik módszer sem alkalmas az X- és S-vírusok eliminálására. A fertőzött hajtások 4-6 hetes hőkezelését követően, a hőkezelt hajtásokból izolált merisztémák tenyésztésével viszont ezektől a vírusoktól és egyéb hőrezisztens törzsektől mentes növényeket lehetett előállítani. A kombinált alkalmazás kedvező eredménye azzal magyarázható, hogy a hőkezelés ideje alatt a vírus szaporodása lelassul, illetve gátolt. A növény azonban – ha lassan is – de tovább nő. Ennek következményeként a hajtásmerisztéma nagyobb (0,3–0,6 mm) része lesz vírusmentes. Ilyen méretű merisztémák már könnyen izolálhatók, és táptalajra helyezve kalluszosodás nélkül, 50–80%-os túléléssel intakt növénnyé nevelhetők. A kombinált kezelés gyakorlati kivitelezése során a hőkezelésre általában gyökeresített, intenzíven fejlődő hajtásokat használunk. A hőkezelést klímakamrában célszerű kivitelezni, ahol napi 16 órán át, 36 oC-ot és 2000– 4000 lux megvilágítást, majd 8 órán keresztül megvilágítás nélkül 33 oC-ot kell biztosítani 6-8 héten át. A 2–3. héten a kezelt hajtások csúcsát célszerű eltávolítani az oldalhajtás-fejlődés serkentése céljából. A 6. héttől az oldalhajtások hónaljrügyeiből a 0,3–0,6 mm-es merisztémák 1–2 levélkezdeménnyel izolálhatók. Táptalajként az MS kisebb módosítással használható. A merisztémákból fejlődő hajtások in vitro továbbszaporíthatók és gyökeresedés után üvegházba kiültethetők. A vírusmentességet természetesen vagy az in vitro tenyészetekben vagy az üvegházban fejlődő növényeken ellenőrizni, pontosabban bizonyítani kell. A különböző vírustesztekben mentesnek bizonyult növények, illetve tenyészetek használhatók fel szaporításra. A vírusmentes hajtástenyészetek éveken keresztül a vírusmentes szaporítóanyag kiinduló bázisai lehetnek egy adott fajta esetében, tehát elég az egyszeri mentesítés. Egy-egy fajta mentesített steril törzsanyagai évi 2–3-szori átoltással a visszafertőződés veszélye nélkül korlátlan ideig fenntarthatók in vitro. Ez adja az in vitro génbankok létesítésének elvi lehetőségét, amit később még részletesen tárgyalunk.

2.6. 5.6. Az in vitro mikroszaporítás technológiája A mikroszaporítás üzemi technológiája – figyelemmel a szaporítás módjára – az alábbi főbb lépésekből és fázisokból áll: 1. Anyanövények kiválasztása • Fajtaazonos, egészséges legyen. 2. Anyanövények vizsgálata • A kórokozómentességet megfelelő módszerekkel tesztelni kell; • Fertőzöttség esetén a kórokozót azonosítani kell; • Szükség esetén kórokozómentesíteni kell (pl. vírusmentesítés). 3. Steril törzstenyészetek létesítése • Izolátum sterilizálása és átoltása táptalajra; • Az izolátumokban látens formában előforduló kórokozók azonosítása, mentesítése; • A primer tenyészetekből a molekuláris azonosításhoz szükséges DNS mintázat (RFLP, AFLP stb.) készítése. 106 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 4. A törzstenyészetek fenntartása • Minimális tenyésztési feltételek biztosítása; • Genetikai stabilitás biztosítása; • Genetikai azonosság ellenőrzése; • Visszafertőződés megakadályozása. 5. Steril mikroszaporítás • Átoltások és tenyésztési ciklusok ismétlése annyiszor és addig, amíg a kívánt mennyiségű szaporítóanyagot elő nem állították; • Újrafertőződés megakadályozása; • Fertőződés esetén antibiotikummal a kórokozó visszaszorítása. 6. Előkészítés a kiültetésre • A tenyésztés fizikai paramétereinek (erősebb megvilágítás, csökkentett citokinin és cukor koncentráció) módosítása, a hajtásmegnyúlás segítése, fotoauxotróf tenyészetek előállítása; • Gyökeresítés in vitro; • Szaporítóanyagok postázása (ha szükséges). 7. Kiültetés, ex vitro nevelés • Edzés, szoktatás (akklimatizáció 4-8 hét) üvegházban; • Takarás (kevés fény, nagy páratartalom, magas hőmérséklet); • Ex vitro szaporítás, miután a fotoszintézis normális, az új gyökerek működnek, kialakul a viaszréteg a levéllemezen és a sztómák működése is normális. A technológia kritikus pontjai: • Az anyanövény, illetve a törzstenyészet nem kórokozómentes (garantáltan és hivatalos dokumentumokkal nem alátámasztott). • A törzstenyészetek fenntartása során véletlen csere (rossz átoltás, hibás címkézés) történik. • A fenntartás vagy a mikroszaporítás fázisában baktériumos vagy gombás fertőzés következik be. • A szaporított hajtástenyészetek nem gyökeresednek. • A kiültetéskori túlélési százalék alacsony.

2.7. 5.7. Az üzemi mikroszaporítás gazdasági jelentősége A világon 600–700 millió növényt állítanak elő évente in vitro. Ennek okai a mikroszaporítás előnyeiben keresendők, természetesen nem elhallgatva a hátrányokat.

2.7.1. 5.7.1. A steril mikroszaporítás előnyei • Helyigénye kicsi, mert a szaporítás az in vitro növények különböző részeivel, illetve sejtjeivel történik. • Hatóságilag igazolható kórokozómentes végtermék állítható elő, mert a törzstenyészetek kórokozómentes anyanövényekről származnak.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA • Nincs visszafertőződés, mert a szaporítás és a törzstenyészetek fenntartása steril, kondicionált körülmények között történik. • Azonos minőségben reprodukálható, mert a tenyésztés és mikroszaporítás folyamata szabályozott feltételek között történik. • Évszaktól és éghajlattól független, mert a mikroszaporítás steril, kondicionált és irányított körülmények között történik. • Folyamatos előállítást tesz lehetővé, mert az in vitro törzstenyészetekből a szaporítás bármikor elindítható. • Új fajok vegetatív szaporítása válhat lehetővé, melyek a hagyományos módszerekkel nem voltak klónozhatók. • Új genotípusok (GM növények) felszaporítását teszi lehetővé, változatlan formában. • A folyamat gépesíthető és automatizálható, mert a rendszer folyamatosan ismétlődő elemekből áll. • Gyors szaporítást jelent, különösen a fás növények esetében. • A felszaporított tenyészetek könnyen szállíthatók (pl. repülővel).

2.7.2. 5.7.2. A steril mikroszaporítás hátrányai 1.Fertőződés léphet fel ami az egész szaporítási folyamatot tönkreteheti. 2.Szomaklonális variabilitás jelentkezhet: a szaporított növényanyag, vagy annak egy része genotípusában eltér a kiinduló fajtától. 3.A kiültetéskori veszteség nagy, mert általában kidolgozatlan a gyökeresítés, edzés és az akklimatizáció. 4.Nagy az előállítási költség, mert a módszer intenzív laboratóriumi munkán alapul. 5.Specializált laboratóriumi feltételeket igényel: steril, kontrollált körülmények. 6.Képzett munkaerőt igényel: izolálás, sterilizálás, átoltás stb.

2.7.3. 5.7.3. Üzemi mikroszaporítás a világon és hazánkban A magasabbrendű növények mikroszaporítása MOREL 1960-as közleményével, az orchideákkal kezdődött, aki lehetségesnek tartotta egy hajtáscsúcsból – járulékos merisztéma-differenciálódás indukciójával - 1 év alatt 4 millió Cymbidium növény előállítását. Felfedezését követően már az 1960-as években számos üzemi laboratórium alakult, főleg az orchideák szaporítására. Az elméletileg előállítható növények száma azóta óriási mértékben növekedett. Burgonya nodális szegmentummal való szaporításának kidolgozásakor havi tízszeres szaporítási rátát értünk el, amely elvileg egy év alatt 10 milliárd növény előállítását teszi lehetővé. Természetesen ilyen nagyságrendű üzemi realizálás nehezen képzelhető el, és nincs is rá szükség. Bizonyítja azonban, hogy az in vitro módszerek elméletileg milyen léptékű szaporítást tennének lehetővé. Évente a világon az in vitro előállított orchideák száma 20–30 millió között van. Természetesen az orchideák mellett számos más növény vegetatív mikroszaporítását és annak nagyüzemi technológiáját is kidolgozták (5/6. ábra). Az 1987-es párizsi biotechnológiai kiállítás szakembereinek véleménye szerint a világon évente csaknem 300 millió palántát állítottak elő steril klónozással.



5/6. ábra: A vírusmentes burgonya szaporítóanyag előállítás – biotechnológiai módszerekre alapozott – technológiájának fő lépései A vegetatív mikroszaporításra specializálódott biotechnológiai laboratóriumok, cégek száma gyorsan növekszik a világon. A nemzetközileg jegyzett kereskedelmi laboratóriumok száma 1986-ban 130 körülire volt tehető, kapacitásuk százezertől néhány millió növény volt évente. Az európai országok közül Nagy-Britannia, Franciaország, Belgium, Olaszország, Hollandia rendelkezik a legnagyobb kapacitású laboratóriumokkal. Egy francia laboratórium 70 milliós nagyságrendet ért el a nyolcvanas évek közepén. Az üzemi laboratóriumok éves teljesítményét azonban ma már nemcsak azok kapacitása – mert az bővíthető –, hanem a piac igénye is meghatározza. Többmilliós kibocsátás már nemzetközi piackutatást és a termelőfolyamat automatizálását igényli. Európában, ahol Morel professzor is dolgozott, a 60-as években a Cymbidium-mal kezdődött az üzemi termelés. A hetvenes évek elején még csak 1–4 millió növényt állítottak elő, viszont 1979-ben a holland, belga, francia és német fejlesztéseket követően már 20 milliót. A fejlődés az 1990-es évek elejéig gyors és folyamatos volt. Az EU termelés ekkor elérte az évi 230 milliót, melyből csak Hollandia évi 100 milliót állított elő. A századfordulón a legnagyobb tömeget az élelmiszernövényekből (100 millió), a gyümölcsfajokból (300 millió) és a dísznövényekből (25 millió) állítanak elő. A 90-es évek második felében azonban csökkent a termelés Hollandiában és Németországban, mivel megjelentek az új indiai és dél-afrikai laboratóriumok termékei a piacon. Az Egyesült Államokban is az orchideákkal kezdődött a mikroszaporítás az 1960-as években. Jelenleg évente körülbelül 100 kereskedelmi laboratóriumban 120 millió növényt állítanak elő. Az USA 26 államában működik üzemi méretű laboratórium, melyek közül Florida foglalja el a vezető helyet évi 6 millió feletti növénykibocsátással. Államonként átlagosan 5–10 kereskedelmi labor működik. Ezek 10%-a évi 2,5–6 millió, 30%-a évi 0,5–2,5 millió és 60%-a az évi 0,5 milliónál kevesebb növényt állít elő. Az éves termelés 50%-át (63 millió) a dísznövények jelentik, az üvegházi növények, gyógynövények, cserjék és fák, zöldségnövények és végül a gyümölcsfajok együttesen jelentik a másik 60 milliót. A Közel-Keleten évente 23 millió növény előállításához elegendő laborkapacitás létesült a 80-as években, melyből 20 milliót izraeli laborok jelentenek. Az arab országokban a növényfajok közül a datolyapálma a


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA meghatározó. További fontosabb fajok a banán, szamóca, burgonya, pisztácia és a rózsa. Az izraeli mikroszaporítás meghatározó fajai a szegfű, krizantém és a gladiólusz. Indiában az elmúlt 10 évben 105 laboratórium létesült, évi körülbelül 200 milliós kapacitással, főleg fásszárú növények szaporítására. A termelésben és a kereskedelemben tehát megindult a verseny a nemzetközi piacokért. E folyamat során lassan kiemelkednek a vezető kereskedelmi laboratóriumok, amelyek vagy saját nemzetközi hálózatot építenek ki, vagy integrálódnak a különböző világkereskedelmi cégekhez. A módszer széleskörű, gyors gyakorlati alkalmazását és terjedését megkönnyítette, hogy a technológia uniformizálható, programozható és automatizálható. Komplett kereskedelmi laboratóriumok teljes felszereléssel, technológiával vásárolhatók és telepíthetők az egész világon, Európától Ázsiáig, Afrikától Amerikáig. A technológia bevezethetősége nem az elhelyezéstől, az ország fekvésétől, a termesztett növény fajaitól függ, hanem a szükséges infrastruktúra meglététől. Magyarországon – Maróti professzor munkásságának eredményeként – már a 60-as években megindult az üzemi mikroszaporítási technikák kidolgozása és alkalmazása az orchidea, szegfű, gerbera stb. fajoknál. A napjainkig eltelt időszak (30 év) két szakaszra osztható. Az első szakaszban (1965–90) a dísznövények üzemi mikroszaporítása gyorsan terjedt a tőkeerős mezőgazdasági, valamint kertészeti Termelő Szövetkezetekben, mint pl. Sasad TSz (1968, orchideák stb.), Óbuda TSz (1973, szegfű, gerbera stb.), Szombathelyi Kertész Mg.Tsz (1972, orchidea, bromélia stb.), Rozmaring TSz (1972, szegfű, gerbera, levéldísznövények stb.). Ezeknek a laboratóriumoknak a termelése általában a TSz saját üzemének igényeit szolgálta. A Zöldségtermesztési Kutató Intézetben – a mikroszaporítás kézi munkaerőigényének csökkentésére – FárI Miklós vezetésével dolgozták ki a Propamatic-rendszert, mely automata táptalajfőző, automata táptalaj adagoló (Clonmatic) és gázsterilizátor egységekből állt. Hollandiában 1985-90 között 30 üzem alkalmazta a Propamatic rendszert. A gyümölcstermő-, dísz- és erdészeti növények vírusmentes szaporítóanyagainak előállítása a Kertészeti Kutató Intézetben, 1979-ben kezdődött. A hazai mikroszaporítás (kb. 4–5 millió palánta/év) a Meriklón GT (dísznövény, szőlő, burgonya, gyümölcs) felépülésével és működésével érte el csúcspontját 198088 között. Felszámolásával a hazai mikroszaporítás első szakasza is lezárult. A második szakaszban, 1990-től a mikroszaporítás hazai súlypontja kisebb üzemi laboratóriumokra és magánvállalkozásokra (pl. Flora GMK) helyeződött át (szegfű, gerbera, levéldísznövények stb.). Az előbbiek általában saját felhasználásra az utóbbiak zömében külső megrendelésre (levéldísznövények, vízinövények stb.), illetve exportra (banán, kivi, fás növények, gyümölcsfajok stb.) termelnek. Számuk országosan 30 körüli, éves becsült termelésük 3 millió palánta. A 90-es években lendületet adott a hazai mikroszaporításnak a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen a Jámborné Benczúr Erzsébet által vezetett laboratórium. A Tanszéken a graduális és posztgraduális oktatás mellett számos különböző dísznövény faj mikroszaporítási eljárását dolgozták ki a 90-es években. Az ő érdeme a Magyar Növény-Mikroszaporítók Egyesülete megalakítása 1993-ban.

2.8. 5.8. A mikroszaporítás a XXI. században A kilencvenes években az üzemi mikroszaporítás elérkezett a technológia automatizálásához. Ennek legfontosabb irányát az alábbi megközelítések jelentik.

2.8.1. 5.8.1. Rita tenyésztési rendszer A mikroszaporítás nagyon munkaigényes technológia. Az összes költség 50–80%-át a laborköltség jelenti: főképpen a szilárd táptalaj és azzal járó feladatok. CIRAD-ban (Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement, Franciaország) az 1990-es évek második felében kidolgoztak egy olyan rendszert, mely folyékony táptalajt használ úgy, hogy azzal mindenféle típusú szövettenyésztéses technika kivitelezhető anélkül, hogy a tenyészetek hidratáltakká válnának. A Rita-nak nevezett „szakaszosan tápláló tenyésztő rendszer” (Temporary Immersion System) jelentősége egyszerűségében és praktikusságában van.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A rendszer egy speciális tenyésztő edényen alapul, mely két részből áll. Az alsóban van a tápoldat, a felsőben pedig a tenyésztendő növényanyag. A RITA kapacitása 250 ml és 1,0 l között változhat. A két részt csövek és nyílások kötik össze. A tenyészetek táplálása úgy történik, hogy meghatározott időközönként egy automatizált rendszer túlnyomást létesít. Ennek következtében az alsó részből a tápoldat feljut – a csöveken keresztül felnyomódik – a felső részbe. A nyomás megszűntével a tápoldat magától visszaáramlik az alsó részbe (5/7. ábra).

5/7. ábra: A RITA in vitro tenyésztő rendszer és működési elve (VITROPIC-CIRAD, 1999 nyomán) (részleteket lásd a szövegben) A rendszerre egyszerre több Rita típusú tenyésztőedény kapcsolható. A tenyészetek levegőztetése külön rendszerrel, sterilizált levegővel történik. Az eddigi eredmények rendkívül biztatóak mind a klasszikus hajtástenyészetekkel, mind a járulékos szervtenyészetekkel (pl. gumó) kapcsolatban. A szomatikus embriógenezis esetében kiválóan alkalmas az embriók érlelésére és csíráztatására. A Rita-val emellett jelentősen növelhető a mikroszaporítási ráta, valamint erősebb és egészségesebb növények kaphatók.

2.8.2. 5.8.2. Vitron 501 mikroszaporító robot A robotot 1997-ben Ausztráliában fejlesztették ki, fás növények mikroszaporítására. A robot, mely egy elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukció, 11 külön meghajtott és külön vezérelt egységből áll. Az egységeket 2 db 486-os számítógép irányítja DOS-rendszerben.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A robot gyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő, nodális szegmentumokból. A gyártó For Bio cég a Monsantoval közösen 4 robotot működtet Indonéziában, melyek éves teljesítménye összesen 15 millió növény (eukaliptusz, akác és tikfa).

2.8.3. 5.8.3. Fotoautotróf mikroszaporítás A fotoautotróf tenyésztés bevezetése és térhódítása a XX. század végi heterotróf és fotomixotróf típusú növényi szövettenyésztés egyik legnagyobb módszertani fejlesztése. Lényege, hogy a tenyésztett növények szénforrását a levegőből biztosítják, azaz a táptalaj semmiféle cukrot nem tartalmaz. A táptalaj szervetlen komponenseit is csökkentett, 50%-os koncentrációban használják (fél MS). A fotoautotróf körülmények között tenyésztett nodális szegmentumokból nagyobb levelű, erőteljesebb növények fejlődnek, a hajtások tövénél nem tapasztalható kalluszosodás. A CO2 tartalom és a megvilágítás növelése kedvezően hatott az eukaliptusz, a kávé és a banán tenyészetek friss súly növekedésére, a hajtás hosszúságára, a levélfelületre, a nettó fotoszintetikus rátára, a gyökeresedésre, illetve a kiültetéskori túlélésre. A fotoautotróf körülményeket (CO2 koncentráció és megvilágítás) optimalizálva még jobb eredmények érhetők el. A kávé esetében a levegő 350–450 µmol mol-1 CO2 koncentrációjához képest a CO2 tartalom jelentősen növelhető volt (1450 µmol mol-1), 150 µmol m2s-1 fotoszintetikus foton flux (PPF) megvilágítás mellett is. A megvilágítás erőssége a 400–700 nm-es fotoszintetikus hullámtartományban viszont még jelentősen elmarad a természetes megvilágítástól. Tehát a fotoautotróf tenyészetekben a szénforrás és a fényforrás szabályozásával javítható az in vitro növények fejlődése, minősége, mely jobb túlélést eredményezve csökkenti az in vitro tenyésztés költségeit és javítja versenyképességét más klasszikus szaporítási rendszerekkel szemben. A jövőben tehát nemcsak a mikroszaporítás során, hanem minden növényi szövettenyésztéssel foglalkozó kutató és fejlesztő laboratóriumban is mérni és szabályozni kell e tenyészetekben a CO 2 tartalmat és a páratartalmat, továbbá a fotoszintézis szempontjából hasznos fénytartományban a fényerősséget. Ez alapjaiban fogja megváltoztatni az in vitro tenyésztési technikát, laboratóriumokat és szemléletünket.

2.8.4. 5.8.4. Mikroszaporítás bioreaktorban A bioreaktorban való szaporítás elterjedésének legnagyobb akadályát a tenyészetek hiperhidratáltsága jelenti. A folyékony közegben fejlődő növények egyrészt abnormálisan fejlődnek, másrészt a kiültetést nem, vagy csak nagyon kis százalékban élik túl. A fentiek miatt egy új, kétlépéses szaporítás van kialakulóban. A kiindulás tulajdonképpen bármelyik szaporításra használt izolátummal történhet: levelek (páfrány), rügyek (filodendron, gladiolusz), gyökér (nyár), nóduszos hajtásdarab (burgonya). Az első lépésben a merisztémák differenciálódását indukálják (citokininnel), és azok proliferációját tartják fenn a fermentorban. A hajtások fejlődését növekedés gátlókkal és gibberellin inhibitorokkal gátolják. A fermentoros tenyésztés során merisztematikus sejtaggregátumok, illetve rügyekből álló aggregátumok fejlődnek. Az aggregátumok folyamatosan szaporodnak. Bizonyos fajok (pl. banán, Brodiaea) az orchideákhoz hasonló protokormokat fejlesztenek. A rügyaggregátumok proliferációja rendkívül gyors, ami korlátlan szaporítást tesz lehetővé. A második ütemben ezekből a rügyaggregátumokból – a hajtásfejlődés gátlásának feloldásával, szokásos mikroszaporítás eljárásokkal – növényeket nevelnek fel. Összefoglalvamegállapítható, hogy a század végére végül is az elméleti ismeretek fejlődése és számos gyakorlati próbálkozás tapasztalatai alapján körvonalazódnak azok a megközelítések, melyek szintáttörést jelentő lehetőségeket jelentenek a növényi mikroszaporítás versenyképességének javításához és általánossá válásához. Talán nem tévedünk nagyot, ha jelenlegi ismereteink alapján úgy fogalmazunk, hogy a XXI. századi üzemi méretű mikroszaporítás kombinálni fogja a rügyaggregátumot eredményező fermentoros szaporítást a fotoautotróf folyékony tenyésztéssel. Mind a két eljárás és folyamat automatizálható és végül is egy robotban 112 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA összekapcsolható. E rendszer jelentősen csökkenteni fogja a laboratóriumi élőmunkát, folyamatos és nagy szaporítási rátát fog biztosítani, valamint erős, egészséges palánták előállítását teszi lehetővé.

2.9. 5.9. A mesterséges mag Az előző pontokban már utaltunk arra, hogy a szomatikus embriók in vitro differenciálódását először az ötvenes évek végén figyelték meg és írták le. A tudományos közvélemény azonban csak a megrendíthetetlen bizonyítékok hatására, a hatvanas évek közepén fogadta el a morfogenezis in vitro indukálható alternatív útjaként. A magasabbrendű zárvatermő fajok szaporítószerve a mag, tulajdonképpen embrióból, az azt körülvevő tápláló szövetből és védőburokból, a maghéjból vagy terméshéjból áll. A kutatókban viszonylag korán felmerült a mesterséges mag laboratóriumi előállításának lehetősége. Mivel a gazdasági haszon óriásinak tűnt, a hetvenes évek közepén a Monsanto és a Union Carbide intenzív kutatást indított ezen a területen. Az első sikeres eredményekről a nyolcvanas évek elején számoltak be. A mag felépítése és működése azonban sokkal bonyolultabb szabályozó rendszer létezését igényli, mint amire a kutatók először gondoltak. Ennek a csodálatos összhangban működő rendszernek mesterséges szimulálása a XX. század végén reménytelen vállalkozást jelent. Ez az oka, hogy a mesterséges mag előállítása jelenleg is kutatási stádiumban van.

5/8. ábra: A mesterséges mag felépítése A mesterséges mag a szövettenyészetekben fejlődött embriót, valamint az azt burkoló – tápláló és védő – anyagot jelenti (5/8. ábra). A mesterséges (artificial) kifejezés helyett használatos a szintetikus (synthetic) vagy szomatikus (somatic) mag megjelölés is. Ez utóbbi egyben azt is jelzi, hogy a mesterséges mag a testi sejtek genomját tartalmazza, tehát a vele való szaporítás klónozást, vagy vegetatív szaporítást jelent. A mesterséges mag előállításának a siker érdekében tehát nem a természet másolása a célja, hanem a mag titkait ellesve, olyan működő rendszer kialakítása, mely alkalmas speciális gyakorlati alkalmazásokra. A kutatások 3 fő területrekoncentrálódnak (5/9. ábra):



5/9. ábra: A szomatikus embriók és a mesterséges mag előállításának, valamint felhasználásának alternatív lehetőségei a) érett szomatikus embriókelőállítása; b) mesterséges magvak elő-állítása; c) mesterséges magvak csí-ráztatása.

2.9.1. 5.9.1. Érett szomatikus embriók előállítása Először egy jól működő in vitro embriogén rendszert kell kidolgozni, melynek célja a kiinduló embriogén kallusz, vagy sejtszuszpenzió előállítása és korlátlan idejű fenntarthatóságának biztosítása (5/10. ábra).



5/10. ábra: A szomatikus embriógenezis indukciója és a mesterséges mag előállítása a vadgesztenye sejttenyészetében A: szomatikus embriókon fejlődő járulékos embriók; B: embriogén sejtszuszpenzióból a kiszélesztést követően fejlődő szomatikus embriók tömege; C: nem szinkronizált szomatikus és adventív embriótenyészet, melyben a gömbtől a szikleveles stádiumig minden fejlődési fázis megtalálható; D: kapszulázott (Na-alginát) torpedó stádiumú szomatikus embrió (Kiss J. és mtsai kísérlete, SZIE Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő E folyamat kritikus lépései a következők: • Az embriógenezis indukciója úgy, hogy a tenyésztett sejtek közel 80–100%-ában lehetőleg azonos időpontban következzék be. Ennek célja, hogy a tenyészet az inkubáció végén nagyszámú és lehetőleg azonos fejlettségű embriókat tartalmazzon. Ezek a feltételek a specifikus embriogén típusú sejtek arányának növelésével, illetve a sejtek szinkronizálásával érhetők el. 115 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA • A szomatikus embriógenezis folyamata optimális feltételeinek biztosítása in vitro abból a célból, hogy a tenyészetben fejlődő embriók minél kisebb százalékban legyenek morfológiailag vagy anatómiailag hibásak, torzak. • A kifejlett szomatikus embriók érlelése abból a célból, hogy minél nagyobb százalékban váljanak csírázóképessé.

5/11. ábra: A kapszulázott sárgarépa embriók előállításának folyamata és hatékonysága fermentorban (Onishi N. Y. és mtsai 1994, PCTOC 39: 137–145 alapján) Az 5/11. ábra szemlélteti ezt a folyamatot, bizonyítva, hogy milyen rossz a szomatikus embrió kihozatal. Japán kutatóknak (Osuga és Komamine 1994) viszont sikerült a sárgarépa szomatikus embriógenezist úgy szinkronizálni, hogy a kiinduló sejtek közel 100%-ából embriókat kaptak. A sárgarépára kidolgozott nagy hatékonyságú szinkronizált embriógenezis rendszer lényege a következő: 1.Embriogén sejtszuszpenzió létesítése 0,05 mM 2,4-D-t, 1 mM zeatint és 0,2 M mannitolt tartalmazó táptalajon. 2.A kicsi, kerek és különálló embriogén sejtek izolálása – a jól növekvő embriogén aggregátumokat tartalmazó tenyészetekből szűréssel, majd Percoll oldatban sűrűség gradiens centrifugálással – és tenyésztése az 1. pontban jelzett táptalajon. 3.A fejlődő embriogén sejtaggregátumok izolálása szűréssel és sűrűség gradiens centrifugálással Ficoll oldatban, majd azt követő alacsony fordulatszámú centrifugálással. 4.A szelektált sejtaggregátumok (2x103 ml–1) 0,1 mM zeatint tartalmazó, auxinmentes táptalajon rövid idő alatt – szinkronizáltan – gömbstádiumú embriókká fejlődnek. 5.Torpedó stádiumú embriókat tartalmazó tenyészet előállítása a gömbstádiumú embriók izolálásával, szűrésével és tenyésztésével (150 embrió ml-1 ). 116 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A kereskedelmi célú előállítást fermentor alkalmazása jelenti. Napjainkig a fenyőfajok azok, amelyekre a fermentor-technológiát (1–2 l-es fermentor) kidolgozták és sikerrel alkalmazzák. Ezek részben mechanikus, részben levegőztetett és air-lift bioreaktorok. A fenyőfélék fermentorban előállított nagyszámú szomatikus embrióinak érlelését a tápoldatba adagolt PEG-gel (MV 4-8000, 10–20%), aktív szénnel (0,05–1,0%), ABA-val (2,5–100 mg/l) és GA3-val (10–20 mg/l) biztosítják. Ezzel jelentősen növelik a táptalaj ozmolaritását. Fontosabb fajok, melyek szaporítása már szomatikus embriógenezissel is lehetséges a Picea mariana, Picea glauca x engelmannii, Pinus radiata, Picea sitchensis és a Preudotsuga menziesii. A szomatikus embriógenezis molekuláris szabályozásával kapcsolatos eredmények is biztatóak. A szomatikus és zigotikus embriógenezisben működő gének összehasonlításakor nyilvánvalóvá vált, hogy a késői stádiumú szomatikus embriókban csak a közepes stádiumú zigotikus embriók génjei működnek. A késői zigotikus embriókra jellemző transzkriptumok sajnos nem mutathatók ki a késői szomatikus embriókban. Tehát a tenyésztés körülményeit ennek megfelelően kellene módosítani. Egyre több ismerettel rendelkezünk azokról a génekről is, melyek a szomatikus embriogenezis során expresszálódnak. Komanine ezeket három csoportba sorolta: • Az első csoportba a sejtosztódás génjei (21D7, CEM6) tartoznak, melyek az indukciót követően kapcsolnak be és a gömbstádium kialakulásáig működnek. Szerepük a szomatikus embriógenezis indításában, az intenzív sejtosztódásban, illetve a totipotencia realizálásában van. • A második csoportba a szervkialakulás génjei (CAR, 3,4,5,6 CHB 4,5) tartoznak, melyek a késői torpedó stádiumban működnek, akkor, amikor a gyökér, a hajtás és a hipokotil differenciálódása kezdődik. Exogén auxin adagolás esetén, ami az embriógenezist leállítja, ezek a gének kikapcsolnak. • A harmadik csoportba a homeobox gének (CHB2, CEM6) tartoznak, melyek glicingazdag fehérjét kódolnak – ez valószínűleg egy glikoprotein – és így specifikus szignálszekvenciát tartalmaz. A CEM6 gén antiszensz génjével történő transzformációt követően a sejtek elvesztették embriogén jellegüket, ami egyértelműen bizonyítja a gén kulcsszerepét az embriógenezis folyamatának indításában. A csíraképes embrió kihozatalt image analízissel is próbálták növelni. A kidolgozott szelekciós rendszer célja, hogy a szomatikus embrió-szuszpenzióból mechanikailag el lehessen különíteni az abnormális (torz, degenerált) és normális torpedó stádiumú embriókat. Sárgarépa esetében az eredeti 30%-os normális embrió arány az image analízissel 80%-ra volt növelhető.

2.9.2. 5.9.2. A mesterséges mag előállítása, típusai A mesterséges mag előállítását szomatikus embriókból az egyes kutatócsoportok különböző fajokon, eltérő módon közelítik meg. Ennek megfelelően eltérő rendszerek vannak kialakulóban, amelyek közül a kapszulázott szomatikus embriók és a szárított szomatikus embriók érdemelnek említést (5/12. ábra).




II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA 5/12. ábra: A mesterséges mag előállításának és felhasználásának főbb lépései A tenyésztett növényi sejtekből n gyszámú szomatikus embrió fermentorban állítható elő, melyek szárítva vagy kapszulázva juttathatók ki a talajba 1. Kapszulázott embriók A kapszulázást sokan a jelenlegi legfejlettebb rendszernek tartják. Az embriók ebben az esetben egy gélszerű anyagba vannak beágyazva. A módszert lucerna- és zellerembriókon dolgozták ki. Lényege, hogy élelmiszerek szilárdítására használt nátrium-alginát burokkal – amely nem toxikus – veszik körül az embriókat. A kapszulázás úgy történik, hogy az embriókat nátrium-algináttal keverik össze, majd valamilyen kálciumsó [(Ca(NO3)2, CaCl2)] oldatába helyezik. A kalciumfürdőben az embriók körül átlagosan 4 mm átmérőjű gélszerű burok alakul ki, amely a továbbiakban megfelelő védelmet nyújt. A kis golyók felülete szilárd, belül az embrió körül kocsonyás marad. Újabban hőmérsékletfüggő gélekkel, hűtéssel is elérhető a kapszulázás (5/10 D. ábra). Automatikusan felnyíló alginát kapszulát is sikerült előállítani. Ennek lényege, hogy a Ca2+-mal szilárdított alginátból csapvízzel kimossák a kalciumot, melyet K+-mal helyettesítenek úgy, hogy KNO3 200 mM-os oldatába helyezik a magvakat 60 percig. Az ilyen kapszula később, amikor nedves környezetbe kerül, azért ,,pattan fel”, mert a K+ nagyobb hidrátburka miatt több vizet vesz fel, ami az alginátot szétfeszíti. A gélbe juttatott különböző anyagokkal befolyásolhatjuk, serkenthetjük az embrió fejlődését. A szomatikus embriót körülvevő, különböző tápanyagokat tartalmazó köpenyt mesterséges endospermiumnak nevezzük. Bizonyos magvak (pl. zeller) esetében a szomatikus embriók megfelelő csírázásához pl. szacharóz is szükséges, melyet a kapszula is tartalmazhat. A kapszulákat kívülről víztaszító (hidrofób) membránnal kell bevonni a gyors kiszáradás és a korai felrepedés megelőzése végett. 2. Szárított embriók Az embriók fejlődése in vivo vízvesztéssel is jár, ami azok érését segíti elő. A száradás a zigotikus embriógenezist leállítja, és az embriókat képessé teszi a csírázásra. Ezért kézenfekvőnek tűnt a szomatikus embriók szárítása, elősegítve ezzel érésüket. A szomatikus embrió szuszpenziókat 2,5% polioxietilénből (a polietilén-oxid homopolimerje) készült lemezeken szárítják. A lemezek rehidratációját követően az embriók kicsíráznak. A szárítás könnyen károsíthatja az embriókat. Az embriók szárítási toleranciája növelhető a fejlődésük során a táptalajba adagolt ABA-val, illetve a szacharóz koncentráció növelésével. A szomatikus embriók 15%-os víztartalomra szárítva jól tárolhatók szobahőmérsékleten és annak megfelelő páratartalom mellett, anélkül, hogy életképességüket elvesztenék. A szárított embriók tárolhatók és felhasználhatók csupaszon, illetve valamilyen szintetikus anyaggal bevonva. Az embriók bevonására alkalmas anyagként háromféle polimer típust próbáltak ki, a polivinil-kloridot (PVC), a polivinil-acetátot (PVA) és a polioxietilén glikolt. E filmszerű bevonatok vastagsága azonban kritikus a csírázás során. Mivel a szárítás hatására a csíranyugalom feltehetőleg megszakad, e módszer azoknál a fajoknál érdemel különös figyelmet, amelyeknél a szárítás stimulálja az embriók további fejlődését (pl. szőlő).

2.9.3. 5.9.3. A mesterséges mag csírázása 1. Kapszulázott embriók vetése A módszer tulajdonképpen a folyékony vetést (fluid drilling) jelenti, amelyet előcsíráztatott és védőgéllel bevont csíranövények vetésére dolgoztak ki. Végül is a fluid drilling a kapszulázott embriók szuszpendálását jelenti a talajba, amelyet speciális géppel végeznek. Legnagyobb hátránya, hogy nem teszi lehetővé a tőszám pontos meghatározását, viszont a gélhez adagolt tápanyagokkal, peszticidekkel és növekedésszabályozó anyagokkal a túlélési százalék jelentősen javítható. Az e módszerrel vetett – előcsíráztatott magvakból fejlődött – növények egyszerre kelnek, gyorsabban fejlődnek, koraibbak, és nagyobb termést hoznak. Ezeket a tulajdonságokat paradicsom, zeller, hagyma, 119 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA sárgarépa és saláta zigotikus embriókból fejlődött növényállományaiban figyelték meg. Feltételezik, hogy a szomatikus embriók esetében is realizálhatók lesznek ezek az előnyök. A kapszulázott lucernaembriók 90% -a kicsírázott in vitro, nem steril földbe való ültetés esetén azonban a túlélés csak 15–25%-os volt. Más fajokkal – pl. sárgarépa és tömjénfenyő (Pinus taeda) – még ezeket az értékeket sem lehetett elérni. A tömjénfenyőé egyáltalán nem, a sárgarépa szintetikus magja is csak 3–10%-ban csírázott in vitro. Sikerrel kapszulázták az utóbbi években a kömény, a gyapot, a saláta, a kukorica és a káposztafélék szomatikus embrióit is. 2. Szárított embriók csíráztatása és palántázása A szárított embriók közül a legjobb túlélést azokkal érték el, amelyeket semmilyen anyaggal sem vontak be. A csomós ebír embrióinak 32%-a, a szőlőéinek 28%-a fejlődött növénnyé in vitro. A különböző fenyőfajoknál a fermentorban fejlődött embriók sejtszuszpenzióban nem csíráztak. A csírázóképesség elérése céljából az embriókat félig szilárdított táptalajra kellett helyezni, és 7–10 napig sötétben tartani. A fényre helyezést követően a szomatikus embriók kicsíráztak, és 6–10 hét múlva a növénykék kiültethetők voltak a talajba. A duglászfenyő egy szaporítási ciklusát követően 30000 növényt lehetett kiültetni. 3. Palánták előállítása Rita-rendszerben A szomatikus embriógenezisre alapozott szaporítás számára, főleg azoknál a növényeknél, melyeket palántáznak, pl. fenyőfélék, banán, kávécserje és Citrus-fajok stb., várhatóan gyorsan el fog terjedni a Rita rendszer, melyet Franciaországban dolgoztak ki (CIRAD) a 90-es évek második felében. A rendszer sikerrel kombinálja a folyékony tenyészetek minden előnyét úgy, hogy kiküszöböli hátrányukat (részletesen lásd az 5.8.1. fejezetben). A szomatikus embriók esetében már sikerrel alkalmazták a banán, kávé, Citrus-félék, olajpálma stb. fajoknál. Magát a szomatikus embriógenezisre képes sejtszuszpenziót célszerű hagyományos módon lombikban előállítani és fenntartani. A Rita különösen a szikleveles stádiumú szomatikus embriók előállítására és az embriók csíráztatására alkalmas. Egy Rita edényben 5000 kávé szomatikus embriót és 500 banán csíranövényt lehetett előállítani.

2.9.4. 5.9.4. Gazdasági jelentősége 1. Általános jelentősége A mesterséges mag, pontosabban a fermentorokban folyamatosan, milliárd számra előállítható szomatikus embriókkal végzett vetés és palántázás a XX. század végén a fenyőféléknél már elérte a gyakorlati alkalmazást. Az utóbbi néhány év eredményei sejtetni engedik, hogy a jelenlegi problémák leküzdésével a XXI. században számos faj szaporítóanyagát klónozással, automatizált fermentor rendszerekben fogják előállítani. Ezzel lehetővé válhat : • a heterózis felhasználása a növényfajok szélesebb körében (klónozás lehetősége miatt); • a heterózis fixálása minden növényfajnál (a klónozás lehetősége miatt); • a teljes termés hasznosítása (nincs vetőgumó, vetőmag előállítás); • a genetikai manipulációval előállított GM növények és GM fajták gyors felszaporítása; • az előállítás helyének és idejének függetlenítése az évszakoktól, a kontinenstől (égövtől) és az adott faj termesztési területétől (zárt fermentor rendszerek miatt). További gazdasági jelentőségét bizonyítja, hogy egy 10 l-es fermentorban 1 hónap alatt elméletileg 1 milliárd embrió állítható elő (1 ml = 100 000 sejt), és ez az embriómennyiség megfelel: • 10 000–15 000 ha kukorica vetőmagnak, • 150–200 ha búzavetőmagnak, • 20 000–25 000 ha burgonya vetőgumónak. 120 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Természetesen a realitások talaján maradva ma – néhány faj kivételével – csak a milliárdos szám 1–10%-ával számolhatunk, de az sem lebecsülendő nagyságrend. Az előbbieken kívül a hagyományos vegetatív szaporításhoz és az in vitro mikroszaporításhoz képest a mesterséges maggal, illetve szomatikus embrióval való szaporítás előnyei, illetve hátrányai a következők: 2. Előnyök a többi vegetatív szaporításhoz képest • korlátlan és gyors szaporítási lehetőség (időben és térben); • az in vitro növényeknek egyidejűleg gyökerük és hajtásuk is van (csíranövények); • közvetlenül is kijuttathatók a talajba (vethetők); • alkalmas a fermentációra (léptéknövelés); • alkalmas az automatizálásra (költségek csökkentése); • alkalmas a krioprezervációra (kriobank). 3. Hátrányok a többi vegetatív szaporításhoz képest • szomaklonális variabilitás (genetikai instabilitás léphet fel); • nagy ráfordítást, befektetést igényel (élő munkaerő, eszközök). Az előállítás gazdasági elemzését napjainkig a legjobb eredményt elérő fajnál, a lucernánál végezték el. A lucerna mesterséges magjának ára egy magra vonatkoztatva hússzorosa a hagyományos vetőmagénak. A költségek várhatóan jelentősen csökkenthetők lesznek a laboratóriumi ráfordítások mérséklésével és a folyamat egyes lépéseinek automatizálásával. További lehetőséget jelent a módszer drágább vetőmagvú fajokra való kidolgozása is. A fenyőféléknél a kiváló fák mesterséges maggal való szaporítása (pl. Picea abies L., P. engelmannii Parry, P. glauca (Moench, Voss) már olcsóbb, mint a gyökérsarjról való szaporítás. A fenyőféléknél a mikroszaporítás már napjainkban is a szomatikus embriógenezisre alapozott! Gazdaságilag jelentős trópusi fajoknál (pl. kakaó, kókuszpálma, olajpálma és kávé), melyek zigotikus magvai gyorsan elvesztik csírázóképességüket, szintén gazdaságosnak tűnik a szomatikus maggal való szaporítás. Ugyanez vonatkozik az értékes dísznövényekre is, ahol egy-egy értékes változat egy-egy palántájának vagy magjának, illetve gumójának ára már napjainkban is jelentősen meghaladja a mesterséges mag költségeit. Végeredményben a mesterséges mag a növényi biotechnológia várhatóan egyik legnagyobb gazdasági jelentőségű eredménye lesz talán nem is a távoli jövőben.

2.10. 5.10. In vitro génbank Az in vitro génbank a különböző genetikai tartalékok tartós tárolását jelenti, biotechnológiai (szövettenyésztés, mélyfagyasztás) módszerekkel. A második világháborút követően a kutatók – VAVILOV fél évszázaddal korábbi munkáira alapozva – felismerték, hogy a civilizáció terjedésével, az intenzív gazdálkodásra való áttéréssel a világ természetes és kultúrflórája rohamosan szegényedik. Különösen az 1960-as években a zöld forradalom során – Afrikában, Ázsiában, Dél-Amerikában stb. – előretörő modern fajták szinte egyik évről a másikra szorították ki a – sokszor évtizedek vagy évszázadok óta termesztett – helyi táj- és primitív fajtákat. A folyamatot – talán a politikusok meggyőzése végett – géneróziónak nevezték el, mely ezeknek a primitív, természet alkotta anyagoknak, mint génforrásoknak elvesztését jelenti. A felismerést követően megindult nemzetközi akció során létesültek a génbankok (csíraplazmabankok), mint olyan kutatóintézmények, ahol a még fellelhető természetes változatosságot hordozó formákat összegyűjtik és az utókor számára megőrzik. A megőrzés és tárolás napjainkban vagy növény formában (pl. fafajok nemzeti parkokban), vagy leszárított és hűtött (+5 – –20 °C) magminták alakjában (magbank) történik. A vegetatív úton szaporított növények esetében a problémát az jelentette, hogy azokat – az előbb bemutatott két lehetőség közül – 121 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA egyikben sem lehet tartósan tárolni. Az évenkénti fenntartás szántóföldön a vírusfertőzés miatt kockázatos, a mag pedig nem reprezentálja az eredeti genotípust, és az utódgeneráció hasad. Szükség volt tehát olyan módszerre, amellyel a vegetatív részek hosszú ideig életképesen megőrizhetők. A növényi biotechnológia fejlődése a hetvenes években két metodikai lehetőséget is kínált. Az egyik az in vitro embrió- és szervtenyészet volt, a másik egy teljesen új terület, a növényi kriobiológia. Ennek megfelelően napjainkban két in vitro tárolási forma kerül bevezetésre, az egyik a lassan növekedő tenyészet, a másik pedig a fagyasztva tárolást, a krioprezervációt jelenti.

2.10.1. 5.10.1. Az in vitro tárolás feltételei Olyan növényfaj esetén érdemes in vitro tartós tárolásra berendezkedni, amely számára már: • kidolgozott a kórokozómentesítés (mert csak egészséges genetikai tartalékokat szabad megőrizni); • kidolgozott a lassú növekedésű tenyészet (mert a költségek ezzel csökkenthetők); • kidolgozott a mikroszaporítás (mert az in vitro génbankból kikerülve az egyes tételeket fel kell szaporítani). Az in vitro génbankban a tenyészet típusa fajfüggő. Az izolátum, amivel a tenyészeteket indítani érdemes, eltérhet egymástól. Az in vitro génbankokban tárolt fajok izolátumai a következők: fejlődő embrió (kókuszpálma), oldalhajtás (kakaó, gyapot), hajtás (fűfélék), egyrügyes hajtás (burgonya). Tárolás a lassan növekvő tenyészetekben – mint in vitro génbankban – azt jelenti, hogy különböző növényi anyagokat in vitro évi 1–2-szeri, vagy ritkább átoltással, magukban a tenyészedényekben steril, kontrollált feltételek között tartjuk fenn (5/13. ábra) és tároljuk.



5/13. ábra: Burgonya in vitro génbankja A) a hajtástenyészetben differenciálódott mikrogumó; B) minimális tenyésztési feltételek között tárolt 1 éves (5 db egyrügyes nóduszból indított) hajtástenyészet, mely 2500–3000 db egyrügyes nóduszt tartalmaz; C) a génbankban tárolt (balról jobbra) 1–3–6–12 hónapos hajtástenyészet (Heszky L. és mtsai kísérlete, Agrobotanikai Intézet, Tápiószele A mikroszaporításnál bemutatott hajtástenyészetek önmagukban is szolgálhatnak rövidebb-hosszabb tárolási célt. Ezekben a tenyészetekben azonban gyorsan nőnek a hajtások, ami gyakori – 4–6 hetenkénti – átoltást tesz szükségessé. Tehát nagyon munka- és eszközigényes. Az átoltások száma és a költségek csak úgy csökkenthetők, ha a hajtások anyagcseréjét és ezzel fejlődését lassítjuk.

2.10.2. 5.10.2. Az in vitro tárolás technikái Klasszikus technikák 123 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A tenyészetek növekedési sebességének csökkentésére dolgozták ki a lassú növekedést biztosító (slow growth) tárolási technikákat, melyek a következők: • Tárolás alacsony hőmérsékleten (0–8 °C); • Tárolás gyenge megvilágításban vagy sötétben (800– 1000 lux, 8–12 óra); • Tárolás minimális táptalajon (szervetlen sók+cukor); • Tárolás ozmotikus növekedésgátlókkal (4–8% mannitol); • Tárolás hormonális növekedésgátlókkal (5–10 mgl-1 ABA). Az egyes fajok esetében általában a fenti technikák kombinációit használják. A szamócatenyészet például sötétben, 4 °C-on, kevés folyékony táptalajban, hűtőszekrényben 6 évig tárolható. Az almaé 2 °C-on 13 hónapig, a baracké 15 °C-on 15 hónapig tárolható átoltás nélkül. Jelenleg ezek a technikák jelentik az in vitro génbank klasszikus módszereit a világon. Alternatív technikák Ezek olyan megközelítések, melyek kipróbálás alatt vannak. • Kallusz tárolás paraffinolaj alatt: a vizsgált fajok sárgarépa, Catharanthus és a szőlő voltak. A 313 tételből álló kalluszgyűjtemény 25–30%-a paraffin olaj alatt 6–12 hónapig tárolható volt. Hasonló eredményt értek el francia kutatók sejtszuszpenzióval, melyet folyékony táptalajjal fedtek le és rázatás nélkül 6 hónapig tárolták. • Hajtásdarab tárolás paraffinolaj alatt: a gyömbér bizonyos genotípusainak hajtásdarabjai kiváló életképességet mutattak 2 éves tárolás után is. A kávé, körte izolátumok már néhány hónapos tárolás után is nekrotizálódtak, illetve hiperhidratáltakká váltak. • Tárolás csökkentett légnyomáson: az alacsony nyomású rendszer (low pressure system) a légnyomás csökkentését jelenti (1013 hPa-ról 500 hPa-ra) a gázok parciális nyomásának csökkentésével. A dohány és krizantém növénykék 6 hétig voltak tárolhatók alacsony légnyomáson és 1,3%-ra csökkentett oxigéntartalom mellett. Az olajpálma embrióit 4 hónapig lehetett szobahőmérsékleten, alacsony légnyomáson, 1%-ra csökkentett O2 tartalom mellett tárolni. • Szárított szomatikus embriók tárolása: sóoldattal víztelenített lucerna szomatikus embriók szobahőmérsékleten, 10-15% páratartalom mellett 1 évig megtartották életképességüket. Csírázóképességük csak 5%-kal csökkent. • Kapszulázott szomatikus embriók és rügyek tárolása: kapszulázott eperfa hónaljrügyek és szantálfa szomatikus embriók 45 napig életképesek maradtak 4 °C-on. Abban az esetben, ha a kapszulázott embriókat folyékony táptalajba helyezték, a tárolás 80–120 napra volt növelhető. Valeriana kapszulázott hajtáscsúcsait 6 hónapig lehetett tárolni.

2.10.3. 5.10.3. Gyakorlati alkalmazás A gyakorlatban jelenleg az ún. minimális fejlődési feltételeket (minimal growth conditions) biztosító eljárások váltak be és terjedtek el. Ezek egyszerűek, olcsók, nem járnak genetikai változással, és a tárolást követően az intenzív növekedés viszonylag gyorsan helyreállítható. A fenntartást az in vitro fejlődött hajtást vagy rügyet tartalmazó hajtásdarab friss táptalajra való átoltásával végzik. Elsőként MOREL professzor alkalmazta szőlő fajtagyűjtemény tárolására a hetvenes évek elején. A merisztémából regenerált hajtásokat 9 °C-on évi egyszeri átoltással tárolta. A „Golden Delicious‟ alma tenyészetei nem vesztették el növekedőképességüket 1 éves 1–4 oC-on történő tárolás során. Egy 0,28 m3-es hűtőszekrényben csaknem 2000 kémcsőtenyészetet lehetett elhelyezni. Ha ezeket az anyagokat egy almaültetvényben kívánnánk fa formában fenntartani, legalább 5–6 ha területre lenne szükség. Hasonlóan alacsony hőmérsékleten tárolják a vírusmentesített szamócát (4 °C-on), burgonyát (8 °C-on) stb. A burgonya nemzetközi génbankjában, Limában még ozmotikus stresszt is alkalmaznak (4% mannitol) a tárolás során. Az átoltások gyakorisága fajtától függően 2 hónap és 2 év között változik. A hazai burgonya


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA fajtagyűjtemény in vitro génbankjának kialakítását Heszky L. kezdte el már az 1970-es évek végén Tápiószelén, az Agrobotanikai Intézetben (5/14. ábra).

5/14. ábra: Merisztéma és hajtástenyészetek felhasználásánakvázlata a burgonya vírusmentesítésben, a genetikai tartalékok tárolásában és a szaporítóanyag- előállításban Vírusmentesítés: a merisztéma izolálás (2) célja, kórokozómentes tenyészetek előállítása (3–4). In vitro génbank: a kórokozómentes anyagok hajtástenyészetekben évente 1–2- szeri átoltással egyrügyes hajtásdarabbal, vagy mikrogumóval (6-8) a visszafertőződés veszélye nélkül korlátlan ideig tárolhatók (7–9). Vegetatív mikroszaporítás: steril szaporítás (10–12) a hajtástenyészetek nodális szegmentjeivel (8,11). Szaporítóanyag-előállítás: a mikroszaporítás utolsó lépése, amely magában foglalja az in vitro növények, mikrogumók edzését (13, 14), kiültetését üvegházba és fóliasátorba (15), valamint forgalmazását és szállítását (Heszky L.E.–Nagy M. 1987 nyomán) A genetikai stabilitás biztosítása A hajtástenyészetekben a fajták nehezen különböztethetők meg egymástól, ezért könnyen keveredhetnek. Az átoltások alkalmával rügymutánst vagy egy szomaklonális variánst is felszaporíthatnak, mivel a tenyészetben a legtöbb esetben megjelenésük nem jelent morfológiai változást. Ezért nagyon fontos, hogy a jövőben minden szaporításra vagy tartós tárolásra kerülő anyagról, fajtáról stb. molekuláris etalon fehérje (izoenzim), vagy nukleinsav (RFLP, AFLP) mintázatok készüljenek, amelyek a későbbi időszakban végzett ellenőrzés során a genotípus pontos azonosítását, illetve szerencsés esetben az esetlegesen bekövetkező változások észlelését tennék lehetővé.



2.11. 5.11. Kriobank (krioprezerváció) A növénytudományok egyik gyorsan fejlődő területe a kriobiológia, pontosabban a növényi sejtek, szövetek, szervek ultramélyhűtése, tárolása és növényregenerálás a fagyasztva tárolt tenyészetekből. Az ezzel kapcsolatos módszertani kutatási eredmények KARTHA (1986) összefoglaló munkájában részletesen megtalálhatók. A krioprezerváción alapuló növényi génbank jelenleg a genetikai tartalékok merisztémáinak fagyasztását és ultramélyhűtött, korlátlan időtartamú és változatlan formában való megőrzését jelenti folyékony nitrogénben. A folyékony nitrogén hőmérsékletén (–196 °C) a sejtek anyacseréje, életfolyamatai gyakorlatilag szünetelnek. A növényi krioprezervációs kutatások QUatrano 1968-as sejtszuszpenziós kísérleteivel kezdődtek. Az első sikeres fagyasztva tárolásról 1976-ban számoltak be. Mélyfagyasztott szegfű merisztémákból sikerült növényeket regenerálni. Ezt követően 1978-ban a szamóca, majd 1980-ban a burgonya, a borsó és különböző gyümölcsfajok merisztémáival végeztek sikeres kísérleteket. A kezdeti eredmények ellenére a krioprezerváció – ellentétben az in vitro hajtástenyészetekkel – nem tudott elterjedni a génbank gyakorlatban. Ennek oka feltehetőleg az, hogy a túlélés a legtöbb fajnál még nem közelíti meg azt az értéket (80–100%), mely a gyakorlati bevezetés alapfeltétele.

5/15. ábra: A növényi krioprezerváció folyamata valamint a genetikai tartalékok kriobankban való megőrzésének főbb lépései (további részleteket lásd a szövegben) A fagyasztva tárolás főbb lépései (5/15. ábra), megegyeznek más élőszervezeteknél, sejteknél alkalmazottakkal. Tehát magukba foglalják: 1. a kémiai fagyásvédelmet, 2. a lassú víztelenítést biztosító fagyasztást, 3. folyékony nitrogén hőmérsékleten való tárolást, 4. a gyors olvasztást, 5. a mosást, majd 6. a túlélés meghatározását, végül pedig 7. a növényregenerálást. Az izolátummal szemben támasztott feltételek: kórokozó-mentesíthető legyen, reprezentálja az adott genotípust, és belőle a tárolást követően növények legyenek felnevelhetők.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA A növények esetében ezért a krioprezervációra legalkalmasabb izolátumoknak a sejttenyészetek, a merisztámák (hajtáscsúcsok) és a szomatikus/zigotikus embriók bizonyultak.

2.11.1. 5.11.1. Fagyásvédő előkezelések A krioprezerváció sikerének kulcskérdése az, bármilyen izolátummal is dolgozunk, hogy képesek legyünk a sejten kívüli és a sejten belüli vizet eltávolítani, illetve a sejtben maradó vízből a jégkristályok képződését a fagyasztás és a felolvasztás során úgy módosítani, hogy az ne károsítsa a sejtet. A tényleges veszélyt a jégkristályok képződése jelenti először a fagyasztás során, másodszor pedig az újrakristályosodás, a felolvasztás folyamán. A következőkben bemutatott klasszikus technika lépései tulajdonképpen e veszély elkerülését szolgálják. 1. Izolátum A fagyasztásnak legjobban a merisztematikus sejtek, tehát a kicsi, sűrű citoplazmával, kis vakuólummal rendelkező sejtek felelnek meg. Ezért célszerű a fagyasztáshoz intenzíven osztódó sejtszuszpenziókat, az embriógenezis korai (pl. gömb) stádiumában lévő zigotikus és szomatikus proembriókat, illetve a merisztéma legfiatalabb részeit használni. Érett embriók esetében a szikleveleket célszerű eltávolítani. 2. Donor növények előkezelése Az izolálást megelőző hidegkezeléssel (4 °C) növelhető a túlélés. 3. A szövetek, sejtek előkezelése Az egyik legkritikusabb fázis. Ebben a lépésben kell a sejtekből a szabad vizet eltávolítani úgy, hogy a sejtek, sejtközötti járatok ne tartalmazzanak olyan vizet, mely a fagyasztás során jégkristályokat képez. Az igazi veszélyt a jégkristályok jelentik, melyek károsítva a sejt membránszerkezetét, annak pusztulását okozzák. A viszonylag homogén sejtekből álló pl. állati sejttenyészetek helyett a növényi kriobankban embriókat és merisztémákat célszerű tárolni, melyek viszont sokféle típusú és korú sejtből állhatnak, ezért az előkezelésnek különböző stratégiái alakultak ki a növények esetében: • Fagyásvédő (krioprotektív) anyagok: sejttenyészetek, szomatikus embriók, merisztémák számára. • Szárítás (víztelenítés, dehidratálás, deszikkálás): zigotikus embriók esetében. • Kapszulázás: zigotikus és szomatikus embriók, merisztémák esetében. • Vitrifikálás: sejttenyészetek, merisztémák esetében. a) Fagyásvédő anyagok Alkalmazásuk sikerét koncentrációjuk és a kezelés időtartamának pontos meghatározása biztosítja. A leggyakrabban használt anyagok a dimetilszulfoxid (DMSO), a szacharóz, a szorbitol, a mannitol, és a polietilén-glikol (PEG). Ezek használhatók önmagukban és kombinációban, általában 5–6%-os koncentrációban. b) Szárítás A víztelenítésnek ez a módja történhet lamináris boxban, szobahőmérsékleten és átlagos páratartalom mellett, vagy szilikagéllel exszikátorban. Fontos, hogy az embriók víztelenítése lassú legyen (kíméletes szárítás). Víztartalmukat az eredeti 50–60%-ról kapszulázott embriók és merisztémák esetében 4–6 óra alatt 19–20%-ra, csupasz izolátumok esetében 10–16%-ra célszerű csökkenteni. c) Kapszulázás A szomatikus embriók kapszulázását a Mesterséges mag (5.9.) c. fejezet tartalmazza. A krioprezerválás céljából az embrió és merisztématenyészetek folyékony táptalajához Na-alginátot adunk (3%), majd azt követően pipettával egyenként kiemelünk egy-egy izolátumot, és olyan táptalajba cseppentjük, mely 100 mM CaCl2-ot tartalmaz. Az embriók és merisztémák körül ekkor átlagosan 4 mm átmérőjű burok alakul ki. A kapszulázott tenyészeteket néhány napig folyékony táptalajban kell tenyészteni, mely 0,3–0,5 M szacharózt tartalmaz. Az ezt követő szárítás szobahőmérsékleten történik (0–6 óra).


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA d) Vitrifikálás A vitrifikáció azt a folyamatot jelenti, mely során a víz a fagyáspont alatt egy üvegszerű – nem kristályos – szilárd fázisba megy át. A vitrifikálás célja tehát a jégkristályok képződésének megakadályozása. A jégkristályok kialakulásának két feltétele van. Egyrészt, hogy a vízben a vízmolekulák ún. jégmagokat alkossanak, másrészt a szabad víz jelenléte, mely a jégmagok körül kikristályosodik, illetve annak folyamatos növekedését biztosítja. A jégmagok kialakulásának az alacsony, a kristályosodásnak pedig a magasabb hőmérséklet kedvez. A vitrifikáció, tehát az üvegszerűen megfagyó oldat a cukorkoncentráció növelésével érhető el (0,56 g víz/1 g szacharóz). Ez azonban nem jelent biztosítékot arra, hogy a felmelegítés során a devitrifikációt követően ne képződhessenek újra jégkristályok. Ezt a 0,43 g víz/1 g szacharóz oldat biztosítja. A vitrifikáció tulajdonképpen a tenyészeteknek a permeálódó vagy nem permeálódó fagyásvédők tömény oldatába való helyezését jelenti. A vitrifikáló oldatok rendkívül koncentrált oldatok. A menta merisztémák esetében 57%-os túlélést sikerült elérni, amikor a vitrifikáló oldat összetétele 1 M DMSO és 10% PEG (8000) volt. Vitrifikálhatók kapszulázott embriók és merisztémák is.

2.11.2. 5.11.2. Fagyasztás, tárolás, olvasztás Háromféle fagyasztási eljárás ismert: az egylépéses vagy gyors, a lassú vagy programozott, és a kétlépéses. A gyors fagyasztás tulajdonképpen az előkezelt merisztémák közvetlen behelyezését jelenti a folyékony nitrogénbe. A hűtés sebessége több száz, illetve ezer fokra tehető percenként. Az ultragyors hűtés 4800 °C/perc sebességet jelent. A gyors fagyasztás előnye, hogy a kritikus hőmérséklet-tartományban megakadályozza az intracelluláris jégkristályok kialakulását. Gyors és egyszerű módszer, amely azonban jelenleg csak néhány faj (pl. szegfű, földimogyoró, manióka) esetében alkalmazható eredményesen. A gyors hűtés sikerrel alkalmazható az érett zigotikus – de már szárított (dehidratált) – embriók fagyasztására is. Lassú fagyasztás. A programozott, kíméletes hűtés (0,5–1 °C/perc) megakadályozza a sejt víztartalmának kiáramlását a sejtközötti járatokba, és ezzel elősegíti az extracelluláris tér – a sejtek lehető legkisebb károsodását okozó – megfagyását. A sejt általában –30 és –40 °C között dehidratálódik, mértékét a fagyasztási sebesség, ebben a hőmérséklet tartományban való tartás időtartama (holding time), a használt fagyásvédő és a membránok permeabilitása befolyásolja. Lassú fagyasztással sikeresen tárolták az alma, a manióka, a borsó, a burgonya és a szamóca merisztémáit, valamint különböző fajok szomatikus sejttenyészeteit. Kétlépéses fagyasztás. A lassú fagyasztást általában a gyors fagyasztással kombinálják, és ezért hívják kétlépéses fagyasztásnak. A fagyasztás első lépését a lassú hűtés jelenti, mely általában –42 °C-ig tart. A lassú hűtési sebesség (0,5–1 °C/perc) célja az izolátumok kíméletes víztelenítése. Általában embriók, merisztémák és sejtkultúrák esetében használják. A lassú fagyasztás során először a sejteken kívüli tápközeg fagy meg. Ennek következtében a sejtekben lévő víz elkezd a sejtekből kifelé áramlani, ami az izolátumok dehidratálódását eredményezi. A lassú hűtés végén –40 °C körül hosszabb rövidebb ideig tartani kell a tenyészeteket (holding time), az optimális dehidratáció elérése céljából. A második lépést a gyors fagyasztás jelenti, a tenyészetek közvetlenül folyékony nitrogénbe helyezésével. E folyamat során ugyan megindul a sejtekben maradt szabad víz kristályosodása, de a mikrokristályok mérete olyan, hogy még nem károsítja a sejteket. Tárolás. A tárolás folyékony nitrogénben történik (–196 °C-on), vagy annak gőzében (–150 °C-on), az e célból készült hűtőszekrényekben, -tartályokban vagy Dewar edényekben. A tárolás módja megegyezik az állattenyésztési vállalatok spermabankjaiban alkalmazott technológiával. A tárolás során a hőmérséklet nem emelkedhet –100 °C fölé, mert akkor bekövetkezhet a jégkristályok átrendeződése, ami a sejtek pusztulását eredményezheti.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Olvasztás. A fagyasztáshoz hasonlóan, kritikus pontja a sikeres krioprezervációnak. A lassú fagyasztással szemben, az olvasztásnak minél gyorsabbnak kell lennie. Ezt 40 °C-os vízfürdőbe helyezéssel érhetjük el. Az ultragyors felmelegítés sebessége 9000°C/perc. Ez utóbbi azért szükséges, hogy a viszonylag nagy víztartalmú szomatikus embriók és merisztémák sejtjeiben az újrakristályosodást megakadályozzuk.

5/16. ábra: Túlélés és növényregeneráció –196 °C-on tárolt sejttenyészetből. Fagyasztott kalluszok (hűtési sebesség 1 °C/perc, DMSO 15 %, transzfer hőmérséklet –20 °C) TTC tesztje. A túlélő sejtaggregátumok a formazántól vörösek. Holding time 0 perc (A), 30 perc (B). Növényreg neráció (C) 6 héttel a fagyasztás után (hűtési sebesség 1 °C/perc, prolin 12,5 %, transzfer hőmérséklet –30 °C) (Jekkel Zs., Heszky L. és mtsai kísérlete, SZIE, Genetika és Növénynemesités Tanszék, Gödöllő) Növényregeneráció (5/16. ábra). A felolvadást követően az izolátumok fokozatos mosásával el kell távolítani a fagyásvédőt, majd azokat megfelelő táptalajra kell helyezni. A túlélést növekedés, illetve a növényfejlődés jelzi. Több mint 2 évig –196 oC-on tárolt szamóca merisztémák 75%-a, borsó merisztémák 60%-a volt képes növényregenerációra.

2.11.3. 5.11.3. Az in vitro génbankok nemzetközi hálózata A biotechnológia végeredményben két módszert is adott a kutatók kezébe, melyekkel a vegetatív úton szaporított növények megőrzése génbankban, pontosabban in vitro génbankban megoldható. Ezeknek a módszereknek a felhasználása a nyolcvanas évek elején felgyorsult. Már létező in vitro génbankok a következők: a burgonya, 1500 fajta CIP (Centro Internacional de la Papa, Lima, Peru), a manióka, 600 fajta, CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical, Cali, Columbia) és a banán, IPGR (International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy). Jelenleg a következő növények génbankjainak kialakítása van folyamatban: • gyökér és gumós növények: batáta, hagymafélék, tárógyökér és jamgyökér; • ipari növények: kakaó, kávé, cukornád, olajpálma, kókuszpálma, szőlő és gumifa; • gyümölcsfajok: banán, citromfélék, különböző trópusi és mérsékelt égövi gyümölcsfajok; • egyéb fajok : olajfa, szágópálma, datolyapálma, egyéb pálmafajok; • egyéb fafajok.


II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Az in vitro génbankokban kórokozómentes formában tárolt tenyészetekből felszaporított lombik növénykék postázásával megvalósulhat a kórokozómentes nemzetközi szaporítóanyagcsere. A jövőben nem kell attól félni, hogy a külföldről érkezett növénymintával annak kórokozóit is importáljuk. Hazánkban, sok nemzetet megelőzve, a hetvenes évek végén és a nyolcvanas évek elején a tápiószelei Agrobotanikai Központban létesült a burgonya in vitro génbankja (149 fajta), melyet a csicsóka- , majd a hagymagyűjtemény kialakítása követett (HESZKY et al., 1983, 1987). Végül visszautalva e fejezet címére, ,,in vitro génbank”, mely kifejezés alatt most, a XX. század végén azt kell értenünk, amit leírtunk. A XXI. században várhatóan megteremtődnek a molekuláris technikai feltételei annak, hogy a ,,génbankokban” valóban a géneket, tehát klónozott DNS szakaszokat vagy teljes genomokat (DNS) őrizzünk és tároljunk a maguk natúr formájában. Végül is a bennük tárolt genetikai információ az, amit meg kell őriznünk az utókor számára. Felhasznált és ajánlott irodalom Altman, A., B. Loberant (1998): Micropropagation: Clonal plant propagation in vitro. In: Altman A. (ed.): Agricultural Biotechnology 19–42. Marcel Dekker, Inc. New York–Basel– Hong-Kong. Altman, A., M. Ziv., S. Izhar, (eds). (1999): Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Academic Publishers pp. 770. Dordrecht–Boston–London. Ammirato, P. V. (1983): Embryogenesis. In: Evans, D. A.–Sharp, W R.–Ammirato, P. V. Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 1, 82–123. McMillan Publ. Comp., New York– London Bajaj, Y. P. S. (1985): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 1. Trees. Springer V., Berlin–Heidelberg– New York. Bajaj, Y. P. S. (1986): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 2. Crops. Springer V., Berlin–Heidelberg– New York. Bajaj, Y. P. S. (1987): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 3. Potato. Springer V. Berlin–Heidelberg– New York. Bajaj, Y. P. S. (1991): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation I. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Bajaj, Y. P. S. (1992a): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation II. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Bajaj, Y. P. S. (1992b): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation III. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Bajaj, Y. P. S. (1992c): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation IV. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Bajaj, Y. P. S. (1997a): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation V. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Bajaj, Y.P.S. (1997b): Biotechnology in Agriculture and Forestry. High Tech. and Micropropagation VI. Springer V. Boston– Heidelberg–New York. Barnabás B.: 1994. Preservation of maize pollen. In: Y. P. S. Bajaj, (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 25, 608–618. Binh, D., Heszky, L. E., Gyulai, G., Kiss, E., Csillag, A. (1989): Plant regeneration from callus of Puccinellia distans (L.) Parl. Plant Cell, Tissue and Organ Cult. 18: 195–200. Bornmann, CH, H.: 1993. Synthetic seed. In: Hayward, M. D., N. O. Bosemark. I. Romagosa (eds). Plant Breeding. Principles and Prospects. Chapman and Hall, London. Conger, B. V (ed.) (1986): Cloning Agricultural Plants Via in vitro Techniques. CRC Press. Inc. Boca Raton, Florida. 130 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Croes, A. F. Derksen, R., Kemp, A., van Wezel, H. Barendse, G. W. M. (1986): Influence of the developing fruit on aging of the floral stalk tissue with respect to flower bud regeneration in vitro. J. Plant Physiol., 125, 61– 68.  Deseuddre J.: Cryopreservation of in vitro cultures of plant cells and organs by vitrification and dehydratation. In: Dattée, Y., C.Dumas, A.Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 291–300. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg, New York. Doré, C. (1987): Application of tissue culture to vegetable crop improvement. In: Green, C. E.–Somers, D. A– Hacket, W. P. –Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 419–432. Dupnis, J. M., C. Roffat (1994): Pharmaceutical capsules as a coating system for artificial seeds. Biotechnology 12, 385–389. EngelmanN N, F. (1992): Cryopreservation of embryos In: Dattée, Y. C., Dumas, A. Gallais (eds): Reproductive Biology and Plant Breeding. 282–290. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg, New York. Etiene, E., C. Teisson, D. Alvard, M. LartaUd, M. Berhouly, F. Georget, M. Escalona, J. C. lorenzo (1999): Temporary immersion for plant tissue culture. In: Altman, A., M. Ziv, S. Izhar (eds.). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 629–632. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London. Fári M. (1986): Pepper (Capsicum annium L.) In: BAJAJ, Y P. S. (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, 2. Crops. 1, 345–362. Springer Verlag, Berlin. FujjII, J. A. Slade. D. T., Redenbaugh, K., Walker, K. A. (1987): Artificial seeds for plant propagation. Tibtech., 5, 335–339. Gorst, J.R., R. D. Teasdale (1999): Robotic micropropagation for commercial forestry. In: Altman, A., M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 632–642. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London. Green, C. E., Somers, D.A., Hacket, W P, Biesboer, D. D. (eds.) (1987): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 407–418. Halperin, W. (1969): Morphogenesis in cell cultures. Ann. Rev. Plant Physiol., 20, 395–418. Hartman R. D. (1999): Commercial micropropagation in the United States 1965–1998. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 699–708. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London. Haydu, Zs., Vasil, I. K. (1981): Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaf tissues and anthers of Pennisetum purpureum Schum. Theor. Appl. Genet., 59, 269–273. Heszky L. E., Enyingi K., Szabó I. (1983): Tissue culture technology for longterm storage and propagation of potato (Solanum tuberosum L.) germplasms. In: Sen. S. K., Giles, K. L. (eds.): Plant Cell Culture in Crop Improvement. Plenum, New York, 9–17. Heszky L. E., Nagy M. (1987): In vitro conservation of potato germplasm in Hungary. In: Bajaj, Y. P. S. (ed.): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 3. Potato. Springer V. Berlin– Heidelberg–New York. 441–451. Heszky L. E., Jekkel Zs., Abdel Hamid Ali (1990): Effect of cooling rate, cryoprotectant and holding time at different transfer temperatures on the survival of cryopreserved cell suspension culture (Puccinellia distans (L.) Parl.), Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 21: 217–226 Heszky L. E. (1975) : Possible ways of morphogenesis in higher plants tissue cultures. Acta Agronomica, 24, 123–141. Heszky L. E. (1973): Investigation at the early stage of embryogenesis into the development of the adventive embryo organized from a cell of the callus tissue in Daucus carota L. Acta Botanica, 22, 303–305. Heszky L. E., Do, Q. B., Kiss, E., Gyulai, G. (1989): Increase of green plant regeneration efficiency by callus selection in Puccinellia limosa (Schur.) Holmbg. Plant Cell Rep., 8: 174–177. Heszky L. E., Li Su Nam, Horváth, Zs. (1986): Rice tissue culture and application to breeding. Factors affecting the plant regeneration during subculture of diploid and haploid callus. Cereal Res. Comm., 14, 289–296. 131 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Holdgate D.P., E. A. Zandvoort (1999): Security cost effective product quality an essential for sustainable business. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 709–712. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston–London. Hu, C. Y., Wang, P. J. (1983): Meristem, shoot tip and bud culture. In: Evans, D. A., Sharp, W. R ., Ammirato, P. V., Yamada, Y. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. 1. Techniques for Propagation and Breeding. McMillan Pub. Comp., New York, 177–227. Ibpgr (1982, 1983, 1984): Annual Reports. International Board for Plant Genetic Resources, Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), Rome. Jámbor B. E. (szerk.) (1993): Dísznövények mikroszaporítása. Jegyzet. Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetem, Budapest, pp. 170. Jámbor B. E., Neményi A., Szendrák E., Kusztor G. (1995): In vitro regeneration and morphological study of Drosera species and Dionaea muscipula (Ellis) I. In vitro regeneration. Horticultural Science, 27, 16–19. Jámbor B. E., Neményi A., Szendrák E., Szafián Zs. (1997). in vitro propagation of Ailanthus altissima (Swingle) ‟Purple Dragon‟. Horticultural Science, 29, 22–25. Jekkel Zs., Gyulai G. and Heszky L.E. (1995): Cryopreservation of some halophyte grasses (Puccinellia sp.). In: Y. P. S. Bajaj (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 32. Cryopreservation of Plant Germplasm I. 245–255. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–New York. Jekkel, ZS., G. Gyulai, J. Kiss, E. Kiss & L. E. Heszky (1998): Cryopeservation of horse-chestnut (Aesculus hippocastanum L.) somatic embryos using three different freezing methods. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 52: 193–197. Kartha, K. K. (1984): Elimination of viruses. In: Vasil, I. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press. Inc., Orlando, Florida, 577–585. Kartha, K. K. (1986): Production and indexing of disease-free plants. In: Withers, L. A. (ed.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 219–238. Kartha, K. K. (1985): Cryopreservation of Plant Cells and Organs. CRC. Press, Inc. Boca Raton Florida. Kartha, K. K. (1992): Use of Cryopreservation in Breeding Programs. In: Dattée, Y., C. Dumas, A. Gallais (eds.): Reproductive Biology and Plant Breeding. 301–310. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Kiss E., Kiss J., Gyulai G., Garcia G. P., Heszky, L. E. (1995): A novel method for rapid micropropagation of pineapple. Hort. Science 30, 1, 127–29. Kozai, T., Q. T. Nguyen, C. Chun (1999): Environmental control in photoautotrophic micropropagation. in.: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 655–658. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht Boston– London. Li Su Nam, Heszky, L. E. (1986): Rice tissue culture and application to breeding: 1. Induction of high totipotent haploid and diploid callus from the different genotypes of rice. Cereal Res.Comm., 14, 197–203. LI Su Nam, Heszky, L. E. (1988): Screening for plant regeneration in callus and protoplast cultures of alfalfa (Medicago stativa L.) germplasms. Acta Botanica, 33: 387–393. Long, R. D., Cassels, A. C. (1986): Elimination of viruses from tissue cultures in the presence of antiviral chemicals. In: Whithers, L. A (ed.): Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications. Butterworths, London, 239–248. Nagakubo, T., M. Takaichi, K. Oeda (1997): Micropropagation of Allium sativum L. (Garlic). In: Bajaj, Y. P. S. (ed): Biotechnology in Agriculture and Forestry. 39, High Tech and Micropropagation V. 3–19. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg– New York. O’Hair, S. K, Baker, C. M., Bryen, H. H. ( 1987): Fluid drilling of embryos in potato improvement – a future possibility. In: Bajaj,Y. P. S. (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry Vol. 3. Potato. Springer, Berlin– Heidelberg, 487–498. 132 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

II. A SZAPORODÁS BIOTECHNOLÓGIÁJA Onishi, N.Y., Sahamoto, T., Hirosawa (1994): Synthetic seeds as an application of mass production of somatics embryos. PCTOC. 39, 137–145. Osuga, K. A. Komamine (1994): Synchronization of somatic embryogenesis from carrot at high frequency as a basis for the mass production of embryos. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 39, 125–135. Pierik, R. L. M. (1990): Rejuvenation and micropropagation. In: Nijkamp, H. J. J., L.H.W. van der Plas, J.van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 91–101. Kluwer Academic Press., Dordrecht– Boston–London. Quak, F. (1977): Meristem culture and virus-free plants. In: Reinert, J.–Bajaj, Y. P. S. (eds.): Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell Tissue and Organ Culture. Springer, Berlin–Heidelberg–New York, 598– 615. Redenbaugh, K.–Viss, P. Slade, D.–Fujii, J.A. (1987): Scale–up: Artificial seeds. In: Green, C. E.–Somers, D. A.–Hacket, W. P.–Biesboer, D. D. (eds.): Plant Tissue and Cell Culture. Alan R. Liss, Inc., New York, 473–493. Reinert, J. (1959): Über die Kontrolle für Morphogenese und Induktion von Adventivembryonen in Gewebekulturen aus Karotten. Planta, 53, 318–333. REUTHER, G. (1984): Vegetables. (Asparagus.) In: Sharp, W R. et al. (eds.): Handbook of Plant Cell Culture. Vol. 2. Crop Species. McMillan Publ. Company, New York, 211–242. Schuler, M. A.–Zielinski, R. E. (1988): Methods in Plant Molecular Biology. Acad. Press, New York–London. Skoog, F.–Miller, C. O. (1957): Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental Biology, 11, 118–131. Terzi, M., R. Cella, A. Falavigna (eds.) (1995). Current Tissues in Plant Molecular and Cellular Biology. Kluwer Academic Publishers, pp. 659–688 Thomas, E., Davey, M. R. (1975): From single cells to plants Wykeham Publ., London TRAN THANH Van, K. (1973): in vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues. Nature, London, 246, 44–48. Törmälä, T. (1990): Genotype–phenotype interplay in micropropagation. In: Nijkamp, L. H. W. van der Plas, J. van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 102–107. Kluwer Academic Press. Dordrecht–Boston–London. Vasil, I. K. (ed.) (1984): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Acad. Press Inc., Orlando, Florida, 82–95. Vassányi R.–Balázs E. (1982): Az ELISA-technika alkalmazása a növényi vírusok kimutatására. 2. füzet, Növényvédelmi Kutató Intézet, Budapest, 1–10. Vitropic–Cirad (1999): RITA Temporary Immersion System for Plant Tissue Culture. Whithers, L. A., Alderson, P. G. (eds.) (1986): Plant Tissue Culture and its Agricultural Application. Butterworths, London, 69–84. Whithers, L. A., F. Engelmann (1998): In vitro conservation of plant genetic resources, in: Altman, A (ed.) Agricultural Biotechnology. 57–88. Marcel Dekker, New York, Basel, Honkong. Ziv., M. (1990): Morphogenesis of gladiolus buts in bioreactors. implication for scaled–up propagation of Geophytes. In: Nijkamp, L. H. W. van der Plas, J. van Aartrijk (eds.) Progress in Plant Cellular and Molecular Biology. 119–124. Kluwer Academic Press, Dordrecht–Boston–London. Ziv, M. (1999): Organogenic plant regeneration in bioreactors. In: Altman, A. M. Ziv, S. Izhar (eds). Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. 673–676. Kluwer Acad. Publ., Dordrecht–Boston– London.


3. fejezet - III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 1. 6. A genetikai variabilitás növelése (Dudits D. és Heszky L.) 1.1. 6.1. Szomaklonális variabilitás 1.1.1. 6.1.1 Biológiai alapja és története A növény különböző testi (szomatikus) szöveteiből létesített in vitro kultúrákból (kallusz, sejtszuszpenzió, protoplaszt) regenerált növények ivaros utódai között kimutatható (genetikailag determinált) különbségeket nevezzük szomaklonálisvariabilitásnak. A regenerált növények egyes egyedeinek utódai a szomaklónok, amelyeknek szimbóluma az SC1, SC2, SC3 stb. A szomaklónok különböző típusokba sorolhatók és a gametoklóntól jól megkülönböztethetők (6.1/1. ábra).


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK

6.1/1. ábra: A különböző szomaklonális és gametoklonális variabilitás növényszintű realizálásának sémája (Heszky L., Simonné Kiss I. és mtsai 1996 nyomán) Szomaklón (klasszikus): Diploid növények, amelyeket a zigóta eredetű növények szomatikus szöveteinek in vitro tenyészeteiből regeneráltak. A variabilitás forrása a tenyésztett diploid sejtek genetikai instabilitása. A tenyészet típusának megfelelően a protoklónokat a protoplasztkultúrákból, a kalliklónokat a kalluszkultúrából regenerált szomaklónok jelentik. Pollenhaploid-szomaklón: Diploid növények, melyeket androgenetikus eredetű haploid növények szomatikus szöveteinek in vitro tenyészeteiből rediploidizációt követően regeneráltak. A variabilitás forrása a tenyésztett haploid sejtek genetikai instabilitása. A pollenhaploid szomaklónok egyben DH (doubled haploid) szomaklónoknak is tekinthetők. Gametoklonális variabilitás: A gaméta eredetű DH-növények között kimutatható (genetikailag meghatározott) különbségek. Gametoklón: Gaméta eredetű haploid, illetve rediploidizációt követően kapott doubled haploid (DH) diploid növények. A variabilitás eredete a meiózis során bekövetkező rekombináció.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A szomaklonális variabilitás tulajdonképpen a változatosság növelésének új lehetősége a növényvilágban. Azért csak a növényeknél, mert sem az állatok, sem az ember testi sejtjeiből még nem vagyunk képesek rutinszerűen kifejlett egyedet reprodukálni. A szomaklonális variabilitásnak, mint módszernek célja tehát a növények variabilitásának növelésével új és értékes típusok előállítása a nemesítés számára. Története STEWARD 1958-ban elsőként regenerált növényt tenyésztett sejtből. A genetika elfogadott posztulátumai alapján a növény különböző sejtjeiből regenerált növényeknek genetikailag azonosaknak kellene lenniük (klónok). A hetvenes évek második felében – miután a legfontosabb fajok esetében a regeneráció rutinszerűvé vált – figyeltek fel arra, hogy a regeneránsok között különbségek is vannak. Először ezt epigenetikai változásnak, illetve a külsőleg adagolt hormonok utóhatásának tartották. A tenyésztés folyamán bekövetkező genetikai (citológiai) változásokat először 1969-ben a cukornádnál figyelték meg. Azt követően megindult kutatások bizonyították a tenyésztett növényi sejtek genetikai instabilitását. Végül két ausztrál kutató, LARKIN és SCOWCROFT 1981-ben a genetikai instabilitást rendszerbe foglalta, és a variabilitásnak ezen új forrását szomaklonális variabilitásnak nevezte el. A szomaklonális variabilitás az ő megfogalmazásuk szerint az in vitro tenyészetekből regenerált növények közötti variabilitás (6.1/2. ábra).



6.1/2. ábra: Szomaklónok előállításának vázlata növényi rendszerben A kalluszkultúra az in vitro feltételek és a differenciálatlan fejlődés által kiváltott variabilitás realizálását teszi lehetővé. A protoplasztkultúra – abban az esetben, amikor a protoplasztokból közvetlenül szomatikus embriógenezissel, organogenezissel történik a növényregenerálás – alkalmas továbbá a növényben de novo létező sejtszintű variabilitás növényszintre hozatalára. A genetikai analízis a nem öröklődő változások kiszűrését szolgálja A variabilitás eredete A szomaklonális variabilitás genetikai okai két fő csoportra oszthatók attól függően, hogy a változás az izolálás előtt a növényben de novo, vagy az izolálást követően az in vitro körülmények hatására következik-e be. Az első csoportba tehát a primer szövet sejtjeiben már eleve létező különbségek, a másodikba pedig a szövettenyésztés által kiváltott genetikai instabilitás tartozik.

1.1.2. 6.1.2. Genetikai variabilitás a növényben in vivo A különböző növényi szövetek sejtjei között a DNS-tartalomban stabil eltérések mutathatók ki. Ezek a változások (endopoliploidia, eltérő DNS-tartalom, mutációk stb.) nagy valószínűséggel a különböző szövetek és 137 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK szervek differenciálódásakor, továbbá a növény élete során bekövetkező mutációs események következményeként alakulhatnak ki. Eredménye a növények sejtszintű szomatikus mozaikossága, amit újabban – egy századeleji fogalom felelevenítésével – poliszomatikusságnak (polysomaty) neveznek.

6.1/1. táblázat. A sejtmag relatív DNS-tartalma a haploid, a diploid és a tetraploid burgonya különböző szerveiben, valamint hajtás-, kallusz- és sejttenyészeteiben (Ramulu és Dijkhuis 1986 nyomán, Plant Cell Reports, 3. 234–237) Áramlásos citometriával (flow cytometry) vizsgálva bizonyították, hogy a burgonya különböző szövetei interfázisos sejtmagjának relatív DNS-tartalma eltérő (6.1/1. táblázat). Az adatokból egyértelmű, hogy a burgonya legfontosabb szerveiben levő sejtek DNS-tartalma között az eltérés 2–3-szoros nagyságrendű, és nem függ a növény eredeti ploidszintjétől. Emellett a növény élete során számos mutáció keletkezhet a különböző célra differenciálódott szövetek sejtjeiben, amit a sejtekben működő javító mechanizmus valamilyen okból nem korrigált. A szövettenyészetek létesítésekor az izolátummal tehát mutáns sejtek is táptalajra kerülhetnek és ezek utódjaiból, a növényregenerálást követően mutáns növények nevelhetők fel. A poliszomatikusság következménye végül is az, hogy az in vitro tenyészetek indításakor a növényi izolátum már eleve heterogén sejtekből áll. Kevés kísérleti adat áll rendelkezésünkre, hogy pontosan meghatározhassuk a de novo létező variabilitás arányát a szomaklonális variabilitáson belül. A különböző kutatók 30% körüli értékre becsülik. Természetesen ez az arány a fajtól, genotípustól és a tenyészetek típusától függően jelentősen változhat.

1.1.3. 6.1.3. A szövettenyészetek in vitro variabilitásának okai Az in vitro tenyésztett és dedifferenciálódott – tulajdonképpen funkció nélküli és folyamatosan osztódó – sejtekben, miután kikerülnek a szervezet korrelatív hatása alól, a genetikai változások bekövetkezésének valószínűsége jelentősen megnő. Hosszú időtartamú tenyésztés során ezek a változások, illetve a megváltozott sejtek egyre növekvő arányban halmozódhatnak fel a tenyészetekben. A genetikailag heterogénné vált tenyészetekből a redifferenciálódás indukciójával a sejtszintű variabilitás növényszintre, tehát az egyedek szintjére hozható. A tenyésztett sejtek szomaklonális variabilitását kiváltó okok két fő csoportra oszthatók, kromoszomális változásokra és molekuláris változásokra. 1. Kromoszómális változások Kromoszómaszám-változások. A legismertebb és leggyakrabban bekövetkező változások a poliploidia és az aneuploidia. Különböző tenyészetekből egész ploidsorok regenerálhatók, míg más fajoknak nagyfokú a stabilitása egy bizonyos ploidszinten (6.1/3. ábra). Burgonya protoklónokban például az aneuploidok aránya – a


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK tenyésztéstől függően – 35–95% között változott. A diploid S. brevidens (2n=2x=24) regeneránsok 50%-a tetraploid (2n = 4x=48) volt.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 6.1/3. ábra: Különböző aneuploid és poliploid regeneránsok a dohány szomatikus (2n = 4x = 48) kallusztenyészetéből Tetraploid 2n = 4x = 48 (A–A1), hexaploid 2n = 6x = 72 (B–B1), aneuploidok 2n = 4x = 44 (C–C1) és 2n = 4x = 42 (D–D1) (Heszky L. és Paál H. kísérlete, Agrobotanikai Intézet, Tápiószele) Kromoszóma-átrendeződések. Több kísérlet igazolta, hogy akkor is fellépett a variabilitás, amikor a kromoszómaszám nem változott. Feltételezték, hogy a tenyésztés, mint stressz hatására kromoszómatörések, újraegyesülések, transzlokáció, multicentrikusság következhet be. Ezek a változások kromoszómarészek elvesztésével, új kombinációban való egyesülésével járhatnak, ami növényszinten fenotípusos variációban jelenhet meg. A kromoszóma-átrendeződések következményeként változhat az egyes gének aktivitása is. Gének expresszálódhatnak, illetve represszálódhatnak, ami tovább növelheti a regeneránsok közötti variabilitást. A zab 20 hónapos tenyészeteiből regenerált növények részletes citogenetikai elemzése bizonyította, hogy a regeneránsok 88%-a citológiai szempontból abnormális volt. A leggyakoribb változásokat (reciprok transzlokáció, deléció, inverzió, nem homológ transzlokáció, centrikus és acentrikus fragmentek) a tenyésztett sejtek és az azokból regenerált növények kromoszómáinak ,,meiotikus‟‟ tulajdonságaival magyarázzák. Feltételezik továbbá, hogy a tenyésztési feltételek hatására a szomatikus crossing over gyakorisága is nő, mely során testvérkromatida kicserélődés is előfordulhat, delécióval, duplikációval, illetve ezek szegregánsaival a későbbi mitózisok során. Mindezek alapján a kromoszóma-átrendeződéseket napjainkban a szomaklonális variabilitás egyik fő forrásának tartják. 2. Molekuláris változások Jelenlegi ismereteink szerint a szomaklonális variabilitás hátterében már bizonyított molekuláris változások a következők: génmutációk, génamplifikáció, mozgékony genetikai elemek (transzpozonok) aktiválódása és a DNS metiláció változása. A molekuláris változások különösen azért következhetnek be, mert a tenyésztés során indukált dedifferenciálódás, majd redifferenciálódás molekuláris folyamatai a tenyésztett sejtek genomjának génregulációs mintázatát (pl. metilezettségi mintázatát) alapjaiban változtatják meg. E folyamat során figyelemmel a tenyésztett sejtek nagy számára (pl. egy ml sejtszuszpenzióban 10 5 sejt van), a kis gyakorisággal bekövetkező molekuláris hibák és egyéb változások is viszonylag nagyszámú mutáns sejtet eredményezhetnek. Amennyiben ezek a változások nem letálisak, a mutáns sejtek a tenyészetben felszaporodhatnak és belőlük a kiinduló típustól eltérő növények regenerálhatók. A DNS metiláltságának változása Phillips szerint az összes molekuláris változás, sőt a kromoszomális változások is közvetve vagy közvetlenül visszavezethetők a tenyésztett sejtek génjei (DNS) metilációjának változására. Holliday bizonyította, hogy negatív összefüggés van a gének promóterében lévő citozinok metiláltsága és a génexpresszió között. in vitro tenyészetekben az eredeti izolátum metilációs mintázata ,,szétesik” és a különböző sejtekben sokféle mintázat alakul ki. Ezt a jelenséget azzal magyarázzák, hogy a szövettenyészetekben a sejtek leggyorsabban úgy tudnak alkalmazkodni a mesterséges környezethez, táptalajhoz stb., hogy megváltoztatják génjeik metilációját (hipo/hipermetiláció). Ezek a metilációs mintázatbeli különbségek közvetve vagy közvetlenül okozói lehetnek a sejtosztódási aberrációknak, a kromoszomális eltérések kialakulásának, de kiválthatják a mozgékony genetikai elemek áthelyeződéseit, az amplifikációt, kvalitatív mutációt stb. Végeredményben a szomaklonális variabilitásnak, mint a variabilitás növelése és új forrásának moleku-láris hátterében új kiváltó okok és folyamatok húzódnak meg. E folyamatban központi szerepe van a DNS (gének) metilációja változásának, pontosabban fogalmazva a metiláció szekvencia specifikus változásának. Phillips szerint az in vitro szövettenyésztés beindít egy epigenetikai mechanizmust, mely – még minden részletében pontosan nem ismert folyamaton keresztül – ,,öröklődő” variációk kialakulását eredményezheti. Génmutációk


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Azok a változások, amelyek a regenerált növényeken nem láthatók, de azok öntermékenyítését követően fenotípusosan megjelennek, recesszív génmutációk következményei. A mutánsok legnagyobb része olyan, amely más úton is előállítható, de egy részük új tulajdonság forrásának tekinthető. A kukorica szomaklónok között talált stabil alkoholdehidrogenáz (ADH) mutáns molekuláris elemzése bizonyította, hogy az egy pontmutáció következménye. Az ADH gén 6. exonjában 1 bázispár csere következett be, ami az ADH enzimben valin-glutaminsav cserét eredményezett. Génamplifikáció Génamplifikációval magyarázható a herbicidrezisztens (imidazolinon) szomaklónok szelekciója. A rezisztens szomaklónok a nagyobb kópiaszám következtében túltermelik a herbicid hatóanyaga által gátolt enzimfehérjét. A szomaklónokból új kukorica hibridet állítottak elő, melyet hazánkban 1998-ban állami elismerésben részesítettek (lásd 10.1.5. pontban a herbicidrezisztens GM-növényeknél). Mozgékony genetikai elemek Ezek olyan DNS-szakaszok, amelyek a genomban egyik helyről a másikra képesek áthelyeződni. Feltételezik, hogy az áthelyeződés különösen akkor gyakori, ha a sejteket valamilyen különleges stressz éri (pl. in vitro tenyésztés). Abban az esetben, ha a transzpozonok demetilálódnak, termelődhet a kivágódásért és beépülését felelős enzim, mely azok áthelyeződését – mozgását a genomban – eredményezi. A kivágódás, illetve inszerció génregulációs következménye a gének be- és kikapcsolása (szabályozási mutáció) vagy azok módosítása (betoldásos mutáció). Ezekből a sejtekből regenerált növények egy része mindenképpen megváltozott geno- és fenotípusú lesz (pl. albinó lucerna).



6.1/4. ábra: Feketenyár (Populus nigra „SL”) szomaklónok molekuláris összehasonlítása RAPD elemzéssel. A szomaklónok a random primerekkel monomorf (A) és polimorf (B–C–D) mintázatot is adtak. M: DNS molekulatömeg marker; 1: kontroll növény; 2–19: szomaklónok, Primerek: A: OPERON P 08, B: OPERON A 16, C: OPERON A 13, D: OPERON J 06 (Kiss E., Kiss J., Törjék O., és Heszky L. kísérlete SZIE, Genetika és Növénynemesítés Tanszék, Gödöllő) A molekuláris változásokat az RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus), a RAPD (random amplifikált polimorf DNS), az AFLP (amplifikált fragment hosszúság polimorfizmus) és mikroszatellit PCR technikákkal számos növényfajnál bizonyították (6.1/4. ábra). E módszerekkel kimutatható különbségek a DNS átrendeződéseinek következményei. Ezek az átrendeződések lehetnek bizonyos DNS szakaszok amplifikációjának, inszerciójának, deléciójának, illetve bizonyos bázispárok változásának következményei. Sok


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK esetben akkor is kimutatható volt a molekuláris polimorfizmus, amikor a regeneránsok fenotípusa azonos volt. Ennek oka az, hogy a változások nem kódoló régiókban következtek be.

1.1.4. 6.1.4. A szomaklonális variabilitás módszere A variabilitás okainak bemutatásakor utaltunk arra, hogy egy része a donornövényben már jelen van, igazi forrása azonban az in vitro tenyésztés. Az in vitro eredetű variabilitást befolyásoló legfontosabb faktoroknak tekinthető: a) a faj és genotípus, aa) a ploidszint, aaa) a szövettenyésztés módszere és időtartama, aaaa) a táptalaj összetétele, különös tekintettel a növekedésszabályozó anyagokra. A faj és genotípus függőség nem igényel külön magyarázatot, az minden in vitro technikára – erősebb, vagy gyengébb hatással – jellemző. A ploidszint esetében a poliploid tenyészetekben főleg a kromoszomális, a haploid tenyészetekben pedig inkább a molekuláris változások a meghatározók. Abból a tényből kiindulva, hogy a molekuláris változások fenotípusos manifesztálódásának valószínűsége a ploidfok növekedésével csökken, feltételeztük, hogy az izolátumok ploidszintjének redukciójával a szomaklonális variabilitás növelhető. A szövettenyésztési módszer és időtartam szoros kapcsolatban van a variabilitás nagyságrendjével. Azoktól a módszerektől várható a legnagyobb variabilitás, amelyek a dedifferenciálódás, a differenciálatlan növekedés, illetve a redifferenciálódás indukcióját igénylik. Ide sorolhatók a protoplaszttenyészetek, a kalluszkultúrák és a sejtkultúrák. A variabilitás növelhető hosszú időtartamú tenyésztéssel, mert a genetikai változások jelentős része az osztódás során következik be, és a tartós tenyésztéssel a sejtciklusok száma jelentősen növelhető. A hosszabb tenyésztési ciklus továbbá lehetővé teszi a szomaklón sejtek felszaporodását a tenyészetekben. A táptalaj összetételétől függetlenül egyesek szerint a növényi sejtek in vitro tenyésztése önmagában is ,,mutagén kezelésnek” tekinthető. E vonatkozásban különösen a sejtek dedifferenciálódását indukáló és fenntartó szintetikus auxin, a 2,4-D az, amely leginkább felelős a tenyésztett sejtek, genetikai és citológiai instabilitásának kialakulásáért és annak mértékéért. Haploid szomaklón nemesítési módszer Az in vitro androgenezist és a tenyésztett sejtek genetikai instabilitását – mint lehetőségeket – hasznosítja az új fajták előállításában. Lényege, hogy a genetikai variabilitás növelése, és ezen keresztül a szomaklonális variabilitás kiváltása a pollenhaploid növények redukált ploidszintű szomatikus sejttenyészeteiben történik. A folyamat végén az új tulajdonságokkal rendelkező szomaklónokat diploid homozigóta (DH) formában kapjuk meg. (6.1/5. ábra).



6.1/5. ábra: A pollenhaploid szomaklón nemesítési módszer sémája. A módszer első lépésében a növényi sejtek ploidszintjét redukáljuk androgenezissel, majd a redukált ploidszintű (n) növények haploid szomatikus sejtvagy szövettenyészetében indukáljuk a variabilitást és a spontán rediploidizációt. Végül a harmadik lépésben a tenyészetekből közvetlenül DH-szomaklónok nevelhetők fel (Heszky L.,Simonné Kiss I. és mtsai 1996 nyomán)

1.1.5. 6.1.5. Fajhibrid szomaklónok A szomaklonális variabilitás távoli hibridizációval kombinálva lehetőséget ad idegen gének és kromoszómák kultúrfajokba való viszonylag gyors bevitelére, introgressziójára. A faj- és nemzetséghibrid szomaklónok jelentik az egyik fontos felhasználási területet. E célból az általában steril hibrid növényekből szövettenyészetet létesítenek és a hibrid sejtekből, kalluszokból – megfelelő időtartamú tenyésztést követően – növényeket regenerálnak. A dedifferenciáció miatt a tenyésztett sejtek, illetve az azokból regenerált növények a legkülönbözőbb számban és kombinációban fogják tartalmazni a szülői kromoszómákat, kromoszóma szegmenteket, illetve géneket (6.1/6. ábra).



6/1/6. ábra: Kromoszómák introgressziója fajhibrid szomaklónok előállításával A regenerált fajhibrid szomaklón növények között aszimmetrikus, addíciós és szubsztitúciós formák random fordulhatnak elő Ezzel a kromoszóma-szubsztitúción alapuló nemesítés (pl. stresszrezisztencia) idejét jelentősen lerövidíthetjük. Az első eredményes lépéseket az alábbi fajhibrid szomaklónok előállításával tették meg: Lolium perenne x L. multiflorum, L. multiflorum x Festuca arundinacea, Hordeum vulgare x H. jubatum, H. vulgare x Triticum aestivum, H. jubatum x Secale cereale, H. vulgare x S. cereale, Triticum sp. x H. vulgare, Agropyronsp. x T. aestivum, A. repens x Bromus inermis.

1.1.6. 6.1.6. Gyakorlati jelentőség és alkalmazás A gyakorlati alkalmazás szempontjából csak az öröklődő genetikai változások jelentenek értéket, szemben a nem öröklődő, tranziens vagy epigenetikai variációkkal. Az utóbbiaknak tekinthetők a táptalaj és az in vitro tenyésztési feltételek által kiváltott olyan fiziológiás tartós módosulások, melyek eltérő fenotípust eredményezhetnek, de ivaros úton nem adódnak át az utódokba. Ezek csak úgy szűrhetők ki, hogy a variabilitást az első szexuális nemzedékben, az SC2-ben vizsgáljuk.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Előnyei: Azok, akik a szomaklonális variabilitás mellett szólnak, a következő előnyökkel érvelnek: • a változások egy része gazdasági szempontból hasznos, • a változások gyakorisága nagy, • új tulajdonságok, illetve tulajdonság kombinációk állíthatók elő, • a változások nincsenek korlátozva, bármire kiterjedhetnek, • az új változatok homozigóta formában is előállíthatók, • az átlagosan 15%-ban előforduló mutánsokban – az indukált mutációval szemben – mozaikosság nem fordul elő. Hátrányai: A tényleges genetikai változások nemesítési értéke vonatkozásában a kutatók álláspontja különböző. A legfontosabb hátrányok, melyek a vitát kiváltották és fenntartják, a következők: • a szomaklonális változások előfordulása és gyakorisága előre nem tervezhető, • a szomaklonális variabilitás nagyságrendje nem, vagy csak ritkán haladja meg az adott fajra jellemző természetes variabilitást, • a szomaklónokban egyszerre nem csak egy, hanem több tulajdonság is megváltozhat, ez a kapcsoltság hátrányos lehet az értékes tulajdonság felhasználhatóságára, • a változások egy része a felhasználás szempontjából hátrányos. A szomaklonális variabilitás végül is minden növényfajnál felhasználható, ahol a növény→protoplaszt→növény, a növény→kallusz→növény és a növény→sejt→növény rendszerek már rutin módszerként alkalmazhatók. A növénynemesítési felhasználás során az alábbi célok realizálhatók: • meglévő fajták vagy fajtajelöltek javítása 1–2 tulajdonságban, • in vitro szelekcióval mutáns (rezisztens) sejtek, növények szelekciója, • faj- és nemzetséghibridekből gazdaságilag értékes fertilis (addíciós, szubsztitúciós) vonalak előállítása, • beltenyésztett vonalakból testvérvonalak indítása, • dísznövények esetében új piaci értékkel rendelkező változatok előállítása, • transzgénikus növények, fajták szomaklón változatainak előállítása. Felhasználás eredményei különböző fajokon. E rövid felsorolásban csak azokra a legvariábilisabb tulajdonságokra hivatkozunk, amelyekben a szomaklónok felülmúlták a kiinduló populációt: Cukornád: (Ez volt az első faj, amelyen a variabilitást bizonyították az 1960-as évek végén). Levélfoltossággal szembeni rezisztencia, cukortartalom. Búza: szárhosszúság, bokrosodás, tenyészidő hosszúsága, kalász alakja és szálkássága, levélállás, gliadinfehérjék és á-amiláz izoenzimek, fertilitás, klorofilltartalom, szemszín. Kukorica: fertilitás, növénymagasság, levélalak, klorofilltartalom, termés, tenyészidő hosszúsága, víztartalom, korai címerhajtás, címermorfológia, kétivarú virágok, hímsterilitás, betegség-ellenállóság.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Rizs: növénymagasság, termőképesség, koraiság, bugahosszúság, klorofilltartalom, bokrosodás.

fertilitás,

szálkásság,

szemprofil,

Lucerna: virágszín, levél morfológiája, kromoszómaszám, hidegérzékenység, termés, internódium-hosszúság, fertilitás. Dohány: levélszín, levélalak és -méret, fertilitás, három sziklevelűség, DNS-tartalom, virágfejlődés, klorofilltartalom, herbicidtolerancia. Szamóca: koraiság, betegség-ellenállóság, gyümölcsminőség, kromoszómaszám. Szeder: levélméret és -mintázat, gyümölcsméret, klorofilltartalom. Burgonya: termés, betegség-ellenállóság, levélalak és -szám, hajtás pigmentáltsága, növénymagasság, kromoszómaszám és -szerkezet, gumószín, -alak és -méret, vírusrezisztencia (Y), levéltetű, Alternaria és Phytophthora rezisztencia. Természetesen jóval több tulajdonságban is előfordulhatnak változások, azokat a kutatók feltehetőleg még nem vizsgálták. Minden bizonnyal vannak stabil tulajdonságok, amelyek most sem és a jövőben sem mutatnak szomaklonális variabilitást. Az első szomaklón eredetű fajtát, mely egy keményhúsú paradicsom volt (DNAP-9), az USA-ban 1984-ben állították elő. Az elmúlt közel két évtizedben a szendvicsekbe használható ropogós zellert és édesebb sárgarépát továbbá klórszulfuron és imidazolinon (herbicid) rezisztens repcét és kukoricát, édesebb paradicsomot, fehérvirágú lucernát, „Scarlett‟ nevű édesburgonyát, nagy termőképességű rizsfajtákat, valamint rovarrezisztens cirkot nemesítettek szomaklónok felhasználásával. Hazánkban Simonné Kiss Ibolya rizsnemesítővel előállított haploid szomaklón eredetű rizsfajtánk „DAMA‟ néven 1992-ben kapott állami elismerést (6.1/7. ábra).

6.1/7. ábra: Az első magyar biotechnológiai eredetű államilag elismert növényfajta, a DAMA üzemi szaporítása 1992 (B); melyet többezer haploid szomaklónból (A) hagyományos nemesítéssel állítottak elő (Heszky L. és Simonné Kiss I. kísérlete, SZIE Gödöllő és ÖKI, Szarvas)

1.2. 6.2. Mutánsok izolálása sejt- és szövettenyészetekben A növények génállományában hirtelen fellépő öröklődő megváltozásokat, a mutációkat a genetikusok régóta vizsgálják. A DNS bázissorrendjében bekövetkező változások vagy a kromoszómákat érintő szerkezeti módosulások egyaránt vezethetnek stabilan öröklődő fenotípusos eltérésekhez. A növényállományban spontánul kialakuló új genetikai formák száma jelentősen növekedhet kémiai vagy fizikai mutagének hatására. A mutációk legtöbb esetben recesszíven öröklődnek, de vannak domináns megváltozások is. A termé-szetben spontán fellépő mutációk az evolúció fontos tényezői. 147 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A fajta-előállítás folyamatában a növénynemesítők is felhasználhatják az új mutáns formákat. A mutációs nemesítés folyamán a magvakat vagy növényeket fizikai vagy kémiai mutagénekkel kezelik, és ha a szomatikus szövetek szintjén kialakult új genotípusú sejtek részt vesznek az ivarsejtek kialakításában, akkor mód nyílik a genetikai változás öröklődésére is. A recesszív mutációk fenotípusosan csak a későbbi nemzedékekben (M2, M3 stb.) jelennek meg. Ezért szelektálásukhoz nagy növénypopulációkat kell felnevelni és értékelni. Az in vitro tenyésztett növényi sejtek a mutáció szempontjából egy hatalmas populáció egyedeinek tekinthetők. Akár kalluszszövetekben, akár szuszpenziós kultúrákban a sejtek milliói szaporíthatók viszonylag kis helyen. Így lehetőség nyílik a kis gyakorisággal megjelenő mutáns sejtek, majd szövetek haté-kony és megbízható szelektálására. Az előző fejezetben láttuk, hogy az in vitro fenntartott sejtek esetében viszonylag nagy a szomaklonális variációt okozó genetikai változások száma. A mesterséges tenyésztés önmagában is hatékony ,,mutagén‟‟ annak ellenére, hogy keveset tudunk a kiváltó okokról. Természetesen a mutációs gyakoriság tovább növelhető a sejtek vagy szövetek besugározásával vagy kémiai mutagének használatával. Szemben a szabad földön és teljes növények szintjén végzett mutánsizolálással az in vitro módszer lehetőséget ad szelekciós nyomás alkalmazására is. A táptalajhoz adott gátló vegyületek segítségével specifikusan leállíthatók bizonyos sejtfunkciók, ami a vad típusú sejtek pusztulását okozza. Ugyanakkor a mutáció következtében megváltozott enzimeket szintetizáló sejtek képesek lehetnek a gátló hatás kikerülésére. A szelektív táptalajon túlélő sejtek felszaporodásával rezisztens szövetek képződnek, amelyekből bizonyos esetekben teljes növények redifferenciálhatók. Tehát a hatékony sejtszintű szelekció összeköthető a növényi szinttel. Az in vitro mutánsizolálás számos előnye mellett hátrányokkal is jár. A korlátozás abból származik, hogy a dedifferenciált, aktívan osztódó tenyészetekben elsősorban alapvető sejtfunkciókat érintő mutációk szelektálhatók. Érthető módon csak olyan tulajdonságokra lehet mutánsokat szelektálni, amelyek in vitro is megnyilvánulnak. Tehát nincs mód arra, hogy közvetlenül differenciált sajátosságokra vagy komplex tulajdonságokra, pl. a tenyészidő hosszúságára vagy a szemtermés mennyiségére szelektáljunk. Sok esetben ötletes szelekciós stratégiák alakíthatók ki, amelyek lényeges bioszintetikus utakban létrejött változásokat detektálnak ugyan, de ezeken keresztül a terméskomponensek, termesztési szempontból fontos tulajdonságok is befolyásolhatók.

1.2.1. 6.2.1. Az in vitro mutánsizolálás metodikai alapjai A mutáció fenotípusos megjelenése szempontjából lényeges a sejt ploidszintje. A recesszív sajátosságok kifejeződését csak haploid kromoszómaszámmal rendelkező sejtekben várhatjuk. Így a portokkultúrákból származó, mikrospóra eredetű szövetek vagy növények sok esetben nélkülözhetetlenek. Kísérleti tapasztalat, hogy recesszív mutánsokat is lehet azonosítani diploid sejtek tenyészeteiben. Ennek magyarázata az, hogy in vitro könnyen kialakulhatnak aneuploid kromoszómaszámmal rendelkező sejtek, amelyekből elveszhet a homológ kromoszómapárok egyik tagja, és így részleges haploidia alakul ki. Ezzel megteremtődik a kifejeződés feltétele recesszív mutáció esetében is. Szelektálhatunk kalluszszövetekben vagy többsejtes mikrokolóniákból álló sejtszuszpenziós kultúrákban. Az egyedül álló sejtekkel végzett szelekciónak azonban több előnye van. Ilyen sejtpopulációkhoz a protoplaszttenyészetek vezetnek (lásd később). Mutagének alkalmazásakor optimalizálni kell a besugárzás dózisát, illetve a kémiai mutagén koncentrációját és a kezelés idejét. Több kísérletben a nagy ölőhatású kezelés mellett döntenek, amelynek hatására a sejtek 90%-a is elpusztul. A túl hatékony mutagén kezelés azonban sok esetben másodlagos mellékhatásokhoz vezethet. Erősen megnő az egyidejűleg bekövetkező mutációk gyakorisága, ami rendellenes növényeket vagy a növényregenerációs képesség elvesztését okozza. A mutagén kezelést követően több sejtciklust is kitevő, ún. expressziós szakaszra van szükség, mielőtt sor kerülhet a szelekciós nyomás alkalmazására. A szelekció folyamata lehet közvetlen vagy közvetett, attól függően, hogy mutáns vagy vad fenotípusú sejtek túlélésére alapul. A szelekció körülményei megválaszthatók úgy, hogy az erős gátlás hatása alatt csak a mutációt hordozó sejtek és a belőlük kialakuló szövetek képesek életben maradni, már a szelekció első fázisában. A többlépéses szelekció során fokozatosan növeljük az inhibitor koncentrációját, lehetőséget adva az átmeneti érzékenységet mutató sejtek túlélésére. A hoszszabb időn át és csak lassan növekvő dózisban alkalmazott gátló hatás kedvezhet a génamplifikációs megváltozások kialakulásának. Ilyen esetekben a gén kópiaszámának megnövekedése következtében a kérdéses fehérje vagy enzim túltermelődése biztosíthatja a sejtek életben maradását a gátlás körülményei között.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A szelekció során életben maradt és felszaporodott szövetek még nem feltétlenül jelentik a mutációeredetű genetikai megváltozások bekövetkezését. A mutáció tényét legmegbízhatóbban az mutathatja, hogy a szelektált szövetekből regenerált növények, illetve azok ivaros utódai is megtartják a módosult fenotípust. Gyakran nincs lehetőség növényregenerációra. Ilyen esetekben a vizsgált tulajdonság stabilitását szokták a mutáció jeleként értelmezni. Ha hosszabb ideig szelekciót nélkülöző körülmények között folyó tenyésztés után megmarad a vizsgált tulajdonság, ez alátámaszthatja, de nem bizonyítja a mutációt.

6.2/1. ábra: Az in vitro mutánsizolálás lépései Az in vitro mutánsizolálással mind sejtmagban, mind extrakromoszómálisan lokalizált mutációk kereshetők. A következőkben a főbb mutánstípusokat mutatjuk be, amelyeket sejt-, illetve szövettenyészetekben szelektáltak (6.2/1 ábra). A végzett munka méreteit és eredményességét talán segít megítélni az az adat, hogy már több mint 100 sejtvariánst izoláltak in vitro. A ,,variáns‟‟ megjelölés használata bizonyos óvatosságot takar. Olyan esetekben alkalmazható, amikor nincs a mutáció ténye bizonyítva, csak ismert egy fenotípusos megváltozás, amely lehet epigenetikai eredetű is. Körülbelül 20 növényfaj bevonásával 51 fenotípust érintő megváltozásról számoltak be. Növény felnevelése 25 vonal esetében járt sikerrel, mintegy 10 faj bevonásával. Ugyanakkor csak 13 esetben sikerült utódanalízissel a mutáció tényét bizonyítani. Lehetséges, hogy az említett értékek idővel változnak, de az általuk tükrözött arányok jól mutatják a szelekciós munka várható hatékonyságát. Bármennyire is nyilvánvaló, hogy ez a megközelítés számos bizonytalansági tényezőt hordoz, a következőkben látni fogjuk, hogy ezen az úton értékes, hasznos tulajdonságú növényeket lehet nyerni. Az így kapott genotípusok növénynemesítési hasznosíthatóságát várhatóan hasonló faktorok befolyásolhatják majd, mint amelyek a klasszikus mutációs nemesítés és fajta-előállítás viszonyát meghatározzák.

1.2.2. 6.2.2. Aminosav analógokkal szembeni rezisztencia


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A természetes aminosavakkal szerkezeti analógiát mutató vegyületek bizonyos funkciókban helyettesíthetik az aminosavakat, de végső soron károsak az élő sejtekre. Segítségükkel azonban kiszűrhetők az aminosavanyagcsere enzimjeit érintő mutációk. Az aminosavak leggyakrabban használt analógjai: 5-metiltriptofán, 5fluorofenilalanin, az 5-aminoetilcisztein, az alfa-hidroxilizin, lizin-, illetve treoninanalógok. A lizin és a treonin nagy koncentrációban analógként működnek. Az analógokkal szembeni rezisztencia kialakulása többféle mechanizmusra is visszavezethető. 1.A végtermékgátlással szemben kevésbé érzékeny enzim kialakulása a mutáció következtében. Ez az egyik leghasznosabb mutánstípus, amely sok esetben aminosav-túltermeléshez vezet. Így például a WAKASA és WIDHOLM (1987) által izolált 5-metiltriptofánra rezisztens rizsmutánsok leveleiben a szabad triptofán mennyisége 54–70 nmol/g levél, míg a kontroll Norin-8 fajta esetében ez az érték 2,8 nmol/g. Érdekes megemlíteni, hogy a triptofán mellett a fenilalanin mennyisége is megnövekedett ezekben a mutánsokban. Ezen kívül triptofántúltermelő mutánsról számoltak be Datura, dohány és burgonya esetében is. 2.Felvételi mutánsok. Ilyen esetekben a sejtek azért maradnak életben, mert az analóg nem jut be a citoplazmába. 3.Lebontáson keresztüli detoxikáció. Példaként a para-fluoro-fenilalaninnak a fenilalanin-ammónia-liáz enzim általi lebontását említhetjük.

1.2.3. 6.2.3. Kondicionális letális mutánsok: auxotrófok Az ilyen típusú mutációk jelentős segítséget adhatnak az anyagcsereutak megismeréséhez, a fejlődés genetikai hátterének tanulmányozásához. Bourgin 1986-ban megjelent összefoglaló munkája átfogó képet ad az ezekkel a mutánsokkal végzett kutatások eredményeiről. A legkiterjedtebben vizsgált mutánsok a nitrátredukcióra képtelen, a nitrát reduktáz (NR) enzimmel nem rendelkező genotípusok. A nitrátot nitritté redukáló enzim egy fémtartalmú flavoprotein. A flavon általában FAD (flavin-adenin-dinukleotid) a fém pedig molibdén (Mo) és vas (Fe). Az enzimkomplex molekulatömege 500 kDa. A NR enzimet érintő mutációk klorátrezisztencia alapján közvetlenül szelektálhatók. Az enzimet tartalmazó vad típusú sejtek a klorátból kloritot képezve elpusztulnak, az enzimfunkció hiányában pedig a mutáns sejtekben a toxikus klorit képződése elmarad. A rezisztencia mellett az ilyen mutánsok valódi auxotrófként viselkednek, mert nem képesek nőni nitráttartalmú táptalajon. Ugyanakkor redukált nitrogénforrás, így aminosav keverék vagy ammónium-szukcinát jelenlétében a kolóniák növekednek. Az eddig izolált NR-mutánsok két csoportba oszthatók. A ,,nia” jelzésűek esetében a mutáció az apoproteint érinti, ezért mind a nitrát, mind a citokróm-C redukciós aktivitás hiányzik. A molibdén kofaktor génjének megváltozása miatt kialakuló NR-fenotípus egyben xantin-dehidrogenáz-hiánnyal is párosul. Ezeket „cnx” mutánsoknak nevezik. Nitrátreduktáz-hiányos mutánsokat elsősorban különböző dohányfajokból izoláltak. Ezek a vonalak jól használhatók sejthibridizációs kísérletekben. Az auxotróf mutánsok esetében valamelyik létfontosságú anyagcsereút egyik enzimjének megváltozása következtében a sejtek növekedése csak a táptalajhoz adott végtermék (aminosav, vitamin, nukleinsavbázis) jelenlétében biztosított. Ilyen típusú mutációkat fel lehet ismerni az egyes kolóniák egyedi tesztelésével, amikor összehasonlítjuk a szövetek növekedését ,,minimál”, vagyis kiegészítés nélküli, illetve ,,teljes”, kiegészítést tartalmazó táptalajon. Bár ez a módszer igen munkaigényes, haploid sejtek mutagén kezelését követően mégis több növény esetében sikerült így mutánsokat szelektálni. A méreteket szemléltetheti például, hogy 3070 Hyoscyamus protoplasztból felnevelt kolónia átvizsgálása 13 mutánst eredményezett. Több próbálkozás történt az auxotróf sejtek feldúsítására az osztódó sejteket szelektíven elpusztító vegyületek, így 5-bróm-deoxi-uridin (BUdR) segítségével. Minimál táptalajon az auxotróf sejtek növekedése leáll, csak a vad típusú osztódó sejtek építik be DNS-ükbe a toxikus BUdR-t. Ezen az úton el lehetett érni a mutánsok bizonyos feldúsulását, de az eddig értékelt kísérleti rendszerek nem bizonyultak tökéletesnek.

1.2.4. 6.2.4. Herbicidrezisztencia A totális herbicidekkel szembeni ellenállóságot mutató genotípusok nemcsak a szabadföldön jelenhetnek meg, hanem hatékonyan szelektálhatók sejt- és szövettenyészetekben is. Az in vitro végzett herbicidszelekció azért került az érdeklődés középpontjába, mert a gyomirtó szerekkel szembeni ellenállóság egyike azon sajátosságoknak, amire megbízhatóan lehet sejtszinten szelektálni, és a kialakuló genotípusnak potenciális agronómiai jelentősége van. A szántóföldeken a gyompopulációkban megjelenő rezisztens formák jelentősen hátráltathatják az eredményes növényvédelmet. A természetben lejátszódó folyamatok utánzása a lombikban 150 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK akkor lehet indokolt, ha a gazdasági növényekben kialakuló rezisztencia alapot ad környezetkímélő herbicidek szélesebb körű felhasználásához. CHALEFF (1986) összefoglaló munkájában részletesen jellemzi az in vitro szelektált genotípusokat. Dohánymutánsokat izoláltak pikloram, paraquat, amitrol és klóroszulfuron herbicidekkel szemben. A regenerált növényekkel végzett genetikai analízis egy gén által meghatározott domináns vagy szemidomináns mutációra vezette vissza a rezisztencia genetikai alapját. A klórszulfuronnal szembeni ellenállóság az acetolaktát szintáz megváltozott érzékenységéből származott. Ma már köztermesztésben vannak olyan kukorica hibridek, amelyek ilyen rezisztenciát hordoznak. A herbicidekkel végzett mutánsizolálási kísérletek külön csoportját alkotják a fotoszintézisgátlókkal szembeni rezisztenciára irányuló szelekciók. A cukrokat és növényi hormonokat tartalmazó táptalajokon a tenyésztett növényi szövetekben általában gátolt a fotoszintézis folyamata. Így ezek a tenyészetek eredeti formájukban nem alkalmasak ilyen típusú vegyületek hatásának vizsgálatára. Ezért CSÉPLŐ és mtsai (1985) a táptalajok cukortartalmát 0,3%-ra csökkentve létrehoztak ún. fotomixotróf tenyészeteket, amelyekben a kalluszszövetek növekedésének 70%-át a fotoszintetikus folyamatok biztosították. Az ilyen tenyészeteket azután már fel lehetett használni triazin típusú herbicidekkel szemben rezisztens dohánymutánsok előállítására. A terbutrin mint triazin típusú herbicid, a II. fotoszisztéma gátlásán keresztül fejti ki hatását, amelynek korai tünete a kloroplasztiszok kifehéredése. A CSÉPLŐ és mtsai (1985) által végzett szelekció olyan dohánynövényeket eredményezett, amelyek 10-5 mol terbutrin jelenlétében is zöldek maradtak. A keresztezési kísérletek anyai öröklődést mutattak ennél a rezisztenciatípusnál. A mutáns szövetekből regenerált növények növekedése és fotoszintetikus produktivitása kisebb volt, mint az eredeti genotípus növényeié.

1.2.5. 6.2.5. Szelekció betegségekkel és stresszhatásokkal szembeni rezisztenciára A különböző kórokozók toxinjainak felhasználásával számos szelekciós programot végeztek in vitro sejt- és szövettenyészetekben (SACRISTÁN, 1986). Bizonyos eredményeket sikerült elérni, pl. a Helminthosporiumtoxinokkal szembeni rezisztencia kialakításában. A számos kedvezőtlen mellékhatás és a nagyfokú bizonytalanság miatt azonban ezek a próbálkozások még nem nyújtottak nemesítést előmozdító növényi anyagot. Hasonló a helyzet a hideggel vagy a nagy sókoncentrációval szemben ellenálló növények szelektálásával kapcsolatban is. További alapkutatásra és szellemes ötletekre van szükség ahhoz, hogy növekedjék az eredményesség valószínűsége.

1.3. 6.3. Szomatikus hibridizáció protoplasztfúzióval A szomatikus hibridizáció során ivaros megtermékenyítés helyett a testi, ún. szomatikus sejtek egybeolvadása vezet a szülők tulajdonságait új kombinációban hordozó hibrid sejtek, illetve növények kialakulásához. Növények esetében a sejtfal mesterséges eltávolításával, protoplasztok izolálásával válik lehetségessé a sejtek egybeolvadása (fúziója).

1.3.1. 6.3.1. Az ivaros keresztezés lehetőségei és korlátai A növénynemesítés egész története tanúsítja a keresztezés, mint nemesítési módszer kulcsszerepét a fajtaelőállítás sikereiben. A termesztett fajták túlnyomó többsége keresztezéssel előállított növénypopulációból származik. A növénynemesítő gondosan kiválasztja a szülői genotípusokat, elvégzi mesterségesen a megtermékenyítést, és az utódok közül kiemeli a kívánt tulajdonságú növényeket. Mivel a fajtaelőállítás állandó versenyében célszerű a legjobb fajtákra építeni, a keresztezés célja többnyire csak néhány tulajdonság javítása. Ezért érthető, hogy a fajon belüli genotípusok, elsősorban a fajták közötti keresztezés a leggyakoribb. A faj- és nemzetséghibridek előállítása akkor kerül előtérbe, ha a kívánt sajátosság nem lelhető fel a faj egyedein. Termesztett növényeinkkel közeli vagy távoli rokon fajok gyakran hasznos génforrást jelenthetnek például a betegségekkel szembeni ellenállóság, a szárazság- és a fagytűrés, valamint a nagy fehérjetartalom, illetve kedvező aminosav-összetétel kialakításához. Az értékes gének felhasználhatósága és a nemesítési alapanyagba történő beépíthetősége a fajok közötti keresztezhetőségtől függ. Kiterjedt kísérletező munka eredményeként számos növénycsalád esetében sikerült keresztezni egy nemzetséghez tartozó, rendszertanilag rokon fajokat (fajkeresztezés), illetve különböző nemzetségbe sorolt, de ugyanazon alakkörbe – tribuszba – tartozó fajokat (nemzetségkeresztezés). A faj- és nemzetséghibridek tulajdonságairól részletes ismertetést találhatunk BELEA (1986) összefoglaló munkájában. A távoli hibridizációból származó növények gyakran kromoszómapárosodási zavarokat mutatnak, és fertilitásuk kicsi. A szülői kromoszómaszerelvények megkettőzése, illetve a többszöri visszakeresztezés jelentősen növelheti a faj- vagy nemzetséghibridek fertilitását és nemesítési felhasználhatóságát. A keresztezés eredményeként nagyszámú tulajdonság kerül át a szülői vad fajból a 151 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK termesztett növényfajtákba. Természetesen ezek közül csak néhány fontos a növénynemesítő számára, ugyanakkor számos nem kívánt bélyeg ronthatja a tenyészanyag értékét. Ezért ezeket a géneket szisztematikus visszakeresztezési programmal ki kell szűrni. Ez a mesterségesen megvalósított introgresszív hibridizáció olyan új formához vezethet, amely tulajdonságainak zömében a kultúrfajta egyedeihez hasonló, de génállománya kiegészül néhány értékes génnel, amelyek a vad fajból származnak. Tekintettel a lehetséges tulajdonságkombinációk nagy számára, megfelelő populációméret mellett több nemzedéken át kell fenntartani és értékelni a tenyészanyagot. A folyamatosan végzett szelekció végül értékes növényanyagot ad, amely általában közvetve járul hozzá a jobb fajták kinemesítéséhez. Kiterjedt kísérletezési tapasztalat mutatja, hogy a távoli keresztezésnek komoly korlátai lehetnek. Összeférhetetlenség (inkompatibilitás) gátolja a fajok közötti génmozgást. A mesterségesen előállított faj- és nemzetséghibrideket kivételnek kell tekintenünk. Előállításukkor a növénygenetikus tudatosan keresi azokat a fajkombinációkat, amelyekben keresztezésekor nem működik tökéletesen az evolúció során kialakult védelmi rendszer, és megtörténhet a megtermékenyítés, majd életképes utód alakulhat ki. A keresztezhetőséget ellenőrző folyamatok csak bizonyos határok között téveszthetők meg, amikor még jelentős a rokonság a szülőfajok között. A rendszertani távolság növelésével mind határozottabban érvényesül az összeférhetetlenség, és a hibridizáció még külső beavatkozással sem valósítható meg. A keresztezhetőséget megakadályozó tényezőket két csoportba oszthatjuk: 1.Gaméta-összeférhetetlenség folytán a bibére került virágpor képtelen kicsírázni, illetve a pollentömlő rövid, és így nem tud behatolni az embriózsákba. A petesejt megtermékenyítésének elmaradása következtében nem alakul ki életképes zigóta. Prezigotikus összeférhetetlenségnek is nevezik az említett rendellenességeket. 2.A hibrid embrió pusztulása, amely bekövetkezhet az embrió és az endospermium közötti kapcsolat zavaraiból, a tápanyagellátás hiányából. A szülői kromoszómaállományok összeférhetetlensége gyakran vezet az egyik szülő kromoszómáinak elvesztéséhez, haploidok kialakulásához. A hormonális rendellenességek megakadályozhatják az embriók differenciálódását. Ezek a posztzigotikus folyamatok jelentős akadályt jelentenek a távoli hibridek létrejöttében. Bizonyos hibridkombinációban sikerült az összeférhetetlenségi reakciók egy részét kiküszöbölni. Így a hibrid embriók mesterséges felnevelése vagy az anyanövény hormonkezelése javította a hibridizáció eredményességét. A számos próbálkozás ellenére az ivaros keresztezés csak egy viszonylag szűk rokonsági körön belül lehetséges. Az evolúciós határok jelentős túllépését és így a rendszertanilag távoli növények közötti hibridizációt az összeférhetetlenség (inkompatibilitás) szigorúan megakadályozza. A fennálló korlátok ellenére sok izgalmas alapkutatási probléma megoldásához, illetve fontos nemesítési célok eléréséhez szükséges lenne a nem rokon növények tulajdonságainak kombinálása. Tekintettel a megtermékenyítéshez kapcsolódó érzékeny védelmi rendszerre, célszerű az ivaros folyamatokat megkerülni, és a testi, ún. szomatikus sejteket használni fel az új genotípusok létrehozásához. A testi sejtekkel történő hibridizáció feltételeit, módszereit és eredményeit a következőkben mutatjuk be.

1.3.2. 6.3.2. Protoplasztokból felnevelt növények A protoplasztok sejtfaluktól megfosztott, külső sejtmembránnal rendelkező növényi sejtek. A növényi sejtek jellegzetes alkotórésze a sejtfal, amely körülveszi a sejtmembránnal (plazmalemmával) határolt citoplazmát. A sejtfal alapvető funkciókat lát el a sejt és környezete közötti kapcsolat kialakításában, a sejtek növekedésében, osztódásában. A primer növényi sejtfalban a párhuzamos elemi cellulózfibrillumok közé ágyazódnak a pektinanyagok, a hemicellulózok és a fehérjék. A sejtfal mesterséges eltávolításával a növényi sejtek különleges formái, a protoplasztok nyerhetők (6.3/1 ábra). Hasonlóan az állati sejtekhez, a növényi protoplasztok esetében is csak külső sejtmembrán határolja a sejteket, és ezzel lehetővé válik makromolekulák bejuttatása a citoplazmába, illetve a sejtek egybeolvadása (fúziója). Ezért a protoplasztok különleges kísérleti objektumot jelentenek a testi sejtekkel végzett genetikai manipulációhoz. A következőkben látni fogjuk, hogy a sejthibridizáció elengedhetetlen feltétele a tökéletes protoplasztálás, illetve számos DNS beviteli módszer a protoplasztok felhasználására épül.



6.3/1. ábra: Szójaprotoplaszt pásztázó elektronmikroszkópos képe (Hadlaczky Gy. felvétele) Protoplasztok képződését már a századfordulót megelőző években megfigyelték. Plazmolizált sejtekből kiszabaduló protoplasztokat nyertek a sejtfal mechanikai megsértésével vagy szövetek metszésével. A hatékony és megbízható protoplasztizolálást a sejtfalbontó enzimek alkalmazása tette lehetővé. COCKING 1960-ban számolt be kísérletéről, amelyben Myrothecium verrucariából nyert cellulázzal paradicsomgyökérből sikeresen izolált protoplasztokat. A protoplasztkutatás fontos állomásait jelentették az eredményes tenyésztési kísérletek, amelyek 1971-ben dohánynövények levélprotoplasztokból való felneveléséhez vezettek. Nagata és Takebe japán kutatóknak sikerült először kiépíteniük a protoplaszttól a növényig vezető utat. Ezek a sikerek világszerte intenzív kutatást indítottak el. Gyors fejlődésnek indult a növényi szomatikus és sejtgenetikai kutatás, amely nem nélkülözheti a protoplasztokat. A több évtizedes kísérletezési tapasztalat birtokában a protoplasztizolálás és -tenyésztés általános szempontjai az alábbiakban foglalhatók össze: A hatékony protoplasztálási módszerek a sejtfalat enzimatikus lebontással távolítják el. Tekintettel a sejtfal főbb komponenseire, cellulázból, hemicellulázból és pektinázból álló enzimkeverék használata a legcélszerűbb. Az enzimek koncentrációja fajonként és sejttípusonként 0,5–2% között változik. A sejtfal emésztésével párhuzamosan ozmotikusan stabilizálni kell a protoplasztokat. Ozmotikumként szolgálhat mannitol vagy szorbitol, illetve glükóz 0,4–0,6 mol koncentrációban. A protoplasztok állóképességét jelentősen növeli az izolálóoldathoz adott Ca2+. Az enzimkeveréket pH 5-6 közötti értékre indokolt beállítani, amelyet különböző pufferekkel stabilizálnak. A hatékony enzimek birtokában gyakorlatilag a növény minden részéből lehet protoplasztokat nyerni. A protoplasztálás eredményessége bizonyos mértékben befolyásolható az enzimkészítmény megválasztásával, de alapvető szerepe a növényanyag állapotának van. Kiindulási anyagként lehet szabad földön vagy üvegházban nevelt növényeket használni. Ebben az esetben a levelek felszínét nátriumhipoklorittal vagy higanykloriddal sterilizálni kell. Ha mód van rá, jobb a protoplasztáláshoz használt növényeket in vitro tenyészetekben nevelni. Ehhez a magokat sterilizáljuk, majd steril körülmények között csíráztatjuk. A fiatal levél vagy a hipokotil kiváló protoplasztforrás lehet. A steril növények hajtástenyészetekben szaporíthatók és folyamatosan fenntarthatók. Így a kívánt növényállapot könynyen biztosítható. Kedvező hatású lehet a növények kis fényintenzitás melletti tenyésztése. Néhány növény esetében a protoplasztálást elősegíti, ha a szöveteket, pl. leveleket levágjuk, majd sötétben tenyészoldatban előinkubáljuk. Az enzimkezelés időtartamát szintén növényenként kell optimalizálni. Gyakran 10–12 órai emésztés után válnak le protoplasztok a kívánt mennyiségben. Ilyen hosszú inkubációnál tenyészoldatban indokolt protoplasztálni. Az enzimoldat és a tenyészoldat keverésekor az oldatok ozmotikus értékeire kell figyelemmel lenni. Az ozmotikus stressz mértékét célszerű csökkenteni, ezért azt a lehetséges legalacsonyabb értéket kell választani, amelynél a protoplasztok még épek maradnak. Nagyszámú, homogén protoplaszt 153 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK izolálható szuszpenziós kultúrában tenyésztett sejtekből. A növényi hormonok jelenlétében fenntartott sejtek intenzíven osztódnak, és jól alkalmazkodnak a mesterséges tenyésztési körülményekhez. Az enzimoldat és a sejtszuszpenzió összekeverése után a tenyészetek gyengén rázathatók. A mozgatás elősegíti a protoplasztok leválását. A protoplasztálhatóság és a tenyészthetőség szempontjából a szuszpenziós kultúra táptalajának cseréje után 2–3 nappal a legjobb a sejtek állapota. Természetesen a tenyészetek sejtdenzitása alapvetően befolyásolja azok növekedési jellemzőit, így a protoplasztálás optimumát is.

6.3/2. ábra: Fertilis búzanövények felnevelése protoplasztokból A) Rázatott tenyészetben búza sejtszuszpenziós kultúra, B) Protoplasztok izolálása sejtfalbontó enzimekkel, C) A protoplasztok tisztítása felfugálással, D) Frissen izolált protoplasztok, E) Sejtfal regeneráció után a sejtek osztódása mikrokolóniák kialakulásához vezet (Pauk János kísérlete, GKI, Szeged) Az enzimkezelés befejeztével a protoplasztokat 40–60 ìm-es fém- vagy műanyag szűrő segítségével választhatjuk el a szövettörmeléktől. A protoplasztok asztali centrifugán 1000/perc fordulat mellett ülepíthetők, majd a leszívott enzimoldatot mosóoldatra cserélve, a mosást 2-szer, 3-szor indokolt megismételni. Nagy tisztaságú protoplasztszuszpenziók nyerhetők felfugálással (6.3/2 ábra). Ilyenkor 0,5 mol szaharózoldattal felefele arányban összekeverjük az enzimoldatot, majd a keverék tetejére mosóoldatot rétegezünk. A sűrű enzimoldatban a centrifugálás hatására a protoplasztok a felső határréteghez vándorolnak, a meg nem emésztett sejtek, szövetdarabok pedig leülepednek. A mosás után a protoplasztok sejtfúziós és transzformációs kísérletekben használhatók fel. Mivel az enzimek eltávolításával egyidőben megindul az új sejtfal képződése, fontos, hogy a protoplasztokat azonnal felhasználjuk. A mosó- és kezelőoldatokból a protoplasztok a tenyészoldatba kerülnek. A protoplasztok sikeres tenyésztése magában foglalja a gyors sejtfalképzést, a nagy gyakorisággal bekövetkező sejtosztódást, a hatékony kolóniaképzést és végül teljes növények regenerálását. Mivel e komplex folyamatrendszer molekuláris alapjait nem ismerjük, sok-sok kísérletezés, próbálkozás és kudarc vezet egy-egy tenyésztési módszer kidolgozásához. Gyakran a közölt kísérletek ismétlése is nagy erőfeszítést igényel. Nincs általános érvényű recept. Fajonként, esetleg genotípusonként kell kidolgozni az optimális körülményeket. A számtalan közlemény alapján csak szűk keretek között adhatók meg hasznos útjelzők a táptalajok és módszerek dzsungelében. Ha a gyakrabban használt protoplaszt táptalaj összetevőit értékeljük, látható, hogy ezek a szuszpenziós kultúrákra épülnek, kiegészítve azokat ozmotikus stabilizátorokkal, esetleg aminosavakkal, vitaminokkal. A sikeres tenyésztés különösen két 154 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK tényezőtől függ. Az egyik maga a növény, a másik pedig a táptalaj hormonjainak típusa és mennyisége. A protoplasztokkal dolgozó kutatók korán tapasztalták, hogy vannak növények, például a Solanaceae család fajai, amelyek viszonylag könnyen tenyészthető protoplasztokat adnak, sok növény esetében viszont az optimalizálás igen nehéz vagy megoldhatatlan. Fontos megfigyelés, hogy alapvető különbségek lehetnek a faj genotípusai között. Az in vitro viselkedés genetikailag meghatározott sajátosság. Ezért célszerű a fajták és vonalak összehasonlító értékelése. A jól kiválasztott növény a siker alapja lehet. A tenyészthetőséget lényegesen meghatározza a protoplaszt eredete is. Általában könnyebben tenyészthetők a sejttenyészetekből származó protoplasztok. Fontos, hogy a protoplasztforrásként használt sejtek, kolóniák még rendelkezzenek a növényregeneráció képességével. A sejttenyészetek használata kétélű fegyver. A tenyésztés előrehaladtával a kultúrák egyre jobban alkalmazkodnak az in vitro körülményekhez, így a belőlük nyert protoplasztok könnyebben kezelhetők. Ugyanakkor a tenyészetek korával megnő a kromoszomális rendellenességek száma, és csökken a növénydifferenciálódási potenciál. Sok növénynél jól tenyészthetők a levélprotoplasztok. Ugyanakkor vannak fajok, amelyek protoplasztjait merisztematikus szövetekből kell izolálni. Mind a sejtosztódás indukálásában, mind a növényregeneráció megindításában kulcsszerepe van a táptalajhoz adott hormonoknak. Ezek a belső hormontartalommal kölcsönhatásban fejtik ki hatásukat, ezért a válaszreakciók nehezen becsülhetők, és a kísérletek ismételhetősége bizonytalan. Nehezíti a helyzetet, hogy a tenyésztés folyamán többször kell változtatni a táptalaj hormonösszetevőit. A hormonhatás időoptimumának megválasztása döntő tényező. A szintetikus auxinok, így a 2,4-diklórfenoxiecetsav (2,4-D) vagy a naftilecetsav (NES) elengedhetetlen a sejtek osztódásához. A citokininek kis koncentrációban javíthatják az osztódó sejtek gyakoriságát. Lényeges szempont, hogy protoplasztálás után az egymástól elválasztott sejtekben kell a mitotikus aktiválódást kiváltani. Természetesen a táptalajon keresztül van kapcsolat a sejtek között. A kondicionáló hatás fontos, ezért szükség van egy minimális sejtszámra a kolóniaképzés megindulásához. Több protoplaszttípus esetében jobb a kolóniaképzés, ha a fiatal sejteket alacsony olvadáspontú agarózba ágyazzuk, majd az agarózblokkokat folyadékban tenyésztjük tovább. Ilyen tenyészetekben az agaróz szilárd környezetet nyújt a sejt számára, hasonlóan a szöveti kötelékhez. Előnye ennek a módszernek, hogy lehetővé válik a külső folyékony táptalaj gyakori cseréje. A protoplasztok természetesen tenyészthetők ozmotikusan stabilizált folyadékkultúrában. Szemben a manitollal és szorbitollal, a glükózt metabolizálják a sejtek, így a tenyésztés alatt fokozatosan csökken a táptalaj ozmotikus nyomása. Ez kedvező, mert a sejtfal regenerációja után már szükségtelen a nagy ozmotikus érték. A protoplasztokból nyert szövetek differenciálódása alapvetően azonos törvényszerűségeket követ, mint a szöveteredetű kalluszoké (lásd 3. fejezet). Bár az egyetlen sejtből származó szövetekben a növények regenerációjának kiváltása gyakran nehezebb, mint amikor organizált növényi szerv szolgál inokulumként. A fentiekben vázolt általános szempontok megvalósítását az alábbi példák szemléltetik: Búza E fontos gabonanövényünk esetében a teljes protoplaszt→növény rendszer szelektált genotípusok esetén rendelkezésre áll (PAUK és mtsai, 1994). Eddig sikertelen volt minden próbálkozás, amelyben levélprotoplasztok tenyésztésével kísérleteztek. Tenyészthetők azonban a sejtszuszpenzióból izolált protoplasztok akár az egyszeres ősi forma, a Triticum monococcum (DUDITS–NÉMETH, 1976), akár a T. aestivum esetében (MADDOCK, 1987) A 6.3/2–3. ábrákon a Pauk János által kifejlesztett kísérleti rendszer egyes lépései láthatók. A sejtszuszpenzió mikrokolóniáit rázatott tenyészetekben szaporítjuk (6.3/2. ábra A). Petricsészében történik az enzimkezelés (6.3/2. ábra B), majd a protoplasztok tisztítása felfugálással biztosítható (6.3/2. ábra C).



6.3/3. ábra: Fertilis búzanövények felnevelése protoplasztokból A) Protoplaszt eredetű többsejtes kolónia, B) Mikrokolóniák kialakulása agarózba ágyazott sejtekből, C) Zöld hajtáskezdemények differenciálódása, D) Protoplaszt eredetű fertilis búzanövények (Pauk János kísérlete, GKI, Szeged) A búza szuszpenzióból származó protoplasztok (6.3/2. ábra D) a sejtfal újra szintetizálása után osztódni képesek. Többszöri sejtosztódás után mikrokolóniák alakulnak ki (6.3/2. ábra E és 6.3/3 ábra A). Az agaróz blokkokban nagyszámú kolónia jelzi a tenyésztés hatékonyságát (6.3/3. ábra B). Hormonmentes táptalajon vagy alacsony koncentrációjú 2,4-D jelenlétében megindul a zöld, differenciált strukturák, hajtáskezdemények kialakulása (6.3/3. ábra C). Az in vitro képződött hajtások, növénykék gyökeresedés után talajba ültethetők és kifejlett, fertilis búza növények nyerhetők (6.3/3. ábra D). Kukorica


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Ezzel az egyszikű növénnyel kapcsolatban is a sejtszuszpenziós kultúrák használata biztat eredményekkel. KAMO és mtsai 1987-ben számoltak be olyan embriogén kukoricasejtvonalról, amelyből osztódásra képes protoplasztokat lehetett izolálni. A képződő kalluszok bizonyos mértékig megtartották morfogenikus képességüket. Gyökerek és hajtásszerű képződmények differenciálódását lehetett megfigyelni. Az elért kezdeti eredmények nagymértékben a megfelelő genotípus kiválasztásának köszönhetők. A szerzők keresztezéssel egyesítették a regenerációs képességet az A 188 vonalból és a szuszpenziós kultúrák kialakíthatóságát a Black Mexican Sweet fajtából. Az éretlen F1 embriók kallusztenyészeteiben szelektálták a II típusú kalluszokat, és ezekből indították a szuszpenziós kultúrákat. Hasonló meggondolást követtek RHODES és mtsai (1988), akiknek az A 188 genotípus protoplasztjaiból sikerült növényeket felnevelni. Eddig az egyik legsikeresebb kukorica protoplaszt szövettenyésztési rendszert MÓROCZ és mtsai (1990) fejlesztették ki. A közel egy évtizedes nemesítési munkával előállított HE/89 genotípus különleges auxin autotróf képességgel rendelkezik. A protoplaszt eredetű kalluszszövetek könnyen átalakulnak késői embriogén állapotba, megjelennek embriogén strukturák, majd a hajtáskezdemények (lásd később a 7/26. ábrát). Egyedülálló képessége ennek a tenyészetnek, hogy 8–10 éves tenyésztés után is megőrizte regeneráló képességét. Rizs Ez ideig több laboratóriumban sikeresen regeneráltak zöld rizsnövényeket protoplaszt eredetű kalluszokból (YAMADA és mtsai 1986; KYOZUKA és mtsai, 1987). A kutatók két alapvetően különböző megközelítést követtek. Az egyik esetben a ,,nevelő” sejtek használata nagy gyakoriságú növényregenerációt tett lehetővé több tenyésztett fajta bevonásával. Érett embriók 2,4-diklórfenoxiecetsavval (2,4-D-vel) történt kalluszosítása után a protoplasztokat vagy az elsődleges kalluszokból, vagy a felhasználásukkal létrehozott sejttenyészetből izolálták. A protoplasztokat ,,Sea Plaque‟‟ agarózba való ágyazás után olyan sejtekkel tenyésztették együtt, amelyek intenzíven osztódtak, de regenerációra képtelenek voltak. A nevelő sejtek jelenléte elengedhetetlen volt a megbízható kolóniaképzéshez. A másik módszer alapja a finom, kis kolóniákat tartalmazó sejtszuszpenziók létrehozása volt. Ehhez a Taipei 309 fajta fiatal csíralevelein először kalluszokat indukáltak, amelyből aztán ún. aminosav-táptalajon szuszpenziós tenyészetet hoztak létre. Ez a táptalaj csak glutaminsavat, aszparaginsavat, arginint és glicint tartalmazott, mint N-forrást. Ilyen körülmények között a tenyészetek kisméretű kolóniákat képeztek, amelyekből jól lehetett protoplasztokat izolálni. A kimosott protoplasztokat a tenyésztés előtt 5 percig 45 C o-os hőkezelésnek vetették alá, majd agarózzal szilárdított táptalajon tenyésztették. A növényregeneráció ebben az esetben is hormonmentes N6 táptalajon következett be. A bemutatott két kísérleti rendszer lehetővé teszi a rizsprotoplasztok felhasználását a genetikai manipulációs kísérletekben. Az alkalmazott tenyésztési fogások ötleteket adhatnak a többi gabonafélével végzett protoplasztmunkákhoz is. Repce Tekintettel a Brassica fajok széles körű mezőgazdasági hasznosítására, a protoplaszttenyésztési módszerek kidolgozásának nagy jelentősége van. A Brassicaceae család több fajánál is alkalmazható megfelelő hatékonyságú tenyésztési rendszert Glimelius írt le 1984-ben. Közleménye alapján a Vetőmag Vállalat Kutató Állomása (Szentes) megbízásából Magyarországon végzett kísérletek eredményét a következőkben ismertetjük, rámutatva a repceprotoplasztok tenyésztésének néhány kulcslépésére. A Brassica napus L ssp. oleifera (Olga fajta) magjainak felszínsterilizálása után a 4–5 napig sötétben csírázott növénykék hipokotilja jobb protoplasztforrásnak bizonyult, mint az üvegházban vagy a steril tenyészetben nevelt növények. A feldarabolt hipokotilszöveteket 0,3 mol mannitolt és 0,05 mol CaCl2. 2H2O-t tartalmazó oldatban előplazmolizáljuk, majd a protoplaszt-tenyészoldatban oldott enzimekkel inkubálva könnyen nyerhető megfelelő számú protoplaszt (6.3/4.A ábra). A repceprotoplasztok tisztításához is jól bevált a felfugálásos módszer. Az enzimoldatból kimosott protoplasztok falképzése és osztódása olyan Kao-Michayluk-féle K75 tenyészoldatban (1974) volt optimális, amelyben 2,4-diklórfenoxiecetsav, naftilecetsav és benziladenin szolgált növényi hormonként. 2,5x104/ml protoplasztdenzitás felett a kolóniák növekedése jelentősen gátolt. A 3–5 napos sejtek agarózba ágyazhatók vagy folyadékban tenyészthetők tovább. A friss táptalaj nem tartalmaz hormonokat. A képződött kolóniák láthatók a 6.3/4.B képen. A differenciálódás indukálásához a tenyészeteket át kell helyezni K 3táptalajra (NAGY és MALIGA, 1976), amelyben 2% szaharóz, 0,1 mg/l indolecetsav és 2 mg/l zeatin van. Amint az a 6.3/4.C képen látható, a kalluszszöveteken zöld hajtások jelennek meg, amelyek azután növénnyé nevelhetők (6.3/4.D. kép).



6.3/4. ábra: Repce- (Brassica napus) protoplasztok tenyésztése és növénydifferenciálása A) Hipokotilszövetekből izolált protoplasztok, B) Protoplaszt eredetű kolóniák, C) Hajtások differenciálódása, D) Regenerált repcenövény (Török É. kísérlete)

1.3.3. 6.3.3. A protoplasztok egybeolvadása – mesterséges sejthibridek Természetes körülmények között a haploid kromoszómakészlettel rendelkező ivarsejtek egybeolvadása vezet a zigóta kialakulásához. A sperma sejtmagjának és petesejt magjának egyesülésével válik lehetővé a két szülő génállományának összeadódása és az új, hibrid genotípus kialakulása. Az egybeolvadás feltételei az embriózsákon belül alakulnak ki, miután a pollentömlő a mikropylén át behatol, és kiszabadul a két spermasejtmag. Az egyik a haploid petesejt magjával, a másik pedig a diploid poláris sejtmaggal egyesül. E kettős megtermékenyítés eredménye a diploid (2n) zigóta és a triploid (3n) endospermium. A növények többségénél az apai citoplazmatikus sejtorganellumok nem jutnak be az embriózsákba. Így az utód kloroplasztiszai és mitokondriumai elsősorban anyai eredetűek. A természetben lejátszódó zigótaképződés mesterséges utánzására ad lehetőséget a növényi protoplasztok fúzionáltatása. Tekintettel arra, hogy a protoplasztok többnyire diploid kromoszómaszámú testi sejtekből származnak és protoplasztfúzió esetén a 158 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK citoplazmák is keverednek, a két folyamat végeredménye eltér egymástól. Lényeges azonban, hogy mindkét esemény hibrid genotípusok létrejöttével jár. A szomatikus (testi) sejtek közvetítésével történő hibridizáció gondolata nem új. Növényi szövetek egymásra oltásával számos próbálkozás történt ún. vegetatív hibridek előállítására. WINKLER (1908) a Lycopersicon esculentum és a Solanum nigrum hajtások oltásából származó kimérákat citológiai módszerekkel vizsgálta. Az oltásos kimérák olyan szervezetek, amelyek egyaránt rendelkeznek az alanyból és az oltóágból származó sejtekkel, szövetekkel. A különböző genotípusú sejtek egymásmellettisége még nem jelenti azt, hogy bekövetkezhet a genetikai információt hordozó sejtalkotórészek kicserélődése, keveredése. Azok a kísérletek, amelyekkel tanulmányozták a tulajdonságok utódokon való megjelenését, nem szolgáltattak egyértelmű bizonyítékokat a hibridizáció bekövetkezéséről. Feltételezhető, hogy a sejtfal jelenléte az a gát, amely megakadályozza a sejtmagok átkerülését. Ernst Küster citológus volt az első, aki a kilencszázas évek elején kalcium-nitrát oldatban lejátszódó protoplasztfúziót látott. Megfigyelései alapján felvetette a protoplasztfúzióval történő hibridizáció gondolatát. Több mint hat évtizednek kellett eltelnie ahhoz, hogy a protoplasztok egyesítésével megvalósítható legyen a növények mesterséges paraszexuális hibridizációja. A sejtfal enzimatikus eltávolítása után a növényi sejteket a külső sejtmembrán, az ún. plazmalemma határolja. E kettős lipidréteg fizikai és kémiai sajátosságai lehetővé teszik a protoplasztok szoros összetapadását, majd a membránok fúzióját. A protoplasztok közötti fúzió csak akkor következhet be, ha a membránfelületek között közvetlen molekuláris kapcsolat alakul ki. Az összetapadás alapvetően a felületi töltésviszonyoktól függ. A negatív elektromos töltést hordozó protoplasztok spontán egybeolvadása általában nem következik be. A töltést mesterségesen meg kell változtatni ahhoz, hogy a protoplasztok összetapadjanak. A töltésviszonyok módosítását és a membránkomponensek átrendeződését szolgálják a kémiai, illetve fizikai fúziós módszerek. Polietilén-glikollal indukált fúzió Egy kanadai és egy svéd laboratórium munkatársai (KAO és MICHAYLUK, 1974; WALLIN és mtsai, 1974) egyidőben közölték a polietilén-glikol (PEG) fúziogén hatását. Megfigyelték, hogy Ca2+ jelenlétében a protoplaszt szuszpenzióhoz adott PEG perceken belül összetapasztja a protoplasztokat, majd a membránok fúzióját követően a két sejt alkotórészei keverednek, a sejtek egyesülnek (6.3/5.A ábra). A gyengén negatív polaritású PEG-molekula [HOCH2-(CH2-O-CH2)n-CH2OH] hidrogénkötéssel kapcsolódhat a víz, a fehérjék és szénhidrátok megfelelő molekularészleteihez, és ezáltal molekulahidat képez a protoplasztok között. A PEG kapcsolódhat a Ca2+-hoz is. A Ca2+ koncentrációtól függően csökkenti a protoplasztok negatív töltését, elősegítve ezzel a közvetlen membránkapcsolat létrejöttét. A membránfúzió, a plazmalemmák makromolekulái közötti átrendeződés csak úgy lehetséges, ha a membránlipidek – akár szabad, akár fehérjékhez kötött állapotban – bizonyos mozgási szabadsággal, fluiditással rendelkeznek. A membránok fluiditásának növelésével, pl. a hőmérséklet emelésével növelhető a fúzió gyakorisága, illetve csökkenthető a fúzió bekövetkezéséhez szükséges idő.



6.3/5. ábra: Polietilén-glikol- (PEG) kezeléssel előidézett fúzió búza- (Triticum monococcum) és rizs- (Oryza sativa) protoplasztok között A) a rizs- (R) és a búza- (B) protoplasztok összetapadása és fúziója, B) a sejtfal regenerációja a heteroplazmás sejten, C) a fúziós termék első osztódása, D) búza- (B) és rizs- (R) sejtmagot egyaránt tartalmazó heterokarion (Dudits D. kísérlete) A vegyszergyáraktól vásárolható PEG-készítmények részletesebb vizsgálata során kiderült, hogy azok több, különböző hatású összetevőt tartalmaznak. Az egyik maga a vízben oldódó polimer, amely a protoplasztok összetapadásáért felelős. A másik vegyülettípushoz a gyártás során adott antioxidánsok, mint például a tokoferol vagy egyéb fenolszármazékok tartoznak, amelyek zsírban oldódnak, és a membránok fúzióját serkentik. Szerencsés egybeesésnek tekinthető, hogy a gyári PEG-készítmények egyesítik a fúzió indukálásához szükséges mindkét sajátosságot. A PEG vizes oldata Ca2+ jelenlétében igen hatásos fúzionáló reagens. Ha a sejtfal eltávolítása tökéletes, a fúzió gyakorisága általában 5–10%, de elérheti a 20–30%-ot is. A protoplasztok túlélése és a fúzionált protoplasztok száma növelhető a PEG-oldat előzetes ionmentesítésével. A fúzió gyakran használt módszere az, hogy a protoplasztkeverékből kicseppentünk műanyag petricsészébe. Megvárjuk, amíg a protoplasztok leülepednek, és ezután óvatosan, a csepp mentén adjuk a PEG-oldatot. A PEG-oldat és a protoplasztoldat arányát úgy célszerű megválasztani, hogy a PEG végső koncentrációja 15–20% legyen. A protoplasztok állapotától függően a kezelés 20–30 percig tart. Vannak kísérletek, amelyekben 3 perces kezelés is elegendő. Már a PEG-oldat jelenlétében is bekövetkezhet a teljes egybeolvadás. Gyakori azonban, hogy a fúzió a kimosás során válik teljessé. Jelentősen növelhető a kezelés hatékonysága, ha a PEG-kezelést követően magas pH-értékű (pH 10), illetve Ca2+-t és dimetilszulfoxidot (DMSO) tartalmazó kimosó oldattal hígítjuk fel a PEG-oldatot. Ilyenkor a protoplasztok összetapadt állapota hosszabb ideig megmarad. Mivel a kezelés eredményeként a protoplasztok letapadnak, a PEG és a kimosóoldat könnyen leszívható, és az egész tenyészet táptalajjal többször átmosható. Sikeres kezelés esetén a tenyészoldatban a protoplasztok új sejtfalat szintetizálnak, majd mind a szülői, mind a heteroplazmás sejtek osztódnak (6.3/5.C. ábra). A fúzió megoldható centrifugacsőben is. Ez esetben a kimosás centrifugálással történik, ami könnyen károsíthatja a protoplasztokat. A PEG-hez hasonlóan protoplasztfúziót lehet kiváltani más, vízben oldódó polimerekkel is, így dextránszulfáttal, polivinyl-alkohollal. Az elterjedten használt fúziós módszerek azonban a PEG-kezelésre épülnek. Elektrofúzió 160 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A protoplasztok egybeolvadásához szükséges körülmények kialakíthatók elektromos kezeléssel is. ZIMMERMANN és SCHEURICH 1981-ben közölt cikkében arról számolt be, hogy zab levélprotoplasztokat fúzionáltattak elektromos erőtérben. Az elektrofúzió folyamata két összetevőből áll:

6.3/6. ábra: Burgonyaprotoplasztok elektrofúziója A) a protoplasztlánc kialakulása a váltóáramú elektromos térben, B) és C) a protoplasztok egybeolvadása az egyenáramú impulzus alatt (Fehér A. kísérlete) 1.Oszcilláló, homogén vagy inhomogén váltóáramú elektromos térben átmeneti depolarizáció jön létre a protoplasztok felszínén, amelynek következtében dielektroforézissel a protoplasztok összetapadnak, és láncot alkotnak a két elektród között (6.3/6 ábra). 2.Nagyfeszültségű egyenáram hatására a protoplasztok közötti érintkezési pontokon a membránok átmenetileg átrendeződnek, szerkezetük felbomlik, ami utat nyit a sejtek egybeolvadásához. A fúzió indukálásához szükséges elektromos áram különböző típusait az erre a célra készített fúziós készülékkel hozzák létre. Ezekhez különböző fúziós kamrák csatlakoztathatók. A homogén és a nem homogén erőterű kamra felépítésének vázlata látható a 6.3/7.A ábrán. Az enzimkezelés befejeztével a protoplasztokat többszöri mosás után mannitol- vagy glükózoldatban kell reszuszpendálni, amelynek vezetőképessége kisebb mint 10 -4–10-5 Ù/cm. Az elektromos kezelések sorrendjét és jellemzőit a 6.3/7.B ábrán tüntettük fel. Célszerű a fúziót egyetlen pulzuskezeléssel végezni. Burgonya protoplasztok elektrofúzióját a 6.3/6. ábra szemlélteti.



6.3/7. ábra: Az elektrofúziós indukcióhoz szükséges váltó- és egyenáram fontosabb jellemzői A kémiai kezeléssel létrehozott fúziógyakorisághoz viszonyítva elektrofúzió esetén általában nagyobb a fúzionált protoplasztok aránya. A közlemények 40–100% fúziógyakoriságról is beszámolnak. Az elektrofúzió a kémiai kezeléshez képest nagyobb beruházást igényel, de lehetővé válik mikrotenyészetekkel egy-egy protoplaszt fúziója, majd a fuzionált sejtek egyedi tenyésztése. Mind a PEG-kezelés, mind az elektrofúzió széleskörűen alkalmazható. A növényi protoplasztokon kívül baktérium- és gombaprotoplasztok, valamint állati sejtek egyaránt fúzionáltathatók ezekkel a módszerekkel. A fúzió nem fajspecifikus fiziko-kémiai folyamat. A membránok szerkezetében meglévő nagyfokú hasonlóság lehetővé teszi még rendszertanilag igen távoli sejtek hibridizációját is. Így például növény-állat heterokarionok is létrehozhatók, amelyek egyedülálló kísérleti lehetőséget adnak evolúciós kérdések és génműködéssel összefüggő szabályozási rendszerek vizsgálatára. SALHANI és mtsai (1985) beszámoltak egérből származó Friend-sejtek és petúniaprotoplasztok elektrofúziójáról. A mesterségesen létrehozott állat-növény heterokarionok növényi és állati funkciókat egyaránt mutattak: sejtfalat szintetizáltak, illetve dimetil-szulfoxid (DMSO) kezelés után hemoglobint termeltek. Ezek a kísérletek rávilágítanak arra, hogy rendszertanilag igen távol álló partnerek esetében is lehetséges a sejtszintű együttműködés. 162 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A fúzionált sejtek citológiai vizsgálata Levélprotoplasztok és sejtszuszpenzió eredetű protoplasztok fúzionálásakor jól követhető a kétféle citoplazma keveredése és a heteroplazmás sejtek kialakulása. A 6.3/5.B,C képen olyan sejt látható, amelyben a búzaszülő sejtjeire jellemző sűrű citoplazmában a rizs zöld kloroplasztiszai láthatók. Természetesen a protoplasztok egybeolvadásakor a különböző eredetű sejtmagok is egyetlen sejtbe kerülnek. Citológiai módszerekkel kimutatható a heterokarionok képződése, amelyekben két növényfaj sejtmagja van jelen. A 6.3/5.D képen rizs+búza heterokarion látható. Tenyészoldatban a fúzionált protoplasztok osztódásakor a mitózis bekövetkezhet a szülői sejtmagok egyikében. Az ilyen aszinkron mitózis később az inaktív sejtmag elkülönüléséhez, elveszéséhez vezethet. A mitotikus kromoszómák egyidejű megjelenése pedig szinkarionok kialakulásához vezethet. A szinkarionok olyan hibrid sejtvonalak, amelyek mindkét szülő kromoszómáit tartalmazzák. A különböző eredetű kromoszómák további sorsa nagymértékben a szülők közötti rokonsági kapcsolattól függ. Fajon belüli és rokon fajok közötti hibridizáció esetén általában fennmarad mindkét kromoszómagarnitúra. A távoli fúziós kombinációkban azonban az egyik szülő kromoszómái gyakran spontánul elvesznek. A szója+dohány sejthibridekben például a dohánykromoszómák instabilitását lehetett megfigyelni. A kromoszómák eliminációja általában fokozatos és nem teljes. Az említett szója+ dohány hibrid sejtvonalban még féléves tenyésztés után is ki lehetett mutatni dohánykromoszómákat (KAO, 1977). A szülői kromoszómák keveredése lehetővé teszi kromoszómarészek transzlokációját.

1.3.4. 6.3.4. A szomatikus fajhibridek főbb sajátosságai

6.3/8. ábra: Hibrid kolóniák szelekciója burgonya [Solanum tuberosum (162/80) és S. brevidens (42/4)] protoplasztok fúziója után 1: S. tuberosum kontroll kallusz, 2: S. tuberosum 100 mg/l kanamicin jelenlétében, 3: Hibrid 100 mg/l kanamicin jelenlétében, 4: S. brevidens kallusz 100 mg/l kanamicin jelenlétében (Fehér A. kísérlete) E könyv korábbi kiadásában részletesen foglalkoztunk a fúzióból származó hibrid növények tulajdonságaival. Az utóbbi években a kutatások kiszélesedésével túlságosan megnőtt a szomatikus hibridekkel foglalkozó munkák száma, mint azt a ,,Somatic hybridization in crop improvement I.” című könyv (szerkesztette Y.P.S. BAJAJ, 1994) is bemutatja. Ezért most két kiemelt példa segítségével szemléltetjük ennek a sejtgenetikai módszernek a jelentőségét. A termesztett burgonya (Solanum tuberosum L.) egyik hegyvidéki fennsíkokon vadon élő rokona, a Solanum brevidens több agronómiai szempontból fontos rezisztenciagénnel rendelkezik. E vad Solanum faj ellenállósága kiterjed többféle vírusra (X, Y és levélsodródási vírus), Erwinia baktériumra, és hideg károsodásra. A S. brevidens növények nem képeznek gumót és ivarosan nem keresztezhetők a burgonyával. Ahhoz, hogy a kedvező hatású rezisztencia géneket át lehessen építeni nemesítési tenyészanyagokba, a szomatikus hibridizáció módszerét indokolt alkalmazni. A két faj protoplasztjainak fúzióját követően a hibrid eredetű kolóniák többféle módon azonosíthatók. Ebben a fúziós kombinációban a hibrid klónok növekedése jelentős hibridhatást tükröz, így egyszerűen a nagyobb méretű, gyorsabban növő kalluszok felismerhetők és kiemelhetők. A molekuláris jellemzés a klónok többsége esetén igazolta a fúziós eredetet 163 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK (POLGÁR és mtsai, 1993). Lehetőség van antibiotikum, mint pl. kanamicin rezisztenciagén beépítésével egy szelekciós markerrel felruházni a S. brevidens szülői sejteket. Mint a 6.3/8. ábrán láthatjuk, a hibridek képesek 100 mg/l kanamicin jelenlétében nőni és morfológiai bélyegeikben a burgonya szövetekhez hasonlítanak. A regenerált hibrid növények köztes, a szülőkre jellemző morfológiai bélyegek átmeneti formáit mutatják (6.3/9. A, B ábra). Az előállított hibridek nemesítési felhasználhatóságát az Erwinia baktériummal szembeni rezisztencia, illetve hidegtűrés szempontjából értékeltük (PREISZNER és mtsai 1991; POLGÁR és mtsai 1996). A 6.3/10. ábrán látható, hogy a hibridekről származó gumókon a rothadó felület lényegesen kisebb, mint a Desiree és White Lady fajták esetében. A további nemesítés egyik fontos feladata, hogy a burgonyával történt visszakeresztezést követően folytatódjék az Erwinia rezisztenciára való szelekció, egyben javuljanak a gumók tulajdonságai és a tenyészanyag agronómiai teljesítménye. Korai, fóliasátras burgonya termesztéskor előnyt jelenthet, ha a növények képesek alacsony hőmérsékletet tolerálni. Így indokolt volt a hibridek hidegtűrését is értékelni (PREISZNER és mtsai, 1991). Mint a 6.3/9 ábrán látható, mind a S. brevidens, mind a hibrid növények túlélték a –2 °C-os kezelést. A burgonyaszülő elpusztult a stressz következtében. A bemutatott tulajdonságok alapján a szomatikus hibridek használható tenyészanyagot jelentenek a nemesítési programok számára. Külön hangsúlyozni kell, hogy ezek a növények nem hasznosítható végtermékek, hanem kiindulási alapanyagok a további keresztezésekhez és szelekcióhoz.




III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 6.3/9 ábra: Az ivarosan nem keresztezhető két Solanum faj szomatikus hibridjének előállítása protoplasztfúzióval A) A szülői fajok és hibridjük morfológiai sajátosságai: baloldali növény – S. brevidens; középen – szomatikus hibrid; jobboldali növény – S. tuberosum B) A fenti növények jellegzetes levélformája. A szomatikus hibrideken a levélnyél lila, antociános, mint a S. brevidens levelein C) A szomatikus hibridek fagytűrése: míg a burgonyanövények (GR) elpusztultak, addig a S. brevidens (BR) és a hibrid növények képesek túlélni az alacsony hőmérséklet okozta károkat (Preiszner és mtsai, 1991)

6.3/10. ábra: A szomatikus hibridek gumóin a rothadási tünetek sokkal mérsékeltebbek, mint az érzékeny szülők (Desiree, White Lady) eset ben, Erwinia-fertőzést követően (Polgár és mtsai, 1996) A repce és rokon fajai számos szomatikus hibridizációs programban felhasználásra kerültek. EARLE és mtsai (1999) összefoglalója szerint a fúzióból származó tenyészanyagok értékes tulajdonságokkal rendelkeznek. A Brassica rapa és B. oleracea szomatikus hibridek többcélú szelekcióhoz szolgáltattak alapot a repceolaj zsírsavösszetételének megváltoztatásához. Így az ipari célú felhasználáskor előnyös a magas erukasav (22:1) tartalom. Főzéshez kedvelt az alacsony linolénsav (18:3) tartalmú repceolaj. A fúziós termékek között azonosítani lehetett ilyen tulajdonságokkal rendelkező genotípusokat. A protoplasztok fúziójára alapozva elő lehetett állítani a szomatikus szintetikus repcét.



6.3/11. ábra: A szintetikus repce előállítása ivaros keresztezéssel, illetve sejthibridizációval BO: Brassica oleracea; BC: Brassica campestris (Terada és mtsai, 1987: Theor. Appl. Genet., 73. 379–384.) Az olajrepce (Brassica napus L. ssp. oleifera) fajkereszteződésből származik. Amfidiploid kromoszómakészlete a B. campestris (AA) és a B.oleracea (CC) genomjából tevődik össze. Rudolf 1950-ben keresztezéssel reszintetizálta a repcét, és egy jó tulajdonságokkal rendelkező fajtát állított elő. A 6.3/11/A. ábrán bemutatott lépéseket kellett követni, amely magában foglalja az F1 növények kromoszómáinak mesterséges megduplázását. A diploid szomatikus sejtek fúziójára épülő szomatikus hibridizáció egy lépésben a kívánt genotípust eredményezheti. A 6.3/11. ábra TERADA és mtsai (1987) munkája nyomán született szomatikus hibridet mutat


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK be. Az így előállított növények egy része 2n = 38 kromoszómával rendelkezik, és képes ivaros utódok létrehozására.

1.3.5. 6.3.5. Extrakromoszómális tulajdonságok átvitele – cibridek A növényi sejtek citoplazmájában található organellumokban, a kloroplasztiszokban és a mitokondriumokban önálló információtartalmat hordozó DNS molekulák vannak. A fotoszintetikus, illetve energiatermelő funkciók ellátásához szükséges fehérjék szintézisét ezek a citoplazmatikus gének a sejtmagi génekkel szoros együttműködésben irányítják. Előfordul például, hogy valamelyik, több alegységből felépülő fehérje egyik alegységét sejtmag-, másik alegységét kloroplasztiszgének kódolják. Így például a ribulóz-1,5- biszfoszfátkarboxiláz rövid polipeptidláncú alegységeinek szintézise sejtmaggénről a citoplazma riboszómáin történik, majd tranzitpeptid segítségével átjutnak a kloroplasztisz membránján, és összekapcsolódnak a hosszú polipeptidláncú alegységekkel. Ezek szintéziséért a kloroplasztisz génje a felelős. Ma már ismert a kloroplasztisz-DNS (155844 bázispár) teljes szekvenciája, és ezen a térképen meghatározták több gén helyzetét. A riboszomális RNS és transzfer RNS gének mellett hozzávetőlegesen 24 gén kapcsolatos a fotoszintetikus funkciókkal. A növények mitokondriumaiban 15–30 ìm nagyságú, köralakú DNS-molekulák vannak, amelyek mérete még fajon belül is nagyon heterogén. A magasabb rendű növények esetében a kloroplasztiszok anyai átöröklése azt jelenti, hogy az apai plasztiszok nem vagy csak ritkán vesznek részt az utódok citoplazmatikus génállományának kialakításában. Az ivaros keresztezéshez kapcsolódó egyirányú organellumátvitel származhat a plasztiszok elvesztéséből a spermatogenezis során. Az elimináció megtörténhet a megtermékenyítés folyamán, illetve a zigótában végbemenő degradációval. Ugyanakkor az anyai öröklődés érvényesülése azt is jelenti, hogy ivaros megtermékenyítéskor nem keverednek a szülői kloroplasztiszok, nincs lehetőség az organellum-DNS-ek kicserélődésére, rekombinációjára. Ezzel szemben a protoplasztok fúziója kevert citoplazmájú sejtek kialakulásával jár. A különböző genetikai programot hordozó organellumok együttes jelenléte a hibrid sejtek citoplazmájában alapvetően új lehetőségeket nyújt az extrakromoszomális gének tanulmányozására. Bonyolult kölcsönhatás alakul ki a sejtmagok, illetve az egyes organellumpopulációk között. A lejátszódó folyamatok követéséhez genetikai, illetve biokémiai markerek szükségesek, amelyek lehetővé teszik a regenerált hibrid növények kloroplasztiszainak és mitokondriumainak azonosítását. A protoplasztok fúziójának eredményeként először kialakul a hibrid sejt, amelynek citoplazmájában egyaránt jelen vannak mindkét szülő citoplazmatikus organellumai. A tenyésztés során, a sejtosztódások soro-zatán keresztül létrejön a hibrid kallusz, amelynek egyedi sejtjeiből növények regenerálódnak. Az osztódások folyamán, a sejtmagi háttér befolyása alatt folyamatosan változik az organellumpopuláció. Az érvényesülő tendenciák eltérnek a kloroplasztiszok és a mitokondriumok esetében. Alapvető befolyása van a tenyésztés során alkalmazott szelekciónak. Spontán vagy irányított kloroplasztisz-kiválogatódás



6.3/12. ábra: Kloroplasztiszok szegregációja szomatikus hibridekben A fúziós termékekből regenerálódott növények jellemzése alapján a kloroplasztiszok viselkedését a 6.3/12. ábra szemlélteti. Látható, hogy a fúzió eredményeként keverednek a különböző eredetű kloroplasztiszok. Ez a kevert állapot kalluszstádiumban, sőt növényregeneráció után is fennmaradhat. Az eltérő típusú kloroplasztiszok egyidejű jelenlétét szemléletesen mutatják a variegáló növények. A fehér foltok megjelenése a zöld növényeken a normális kloroplasztiszok szektoriális elvesztését jelzi. A kevert citoplazmájú szomatikus hibridek előfordulása ellenére általánosabb és gyakoribb a kloroplasztisz-populációk kiválogatódása, amelynek eredménye egy típusú kloropasztisz jelenléte a hibrid növényekben (6.3/12. ábra). A regeneránsok között általában mindkét szülői típus előfordulhat. Természetesen szelekcióval befolyásolható a szétválogatódás folyamata a rezisztens kloroplasztiszok előnyére. Cibridizáció


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Mind alapkutatási, mind növénynemesítési szempontból olyan organellum átvitel kívánatos, amely érintetlenül hagyja a recipiens növény sejtmagi génállományát. Ez ivaros úton csak több generáción át végzett visszakeresztezési programmal érhető el. Ebben az esetben természetesen nincs mód a kloroplasztisz-, illetve mitokondrium-átvitel szétválasztására. A protoplasztfúzió eddig leírt alkalmazása lényegében hasonló eredményre vezet, mivel a sejtmagok egyetlen sejtbe kerülésével hibrid genotípus alakul ki. Ennél a megközelítésnél azonban több lehetőség van a beavatkozásra. Magas dózisú röntgen- vagy gamma-sugárzással elérhető, hogy a kezelt szülő sejtmagja ne osztódjon, DNS-e fragmentálódjon, és így a hibrid kialakulása folyamán teljesen vagy jelentős mértékben eliminálódjék. Ugyanakkor az organellumok keveredése következtében a cibriditás fennmarad. Az ilyen fúziós termékekből lehet olyan cibrid növényeket felnevelni, amelyek sejtmagja az egyik szülőből, organellumai pedig a másik szülőből származnak (6.3/13. ábra). Cibridek közvetlenül, nagy gyakorisággal nyerhetők szelekcióval. A citoplazmatikus organellum átvitelének ezt a módszerét ZELCER és mtsai 1978-ban megjelent közleményükben közölték. Mint a 6.3/13. ábrán láthatjuk, azóta a fúziós kombinációk széles körében használják. A sugárzás dózisától függően változik a sejtmag eliminációjának hatékonysága. MENCZEL és mtsai (1982) vizsgálata szerint a dózis növelésével csökken a nukleáris hibridek aránya és nő a recipiens szülő fenotípusát mutató, de a donor kloroplasztjaival rendelkező regeneránsok száma.



6.3/13. ábra: Kloroplasztiszpopuláció kicserélése cibridizációval A kloroplasztisz-DNS rekombinációja szomatikus hibridekben A szülői kloroplasztiszok együttes jelenléte a fúzionált sejtekben elvileg megteremti a fizikai feltételét annak, hogy organellumok érintkezzenek, és DNS-állományuk kicserélődjék. A Chlamydomonas egysejtű algában ki lehetett mutatni kloroplasztisz markerek rekombinációját és szegregációját. A protoplasztfúzió hasonló analízis lehetőségét teremtette meg a magasabbrendű növényeknél. Bár a kevert citoplazma meglétét még növényszinten is több esetben ki lehetett mutatni, a rekombináció felismerése komplex, több szelektálható markerre épülő fúziós rendszert igényelt. Citoplazmatikus hímsterilitás szomatikus hibridekben 171 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Az eddigiekben a könnyebb áttekinthetőség kedvéért elsősorban a kloroplasztiszokkal foglalkoztunk. Természetesen a mitokondriumok is összekeverednek a fúzió során. A szomatikus hibrid növények mitokondriumainak jellemzése gyakran a citoplazmatikus hímsterilitás átvitelének tanulmányozásához kapcsolódik. Tekintettel e sajátosság növénynemesítési fontosságára, ezek a kísérletek segíthetik az eredményes fajta-előállítást. Hímsteril és fertilis növények protoplasztjainak fúziója fajonként eltérő eredményhez vezetett, ezért célszerű azokat külön elemezni. A Nicotiana fajok esetében a fúzióból származó regeneránsok virágfelépítésükben és ezzel összefüggően fertilitásukban a szülőihez hasonló fertilis, illetve steril növények mellett nagyszámú átmeneti forma jelent meg. Az organellum-DNS-ek részletesebb vizsgálata azt mutatta, hogy a dohány esetében nincs összefüggés a steril és a fertilis állapot, valamint a kloroplasztisz DNS összetétele között. Ugyanakkor a mitokondrium-DNS mintázata és a sterilitás kapcsolata már igazolható. Eszerint a cibridek mt-DNS-e mindig tartalmaz olyan restrikciós fragmenteket, amelyek kimutathatók mindkét szülő mitokondriumában. A legtöbb cibridben azonban a szülői mintázatokból hiányzó új mt-DNS-fragmentek is vannak. Az új mitokondrium-DNS megjelenése a hibrid sejtekben gyakori, és arra utal, hogy intenzív mt-DNS-átrendeződés zajlik le. Ezt a kutatók többsége rekombinációs folyamatokra vezeti vissza, bár hasonló változások szövettenyésztés hatására is bekövetkezhetnek. A hímsterilitás átvitelének szintén hatékony módszere a besugározott protoplasztok felhasználásával végzett cibridizáció. Ebben a donor-recipiens hibridizációban a hímsterilitást hordozó partner sejtmagjait inaktiválja a besugározás. Jódacetátos kezeléssel kombinálva akár egy lépésben is átvihető a citoplazmás hímsterilitás. A Petunia citoplazmás hímsterilitást (cms) is több fúziós kísérletben tanulmányozták. A kapott eredmények a dohányoknál megfigyelttől alapvetően eltérő mechanizmusra utalnak. A fertilis és cms szülők szomatikus hibridjeiben heteroplazmatikus állapot mutatható ki, amely a cms és a normál genetikai elemek kiválogatódásával párosul. Nem található egyértelmű összefüggés a mt-DNS-ek restrikciós mintázata és a Petunia hímsterilitása között. A molekuláris jellemzés ebben az esetben is jelentős mt-DNS-átrendeződést tárt fel. A hibridek mt-DNS-ének restrikciós mintázata egyedi, nemcsak a szülőkkel, hanem a többi hibriddel történő összehasonlításkor is. A Brassica fajok közül a hímfertilitást mutató repce (Brassica napus) kialakulásához vezetett a hímsteril B. oleracea, valamint a fertilis B. campestris szomatikus hibridizációja. A hibrid növények virágainak morfológiája a fertilis B. campestris szülőéhez volt hasonló. A fúzióból származó regeneránsok mt-DNS-ében mindkét szülőre jellemző restrikciós fragmenteket, illetve új fragmenteket lehetett azonosítani. A bemutatott kísérletek példákat szolgáltattak arra, hogy legalább két nemzetség (Nicotiana, Petunia) esetében a sejthibridizáció eredményesen alkalmazható a citoplazmás hímsterilitás átvitelére, illetve új mt-DNS-molekulákat hozhat létre.

1.3.6. 6.3.6. A paraszexuális távoli hibridizáció lehetőségei Az eddig tárgyalt szomatikus hibridek azonos nemzetségekhez tartozó fajok protoplasztjainak fúziójával keletkeztek. Bár néhány esetben ivarosan nem keresztezhető növények szolgáltak fúziós partnerként, a bemutatott fajhibridek több-kevesebb rokonságot mutató szülőktől származnak. Már a legelső fúziós kísérletekből kiderült, hogy a fúzió létrejöttében nem jelent korlátozó tényezőt a protoplasztok eredete. Mindent mindennel lehet fúzionáltatni. Így ellenállhatatlan kísértést jelentett az új lehetőség, amely eddig teljesen elképzelhetetlen távlatokat csillantott fel a rendszertanilag igen távoli növények tulajdonságainak kombinálására. A korai, szárnyaló elképzeléseket azonban rövidesen a realitás medrébe terelték a kísérletek. A több évtizedes kutatás buktatói és sikerei során körvonalazódtak azok a genetikai törvényszerűségek, amelyek megszabják a távoli szomatikus hibridizáció kereteit. A következőkben látni fogjuk, hogy sejtfúzióval valóban megvalósítható a nem rokon növények között a tulajdonságok átvitele. Így ez a módszer jól meghatározható helyet foglal el a többi genetikai manipulációs módszer, mint pl a DNS-transzformáció mellett. Jelentősége elsősorban abban van, hogy lehetővé teszi a tulajdonságok átvitelét olyan esetekben is, amikor nem áll rendelkezésre az adott tulajdonságért felelős gén, klónozott DNS-darab formájában. Módot ad komplex, több gén által befolyásolt sajátosságok megváltoztatására. Különleges génforrást jelent a géntérképezési és izolálási programok számára. A következőkben bemutatandó kísérletek eredményei körvonalazzák a módszer adta lehetőségeket. A hibridizáció eredményei rendszertanilag távoli növények protoplasztjainak fúziója után


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A polietilén-glikol-kezelést követően kialakuló fúziós termékek citológiai analízise azt mutatta, hogy még egyés kétszikű növények sejtjeinek egybeolvasztása után is bekövetkezhet sejtosztódás. Így például sárgarépa- és árpa-, vagy szója- és kukoricakromoszómák együttes jelenléte látható a mitotikus hibrid sejtekben. Az osztódási képességet alapul véve általában nem mutatható ki összeférhetetlenség a korai, néhány sejtes stádiumban. A sejtinkompatibilitás nem jellemző a növényi sejtek közötti kölcsönhatásokra az általánosan használt tenyésztési körülmények között. Különösen érvényes ez azokra a fúziós kombinációkra, amelyekben az egyik szülősejt dedifferenciált és mitotikusan aktiválni képes a másik partner nem osztódó sejtjeit. A fúzionált sejtek osztódásának megindulása természetesen még nem jelenti azt, hogy hibrid növények is felnevelhetők. Az első osztódások kiindulópontot jelentenek egy bonyolult kölcsönhatásokra épülő folyamatsorhoz, amelyben a két eltérő genetikai program teljesen vagy csak részben érvényesül. A mindkét szülő kromoszómáival egyaránt rendelkező hibrid sejtvonal kialakíthatóságának lehetőségét, majd a hibrid növények felnevelhetőségét a szülőfajok közötti rendszertani távolság alapvetően befolyásolja. A szomatikus nemzetséghibridizációs kísérletek eredményei alapvetően három csoportba oszthatók. A csoportosítás a kromoszomális összetételen és a növény redifferenciációs képességen alapul. Egyre nő azoknak a protoplasztfúziós kísérleteknek a száma, amelyek dedifferenciált hibrid sejtvonalak kialakulásához vezettek. Ezekben a kalluszsejtként fenntartott hibridekben a genomösszetétel igen változó. Ismertek olyan fúziós kombinációk, amelyekben a két szülő kromoszómaállományának jelenléte akár a kromoszómaszám, akár a biokémiai vagy genetikai markerek segítségével kimutatható. Gyakoribb az egyik szülő genomját érintő instabilitás. Több fúziós kombinációban fokozatos kromoszómavesztés figyelhető meg, amelynek következtében a hibrid sejtek csak néhány kromoszómát hordoznak az instabil szülőtől. Kialakul az ún. aszimmetrikus hibrid, amelynek génállományát alapvetően az egyik szülő határozza meg, a másik szülő hozzájárulása pedig jelentősen redukált. Keveset tudunk azokról a tényezőkről, amelyek meghatározzák, hogy egy adott hibridben melyik az instabil szülői sejtmag. Függhet ez a fúziós partnerek sejtciklusának állapotától vagy bizonyos szelekciós előnyöktől az adott tenyésztési körülmények mellett. A spontán kromoszómaváltozások bizonyos mértékű mesterséges befolyásolására ad lehetőséget a protoplasztok fúzió előtti besugározása. Fajspecifikus repetitív DNSszekvenciák segítségével P32-izotóppal jelölt próbákat használva, molekulahibridizációval megbecsülhető a besugározott genom hozzájárulásának mértéke az aszimmetrikus genom kialakításához. Ezek a vizsgálatok egyértelműen mutatják, hogy a besugározás, ha nem is mindig dózisfüggő módon, de kiváltja a kromoszómavesztést. Az ilyen kísérletek esetében célszerű donor- és recipiensviszonyról beszélni. Az átvitt idegen DNS mennyiségét a besugározáson kívül természetesen más tényezők is befolyásolhatják, pl. elsősorban a szülők közötti rokonsági kapcsolat. Sejtvonalak, amelyek nem képesek növényekké differenciálódni, sok fontos információt szolgáltattak a távoli hibridizációval kapcsolatos törvényszerűségek megismeréséhez. Igazolták, hogy a kromoszómavesztés ellenére különböző genomok, legalábbis részben, tartósan egyesíthetők és egymás melletti működésük biztosítható. Hasonlóan az emlős sejthibridekkel végzett géntérképezéshez, a szegregáló növényi sejt-hibridekben is összekapcsolható egy tulajdonság (pl. izoenzim) eltűnése kromoszómavesztéssel. Ugyanakkor jelentős azoknak a nemzetséghibridizációknak a száma, amelyekben hibrid növényeket lehetett felnevelni. Az így kapott genotípusok kromoszóma-összetételük szerint két csoportba sorolhatók. Az egyikbe az amfidiploid típusú hibridek tartoznak. Jellemző rájuk, hogy mindkét szülőtől csaknem a teljes kromoszómakészlettel rendelkeznek. A szomatikus hibridek egy részénél nem okoz zavarokat a két eltérő génállomány egyesítése. Így például a burgonya- és a paradicsomhibridek morfológiai rendellenességektől mentesek, sőt a Lycopersicon esculentum és a Solanum lycopersicoides esetében ivaros utódokat is sikerült nyerni. A szomatikus inkompatibilitás mint gátló tényező A távoli szomatikus hibridizáció lehetőségeinek elemzése nem lenne teljes, ha figyelmen kívül hagynánk a sikertelen próbálkozásokat. A kutatók több fúziós kísérletről számoltak be, amelyekben a hibrid növények kialakulása elmaradt még akkor is, ha a korai fejlődési szakaszban osztódó heterokarionokat lehetett kimutatni a tenyészetekben. A fúzióval egyesített sejtekben a partnerek közötti élettani vagy genetikai összeférhetetlenség gátja lehet a funkcionális együttműködésnek és így a hibridek kialakulásának. A kísérleti megfigyelések egyértelműen felhívják a figyelmet a szomatikus sejtek, szövetek szintjén érvényesülő összeférhetetlenségre (inkompatibilitásra) (DUDITS, 1982). Ahhoz, hogy a sejthibridizáció a távoli génátvitelben ténylegesen használható módszer legyen, meg kell ismernünk a szomatikus inkompatibilitási faktorokat. Összevetve az ivaros megtermékenyítést kísérő összeférhetetlenségi tényezőkkel, könnyen belátható, hogy azok egy része szomatikus sejtek fúziója esetén nem juthat szerephez. Így például kikapcsolódik a megtermékenyítést megelőző folyamatok szelektivitása, hiszen a fúzió minden kombinációban létrehozható, amely közvetlenül biztosítja a szülők genetikai anyagainak egyesítését. Valószínű, hogy nincs szerepe a tápanyagellátási zavaroknak, mivel a sejthibrideket komplex táptalajokban tenyésztik. Ellenben mind az embriófejlődés, mind a fúziós termékek osztódása során bekövetkező kromoszómavesztés a szülői genomok közötti diszharmóniát jelzi. A szomatikus rendszerben sem lehetséges minden esetben a két teljes szülői genom stabil, funkcionális egymásmellettisége. 173 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Számos fúziós kombinációkban a spontán aszimmetria kialakulása az inkompatibilitás érvényesüléseként értelmezhető. Még kifejezettebb megnyilvánulása az összeférhetetlenségnek, hogy számos nemzetséghibrid esetében a fúziós termékek csak dedifferenciált sejtekként tarthatók fenn. Nincs meg a növényregeneráció lehetősége annak ellenére, hogy egyik vagy mindkét szülő rendelkezik a differenciálódás képességével. A dedifferenciált kalluszállapotból az organizált növekedésre történő áttérés igen kritikus pont a hibridek kialakulásának folyamatában. A petrezselyem+sárgarépa szomatikus hibridek esetében nagyfokú sejtpusztulással járt a morfogenezis indukciója, a dedifferenciált kalluszszövetek pedig semmi jelét nem mutatták az inkompatibilitásnak. A nemzetséghibridek jelentős részénél sikerült ugyan az organogenezis indukálása, a regenerált növénykék azonban súlyos fejlődési rendellenességeket mutattak. Ezek a zavarok szintén a genetikai programok közötti hibás együttműködésből származnak. Mindezek alapján tehát el kell fogadnunk azt a tényt, hogy a szomatikus inkompatibilitás a hibridképződés különböző pontjain kifejeződve jelentősen korlátozhatja a növények közötti távoli hibridizációt. Ugyanakkor azt is láthatjuk, hogy a sejthibridizáció ténylegesen kiszélesítette a nemzetséghibridek körét. Ez azért vált lehetségessé, mert az in vitro végzett sejtfúzió után sokkal nagyobb tere van a mesterséges beavatkozásoknak, mint a megtermékenyítés és embriófejlődés érzékeny folyamatai során. A kétféle inkompatibilitás morfológiai, élettani és genetikai alapjai alapvetően eltérő lehetőségeket biztosítanak a lejátszódó folyamatok irányítására. A paraszexuális technológia támaszkodhat a kromoszómavesztés befolyásolására és irányítására, illetve izolált sejtorganellumok – kromoszómák, sejtmagok – átvitelére, mint azt a következőkben látni fogjuk. Aszimmetrikus hibridek Az összeférhetetlenségi reakciók szerepének mérsékléséhez kiindulási alapot adhat az a feltételezés, hogy ha a fúzióban részt vevő egyik genom méretét jelentősen csökkentjük, ha csak egyes kromoszómák vagy néhány gén átvitelére kerül sor, akkor ezzel a különbségekből fakadó zavarok kikerülhetők. A szülői genomok fokozatos eliminációja, mint az előzőekben láthattuk, bekövetkezhet spontán módon. A magától kialakuló aszimmetria sok esetben nem elegendő az inkompatibilitás teljes feloldására. Ezért van létjogosultsága a kromoszomális folyamatok mesterséges befolyásolásának. A kívánt genotípus kialakításához egyrészt a kromoszómavesztés fokozására, másrészt az átmenetileg fizikai közelségbe kerülő genomok közötti rekombináció elősegítésére van szükség. A mesterségesen létrehozott aszimmetrikus nemzetséghibridek mindinkább az érdeklődés középpontjába kerülnek, mivel ez a hibridtípus jól megfelel a nemesítési programok által megjelölt követelményeknek (lásd összefoglaló: HINNISDAELS és mtsai, 1994). A csak néhány tulajdonság átvitelét biztosító aszimmetrikus hibridizáció mind több növény nemesítéséhez használt módszerré válik. Nagy dózisú besugározás mint a genominstabilitás kiváltásának eszköze A spontán kromoszómavesztés következtében kialakuló aszimmetria gyakran nem elegendő a rendellenességektől mentes fertilis hibridek létrehozásához. Így merült fel az igény a kromoszómavesztés irányának és mértékének befolyásolására. Ezt szolgálhatja az egyik szülői protoplasztpopuláció nagy dózisú besugározása. Ismert ugyanis, hogy akár röntgen-, akár gamma-sugározással a sejtmagok kromatinállománya összetörhető (fragmentálható). A kezelt sejtek maganyaga a hibridekben fokozott instabilitást mutat. Erre alapozva terjedt el a besugározott protoplasztokkal végzett aszimmetrikus hibridizáció módszere. Több kísérleti rendszerben igazolódott, hogy a besugározott partner kromoszóma állománya jelentősen csökkenhet, és a hibridekben csak egy vagy két kromoszóma marad vissza a donorfajból. A kialakuló aszimmetrikus hibrid genom fenotípusos hatásaként több, a kezelt szülőre jellemző biokémiai vagy morfológiai bélyeg is megnyilvánul a hibrid növényeken. A dohány+sárgarépa hibridizációjának példáján a következőkben az aszimmetrikus távoli hibridizáció lehetőségeit vázoljuk.



6.3/14 ábra: A dohány + sárgarépa NICA aszimmetrikus hibridek jellegzetes morfológiai sajátosságai A) a NICA 105–E és 105–7 jelzésű növények kisebbek, de lényegében dohány fenotípusúak, B) egy rendellenes NICAregeneráns keskeny levelei láthatóak a dohány (SR1) és a sárgarépa (CA) levelei mellett (Dudits és mtsai, 1987 PNAS, 84: 8434–8438)


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Ebben a kísérletben a regenerációra képes dohánylevél-protoplasztok szolgáltak recipiensként. A donor, besugározott sárgarépa protoplasztok rezisztencia markerrel (metotrexát ellenállóság) rendelkező sejtvonalból származtak. A hibrid kalluszokból aztán növényeket regenerálva került sor a hibridjelöltek részletesebb vizsgálatára. Mint a 6.3/14. ábrán látható, a fúziós hibridként szelektált NICA jelzésű regeneránsok között vannak olyanok, amelyek a dohány szülőhöz nagyon hasonló fenotípusúak. Ugyanakkor megfigyelhetők jelentős morfológiai eltéréseket hordozó növények is, mint a 6.3/14.B ábrán látható keskeny levelű forma. A továbbiak szempontjából azok a növények érdekesek, amelyek rendellenességektől mentesek, dohány fenotípusúak, de ugyanakkor sárgarépára specifikus tulajdonságokkal is rendelkeznek.

6.3/15 ábra: A dihidrofolát-reduktáz (DHFR) enzim jellemzése a NICA-hibridekben A) A DHFR izoenzimek natív poliakrilamidgél-elektroforézise az enzimaktivitás kifejezés után, 1 – H47 sárgarépa, 2, 3, 4, – NICAvonalak, 5 – SR1 dohány, B) sárgarépa-specifikus fehérjék kimutatása a NICAhibridekben a sárgarépa-DHFR elleni ellenanyaggal, 1,2 – MTX-rezisztens NICA, 3 – SR1 dohány, 4 – MTXszenzitív szegregáns, 5 – H47 sárgarépa (Dudits és mtsai, 1987 PNAS, 84: 8434–8438) A rezisztenciabélyegek fenotípusos értékelésén túl biokémiai módszerekkel is igazolható, hogy a sárgarépára jellemző dihidrofolát-reduktáz enzim szintetizálódik a hibrid növényekben. A 6.3/15.A ábrán egyrészt látható, hogy a hibridekben mind a dohány, mind a sárgarépa izoenzimjei szintetizálódnak. További információt nyújt a répa dihidrofolátreduktáz ellen képződött ellenanyag segítségével végzett immunológiai analízis. A 6.3/15.B. ábrán az ellenanyag által felismert 58 kD-tömegű fehérje csak a sárgarépa szülőben és a metotrexátrezisztens hibridekben van jelen. A szenzitív szegregáns a dohányhoz hasonló mintázatú. A sárgarépaenzimet is szintetizáló dohánynövények jelentőségét növeli, hogy a dohánnyal történt beporzás után sikerült ivaros utódokat nyerni.

1.3.7. 6.3.7. Izolált sejtmagok és metafázis kromoszómák mint a génátvitel eszközei 176 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Protoplasztfúzió során a két szülői partner teljes sejtállománya kerül át a fúziós termékbe. Az előzőekben láttuk, hogy a hibrid sejtekben lejátszódó utólagos kromoszómavesztés, illetve organellum szegregáció feltétele lehet a rendellenességektől mentes hibridek előállításának. Ennek alapján indokolt az a kérdés, lehet-e az átvitel specifitását növelni azzal, hogy fúzió helyett izolált organellumokat használunk a genetikai manipuláció eszközeként. Nyilvánvaló, hogy lényegesen csökkenthető az átvitt idegen genetikai anyag mennyisége akkor, ha például izolált kromoszómák szolgálnak vektorként. A sejtben a mag és citoplazma kölcsönhatásából származó zavarok kiküszöbölését jelentheti a donor partnerből izolált sejtmagok bevitele a recipiens sejtekbe. A következőkben látni fogjuk, hogy az organellumátvitel megoldása ugyan nehezebb, mint a protoplasztfúzió, mégis az eddigi eredmények megerősítik e módszerek használatának létjogosultságát. Alkalmazásuk akkor kerül előtérbe, ha nem áll rendelkezésre a génsebészeti úton izolált gén, és így DNS transzformációra nem kerülhet sor. Gyakori ez a helyzet az agronómiai tulajdonságokkal kapcsolatban, amikor több gén felelős a genetikai háttér kialakításáért. Az organellumok közvetítésével történő génátviteli rendszerek kidolgozása a metodikai alapok megteremtésének stádiumában van. Napjainkban látnak napvilágot az első sikeres eredmények, amelyek igazolják az új gének megnyilvánulását. Sejtmagátvitel Kidolgozásra kerültek olyan sejtmag izolálási módszerek, amelyek biztosítják a maghártya megmaradását és így a sejtmagok PEG oldat közvetítésével protoplasztokkal fúzionálhatók. A kromoszómák mint génátviteli vektorok Sejtmagok átvitelekor még a teljes kromoszomális génállomány átkerül a recipiens sejtbe, de kiküszöbölődnek a citoplazmatikus komponensek. Alapvetően új helyzetet teremthet azonban a mitózis során megjelenő kromoszómák, mint génátviteli vektorok használata. A magállomány kondenzációjával a metafázisban kialakuló kromoszómák már lényegesen kisebb részét képviselik a genomnak. Ha ezek a sejtorganellumok az osztódó sejtekből izolálhatók, továbbá beépíthetők egy másik növény protoplasztjaiba, megteremtődnek a feltételek a genomrészek genetikai manipulációjához. Emlőssejt genetikai rendszerekben az izolált metafázis kromoszómák közvetítésével történő génátvitel széleskörűen használt módszer. A beépített kromoszómák sorsát vizsgálva az esetek többségében a kutatók citológiai módszerekkel nem tudták kimutatni az idegen kromoszóma jelenlétét a kialakuló sejtvonalakban. Ugyanakkor mind genetikai, mind biokémiai úton igazolni lehetett idegen kromoszóma által hordozott sajátosságok megnyilvánulását. A kialakuló részleges hibrid genom ideális genetikai konstrukciónak tekinthető számos növénygenetikai vagy nemesítési cél szempontjából. Ezért indokolt volt a szükséges metodikai háttér megteremtése, amely biztosítja intakt növényi metafázis kromoszómák nagy tömegű izolálását. Az emlőssejteknél alkalmazott megközelítések adaptálásával a 80-as évek elején születtek meg az első eredmények. A kromoszómaizolálás lépéseit HADLACZKY és mtsai (1993) közleménye foglalja össze. Ahhoz, hogy az izolált kromoszómák mint természetes úton becsomagolt DNS-molekulák a génátvitel eszközei lehessenek, szükség van a kromoszómák protoplasztokba való bevitelére. Az első sikeres kísérletekről SZABADOS és mtsai 1981-ben számoltak be, amelyekben a protoplaszt + kromoszóma keverék polietilénglikollal történt kezelése után citológiai módszerrel ki tudták mutatni egyetlen búzakromoszóma jelenlétét petrezselyem sejtben. Holland kutatók mikroinjektálással juttattak be kromoszómát növényi protoplasztokba. A kromoszómaátvitel tényét igazoló eredmények ismeretében felmerül a kérdés, mi a sorsa az idegen kromoszómáknak? Erre választ olyan kísérleti rendszer segítségével kaphatunk, amelyikben a kromoszómaforrásként szolgáló sejtek domináns, szelektálható markert hordoznak. Így például a metotrexátrezisztenciát hordozó sárgarépamutáns sejtvonalból Praznovszky Tünde kromoszómákat izolált, majd polietilén-glikolos kezeléssel átvitte azokat búza (Triticum monococcum) protoplasztokba. A 6.3/16. A ábrán látható egy búzasejt, amelyben az interfázisos sejtmag mellett egyetlen sárgarépa-kromoszóma van. Ez a kép a felvétel utáni helyzetet szemlélteti. A további folyamatok vizsgálatához a kezelt protoplasztokat gátló koncentrációjú metotrexát jelenlétében tenyésztette, és így több rezisztens kolóniát kapott (6.3/16. B ábra). A rezisztens vonalak citológiai jellemzése azt mutatta, hogy az egyik esetében három hónappal a felvétel után még kimutatható egyetlen kis sárgarépa-méretű kromoszóma a nagy búzakromoszómák mellett (6.3/16. E ábra). A későbbi citológiai ellenőrzés során ennél a vonalnál is – a többihez hasonlóan – már nem lehetett kimutatni a répa kromoszómát, ugyanakkor a sejtek megtartották metotrexátrezisztenciájukat. Napjainkban a kutatási kapacitások döntő részét a génizolálási és transzformációs törekvések foglalják le. Elképzelhető, hogy a jövőben mind nagyobb lesz az érdeklődés az izolált kromoszómák közvetítésével történő génátvitel iránt. Hiszen ezen az úton nemcsak nemesítési tenyészanyagok nyerhetők, hanem a funkcionális genom programok egyedülálló génforrást jelentő növényanyaghoz juthatnak. Külön jelentőséget kölcsönözhet ennek a megközelítésnek, hogy számos, a transzformánsokkal szembeni kifogás ezekre a genotípusokra nem érvényes. 177 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


6.3/16 ábra: Izolált sárgarépa-kromoszóma bevitele búza (Triticum monococcum) protoplasztokba polietilénglikol-kezeléssel A) sárgarépa-kromoszóma a kétmagvú búzasejtben,közvetlenül a felvétel után, B) metotrexátrezisztens búzakolóniák, C) mitotikus búzakromoszómák, D) mitotikus sárgarépa-kromoszómák, E) egyetlen, kisméretű kromoszóma a metotrexátrezisztens búzavonalban az MTX® sárgarépavonalból izolált kromoszómák bevitele után három hónappal (Praznovszky T. kísérlete) Felhasznált és ajánlott irodalom Bajaj, Y. P. S. (1994): Somatic hybridization in crop improvement. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 27, Springer Verlag, Berlin. Belea, A. (1986): Faj- és nemzetségkeresztezések a növényvilágban. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Bourgin, J. P. (1986): Isolation and characterization of mutant cell lines and plants: auxotrophs and other conditional lethal mutants. In: Vasil, J. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, 3, 475–498. Bucherna N., Nagy I., Heszky L. (1995): A DNS metilációjának szerepe a növényi génműködés szabályozásában. Növénytermelés 44, 193–200. Chaleff, R. S. (1986): Isolation and characterization of mutant cell lines and plants: Herbicide resistant mutants. In: Vasil, J. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, 3, 499–512. Cséplő, Á., Medgyesy, P., Hideg, É., Demeter, S., Márton, L., Maliga, P. (1985): Triazine resistant Nicotiana mutants from photomyxotrophic cell cultures. Mol. Gen. Genet., 200, 508–510. Dudits, D. (1982): Fúzionált sejtek, hibrid növények. Akadémiai Kiadó, Budapest. Dudits, D., Maróy, E., Praznovszky, T., Oláh, Z., Györgyey, J., Cella, R. (1987): Transfer of resistance traits from carrot into tobacco by asymmetric somatic hybridization: regeneration of fertile plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 8434–8438.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Dudits, D., NémetH, G. (1976): Methods of somatic plant genetics in cereal research. In: Semaine D‟Etude Cerealiculture. Centre de Rescherches Agronomiques. Gembloux, Belgique, 127–139. Earle, E. D., Cardi, T. D., Dickson, M. H., Hansen, L. N., Heath, D. W., Ren, J. P., Sigareva, M. (1999): Contribution of protoplast fusion to improvement of Brassica crops. In: Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. Altman, A., Ziv, M. Izhar, S.(eds), Kluwer Academic Publisher, 131–134. Gillissen, L. J. W., Staveren, M. J., Cremers-Molenuaar J., VerhOeven H. A. (1993): Development of polysomatics in seedlings and plants of Cucumis sativus L. Plant Science 91, 171–179. Glimelius, K. (1984): High growth rate and regeneration capacity of hypocotyl protoplast in some Brassicaceae. Physiol. Plantarum, 61, 38–44. Hadlaczky, G., Bisztray, G., Praznovszky, T., Dudits, D. (1983): Mass isolation of plant chromosomes and nuclei. Planta, 157, 278–285. Heszky L. E., Li Su Nam, Simon-Kiss I., Lőkös K., Gyulai G., Kiss E. (1990): Organ specific and ploidy dependent somaclonal variation, a new tool in breeding. Acta Biologica 40, 383–394. Heszky L. E., Simon Kiss I., Do Quangh B. (1996): Release of rice variety ‟DAMA‟ developed trough haploid somaclone breeding. In: Y.P.S. Bajaj (ed.) : Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 36. 46–54. Springer Verlag, Berlin-Heidelberg-New York. Heszky L., Simonné Kiss I. (1997): „DAMA‟ az első magyar ,,biotech” növényfajta. Növénytermelés 6, 555– 557. Hinnisdaels, S., Jacobs, M., Negrutiu, I. (1994): Asymmetric somatic hybrids. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry, 27, 57–71. Kamo, K. K., Chang K. K., Lynn, M. E., Hodges T. K. (1987): Embryogenic callus formation from maize protoplasts. Planta, 172, 245–251. Kao, K. N. (1977): Chromosomal behaviour in somatic hybrids of soybean and Nicotiana glauca. Mol. Gen. Genet., 50, 225–230. Kao, K. N., Michayluk, M. R. (1974): A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta, 115, 355–367. Karp, A. (1991): On the current understanding of somaclonal variation. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology 7, 1–58. Kyozuka, J., Hayashi, Y., Shimamoto, K. (1987): High frequency plant regeneration from rice protoplasts by novel nurse culture methods. Mol. Gen. Genet., 206, 408–413. Larkin, P. J., Scowcroft, W R. (1981): Somaclonal variation – a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appl. Genet., 60, 197–214. Maddock, S. E. (1987): Suspension and protoplast culture of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.). Plant Cell Report, 6, 23–26. Menczel, L., Lázár, G., Nagy, F., Maliga, P. (1982): Effect of radiation dosage on efficiency of chloroplast transfer by protoplast in Nicotiana. Genetics, 100, 487–495. Mórocz S., Donn, G., Németh, J., Dudits, D. (1990): An improved system for the obtention of fertile regenerants via maize protoplasts isolated from a highly embryogenic suspension culture. Theor. Appl. Genet. 80, 721–726. Pauk, J., Kertész, Z., Jenes, B.–Purnhauser, L., Manninen, O., Pulli, S., Barabás, Z., Dudits, D. (1994): Fertile wheat (Triticum aestivum L.) regenerants from protoplasts of embryogenic suspension culture. Plant Cell, Tissue and Organ Cult., 38, 1–10.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Phillips, R. L., Kaeppler, s. m., V. m. Peschke (1990): Do we understand somaclonal variation? In: Nijkamp H. J.J, van der Plas, L.H.W., J. van Aartrijk (eds): Progress in Plant Cellular and Molecular Biology, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht – Boston – London, 131–141. Polgár, ZS., Dudits, D., Horváth, S. (1996): Burgonya + Solanum brevidens (Phil.) szomatikus hibridek előállítása, jellemzése és nemesítési értékének meghatározása. Növénytermelés 45/1, 1–11. Polgár, ZS., Preiszner, J., Dudits, D., Fehér, A. (1993): Vigorous growth of fusion products allows highly efficient selection of interspecific potato somatic hybrids: molecular proofs. Plant Cell Reports, 12: 399–402. Preiszner, J., Fehér, A., Veisz, O., Sutka, J., Dudits, D. (1991): Characterization of morphological variation and cold resistance in interspecific somatic hybrids between potato (Solanum tuberosum L.) and S. brevidens Phil. Euphytica, 57, 37–49. Ramulu, K. S., Dijkhuis, P. (1986): Flow cytometric analysis of polysomaty and in vitro genetic instability in potato. Plant Cell Reports 3, 234–237. Rhodes, C. A., Love, K. S., Ruby, K. L. (1988): Plant regeneration from protoplasts isolated from embryogenic maize cell cultures. Biotechnology, 6, 55–60. Sacristán, M. D. (1986): Isolation and characterization of mutant cell lines and plants: Disease resistance. In: Vasil. J. K. (ed.): Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, 3, 513–525. Salhani, N., Vienken, J., Zimmermann, U., Ward, M., Davey, M. R., Clothier, R. H., Balls, M., Cocking, E. C., Lucy, J. A. (1985): Haemoglobin synthesis and cell wall regeneration by electric field induced interkingdom heterokaryons. Protoplasma, 125, 3035. Szabados, L., Hadlaczky, Gy., Dudits, D. (1981): Uptake of isolated plant chromosomes by plant protoplasts. Planta, 151, 141–145. Terada, R., Yamashita, Y., Nishibayashi, S., Shimamoto, K. (1987): Somatic hybrids between Brassica oleraceae and B. campestris selection by use the of iodoacetamide inactivation and regeneration ability. Theor. Appl. Genet., 73, 379–384. Wakasa, K., Widholm, J. (1987): A 5-methyl-triptophan resistant rice mutant, MTRl, selected in tissue culture. Theor. Appl. Genet., 74, 49–54. Wallin, A., Glimelius, K., Eriksson, T. (1974): The induction of aggregation and fusion of Daucus carota protoplasts by polyethylene glycol. Z. Pflanzenphysiol., 74, 64–80. Yamada, Y., Yang, Z. Q., Tang, D. T. (1986): Plant regeneration from protoplasts-derived callus of rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Reports, 5, 85–88. Zelcer, A., Aviv, D., Galun, E. (1978): Interspecific transfer of cytoplasmic male sterility by fusion between protoplasts of normal Nicotiana sylvestris and X-ray irradiated protoplasts of male-sterile N. tabacum. Z. Pflanzenphysiol., 90, 397–407. Zhang, S., S. Zhang, M. J. Cho, P. Brigitzer, G. P. Lemaux (1998): Comparative analysis of genomic DNA methylation status and field performance of plant derived from embryogenic calli and shoot meristematic cultures. in: Altman A., M. Ziv., S.Izhar (eds): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. 263–268. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht – Boston – London. Zimmermann, U., Scheurich, P. (1981): High frequency fusion of plant protoplasts by electric fields. Planta, 151, 26–32.

2. 7. Transzgénikus növények létrehozása DNStranszformációval (Dudits D.)A DNS-transzformáció folyamán a génátvitel közvetítői a nukleinsavmolekulák, amelyek a sejtbe való bejutás után integrálódnak a recipiens genomba, vagy extrakromoszomális molekulaként replikálódnak. 180 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Az előző fejezetekben ismertetett génátviteli módszerek közvetve, a sejtorganellumok közvetítésével juttatták be az idegen genetikai információt hordozó DNS-molekulákat a szomatikus növényi sejtekbe. Sejtfúzió vagy kromoszómák bevitele esetén a sejtbe kerülő DNS-molekulák nincsenek szabad formában. Fehérjékhez kötötten, az eredeti kromatinstruktúra fennmaradása mellett jutnak be a citoplazmába, ahol a sejtciklus változásait követve az S fázisban lejátszódó DNS-szintézis alatt következhet be a DNS-molekulák közötti rekombináció. Az ún. sejtgenetikai módszerek egyidejűleg nagyszámú génnek megfelelő kódoló és jelentős mennyiségű nem kódoló DNS-szekvencia átvitelét biztosítják. Ezért használatukkor nem beszélhetünk specifikus genetikai manipulációról. A véletlenszerűen kialakuló sokféle rekombináns közül sejtvagy növényszinten utólagos szelekcióval kell a kívánt genotípust megtalálni. Az átvitel irányítottságának és hatékonyságának növelésére adhat lehetőséget, ha a szóban forgó tulajdonság kialakításáért felelős gént, mint izolált DNS-molekulát juttatjuk a növényi sejtekbe. Bármilyen könnyen elfogadható is egy ilyen megközelítés létjogosultsága és előnyei, a növények transzformációját csak az 1980-as évek elején sikerült megoldani. A siker megalapozásához több tudományterület fejlődése is hozzájárult, azonban a legfontosabb szerepe a rekombinánsDNS-technika kialakulásának volt. A génsebészet, mint új kutatási módszer a lehetőségek széles körét nyitotta meg az 1970-es években a biokémiai, a genetikai és a molekuláris biológiai kutatásban egyaránt. A specifikus helyeken hasító restrikciós endonukleázok felfedezése, majd DNS-ligáz alkalmazásával a restrikciós DNS fragmentek összekapcsolása, továbbá idegen DNS-szakasz beépítése plazmidmolekulákba fontos tudományos eredmények voltak, amelyek alapot adtak a növényi gének izolálásához és transzformációs vektorok kifejlesztéséhez is. Az eredményes növénytranszformáció feltétele volt továbbá a sejt- és szövettenyésztési módszerek tökéletesítése. Mint a következőkben látni fogjuk, a DNS-t az esetek túlnyomó többségében tenyésztett szomatikus sejtekbe vagy szövetekbe viszszük be. Így az idegen gént hordozó ún. transzgénikus növény előállításához általában szükség van a testi sejtekből történő növényredifferenciációra. A következőkben ismertetett transzformációs módszerek és eredmények elemzésekor nem térünk ki a génsebészeti eljárások részleteinek bemutatására. Ezek megismerését több összefoglaló munka is segíti (SAIN BÉLA–ERDEI SÁRA: Génsebészet Gondolat, 1985; WATSON, J. D.–TOOZE, J.–KURTZ, D. T.: A rekombináns DNS. Mezőgazdasági Kiadó, 1988; valamint SAMBROOK, J.–FRITSCH, E. F.–MANIATIS, T.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

2.1. 7.1. A növényi genom mérete és a sejtmagi DNS szerveződése A növények sejtmagjában található DNS mennyisége fajonként jelentősen eltérhet. A 7/1. táblázat adatai szerint a genom méretében akár 10-szeres különbségek is lehetnek egyes növények között. Az Arabidopsis és a Vigna kisméretű genomja 7x107, illetve 5x108 nukleotidpárból épül fel, míg a rozs (Secale) sejtmagi DNS-ét hozzávetőlegesen 7x109 bázispár alkotja. Ahhoz, hogy a DNS alkalmas legyen a biokémiai és génsebészeti vizsgálatokhoz, sérülésmentesen ki kell nyerni a sejtekből, meg kell tisztítani a fehérjéktől, RNS-molekuláktól, illetve különböző szennyeződésektől, pl. a poliszacharidoktól. A kísérlet céljától függően elégséges lehet az össz-DNS kinyerése, illetve szükségessé válhat a sejtmagi, a kloroplasztisz- és a mitokondriális DNS-frakciók elkülönítése. Ehhez először izolálni kell az egyes sejtorganellumokat, majd aztán kitisztítani a DNS-t. Protoplasztok készítésével megkönnyíthető a sejtek feltárása és az egyes sejtkomponensek szétválasztása, azonban leggyakrabban a szövetek fagyasztás utáni homogenizálását használják. A cézium-klorid sűrűségi gradiens-centrifugálásra épülő ún. maxipreparálási módszer mellett ismertek gyors, kis anyagmennyiséget igénylő ún. minipreparálási módszerek. Az előbbi igen tiszta, klónozásra alkalmas DNS -t eredményez, az utóbbival előállított preparátum pedig restrikciós enzimekkel vágható, és így felhasználható molekuláris hibridizációhoz.



A sejtmagból származó DNS-molekulák szekvencia típusainak jellemzése általános képet ad a növényi genom szerveződéséről. Az egyes szekvenciák előfordulási gyakorisága alapján meg lehet különböztetni nagy példányszámban előforduló, ún. gyakran ismétlődő szekvenciákat, illetve közepes gyakorisággal előforduló DNS-szakaszokat. Az egyszeres vagy néhányszoros példányban kimutatható szekvenciák szintén fontos alkotóelemei a genomikus DNS-nek. A különböző szekvenciakategóriák részarányát az egyes szálú, denaturált DNS-szakaszok közötti reasszociáció eredményeként kialakuló kettősszálú molekulák gyakoriságának a DNS koncentrációjától függő időbeni változása alapján állapítjuk meg. A 400–1000 bázispár hosszúságú szakaszokra darabolt egyes szálú DNS-molekulák közül már kis DNS-koncentráció mellett is azok fognak egymással a leggyorsabban hibridizálni, így kettős szálat képezni, amelyek a legnagyobb mennyiségben vannak jelen a hibridizáló oldatban. Minél kisebb egy szekvencia előfordulási gyakorisága, annál több időre, illetve nagyobb DNS-koncentrációra van szükség a kettős szál kialakulásához. A petrezselyem DNS-ével végzett reasszociációs analízis szerint az egyes szekvenciák gyakorisága és részaránya a következő:

Szekvencia típusa

Arány

Példányszám

%

db

Egypéldányú

30

1

Közepesen ismétlődő (lassan reasszociálódó)

16

42

Közepesen ismétlődő (gyorsan reasszociálódó) 37

3 000

Gyakran ismétlődő

136 000

13

Amint a 7/1. táblázat adataiból láthatjuk, a növényeket általában az ismétlődő szekvenciák nagy részaránya jellemzi. Elrendeződésük többféle mintázatú lehet. Az ismétlődő szekvenciák, amelyek jelentős része nem kódol funkcionáló gént, valószínűleg fontos szerepet töltenek be a genom szerkezetének kialakításában. A növényi kromoszómák molekuláris vázát alkotó elemek gyakran részesei átrendeződéseknek, áthelyeződéseknek.

2.2. 7.2. Genomikus növényi géntárak 182 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


2.2.1. 7.2.1. Fág vektorokba történő klónozás Génsebészeti módszerek felhasználásával az átlagosan 5x109 nukleotidpárból álló növényi genomok rövidebb molekulaszakaszokra darabolhatók, majd vektormolekulák segítségével a növényi szekvenciák baktériumsejtekben fenntarthatók és szaporíthatók. Létrehozhatók olyan baktérium-, pl. E. coli sejtpopulációk, amelyek a vektor által hordozott DNS-molekulák formájában egy növény teljes genomját reprezentálják. Ezekből az ún. géntárakból aztán molekuláris módszerek segítségével kiválaszthatók azok a baktériumsejtek, kolóniák, amelyek egy kívánt növényi DNS-darabot hordoznak. Így mód nyílik növényi gének, specifikus DNSszekvenciák izolálására, nagymértékű felszaporítására és részletes analízisére. Alapul véve például a lucernagenom méretét (7/1. táblázat), amely 1,2x109 bázispárból áll a haploid kromoszómaszámot tekintve és azt, hogy ha hozzávetőlegesen 18 kb hosszúságú szakaszokra daraboljuk fel a DNS-t, akkor csaknem 500 000 baktériumtelepre van szükség valamely egy példányban előforduló szekvencia 99%-os valószínűséggel való megtalálásához. Ilyen méretű géntárak előállítására a lambda-fágokból kifejlesztett vektorok a legalkalmasabbak A következőkben egyik leggyakrabban használt klónozóvektor, az EMBL-3 példáján keresztül mutatjuk be a genomikus génbank készítésének főbb lépéseit (7/1. ábra).



7/1. ábra: Az EMBL3 vektorba való klónozás lépései A több mint 40 kb hosszú lineáris fág-DNS-molekula három egységből épül fel. A bal oldali karon helyezkednek el a virionfehérjéket kódoló gének, a jobb oldali, szintén nélkülözhetetlen karon találhatók a replikációs gének és a promoterek. A két kar közötti központi, ún. kitöltőszakasz nem létfontosságú a fág életciklusa során, ezért az ún. helyettesítő vektoroknál, mint amilyen az EMBL-3, erre a részre építik be a klónozandó idegen DNS-darabokat. Amint a 7/1. ábrán látható, BamHI enzimmel kivágható a kitöltőszakasz. Azért, hogy ez a molekula a későbbiekben ne vehessen részt a ligálási folyamatban, és elsősorban rekombináns fágmolekulák képződjenek, továbbá ne álljon vissza az eredeti fágstruktúra, egy következő, EcoRI-emésztést célszerű végezni. Az így keletkező EcoRI-végek már nem kapcsolódnak a többi fragmentvéggel, és a keletkező 10 bázispár nagyságú EcoRI-BamHI fragmentek izopropanollal kicsapva szelektíven eltávolíthatók. A fágkarok végén található tapadós szakaszok. az ún. kohézív végek (cos) lehetővé teszik a két kar összekapcsolódását és 184 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK egy konkatemer molekula létrejöttét. A 7/2. ábrán Takács Imre kísérlete alapján bemutatjuk az egyes fágkomponenseket. A klónozandó növényi DNS-t törésmentesen megfelelő tisztasági fok elérésével kell izolálni. Protoplasztok használata és sejtmagok izolálása lényegesen javíthatja az izolálás minőségét. A magfrakciót szarkozilt (2%) tartalmazó oldattal célszerű feltárni és CsCl hozzáadása után ultracentrifugálással megtisztítani a növényi DNS-t. Tekintettel arra, hogy ez a vektortípus 18–22 kb nagyságú DNS-szakaszok befogadására alkalmas, a növényi DNS-t a feldarabolás után méret szerint frakcionálni kell. Mivel a vektormolekulák szabad végein BamHI kinyúló vég van (GATC) a növényi DNS-t kompatibilis enzimmel kell hasítani. A négy nukleotidot (GATC) felismerő Sau3A és Mbol enzimekkel végzett részleges emésztés a karokhoz ligálható növényi DNS-t eredményez. Mivel ezek az enzimek átlagosan 256 bázispáronként vágják a DNS-t, a részleges emésztést úgy kell végezni, hogy csak minden 80. felismerhető restrikciós vágási helyen legyen emésztés. Ez vezethet a kívánt 20 kb nagyságú szakaszokhoz. Az optimális vágási körülmények DNSmintánként változnak, ezért az enzim koncentrációját és az emésztés idejét kísérletesen kell megállapítani. A 7/2. A ábrán az Arabidopsis-DNS MboI-emésztés utáni méret szerinti megoszlása látható. Azt a kezelési kombinációt kell használni, amely a 18–22 kb tartományban a legtöbb molekulát eredményezi. A kívánt fragmenteket nagyobb mennyiségben az optimalizált emésztés után általában cukorgradiensen tisztítjuk meg (7/2. B. ábra). A növényi DNS-molekulákat a DNS-ligáz enzim kapcsolja össze a vektormolekulákkal, és az így kialakuló rekombináns fág-DNS, ha mérete eléri a 40 kb-ot, és nem nagyobb 52 kb-nál, in vitro fágfejbe csomagolódhat. Ilyenkor a DNS-ből és a tisztított fágfehérjékből összeépülnek a fágrészecskék, amelyekkel baktériumsejtek fertőzhetők. A fertőzött sejtekben a fág szaporodása egyben az idegen szekvencia megsokszorozódását is jelenti. A baktérium-,,pázsiton‟‟ kialakuló ,,tar” foltok jelzik az eredményes fertőzés helyét.



7/2. ábra: Az Arabidopsis DNS előkészítése a klónozásra A) Az Mbol-emésztés körülményeinek optimalizálása részleges emésztéshez; 1 – 1 egység/μg DNS, 2 – 0,5 egység/μg DNS, 3 – 0,2 egység/μg DNS, 4 – 0,125 egység/μg DNS, 5 – 0,062 egység/μg DNS, 6 – 0,031 egység/μg DNS, 7 – 0,015 egység/μg DNS, 8 – 0,007 egység/μg DNS (a nagy tételű izoláláshoz az 5. kombinációt célszerű használni) B) Az Mbol-emésztés után a cukorgradiensen (10–40%) 1 mol NaCl jelenlétében frakcionált Arabidopsis-DNS molekulatömeg szerinti megoszlása; C) A klónozó vektor és a növényi DNS próbaligálása; 1 – Bam HI + EcoRI emésztett EMB L 3 DNS, 2 – szacharóz gradiensen frakcionált Arabidopsis-DNS 14–20 kb 3 – az EMBL 3 fágkarok próbaligálása, 4 – az Arabidopsis-DNS próbaligálása, 5 – a fágés a növény-DNS-ek egymáshoz ligálása (Takács I. kísérlete) A lambda-fágokból kifejlesztett vektorok korlátja, hogy 20–25 kb az a legnagyobb fragmentméret, amely még elhelyezhető a molekulán. Ezt a hátrányt küszöbölik ki az ún. kozmidvektorok, amelyek akár 45 kb nagyságú DNS-szakasz befogadására is képesek. Így lehetővé teszik nagy gének egyetlen rekombináns klónként történő 186 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK izolálását. Hosszabb, kapcsolódó szekvenciák vagy több gén együttesen is izolálható ezekkel a vektorokkal. Kevesebb kolónia kell egy kívánt gén megtalálásához. Ugyanakkor a kozmidvektorok használata nehézkesebb. A kozmidok lényegében plazmidmolekulák, amelyek hordozzák a lambda-fág kohéziv végeit. A cos szekvencia jelenléte lehetővé teszi, hogy az egész molekula in vitro a fágfejekbe csomagolódjon, és az E.coli sejtek fertőzésén keresztül a sejtekben fennmaradjon és megsokszorozódjon. Ez a klónozási technika kisebb hatékonyságú, ezért általában genomrészek klónozására használható.

7/3. ábra: A lucerna genomikus génbankban a nodulingén azonosítása 32P izotóppal jelölt cDNS-t használva próbaként (Kiss Gy. B. kísérlete) A rekombináns klónok közül a kívánt szekvenciát hordozó fágok molekuláris hibridizációval találhatók meg és azonosíthatók. A tar foltokban lévő fágrészecskéket és a kiszabadult DNS-molekulákat nitrocellulóz hártyára átitatva mód van egy vagy több másolat készítésére. A fágok feltárása és a DNS denaturációja után az egyes szálú DNS-molekulák 80 °C-on végzett kezeléssel erősen rögzíthetők a nitrocellulóz hártyán. P 32-izotóppal jelölt homológ vagy részben homológ DNS-molekulákat folyadékban érintkezésbe hozva a nitrocellulózhoz kötött fág-DNS-sel, bekövetkezik a homológ szakaszok közötti renaturáció. A jelzett DNS-molekulák kapcsolódnak a hártyán lévő komplementer szekvenciákhoz. A kötődési helyeket jelzik az autoradiogramon megjelenő elfeketedések, így a film segítségével pontosan megtalálhatók a pozitív tar foltok, és izolálhatók a rekombináns fágok. A 7/3. ábrán egy ilyen hibridizációs kép látható, amelyben a lucerna cDNS-ét használva molekuláris próbaként, lehetővé vált a lucernagénbankokból a nodulingén megtalálása. Gyakran követett megközelítés a heterológ próbák használata. Alapvető sejtfunkciókat ellátó fehérjék génjei sok esetben nem változtak az élővilág evolúciója során. Így jelentős a nukleotidsorrendben meglévő azonosság még rendszertanilag távoli fajok esetében is. Ez bizonyos korlátok között lehetőséget ad a már más fajokból megklónozott gének próbaként való felhasználására. A génizolálás legáltalánosabban követett stratégiája komplementer cDNS előállításán alapszik (lásd később), amelynek birtokában a genomikus klónok hibridizációval megkereshetők. A fehérjeszekvencia ismeretében felírható a nukleotidszekvencia egy részlete, aminek alapján mesterségesen megszintetizálható egy 20–30 bázispárból felépülő oligonukleotid. Tekintettel arra, hogy ugyanazt az aminosavat különböző kodonok is meghatározzák, az oligonukleotid szintézisénél több variációt tartalmazó molekulát kell kialakítani. Különösen a harmadik nukleotidokat érinti ez a heterogenitás. A kevert próba használata helyett kedvezőbb egy olyan molekula szintézise, amelyben a bizonytalan helyekre 2-dezoxiinozint építenek. Ez mint semleges nukleotid párosodni képes az A-, a C- és a T-bázisokkal.

2.2.2. 7.2.2. Nagyméretű genomikus DNS-szakaszok izolálása és klónozása – YAC és BAC génbankok 187 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK A genetikai és molekuláris térképekre alapozott génizolálás szükségessé teszi több száz kb hosszúságú DNSmolekulák klónozását. A jóminőségű megabázis nagyságú növényi DNS-t protoplasztok agarózblokkokba történő beágyazásával lehet izolálni (WING és mtsai 1993). A módszer lényege, hogy fiatal növényi részekből ép, egészséges protoplasztokat izolálnak, majd beágyazzák azokat alacsony olvadáspontú agarózba ásványi olaj jelenlétében. Az így képződött emulziót jéghideg oldatban hirtelen lehűtik, és ott agarózgömböcskék alakulnak ki. A proteináz K kezelést követően kerül sor a növényi DNS részleges emésztésére. Gyakran EcoRI restrikciós enzimmel hasítják a növényi DNS-t. A vágási helyek számát, és így a keletkező DNS-fragmentek hosszát az enzim koncentrációjának változásával lehet optimalizálni. Jól bevált az EcoRI-metilázzal történő egyidejű kezelés, mert így bizonyos EcoRI felismerő helyeknél gátolható a hasítás. A két enzim arányának optimalizálásához szükség van a kapott DNS-fragmentek méretének meghatározására. A 200–800 kb méretű DNS-molekulák elektroforéziséhez váltakozó irányú elektromos erőteret biztosító készülékekre (PULSED FIELD ELECTROPHORESIS) van szükség (összefoglaló: EBY, 1990). Ezek egyik típusát, a rögzített homogén elektromos erőteret (CLAMPED HOMOGENOUS ELECTRIC FIELDS, CHEF) előállító készülék változatát az 7/4. ábra mutatja be. Mint láthatjuk, ennél az elrendezésnél a gél fixen rögzített és körülötte helyezkednek el az elektródok. A változó irányú elektromos erőtér úgy biztosítható, hogy az egyes elektródok áram alá helyezését meghatározott időrend szerint egy komputer irányítja. Például 1%-os agarózgél esetében 200 V feszültség mellett 19 órán keresztül 60–90 másodpercenként történik az átkapcsolás a másik póluspárra. Az elektroforézist követően etidiumbromid-festés után UV-fényben látható a kapott DNS-fragmentek méret szerinti megoszlása. Ha a DNS nagyobb részt a 200–800 kb tartományban található, akkor a használt emésztési körülmények már alkalmazhatók a génbank elkészítéséhez szükséges DNS-minta előállításához.

7/4. ábra: A változó irányú elektromos erőteret biztosító elektroforézis készülékek egyik változata, ahol a gél rögzített és az elektródok áram alá helyezésével változtatható a tér iránya, amelyet a hosszú Az eukarióta szervezetek génállományának felderítését, a teljes DNS-szekvencia meghatározását célzó ún. genomprojektek sikeressége nagyban függ a klónozó vektorok befogadóképességétől, stabilitásától és a génkönyvtár kezelhetőségétől. A néhány száz kb. nagyságú DNS-fragmentek klónozása mind élesztő-, mind baktériumvektorok felhasználásával megvalósítható (7/5. és 7/6. ábrák). Az ún. élesztő mesterséges kromoszóma (YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOME, YAC) rendszert BURKE és mtsai (1987) fejlesztették ki. Mint a 7/5. ábrán látható, ez a rendszer rendelkezik egy élesztőkromoszóma funkcionális elemeivel, úgymint telomerekkel (TEL), centromerrel (CEN4) és az önálló replikációhoz szükséges szekvenciákkal (AUTONOMOUS REPLICATION SEQUENCES, ARS‟s). A szelekciót biztosító markerek az URA3 és TRP1. A SUP4 egy színbélyeg működését teszi lehetővé, amikor az inszerciót hordozó élesztősejtek vörös színűek. A SmaI részlegesen emésztett klónozandó genomikus DNS-fragmentek a SUP4-régióba kerülnek beépítésre a SmaI helyre. A YAC klónok akár 1000 kb (1 Mb) nagyságú növényi DNS-t is képesek befogadni. Ez azt jelenti, hogy kb. 2400 YAC klónnal a rizs genom fele reprezentálható. 188 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


7/5. ábra: Nagyméretű (>1000 kb) növényi DNS-szakaszok klónozása élesztő mesterséges kromoszómába (YAC) A vektoron megtalálhatók a kromoszómák funkcionális elemei, mint centromer (CEN4), telomerek (TEL), replikációs régió (ARS1), szelekciós markerek (URA3; TRP1) (Burke és mtsai, 1987 nyomán A bakteriális mesterséges kromoszóma (BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME, BAC) vektorrendszer ugyan 300 kb méretű inszerciók befogadására alkalmas, de számos előnyt kínál komplex genomok vizsgálatára (SHIZUYA és mtsai, 1992). Az E. coli F-plazmidjából kifejlesztett vektor főbb elemeit a 7/6. ábra mutatja. Az oriS és a repE gének biztosítják a replikáció egyirányúságát. A parA és parB gének szabályozzák a kópia számot. Az F faktor baktériumsejtenként egy vagy két példányban fordul elő és így csökkent valószínűségű a beépített fragmentek közötti rekombináció. A plazmidon megtalálható a klóramfenikol rezisztenciagén, mint szelekciós marker. A klónozó régióban helyezkednek el a á bakteriofág cosN és P1 fág loxP szakaszai, segítségükkel használható fragmentvégek alakíthatók ki. A HindIII és BamHI klónozó helyet a T7 és SP6 promoterek fogják közre, így RNS-próba készíthető illetve az inszert végei megszekvenálhatók. A BAC vektor előnyeként említhető még, hogy az erősen felcsavarodott, kör alakú plazmid könnyen, törések nélkül izolálható.



7/6. ábra: Közepesen nagyméretű (>300 kb) nagyságú növényi genomikus DNS-szakaszok klónozására alkalmas bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) (Shizuya és mtsai, 1992 nyomán) A YAC vagy BAC génkönyvtárak birtokában el lehet készíteni a szomszédos, átfedő klónok sorrendjét, a fizikai térképet. Az átfedő klónok behatárolása történhet DNS-ujjlenyomat (FINGERPRINT) készítésével. Ehhez a BAC klónokból plazmidot izolálunk, majd HindIII emésztés után P32-ATP segítségével megjelöljük az inszertek egyik végét. Ezt követően Sau3AI emésztéssel feldaraboljuk a végjelölt növényi DNS-t. Denaturáló poliakrilamid gélben a jelölt DNS-darabokat frakcionáljuk és autoradiogramot készítünk az egyes inszerciókra jellemző mintázat láthatóvá tételére. A mintázatok közötti hasonlóság alapján az átfedő BAC-klónok felismerhetők. Az egyes klónok által hordozott DNS-fragmentek kromoszómákon történő elhelyezését segítheti a kromoszóma-specifikus markerekkel való hibridizáció. Ilyenek lehetnek a szekvencia specifikus régiók, RFLP vagy mikroszatellit markerek. Az egyes inszertek közötti kereszthibridizáció szintén rámutat a klónok közötti átfedésekre. A szomszédos, átfedő klónok ismeretében megszerkesztett fizikai térkép hatékony használatának az a feltétele, hogy ezt az információt kombináljuk a genetikai és molekuláris térképek adataival. A térképezett RFLP markerek igen hasznos eszközei lehetnek az agronómiai gének klónozásának, amennyiben a molekuláris marker és az adott tulajdonság hasadó populációkba együtt szegregál. A YAC és a BAC klónokra alapozott


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK térképezési és klónozási stratégiát két összefoglaló is részletesen ismerteti (KURATA és mtsai 1997, ZHANG és WING 1997).

2.3. 7.3. Komplementer DNS-molekulák szintézise és klónozása A génizolálási stratégiák egyik legeredményesebben használt változatában a génműködés köztes termékét a hírvivő, ún. mRNS molekulákat használják kiindulási anyagként. A citoplazmában található érett mRNSmolekulák az elsődleges transzkriptumokból, a sejtmagi heterogén RNS-ekből (hnRNS) képződnek az intronszekvenciák kivágódásával és az 5‟ végén található CAP, valamint a 3‟ végén kialakuló poliadenilációs szignál kialakulásával (lásd később 7/15. ábra). A különböző sejttípusokban szintetizálódott mRNS-populációk nem a teljes genomikus génállományt, hanem csak a működő géneket reprezentálják. A reverz transzkriptáz enzim az mRNS nukleotidszekvenciájának megfelelő egyszálú komplementer DNS molekula szintetizálására képes. Ezzel a génexpresszió természetes folyamatának fordítottja történik. Az mRNS-molekulák szolgálnak templátként a sejt működő génjeinek megfelelő DNS-darabok létrehozásához. A cDNS-molekulák előállításának és klónozásának vázlata a 7/7. ábrán látható.



7/7. ábra: A cDNS-molekulák előállításának és klónozásának vázlata A növényi szövetekből történő RNS-izolálás eredményessége elsősorban attól függ, mennyire sikerül a ribonukleáz enzimeket gátolni, illetve hatékonyan kinyerni az RNS molekulákat az RNS-fehérje-komplexből. A növényi anyagok esetében jól bevált a lítium-kloridos RNS-izolálási módszer. Az össz-RNS birtokában affinitás kromatográfiával lehet izolálni az mRNS-frakciót. Az mRNS molekulák 3‟ végén található poliadenilációs szakasz révén ezek a molekulák specifikusan köthetők oligo- (dT-) cellulózhoz, a riboszomális és transzfer RNS-ek pedig átfolynak az oszlopon. A polimer 10–12 nukleotidja (T) nagy sókoncentráció mellett hibridizál az mRNS poli(A)+ szakaszaival, kis sókoncentrációjú oldattal azonban ez a kötés feloldható, és mRNS-ben jelentősen feldúsított preparátum nyerhető. Megfelelő tisztítás után a felvitt össz-RNS néhány százaléka marad


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK vissza mRNS-ként. A preparátum minőségét célszerű ellenőrizni in vitro, sejtmentes fehérjeszintetizáló rendszerben (in vitro transzláció).

7/8. ábra: Az egyszálú cDNS-molekulák méret szerinti megoszlása a lucerna cDNS-bank készítésekor 1– 1 szál szintézise 32P-izotóppal, 2 – 2 szál szintézise 32P izotóppal (Györgyey J. kísérlete) A degradációtól mentes, megfelelő hosszúságú mRNS-molekulákról a DNS-szintézist a reverz transzkriptáz akkor tudja megkezdeni, ha a molekulán kettősszálú szakasz alakul ki. Amint az a 7/7. ábrán látható, ez 10–20 bázishosszúságú ún. oligo (dT) hozzáadásával érhető el, amely hibridizál az mRNS 3‟ végén található poliadenilációs régióval. Az első DNS-szál szintéziséhez természetesen szükség van mind a négy nukleotidtrifoszfát (dNTP) jelenlétére. A reakcióelegyhez az egyik nukleotid-trifoszfátot P32 izotóp formájában, pl. alfaP32-dATP-ként is célszerű hozzáadni, így a képződött cDNS-termékek mérete ellenőrizhető. A 7/8. ábrán Györgyey J. kísérlete alapján mutatjuk be az egyszálú cDNS-molekulák megoszlását 1,2%os agarózgélen végzett elektroforézis után. A képződött cDNS-terméket hő denaturálással lehet szétválasztani a templátként használt mRNS-molekulától. Ez elérhető úgy, hogy a mintát 1,5 percig forrásban lévő vízbe helyezzük, majd jégen lehűtjük. A 7/7. ábra az RNaseH-kezelést felhasználó módszert szemlélteti. Az E. coli-ból származó RNase H-enzim hatására folytonossági hiányok keletkeznek az RNS-molekulán, és így a DNS-polimeráz I hatékonyan meg tudja szintetizálni a második szálat, a megmaradó RNS-részeket kötőhelyként, indítómolekulaként, ún. primerként használva. A T4 ligáz pedig kitölti az esetleg meglévő folytonossági hiányokat. A létrejött kettősszálú cDNS-molekulákat akár plazmid-, akár fágvektorokban lehet klónozni. Ezzel lehetővé válik az izolált szekvenciák felszaporítása és a kívánt gének kikeresése. A kettősszálú cDNS-molekulák vektorba építéséhez mesterségesen szintetizált, néhány nukleotidból álló, ún. linkermolekulák használhatók, amelyeknek szekvenciája egyben egy restrikciós enzim hasítóhelyét is hordozza. Ha a klónozóvektor, az EcoRI helyére építjük be a cDNS-molekulákat, akkor EcoRI-linkert kapcsolhatunk a cDNS mindkét végére. Ahhoz, hogy EcoRI-emésztéssel a fölöslegben lévő linkermolekulákat el lehessen távolítani, illetve ragadós végek alakuljanak ki, meg kell védeni a cDNS-en belül lévő EcoRI-felismerési helyeket. Ezt szolgálja ezeknek a szakaszoknak metilcsoporttal való ellátása az EcoRI-metiláz segítségével (7/7. ábra). Indokolt egy méret szerinti szétválasztási lépés beiktatása. Így Bio-gel A 50 m oszlop segítségével különíthetők el a fölösleges linkermolekulák, illetve mód nyílik a cDNS-ek méret szerinti szétválasztására is. A további klónozáshoz csak a kívánt méretű, pl. az 500 bázispárnál hosszabb molekulákat használjuk fel. A 7/7. ábrán bemutatott pGEM-vektor segítségével a rekombinánsok könnyen felismerhetők. Az IPTG-et [béta-Dtiogalaktopiranozidot és az X-Galt (5-bróm-4-klór-3-indolil-béta-D-galaktopiranozidot)] tartalmazó táptalajon a cDNS inszertet hordozó kolóniák fehérek, az üres plazmidot hordozók pedig kék színűek. Előnye ennek a 193 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK vektornak, hogy a cDNS-ről nagy specifikus aktivitású, egyszálú RNS szintetizáltatható, amely hibridizációs próbaként szolgálhat. Nagy mennyiségű specifikus transzkriptumok in vitro előállítására módot ad egy transzlációs rendszerben fehérje termeltetésére. A lambda-gt 11 klónozórendszerben az EcoRI helyére épített cDNS-szakaszról a lac promoter segítségével a béta-galaktozidázzal együtt fúziós fehérje szintetizálódhat. Így ha rendelkezésre áll a keresett gén fehérjetermékével, mint antigénnel szembeni ellenanyag, akkor immunológiai úton kikereshető és azonosítható a kérdéses cDNS-t hordozó klón. Az ismert aminosavszekvencia alapján szintetizált oligonukleotid-próbák szintén eszközei lehetnek a gének keresésének.

7/9. ábra: 2,4-diklórfenoxiecetsav által indukált cDNS-klón azonosítása differenciálhibridizálással cDNSklónokat hordozó baktériumkolóniák tesztelése indukálatlan (A), illetve 2,4-D-indukált (B) sejtekből származó mRNSmolekulákból mRNS-populációjának 32P-vel jelölt próbával – kolóniahibridizáció, C – kiválasztott klónok hordozta cDNS-inszertek, D – a C ábra klónjainak tesztelése 32P-vel jelölt próbával; D mint A, E mint B – Southern-hibridizáció: F – 2,4-D-indukált cDNS-klón expressziója az idő függvényében: 1 – 0 napig, 2 – 1 napig, 3 – 2 napig, 4 – 3 napig, 5 – 4 napig hormonkezelt sejtek, 6 – szomatikus embriók össz RNS-e, 7 molekulaméret-marker – Northern hibridizáció; G – mint F, de a használt próba egy 2,4-D független cDNS-klón (Györgyey J. kísérlete) A cDNS géntárak az RNS-forrásként használt sejtek, szövetek aktuális génexpressziós állapotát tükrözik. Így különböző sejtpopulációkból készített rekombináns klónok összehasonlításával kiválaszthatók a közös, illetve eltérő cDNS-ek. Ezzel az összehasonlító hibridizációs módszerrel bizonyos keretek között lehetőség nyílik sejtvagy szövetspecifikus klónok azonosítására. Ilyen megközelítést választott Györgyey János a lucerna embriógenezisével kapcsolatban lévő gének izolálására. Ezekben a kísérletekben az egyik szövettípust 194 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK dedifferenciált kalluszok alkotják, míg a másik, ún. indukált szöveteket a 2,4-D-kezelést követően a szomatikus embriók képződése jellemzi. A 2,4-D által indukált gének azonosítására a cDNS-bank az indukált szövetekből izolált mRNS felhasználásával készült az előzőekben vázolt módon. A rekombináns baktérium kolóniák DNS-ét egy-egy nitrocellulóz hártyához kötve lehetővé vált, hogy ugyanazt a klónt kétféle próbával hibridizáljuk (7/9. A, B ábra). Ebben az esetben a radioaktív próbák egyike a kallusz-, másika az indukált kalluszszövetből izolált mRNS-ek egyszálú cDNS-populációit képviseli. Ebben a megközelítésben nincs szükség a cDNS-szintézis minden lépésére, csak az első szál szintézisére kerül sor alfa- P32-dezoxinukleotid-trifoszfát jelenlétében. Az azonos klónokat hordozó két nitrocellulóz membránt a kétféle próbával hibridizálva többféle klóntípust láthatunk (7/9. ábra). Vannak olyan klónok, amelyek mindkét esetben egyforma jelet mutatnak. Sokkal érdekesebbek azok, amelyek nem vagy gyengén hibridizálnak a kalluszokból származó RNS-ekkel, erős viszont a szignál az indukált próbával. A 7/9. D, E ábra valóban azt mutatja, hogy a kolóniahibridizáció eredményeit megerősítik a megtisztított és a vektormolekulától elkülönített cDNS-inszerttel kapott hibridizációk. A szelektált cDNS-szakasz valóban olyan gént képvisel, amelyiknek expressziója fokozódik az indukció hatására. Ezt igazolják a Northern-hibridizáció képei, amikor most már az izolált cDNS szolgál RNS hibridizációs próbaként és a jel sokkal intenzívebb a 2,4-D kezelés hatására, jelezve a kérdéses gén aktiválódását (7/9. F ábra). A 7/9. G ábrán egy másik kontroll cDNS-sel kapott expressziós mintázat látható. Az összehasonlító hibridizáció molekulapopulációk vizsgálatára épül. Mind a klónok, mind a próbák statisztikusan jellemzik az értékelt sejteket, szöveteket. Ez a módszer elsősorban olyan gének felkutatását teszi lehetővé, amelyek elég nagy számban íródnak át RNS-sé akár a gén többszöri előfordulása, akár erős kifejeződése miatt. A kolóniahibridizáció könnyen félrevezethet, ezért az eredményeket ellenőrizni kell izolált DNS-sel is. Az összehasonlító hibridizáció eredményessége növelhető a molekulák előszelekciójával. Ez történhet folyadékban végzett hibridizációval, amikor az egyik sejttípusból származó egyes szálú cDNSmolekulákat összekeverjük nagy fölöslegben adott mRNS-sel, amelyet a másik sejttípusból izoláltunk. A mindkét molekulapopulációban előforduló szekvenciák cDNS-mRNS-hibridet, kettős szálat képeznek, az egyedi, specifikus szekvenciák pedig a hibridizáló komplementermolekula hiányában egyszálúak maradnak. A hidroxilapatit-kromatográfia lehetővé teszi a nem hibridizáló molekulák kiválasztását, és így elérhető a jellegzetes szekvenciák feldúsulása.

2.3.1. 7.3.1. A transzkripciós mintázat összehasonlításával történő génizolálás további módszerei A sejtek, szövetek fiziológiai és differenciáltsági állapotának megfelelően a gének egy meghatározott köre (10– 15 ezer gén) mutat transzkripciós aktivitást, így a szintetizálódó mRNS-populáció visszatükrözi az aktuálisan működésben lévő sejtfunkciókat. Ezért a transzkripciós mintázat összehasonlításával (TRANSCRIPTIONAL PROFILING) felderíthetők egy adott sejtállapot fenntartásában szerepet játszó gének illetve izolálhatók cDNSklónjaik. A rekombináns DNS-technológiák tökéletesedésével egyre jobb felbontóképességű, megbízhatóságú módszerek kerültek kidolgozásra, amelyek lehetővé teszik az alacsony példányszámú mRNS-molekulák bevonását is az összehasonlításba. Így a megközelítések egy része, mint pl. a cDNS-populációk eltéréseit kimutató “DIFFERENTIAL DISPLAY (DD)” módszer a polimeráz láncreakcióval (POLYMERASE CHAIN REACTION, PCR) megvalósított amplifikációra épül. Ezt a módszert eredményesen használták számos növényi gén izolálására, amelyek fejlődési stádiumtól függő kifejeződést mutatnak (lásd összefoglaló: BALDWIN és mtsai 1999). A DD módszer vázlatát a 7/10. ábra szemlélteti. Az összehasonlítandó sejtvagy szövetmintából először RNS-t kell izolálni, amelyet DNáz-kezelés után lehet az első szálú cDNS szintéziséhez felhasználni. A reverz transzkripcióhoz a 7/10. ábrán bemutatottaknak megfelelően 12 nukleotidból álló oligo dT, ún. rögzítőprimer-keverék kerül felhasználásra. A megszintetizált egyszálú cDNS-ek amplifikációjához szükség van rövidebb, tetszőleges nukleotid-összetételű primerek sorozatára, amelyek a cDNS-ek különböző helyeihez kapcsolódva biztosítják a Taq DNS-polimeráz által katalizált többszöri DNS-szintézist. A PCR termékek radioaktív jelölését a reakcióelegyhez adott S35-dATP biztosítja. Miután a cDNS-ek amplifikációja a minták mindegyikének felhasználásával megtörtént, a jelölt termékeket denaturáló poliakrilamid gélen lehet szétválasztani. A mintázat összehasonlításával megtalálhatók azok a termékek, amelyek csak az egyik mintában fordulnak elő. A megfelelő DNS-csík kivágása utáni további PCR amplifikációval annyi minta nyerhető, amely próbaként használható cDNS-bank teszteléséhez vagy a DNS-szakasz megszekvenálható. Bár ezt a DD módszert kiterjedten használják, érdemes néhány nehézségre felhívni a figyelmet. Így problémát jelenthet nagyszámú hibás termék képződése. Ezek száma mérsékelhető mind a rögzítő, mind a tetszőleges primerek módosításával. A PCR-termékek általában rövidek, ezért a nyerhető szekvencia információ nem mindig biztosítja a gén azonosítását. Megnehezíti a gének azonosítását, hogy a kivágott DNS-csíkok több molekulát is tartalmaznak. Ezért újabb northern hibridizáció szükséges a génexpressziós különbségek igazolására.



7/10 ábra: Kétféle cDNS-populáció klónjainak polimeráz láncreakcióval (PCR) történő amplifikálása és a különbséget reprezentáló cDNS-ek azonosítása az ún. differential display, DD módszerrel. Rögzítő oligo dT primer felhasználásával reverz transzkripció segítségével egyesszálú DNS szintetizálható. Az „M” a G, C, és A nukleotidok keveréke. A képzett DNS-molekulák további amplifikációjához szükséges primerek egyike az oligo dT, a másik pedig egy tetszőleges szekvenciájú belső primer, amely kapcsolódni tud a cDNS-ekben fellelhető komplementer szekvenciarégióhoz. Mindkét mintából származó PCR-termékek összehasonlíthatók a szekvenáló gélen (Kozian és Kirschbaum, 1999 nyomán Különböző feltételek között nagyszámú, több ezer gén kifejeződésének egyidejű követését teszi lehetővé rendezett hálózat mentén elhelyezett DNS-molekulák hibridizálása jelzett cDNS-próbákkal. A DNS mikrohálózati technológiák (DNA MICROARRAY, DNA CHIP) kifejlesztése az utóbbi években felgyorsult és különböző technikai megoldások egyre növekvő mértékben kerülnek felhasználásra. Így pl. 1400 Arabidopsis gén kifejeződési mintázatát tanulmányozták ilyen eszközökkel (RUAN és mtsai 1998). A plazmid DNS-ek, PCR termékek vagy szintetikus oligonukleotidok egy adott rácshálózat szerint rögzíthetők üveg, nylon, nitrocellulóz vagy szilikon hordozófelületre. Így pl. egy 22x22 cm-es nylonszöveten a kifejlesztett robotok akár 60 000 DNSmintát is el tudnak helyezni. Gyakran ismert szekvenciájú cDNS-ek akár plazmidként, akár az inszertről készített PCR-fragmentként kerülnek a nylonszövetre. Több párhuzamos filter is készíthető, amelyeket a különböző eredetű poliA+RNS felhasználásával szintetizált P32-vel jelölt cDNS-próbával lehet hibridizálni. A radioaktív jelet egy sugárzás érzékelő, az ún. PHOSPHOIMAGER méri és analizálja. A jel erőssége mutatja a génkifejeződés mértékét. Egy másik technológia mikroszkóp-tárgylemezen rögzített DNS-mintákat használ. A robot 10 000 DNS-fragmentet képes elhelyezni 3,24 cm2-es felületen. Lehetőség van arra, hogy a kétféle mintából származó cDNS-próbák jelölésére különböző fluoreszcens festéket (Cy3dCTP illetve Cy5dCTP) használjunk. Így a minták egyidejűleg hibridizálhatók a két próbával. A fluoreszcens jelek egymástól


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK megkülönböztethetők, és az intenzitásbeli különbségek mutatják a transzkriptumok mennyiségi viszonyait (7/11. ábra).

7/11. ábra: Nagyszámú DNS-minta mikrohálózat szerinti elhelyezése (microarray) mikroszkóp-tárgylemezen PCR-amplifikált formában történhet cDNS-inszertek vagy genomikus DNS kódoló régiói szolgálhatnak templátként a mintakészítéshez. A PCR-termékeket ismert helyen rögzíti egy robotvezérelt nyomtatófej. 10 000 DNS-minta is elhelyezhető egy tárgylemezen. Az összehasonlítandó sejtekből, növényi szövetekből mRNS izolálása után cDNS készül fluoreszcens nukleotidok (Cy3-dCTP illetve Cy5-dCTP) jelenlétében. A kétféle próbát összekeverve kerül sor a tárgylemezen lévő DNS-ekhez történő hibridizációra. A nem kötődött próbák lemosása után kétcsatornás lézerleolvasó egy fotonsokszorozóval összekapcsolva értékeli a jeleket. A két fluoreszcens próba jele elkülönítve jelenik meg, így ugyanazon gén kifejeződése a kétféle sejtmintában egyidejűleg jellemezhető A DNS-chip technológiák a génexpressziós vizsgálatok lehetőségeit jelentős mértékben kiszélesítik. Ugyanakkor felhasználhatók új gének felfedezésére is. Ha valamilyen kezelés utáni vagy fejlődési stádiumból véletlenszerűen kiválasztott ismeretlen szekvenciájú cDNS-ek PCR-termékeit helyezzük el a nylonszöveten vagy tárgylemezen és azokat kétféle próbával hibridizáljuk, akkor felismerhetők a reagáló cDNS-ek. Ezek megszekvenálása után a homológiakeresések megmutatják, hogy ismert vagy új gén kifejeződését érintette-e a hatás.

2.3.2. 7.3.2. Növényi genomprogramok: DNS-szekvenciától a funkcióig Nemzeti és nemzetközi programok keretében, vállalati és kormányzati támogatással egyaránt igen intenzíven folyik szelektált növények, mint az Arabidopsis, kukorica, rizs teljes DNS-állományának szekvenálása. A korábban bemutatott YAC és BAC genomikus génkönyvtárak fontos bázisai ezeknek a szekvenálási munkáknak. Köszönhetően a nagyteljesítményű, automata szekvenáló készülékeknek valamint a különféle robotoknak, ma már biztosíthatók a technikai feltételei annak, hogy a különböző eredetű cDNS-bankok felhasználásával véletlenszerűen nagyszámú klónt lehessen megszekvenálni. A szekvencia ismeretében az egyes cDNS-klónok expressziós markernek (EXPRESSED SEQUENCE TAG, EST) tekinthetők. Így például a japán és koreai rizs genomprojektek keretében több, mint 40 ezer szekvencia vált ismertté. Ha feltételezzük, hogy egy gabonanövény életciklusa során 30 ezer gén fejeződik ki, akkor a jelenlegi EST adatok már egy igen jelentős információs alapot jelentenek. Az EST klónok 25%-ának az adatbázisokban már megtalálható az ismert gén megfelelője. A hasonlósági vizsgálathoz a cDNS-klón nukleotidszekvenciáját a komputerprogram három leolvasási keretben vizsgálja és a FASTA algoritmus segítségével értékelheti, hogy hasonló aminosavsorrendű fehérje ismert-e. Talán tanulságosak az ismert fehérjét kódoló rizs cDNS-klónok gyakorisági adatai, amelyek a különböző kezelésekből vagy növényi részekből készült cDNS-bankok szekvenálását követően váltak ismertté (7/12. ábra). YAMAMOTO és SASAKI (1997) elemzéséből látható, hogy az alapvető sejtfunkciókban résztvevő fehérjék (transzláció elongációs faktor, ubiquitin, riboszómális fehérjék) valamennyi szövetmintában képviselve vannak. Jól felismerhetők a szövetspecifikus cDNS-ek, illetve a stresszhatásokkal aktivált gének.



7/12. ábra: Ismert fehérjéket kódoló cDNS-ek gyakorisági adatai a különböző eredetű rizs cDNS bankokból, véletlenszerűen kiválasztott klónok megszekvenálása alapján (Yamamoto és Sasaki, 1997 nyomán) Az EST klónok fontos segítséget adnak a teljes hosszúságú cDNS-ek megtalálásához és így a gének izolálásához. A genetikai és molekuláris térképek elkészítésénél szintén nélkülözhetetlenek az EST klónok. A rizs esetében a markerek 70%-a EST. A molekuláris markerekre épülő térképezési és génizolálási feladatok teljesítését nagymértékben segítheti az a felismerés, hogy a Gramineae család 60 millió éves evolúciója során mind a génállomány, mind a gének elrendeződése megdöbbentően nagyfokú konzerváltságot mutat (lásd összefoglaló: GALE és DEVOS 1998). A kromoszómák számát (5–12), a sejtmagi DNS mennyiségét (400–600 Mb) érintő nagyfokú változatosság ellenére a fűfélék genomja 25 ún. ,,rizs kapcsoltsági blokkra” osztható. Az egymásra helyezett köralakú térképeken számos ismert gén egy vonal mentén található az egyes fajok genomjában. Hasonló genomiális konzerváltság mutatható ki a pillangósvirágúak vagy a keresztesvirágúak körében is. Az továbbra is nyitott kérdés, hogy milyen mértékű az egyszikű és kétszikű fajok genomjainak megfelelése a 130–200 millió éves párhuzamos evolúciót követően. Az EST klónok által nyújtott aminosavszekvencia adatok már adhatnak bizonyos funkcióra utaló információt. Így az EST-programok fontos elemei az ún. gén és funkció összekapcsolásának, a “FUNCTIONAL GENOMICS”-projekteknek. A gén és funkció közötti kapcsolat felderítésében lehetőség van a fehérjék oldaláról történő megközelítésre is. Ha az összehasonlítandó sejtekből, szövetekből fehérjekivonatokat készítenek, és az egyes fehérjéket kétdimenziós poliakrilamid gél elektroforézissel (2D-PAGE) izoelektromos pont és molekulatömeg szerint szétválasztják, akkor az egyező és különböző fehérje-összetevők felismerhetők. Napjainkban az így kiválasztott fehérjék


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK azonosítására a tömegspektroszkópia módszereit használják. Egyik lehetséges megközelítés, hogy a 2D-PAGE után a vizsgálandó fehérjét tartalmazó géldarabot kivágják és proteolitikus enzimmel (pl. tripszin) a gélben peptiddarabokra hasítják. A peptideket aztán tömegspektroszkópiával feltérképezik. Az egyes peptidfragmentek tömegük alapján történő azonosításához a fehérje-adatbázisokat használják. Ha a tömegre vonatkozó adat nem elégséges, akkor a peptid aminosav-sorrendje is meghatározható. Ezek a peptid expressziós markerek (PEPTIDE SEQUENCE TAG) alapot adnak mind a fehérje, mind az EST adatbázisokban történő keresésére. Illetve az aminosavsorrend ismeretében szintetikus oligonukleotid készíthető, amelyet hibridizációs próbaként használhatunk a génkönyvtárak vizsgálatára és a gének izolálására.

7/13. ábra: A lucernából izolált ciklin függő kináz (Mscdc2A) cDNS-e élesztő promoterrel összeépítve képes az élesztő hőmérsékletérzékeny CDC28 gén mutációját kijavítani A: kontroll, mutáns élesztősejtek; megnyúltak, osztódásra képtelenek, B: a lucerna eredetű fehérje működőképes az élesztőben, a sejtek osztódni tudnak (Hirt és mtsai, 1991) Növényi gének sikeres izolálását és egyben funkcionális információhoz való jutást tesz lehetővé az élesztő genetikai rendszerek felhasználása. Bizonyos alapvető eukarióta sejtfunkciók erősen konzerválódtak az evolúció során, így növényi gének illetve az általuk kódolt fehérjék képesek élesztőmutánsokban a funkciók helyreállítására. Példaként az 7/13. ábra bemutatja, hogy élesztő expressziós vektorba építve egy lucerna sejtciklus gént (ciklin függő kináz, cdc2MsA), az osztódásra nem képes hőmérsékletérzékeny élesztősejtek visszanyerik eredeti morfológiájukat és osztódásuk biztosított. Az élesztő genetikai rendszer segítségével ezen az úton igazolni lehetett a lucernagén funkcióját. Élesztőmutánsok komplementálására alapozva eredményesen klónozhatók ismert fehérjék növényi homológjait kódoló gének. Egy növényi cDNS-génkönyvtárat élesztőpromoter mögé klónozva és mutáns élesztősejtekbe transzformálva kiszelektálhatók a funkció visszaállítására képes cDNS-ek. Ezt a génizolálási stratégiát sikeresen használták nagyszámú növényi gén klónozása során.



7/14. ábra: A GAL4 transzkripciót aktiváló fehérje egy DNS-kötő és egy aktivátor régióval rendelkezik. Ez a két elem fizikailag szétválasztható, de a transzkripció beindításához mindkét funkció szükséges. Ehhez a kapcsolat létrehozható az egymással kölcsönhatásba lépő két „idegen” fehérje (X,Y) közvetítésével. Élesztősejteket két vektorkonstrukcióval kell transzformálnunk, amelyek egyike a DNS-kötő régió és az X fehérje fúziós termékét, a másik az aktivátor régió és az Y fehérje hibridjét szintetizáltatja egyetlen sejtben. Amennyiben az X és Y fehérje kapcsolódni képesek, kialakul az a fehérjekomplex, amely a promoter UAS szekvenciájához kötődve elindítja a riportergén működését (Horváth V. Gábor, SZBK, Szeged nyomán) Egy másik, szintén élesztőre épülő génizolálási módszer, az ún. élesztő kéthibridrendszer (YEAST TWOHYBRID SYSTEM) az egymással kölcsönható fehérjék génjeinek izolálását teszi lehetővé (összefoglaló: Frederickson 1998). Magyar nyelven Horváth V. Gábor foglalta össze ennek a fontos molekuláris biológiai módszernek a lényegét (1999). Mint a 7/14. ábrán látható, az élesztő GAL4 transzkripciós aktivátorfehérjében behatárolható a DNS-kötő szakasz és a transzkripciós komplex fehérjéivel kölcsönható aktivátorszakasz. E két funkcionális egység kapcsolata úgy is létrejöhet, hogy két, egymással kölcsönható fehérje szolgál kapocsként, miután fúziós fehérjét alkotnak egyrészről a DNS-kötő, másrészről az aktivátor szakasszal. Ennek megfelelően az élesztő kéthibrid-rendszerben a plazmidkonstrukciók két fúziós hibridfehérjét kódolnak. Az egyik hibridfehérjében a DNS-kötő régiót építjük össze valamely (x) fehérjével, a másik esetében pedig a fúzió az aktivátorszakasz és egy további (y) fehérje között jön létre. Ezekkel a plazmidokkal élesztő törzset kell transzformálni, amely egy vagy több riportergénnel (pl. lacZ gén) rendelkezik. A riportergén promoterében az UAS szekvenciaelemhez kapcsolódhat a DNS-kötő szakasz. A transzformáns élesztősejtekben kétféle fúziós fehérje szintetizálódik, amelyek önmagukban nem képesek a riportergént működésbe hozni. Ellenben, ha a fúziós fehérjék egymással kölcsönhatásba lépnek, akkor kialakulhat az a komplex, amely már biztosítja a riportegén transzkripcióját. A funkció helyreállításának mértéke és a riportergén termékének mennyisége függ a kapcsolat erősségétől. Ez a rendszer használható két fehérje közötti komplex kialakulásának tesztelésére. Gyakran azonban egy ismert fehérjével kölcsönható fehérjék cDNS-einek felkutatására használják úgy, hogy az aktivátorrégióval egy cDNS-könyvtár által reprezentált fehérjekészletet fúzionáltatnak. A riportergén működése alapján kiemelhetők azok az élesztő transzformánsok, amelyek kölcsönható fehérje cDNS-ét tartalmazzák. Az 200 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK élesztő kéthibridrendszerrel klónozott génekkel kapcsolatban már bizonyos funkcionális adattal is rendelkezünk, hiszen ismert egy kölcsönható fehérjepartner. Fontos ezzel a kísérleti rendszerrel kapcsolatban azt hangsúlyozni, hogy további módszerekkel is meg kell erősíteni az élesztő kéthibridvizsgálat eredményeit. Így lényeges követelmény annak bizonyítása, hogy a szóban forgó fehérjék valóban a növényi sejtekben in vivo is, mint komplexek megtalálhatók. Ez gyakran nem könnyű, hiszen a kölcsönhatás fiziológiai állapottól, poszttranszlációs módosításoktól (pl. foszforiláció) függhet. Specifikus ellenanyagok fontos szerepet játszhatnak a sokszor kis mennyiségben előforduló komplexek jellemzésében. A gének funkciójának, fenotípusos hatásainak felderítésében igen jó szolgálatot tesznek mind a funkcióvesztési, mind a funkciónyerési mutációk. Azoknál a növényeknél, mint pl. az Arabidopsis, amelyeknél igen részletes, finom felbontású genetikai és molekuláris térképek állnak rendelkezésre, mód van a mutáns gén azonosítására és klónozására. Kémiai és fizikai mutagének által indukált mutációk mellett növekvő jelentőségük van az ún. beépüléses, (inszerciós) mutánsoknak. Ilyenkor idegen DNS integrálódása vezet a gén működésének meghibásodásához. A gént elronthatja, ha ugráló gén, ún. transzpozon találat éri. De az Agrobacteriumtranszformációt követően a T-DNS beépülése is mutációhoz vezethet (az Agrobacterium-közvetített génbeépülés részleteit a 7/5. fejezet ismerteti). A transzpozon mutagenezis lehetőséget ad a génizolálásra is, hiszen a beépülést hordozó genomikus klónok a génkönyvtárban azonosíthatók a transzpozon-szekvenciákkal való hibridizációval (összefoglalóként lásd MARTIENSSEN 1998). Hasonlóan a T-DNS mutagenezis után is megklónozhatók a beépülést hordozó növényi DNS-szakaszok. Így meghatározható a mutációt szenvedett gén szekvenciája, ugyanakkor ismert a mutáció következtében létrejött fenotípus. Éppen ezért az inszerciós mutánsgyűjtemények igen fontos eszközei a funkcionális genomprogramoknak. A gén és funkció kapcsolatának tisztázásához ezek a mutánsparkok úgy is felhasználhatók, hogy egy ismert szekvenciájú génhez keressük meg az inszerciós mutánst, és annak fenotípusából következtetünk a gén funkciójára. Az ilyen vizsgálatokhoz az inszerciós mutánsokból izolált genomikus DNS-t csoportokat képezve összekeverjük és a génnek megfelelő PCR-próbával kiválasztjuk azt a csoportot, amely tartalmazza az adott gént érintő mutánst. Ezután a csoport egyes tagjainak DNS-ével ismételjük meg a hibridizációt, és így eljuthatunk ahhoz a mutánsvonalhoz, amely az érintett gén elrontott változatát hordozza. A mutáns birtokában aztán részletesen tanulmányozható a génműködés képtelenségének, ,,KNOCK OUT” változatának élettani, fejlődési következményei. Izolált gének funkciójának felderítésében természetesen igen fontos szerepet töltenek be a transzgénikus növények. Egy konstitutív, erős promoterrel összekapcsolva a vizsgálandó cDNS-t, a transzformánsokban túltermeltethető a gén fehérjeterméke. A transzformánsok részletes molekuláris, biokémiai és élettani jellemzése felvilágosítást adhat a gén által szabályozott folyamatokról. Transzformánsok előállításával specifikus génkikapcsolás is elérhető. Ha egy cDNS-t fordított irányban építünk össze egy promoterrel, akkor csak RNStermék keletkezik, melynek hibridizációja az eredeti, belső géntermékhez meggátolja fehérje képződését. Génelhallgattatás (GENE SILENCING) jelensége a rendes (szensz) irányú transzgének esetén is bekövetkezhet abban az esetben, ha több példányban történt a transzgén beépülése (lásd 9.1/3. ábra). Ilyenkor specifikus mRNS-degradáció következtében nem keletkezik funkcionális géntermék. Különösen kifejezett lehet ez a jelenség, ha komplex, több ellentétes irányú beépülésre kerül sor. Erős promoterek használatakor az mRNS-ek nagymennyiségű felhalmozódása szintén hozzájárulhat kettősszálú RNS-molekulák kialakulásához és nukleázok aktiválásához. Növények esetében különösen jelentős szerepet kap ez a megközelítés, mivel az idegen gének helyspecifikus beépítése homológ rekombinációval nehezen valósítható meg.

2.4. 7.4. A növényi gének molekuláris szerkezete és aktivitásának szabályozása A biotechnológiai alkalmazások szempontjából mind a promoterrégióknak, mind a termékelőállítást megalapozó fehérje szintézisét irányító kódoló szakaszoknak gazdasági értéke van. Szabadalmak védik az agronómiai értékkel bíró géneket, ugyanakkor a hasznosíthatóságot csak a gének szabályozott működtetésével lehet biztosítani. Ezért egyre nő a promoterek iránti érdeklődés, és különösen nagy értéket képviselnek azok a szabályzó DNS-szakaszok, amelyek sejttípus-, szövetspecifikus vagy indukálható génműködést tesznek lehetővé. Ennek megfelelően a génizolálási programok fontos elemét jelenti a promoterek klónozása és funkcionális jellemzése.

2.4.1. 7.4.1. Egy növényi gén főbb szerkezeti elemei Lényegében az 1970-es évek utolsó éveiben kezdődött meg és a nyolcvanas évek elején vált széleskörűvé a növényi gének izolálása és jellemzése a rekombináns-DNS-technika eszközeivel. Mind több és több gént sikerült klónozni akár genomikus szekvenciaként, akár cDNS-ként. Lehetővé vált a funkcionális egységek 201 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK behatárolása. Ma már elég nagy számban állnak rendelkezésre kísérleti adatok, amelyeknek alapján megbízhatóan felvázolható egy szerkezeti modell. Természetesen a tájékozódást segítő egyszerűsítések korántsem adnak elég alapot a szerkezet és működés bonyolult összefüggéseinek tisztázásához. A nem növényi eukarióta szervezetek génjeinek szerveződésére vonatkozó adatok gyakran a növényekkel kapcsolatos hiányzó adatok helyettesítéséhez segítenek. A 7/15. ábrán egy növényi gén legfontosabb szerkezeti és funkcionális elemeit vázoljuk fel. A fehérjét kódoló DNS-szakaszt mindkét oldalról regulátorrégiók veszik közre, amelyek egyrészt biztosítják a gén szabályozott működését, másrészt tartalmazzák a gén transzkripciójához és transzlációjához szükséges struktúrális elemeket. A gén 5‟ részén elhelyezkedő promoterszakasz az RNSszintézist végző RNS-polimeráz II fehérje kötődési helye. Az eddig analizált növényi gének több mint 80%ában megtalálható az eukarióta promoterekre jellemző ún. TATA-boksz, amely átlagosan 32 bázispárnyi távolságra helyezkedik el a transzkripció kezdési helyétől. Több növényi génben, így a klorofillkötő fehérje (cab), a patatin, az aktin és a hősokkfehérjék génjeiben ezt a szekvenciát nem lehetett azonosítani. A TATAbokszot körülfogó szekvenciák bázisösszetétele befolyásolhatja a gén indukcióját különböző behatások esetén. A CAAT-boksz előfordulása a növényi gének promotereiben nem mindig mutatható ki. A promoterrégió fontos elemei azok a regulátor – cisz – szekvenciák, amelyek a génexpresszió mértékéért és programozottságáért felelősek. Bizonyos fehérjetermékekre csak az egyedfejlődés egy adott szakaszán és meghatározott szövet- és sejttípusban van szükség. Ez ideig több olyan szekvenciát sikerült azonosítani, amelyek felelősek pl. a fényregulált megnyilvánulásért vagy a raktározott magfehérjék szintéziséért. Ismertek a gének kifejeződését fokozó, ún. enhancer elemek, amelyek akár szövetspecifikusan, akár specifitás nélkül növelik a promoterek aktivitását. A fehérjeszintézis során a 40 s riboszóma-alegység az mRNS 5‟ cap szakaszához kapcsolódik, és addig vándorol 3‟ irányba, amíg AUG triplethez ér. Ez a kodon szolgál a transzláció kezdési szignáljául. Az első AUG kodont körülhatároló szomszédos szekvenciák alapvetően befolyásolják a transzlációra való alkalmasságot. A növények esetében az optimálisnak megfelelő szekvenciakörnyezet a DNS ATG kodonja körül a 7/15. ábrán látható. Ezeknek a nuleotidoknak szerepe lehet a gének indukált expressziójában. A növények génjei között egyaránt vannak intronnal rendelkezők és intron nélküliek. A gének 3‟ végén található nem transzlálódó régiók szintén hordoznak regulátorelemeket. A hexanukleotidból álló konszenzusszekvencia (AAT AAA) számos növényi gén esetében fellelhető.

2.4.2. 7.4.2. A génaktivitás – promoterműködés – mérésének módszerei A promoterek funkcionális jellemzése építhető a mRNS illetve a fehérjetermék mennyiségének meghatározására. Természetesen figyelembe kell venni, hogy a sejtekben, szövetekben aktuálisan felhalmozódott és kimutatható mRNS többféle folyamat – szintézis, degradáció – eredője, így a promoteren kívül más szabályozó mechanizmusok is szerepet játszhatnak. A génkifejeződést leggyakrabban az ún. NORTHERN HIBRIDIZÁCIÓVAL vizsgáljuk. Akár össz-RNS-t, akár mRNS-t izolálhatunk a növényi szövetekből, majd az egyes RNS-termékeket denaturáló agarózgél elektroforézissel történt frakcionálás után génspecifikus hibridizáló próbával azonosíthatjuk. A poli A+ véggel rendelkező mRNS-molekulák kinyeréséhez oligo dT cellulóz kromatográfia használható. Az mRNS-fragmentek nitrocellulóz membránhoz történő kötés után hibridizálhatók P32 izotóppal jelölt próbával. Az autoradiogramon megjelenő hibridizációs jel megfelel a mintában jelenlévő géntermék mennyiségének. Poli A+ RNS használatakor a gyengébben kifejeződő gének is vizsgálhatók. A módszer érzékenysége fokozható a polimeráz láncreakció (PCR) segítségével. Ilyenkor reverz transzkriptáz (RT) felhasználásával cDNS készül az mRNS-ről oligo(dT) primer jelenlétében, majd e gén szekvenciájának megfelelően antiszensz oligonukleotid primerrel történik a specifikus géntermék amplifikációja. Az RT-PCR-termék gélben etidiumbromid-festéssel tehető láthatóvá vagy jelzett próbával hibridizálható. Az S1-nukleáz-protekciós módszer arra épül, hogy ez az enzim az egyszálú DNS- és RNSmolekulákat megemészti, míg a DNS-RNS kettősszálú hibridmolekulák rezisztensek az enzimmel szemben. Így a védett fragmentek a gélben szétválaszthatók, és génspecifikus próbával hibridizálhatók. Sok esetben szükség van arra, hogy szövetrészekben, sejtekben vizsgáljuk egy adott gén működésének mértékét. Erre adnak lehetőséget különböző in situ hibridizációs módszerek.



7/15. ábra: A növényi gének fontosabb struktúrális és funkcionális elemei Mint az 7/15. ábrán láthatjuk, a genomikus génkönyvtárból izolált gének 5‟ végén elhelyezkedő DNS-szakasz felelős elsődlegesen a génkifejeződés szabályozásáért. A regulációban szerepet játszó aktiváló illetve gátló ún. cisz elemek néhány kb hosszúságú régióban találhatók. A promoter működésének vizsgálatához célszerű ezt az 5‟ régiót egy ún. riportergénnel összekapcsolni és nyomon követni a riportergén termékét transzformált sejtekben, szövetekben. Növények esetében a â-glukuronidáz (GUS) enzimet kódoló gén használata igen széles körben elterjedt. A promoter funkciói nyomon követhetők az enzimaktivitás meghatározásával vagy a szövetek megfestésével (7/17. ábra). A luciferáz (lux) enzim szintén lehetőséget ad a promoterműködés kvantitatív nyomon követésére. Előnye, hogy a növény elpusztítása nélkül, in vivo értékelést tesz lehetővé. A dekanalszubsztrát jelenlétében kibocsátott fényérzékeny fotonszámláló képanalizálóval vagy luminometerrel mérhető. A zöld fluoreszcens fehérje (GREEN FLUORESCENS PROTEIN, GFP) szintén a szövetek feltárása nélkül teszi lehetővé a promoter vizsgálatát.



7/16. ábra: A virális CaMV35S promoter fő funkcionális elemei (A) és működésük jellegzetességei (B) a βglukuronidáz riportergén működése alapján A TATA boxot és az AS-1 cisz elemet tartalmazó A domén az embrió gyökérkezdeményében valamint a hajtás- és gyökérmerisztémában biztosít aktivitást. A teljes hosszúságú B elem a sziklevelekben (mag és csíranövény), illetve a kifejlett növény valamennyi szövetében működteti a riportergént (Benfey és Chua, 1990 nyomán

2.4.3. 7.4.3. A folyamatos génkifejeződést biztosító konstitutív promoterek A fejlődési fázistól, a szerv típusától, a szövetféleségtől illetve a sejt differenciáltságától függetlenül folyamatosan működő promotereket gyakran használnak idegen gének kifejeztetéséhez a transzformáns növényekben. A legkiterjedtebben használt ilyen promoter a karfiol mozaik vírus (CAULIFLOWER MOSAIC VIRUS, CaMV) 35S transzkriptumának szintézisét irányítja. Ez a promoter mind kétszikű, mind egyszikű fajokban működik, és a teljes hosszúságú (343 bp) szabályozó régió jól behatárolható funkcionális elemekből épül fel (7/16. ábra, BENFEY és CHUA 1990). A különböző hosszúságú DNS-szakaszok által biztosított kifejeződési mintázatot a GUS riportergénnel történt összeépítés után dohány transzformánsokban lehetett vizsgálni. Az 7/16. ábrán a transzkripció kezdetéhez számított nukleotidpozíciókat feltüntetve látható egy minimál promoterszakasz (–46 és +8), amely az ún. TATA elemet tartalmazza. Ez a rövid szakasz nem képes a GUS riportergént működésbe hozni. Az ún. A régió a –90 és +8 pozíciójú nukleotidokat foglalja magába. Ez a 98 bp GUS-aktivitást eredményezett az embrió gyökérkezdeményében, a hajtás- és gyökérmerisztémákban. Érdekessége ennek a szekvenciarésznek, hogy kétszer is előfordul egy cisz elem: az (as-1): TGACG(T), amelyhez az ún. TGA1 transzkripciós faktor specifikusan kötődik. A –343 és –90 nukleotidok közötti B régió,


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK mint egy komplementer, expressziós mintázatot eredményez. Erős GUS-festődés figyelhető meg a szikleveleken, és a kifejlett növény valamennyi szövetében (7/16. ábra). Folyamatosan erős génkifejeződést biztosító szabályozó elemeket találhatunk olyan növényi génekben, amelyek alapvető sejtfunkciókat ellátó fehérjéket kódolnak. Így az aktin vagy tubulin gének promotereit több transzformációs kísérletben is eredményesen felhasználták. Itt érdemes megemlíteni, hogy intronszekvenciák jelenléte több esetben is növelte a génkifejeződés mértékét. A konstitutív génexpresszió kapcsán talán külön megemlíthetők a polipirimidinekben (timin, citozin) gazdag régiókat tartalmazó gének. Így például egy konstitutívan kifejeződő lucerna hiszton gén promoterében illetve intronjában több változatban is előfordulnak ilyen szekvenciaelemek: mint a TCTCTCTC; TTTCTCTTT; TTTCTCTCTCC. Ha ezt a lucernapromotert GUS riportergénnel összeépítjük és dohányba transzformáljuk, akkor igen erős, a CaMV35S promoter aktivitását meghaladó génkifejeződést figyelhetünk meg (7/17. A, B ábra). Gélretardációs kísérletekkel igazolható, hogy a CT-ben gazdag oligonukleotidhoz sejtmagi fehérje kötődhet. A DNS-fehérje-komplex kialakulását jelzi, hogy a P32 izotóppal jelölt kettősszálú szintetikus DNS – CT/GA gazdag szekvenciákkal – mozgása gátolt az elektroforézis során. Ez az erős és specifikus kölcsönhatás in vivo transzkripciósan aktív kromatinszerkezet kialakulását eredményezheti.




III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 7/17 ábra: A polipirimidinekben (timin, citozin) gazdag régiókat tartalmazó konstitutív lucerna H3 hiszton gén promotere erõs ripotergén-kifejeződést biztosít dohány transzformánsokban A: β-glukuronidáz (GUS) enzim aktivitása 4-metilumbelliferil- glukuronid szubsztrát jelenlétében. B: Csíranövény hisztokémiai festése 5-bróm4-klór-3- indolil-β-D-glukuronsav (X-gluc) jelenlétében. Az indigó festék kicsapódása minden szövetben erőteljes festődést eredményezett (Kelemen Zsolt és Kapros Tamás kísérlete, SZBK, Szeged)

2.4.4. 7.4.4. Hormonok által szabályozott illetve szövet-, és szervspecifikus génműködés molekuláris háttere Összhangban az auxinok igen sokirányú fiziológiai hatásával, nagyszámú génről lehetett kimutatni, hogy auxinkezelésre ki- illetve bekapcsolnak. Ezek közül a borsó ún. PS-IAA4/5 jelű génje az auxinhatást követően 10-15 perc múlva aktiválódik és a promoteren végzett deléciók segítségével behatárolható volt az a –319 és – 154 nukleotidok közötti szakasz, amelyik felelős az auxinválaszért. Ez az ún. AuxRE (AUXIN RESPONSIBLE ELEMENT) egy CaMV35S minimál promoterhez kapcsolva biztosítja, hogy auxinkezelt sejtekben a promoter aktiválódjon. Az AuxRe szekvenciában kialakított nukleotidcserék hatását követve két funkcionális szakasz határolható be. Az A szakaszban egy erősen konzervált szekvenciamotívum fedezhető fel: a T/GGTCCCAT, amely számos auxinregulált gén promoterében megtalálható. Ennek a régiónak kapcsoló szerepe van, auxin hatására elindítja a transzkripciót. A másik, a B szakasz, mint egy hatást fokozó elem működik jellegzetes nukleotidsorrenddel: ATGTCTC. Ehhez a motívumhoz kötődő fehérjék, az auxinválaszt közvetítő faktorok (AUXIN RESPONSIVE FACTORS, ARFs) több típusát sikerült azonosítani; egy részük aktiválja, másrészük gátolja a transzkripciót. Az ARF fehérjék kölcsönhatásba léphetnek egymással vagy az ún. Aux/IAA fehérjékkel. Az utóbbi túltermeltetése a sejtekben specifikusan gátolja a TGTCTC motívumot tartalmazó gén transzkripcióját. Az auxinhatástól függő promoterműködés a vázoltak szerint fehérje-DNS és fehérje-fehérje kölcsönhatások bonyolult rendszerén keresztül szabályozott. Ezek tisztázása segíthet hormonindukálható expressziós vektorok kifejlesztésében. Számos géntechnológiai cél eléréséhez fontos annak biztosítása, hogy valamely fehérje vagy enzim a sejtek meghatározott típusában, csak bizonyos szervekben vagy szövetféleségben termelődjék. A szabályozott génkifejeződést speciális funkciót ellátó promoterekkel lehet megvalósítani. Ezért jelentős gazdasági érdek fűződik szervspecifikus gének illetve promoterek izolálásához és részletes jellemzéséhez. Gyakori igény, hogy valamilyen transzgén terméke a szemtermésben illetve embrióban vagy endospermiumban képződjön. Kiindulásként szolgálhat az a tény, hogy például a rizs raktározott magi fehérjéinek 80%-a glutenin. A GluA és GluB gének promotereiben több cisz elemet lehetett azonosítani. A 21 nukleotidből felépülő ún. GCN4 elem: GTTTGTCATGGCTGAGTCATG endospermium-specifikus génkifejződést biztosít. Gélretardációs kísérletben igazolható, hogy az opaque-2 transzkripciós aktivátor kötődik a GCN4 elemhez. Ugyanis az opaque2 fehérje lelassítja a szintetikus oligonukleotid mozgását a gélben. Ha az opaque2 cDNS-t túltermeltetik, akkor a GCN4 szekvenciát tartalmazó promoter nagy mennyiségű transzkriptum szintézisét biztosítja. Természetesen gyökér-, pollen-, portok, pollenszem-specifikus génműködés is megvalósítható speciális promoterek felhasználásával.

2.4.5. 7.4.5. Környezeti faktorok által irányított promoterek



7/18. ábra: A spenót rubisco-aktiváz (Rca) gén promotere számos fényszabályozásban szerepet játszó cisz elemet tartalmaz, amelyek megtalálhatók más fényregulált gén 5‟ végi szakaszán (Orozco és Ogren, 1993 nyomán) A növények számára a fény létfontosságú környezeti tényező, amely közvetlenül befolyásolja az élettani folyamatok sokaságát, a növekedést és a fejlődési programot. A fény által szabályozott sejtmagi gének, mint a ribulóz- 1,5-biszfoszfát karboxiláz-oxigenáz (RUBISCO) kis alegység, a klorofill a/b kötőfehérje (CAB), valamint a fitokrómok (PHY) génjei olyan specifikus promoterrégiókkal rendelkeznek, amelyek a fényregulációban kitüntetett szerepet játszanak. A 7/18. ábra, OROZCO és OGREN (1993) nyomán a spenót rubisco aktiváz (Rca) gén főbb funkcionális elemeit mutatja, amelyek erősen hasonlítank a RUBISCO kis alegység génjében (rbcS-3A) azonosított fehérjekötő cisz elemekhez. A transzkripció kezdési helyét jelölő +1 helyzetű nukleotid szomszédságában található a fény hatására működő promoterelem (LIGHT-RESPONSIVE ELEMENT, LRE). Ezzel a cisz régióval kölcsönhatásba a HY5 bázikus leucinzipzár DNS-kötő fehérje lép. Sötétben egy represszor fehérjével (COP1) együtt a HY5 gátolja a promoter működését. Fény hatására a COP1 fehérje a citoplazmába helyeződik át és a gén aktív állapotba kerül. A HY5 transzkripciós faktor erős hasonlóságot mutat a G-box-kötő fehérjékhez (G-BOX BINDING FACTORS, GBFs). A G-box szekvenciamotívumok meghatározó szerepet játszanak a transzkripciós szint fenntartásában. A G-box közelében elhelyezkedő GT szabályzó cisz elemnek egyaránt lehet pozitív és negatív szerepe a transzkripció folyamatában. Általában egymás utáni ismétlődésekben találhatók, és például a RUBISCO promoter esetében fény által működtetett kapcsolóként funkcionál. A GT-ben gazdag szekvenciarégióhoz kötődő fehérjék különbözősége hozzájárul a szabályozás specifitásához. Az AT-ben gazdag fehérjekötő szekvenciaelemek szintén különböző fehérjékkel (AT1 és 3AF-1) léphetnek kölcsönhatásba, és szerepük a génkifejeződés fokozásában van. A fentiek jól szemléltetik, hogy a promoterek fényregulációja igen összetett szabályozó mechanizmuson alapszik. A magas hőmérsékleti stressz a hősokkgének gyors bekapcsolását váltja ki. A hősokk-promoterek és a transzkripciós faktorok működésének több fontos lépése tisztázott (SCHARF és mtsai 1994), amelyekkel röviden a 10.3 fejezet foglalkozik.

2.4.6. 7.4.6. Vegyszeres kezeléssel aktiválható promoterek



7/19. ábra: A dexamethazon (dx) által aktivált glükokortikoid receptor (gr) növényi transzkripciós faktorral (tf) fuzionáltatva indukálható promoterrendszer kifejlesztését tette lehetővé. A dx hiányában a HSP90 fehérje meggátolja a fúziós fehérjekomplex promoterhez kapcsolódását. A dx ezt a gátlást szünteti meg, és a promoter működésbe lép (Gatz és Lenk, 1998 nyomán) Számos géntechnológiai cél eléréséhez szükség van arra, hogy a beépített gén működését csak meghatározott időre korlátozzuk, azaz a gén tetszés szerint be- illetve kikapcsolható legyen. Így több próbálkozás történt vegyszeres kezelésre érzékeny promoterrendszerek kifejlesztésére (lásd összefoglaló: GATZ és LENK 1998). A növényi eredetű promoterek közül a PR-1a regulátorrégió egy védekezési génből származik, amely patogén támadás, oxigénstressz vagy szeneszcencia hatására lép működésbe. Ugyanakkor benzithiadiazole (BTH) kezelés szintén aktiválja. Sikeresen alkalmazták transzformáns növényekben a bakteriális tetraciklin-aktivált promotert vagy az Aspergillus alc a promotert, amely etanolkezelést követően működik. A 7/19. ábra a szteroid, a glükokortikoid dexamethazon (dx) rendszer főbb komponenseit mutatja be. A glükokortikoid receptor rendelkezik egy hormonkötő régióval, amelyhez a szabályozandó növényi gén transzkripciós faktora (TF) fúzionáltatható. A virális CaMV35S promoter segítségével biztosítható ennek a fúziós fehérjének a szintézise transzgénikus növényekben. Hormonmentes feltételek mellett egy hősokkfehérje (HSP90) kapcsolódik a hormont megkötő régióhoz, ezért a komplex működésképtelen. Szteroid, mint például dx jelenlétében a HSP90 fehérje leválik és lehetővé teszi a transzkripciós faktor kötődését a célgén promoteréhez. Ezzel a gén működése beindul. Ezt a promoterrendszert sikerrel alkalmazták több homeotikus géntől függő fejlődési folyamat befolyásolására.



2.4.7. 7.4.7. Génkifejeződést befolyásoló tényezők a transzgénikus növényekben A transzformációval beépített gének működését befolyásoló faktorok közül eddig kiemelt figyelmet fordítottunk a promoterekben elhelyezkedő cisz regulátor elemeknek illetve a DNS-kötő fehérjéknek, az ún. transzkripciós faktoroknak. Ugyanakkor a promotereken kívül elhelyezkedő cisz hatású szekvenciamotívumok szerepe is jelentős lehet mind a transzkripciós, mind a transzkripció utáni szabályozási mechanizmusokban (összefoglaló: Gallie 1998). A beépülés kromoszómális helye, a transzgént körülvevő szekvenciák egyértelműen befolyásolhatják a kifejeződés mikéntjét. Az egyik, a transzgén expresszióját fokozó kromatin strukturális elem, az ún. sejtmagi mátrix tapadási régió (NUCLEAR MATRIX ATTACHMENT REGION, MAR). Izolált sejtmagokat magas koncentrációjú sóval extrahálva a hisztonfehérjék eltávolíthatók, és hátramarad a sejtmagi mátrixszerkezet. Ehhez tapadhat az AT nukleotidokban gazdag MAR szekvencia. Az 7/20. ábrán látható, hogy míg az 1 kb kiterjedésű MAR struktúrák aktív állapotban hurokformájúak, addig az inaktív állapotot a tömött elrendezés jellemzi.

7/20. ábra: A) Növényi génekben elhelyezkedő cisz-hatású szekvenciamotívumok Ezek mind a transzkripciós, mind a transzkripció utáni folyamatokon keresztül részt vehetnek a génműködés szabályozásában. B) A sejtmagi mátrix tapadási régió (MAR) szekvencia képezhet aktív hurokszerű szerkezetet, illetve inaktív állapotban tömött struktúrájú. A MAR-szekvenciák által határolt transzgén szekvenciától független hurokszerkezetet vehet fel. Ennek következtében mérséklődik a beépülést közrefogó szekvenciák hatása és megnövekedett génexpresszió következhet be (Spiker és Thompson,1996 valamint Gallie, 1998 nyomán) Ha a transzgén transzkripciósan aktív, fellazult régióba épül be, akkor alkalmazkodva a környezethez átíródik mRNS-sé. Ha a beépülés inaktív régióba történik, úgy a transzgénnek kisebb lehetősége van a kifejeződésre. 210 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK Izolált MAR szekvencia összeépítése a transzgénnel önálló, az integrálódási környezettől elhatárolt struktúra kialakulását teszi lehetővé a magas kifejeződés lehetőségével. A MAR szekvenciák által közrefogott transzgének a beépülési helytől független génexpressziót mutatnak, és kevésbé kifejezett a génelhallgattatás jelensége. Mint az 7/20. ábrán láthatjuk, a génkifejeződést serkentő, transzkripciót fokozó szekvenciamotívumok (TRANSCRIPTIONAL ENHANCERS) megtalálhatók az 5‟ nem kódoló régióban, exonokban, és a poli A+ szignál után a 3‟ végen. A mRNS stabilitását elősegítő elemek működhetnek mind az 5‟, mind a 3‟ kapcsolódó régióban. Az intron jelenléte szintén növelheti a gén kifejeződését poszt-transzkripciós mechanizmusok révén. Ugyanakkor a transzláció folyamatát pozitívan befolyásoló elemek is behatárolhatók. Itt megemlíthetjük, hogy nem növényi eredetű fehérjék transzformánsokban való termeltetését hatékonyabbá lehet tenni szintetikus gén előállításával, amelynek megtervezésekor a növényi kódhasználat alapján alakítják ki a gén szekvenciáját. Éppen a transzgénikus növények előállítása és beható tanulmányozása járult hozzá igen jelentősen a növényi gének működésének megismeréséhez. Ezek a kutatási eredmények gyökeresen átformálták elképzeléseinket a genetikai szabályozás molekuláris alapjairól. A tudományos ismeretek igen nagy értéket képviselnek, és nélkülük elképzelhetetlen a gyakorlati célok megvalósítása.

2.5. 7.5. Agrobacteriumplazmidok mint természetes génátviteli rendszerek A talajbaktériumok által okozott betegség, a gyökérgolyvásodás (CROWN GALL) molekuláris alapjának megismerése vezetett az egyik leghatékonyabb és kiterjedten használt transzformációs rendszer kifejlesztéséhez.

2.5.1. 7.5.1. A tumorképződés molekuláris háttere Agrobacterium-fertőzés során



7/21. ábra: Az Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmidjainak molekuláris felépítése A Rhizobiaceae családba tartozó Gram-negatív Agrobacterium tumefaciens és az A. rhizogenes talajbaktériumok a kétszikű növényeket sebzési helyeken fertőzik. A fertőzött növényeken tumorfejlődést, illetve hajszálgyökeresedést okoznak. Az egészséges növényi szövetekkel ellentétben a tumorszövetek in vitro hormonmentes táptalajon növekedésre képesek, illetve opinokat (oktopint, nopalint, agropint) termelnek. ZAENEN és mtsai 1974-ben kimutatták, hogy a tumorképződés, valamint az opinszintézis összefügg egy nagy plazmid, a tumort indukáló (Ti) plazmid jelenlétével az Agrobacterium tumefaciens-sejtekben. Később molekuláris hibridizációval több laboratóriumban is igazolták, hogy a Ti-plazmid egy része, az ún. transzfer vagy T-DNS a baktériumfertőzés során átkerül a növényi sejtekbe és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-ébe (7/21. ábra). Ezek nagyon lényeges kísérleti megfigyelések voltak, mert rávilágítottak egy természetes génátviteli mechanizmusra, amelynek során bakteriális gének épülnek be a fertőzött növények génállományába. A Ti-plazmidok későbbi molekuláris és funkcionális analízise számos fontos tumorképzési lépést tisztázott, amivel megteremtődtek a feltételek a molekulák transzformációs vektorként való felhasználásához. A 200 kb nagyságú Ti-plazmidon több funkcionális régiót lehetett mutagenezissel behatárolni (7/21. ábra). A növénybe átkerülő T-DNS hozzávetőlegesen 21–23 kb hosszúságú, amelyen az opinszintézisért és a tumoros növekedésért felelős gének lokalizálhatók. Az oktopin, illetve a nopalin típusú plazmidok felépítése eltér egymástól. A nopalin T-DNS 23 kb fragmentje érintetlenül kerül át a növényekbe. Az oktopin T-DNS egy 14 kb hosszú bal oldali (TL-DNS) és egy 7 kb jobb oldali (TR-DNS) szakaszból tevődik össze, amelyek egymástól függetlenül 212 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK épülnek be a növényi genom különböző részeibe. A TL-DNS és a nopalin T-DNS egyaránt tartalmaz egy egymáshoz nagymértékben hasonló, 9000 bázisból álló DNS-szakaszt. Az itt elhelyezkedő gének eddig ismert funkciója a következő: 1-es gén– auxinszintézis – triptofán-2-monooxigenázenzim, 2-es gén– auxinszintézis – indolacetamid hidrolázenzim, 4-es gén– citokininszintézis – izopenteniltranszferázenzim, 5-ös gén– serkenti a hajtásos tumorteratomák növekedését (shi gén), 6a gén– opinkiválasztásért felelős, 6b gén– tumornövekedés fokozása (tm 1), 0‟ gén– mannopin átalakítása agropinná, l‟ gén– mannopin bioszintézise, 2‟ gén– mannopin bioszintézise. A 4-es gén mutációja következtében nincs citokinintermelés, így a nagy auxintartalom miatt a tumorok gyökeresednek (roi gén). Az 1-es és 2-es gének inaktiválása erőteljes hajtásképződéshez vezet (shi gének). A Tiplazmidon végzett deléciós analízis azt mutatta, hogy a baktérium fertőzőképességéért, virulenciájáért, valamint a T-DNS átviteléért és integrációjáért felelős szekvenciák a T-DNS-en kívül helyezkednek el. A szekvenciavizsgálatok szerint a T-DNS-t mindkét oldalról 25 bázispárból álló direkt ismétlődő szakaszok (határszekvenciák; 7/21. ábra) fogják közre. Az általuk kijelölt és behatárolt bármely DNS-darab, amely akár 50 kb nagyságú is lehet, hatékonyan átvivődik és integrálódik a gazdanövény genomjába. Az átvitelt a Ti-plazmid virulenciarégiója (vir) és a kromoszomális (chrA és chrB) gének kontrollálják. A chr gének folya-matosan, ún. konstitutív módon nyilvánulnak meg, és termékeik a baktériumok sejtfalhoz tapadását okozzák, a vir expressziója viszont szigorúan szabályozott, és aktiválódása indítja el az átviteli mechanizmust. A sebzett növényi szövetekből kiszabaduló fenolvegyületek, mint például az acetosziringon (AS) aktiválják ezeket a géneket. A határszekvenciák funkcióját vizsgálva bizonyos polaritás figyelhető meg. A baloldali 25 bázis eltávolítása nem befolyásolja a fertőzési képességet, a jobboldali ismétlődő szakasz hiányában pedig avirulencia tapasztalható. A T-DNS kivágódásának és átvitelének pontos mechanizmusa ma még nem ismert. A legújabb eredmények arra utalnak, hogy a vir gének aktivációja folytán a határszekvenciáknál helyspecifikus kivágódás történik és egyes szálú lineáris molekulák (T-strand) képződnek, amelyek megfelelnek a T-DNS alsó szálának. Ezek az egyszálú DNS-molekulák esetleg a jobb oldali határszekvenciákhoz kötődött vir gén fehérjetermékkel együtt kerülnek át a növényi sejtekbe, feltételezhetően a bakteriális konjugációhoz hasonló mechanizmuson keresztül. A 25 bázispár-ismétlődések valószínűleg nem szükségesek a növényi DNS-be történő beépüléshez, amely bekövetkezhet elszórtan a növényi genom bármely pontján. Az integráció molekuláris folyamatainak lépései még szintén nem tisztázottak. GHEYSEN és mtsai (1987) a következő lépéseket tartják valószínűnek: 1. A sejtbe került egyes szálú T-DNS (ún. T-strand) 5‟ végén elhelyezkedő fehérje kölcsönhatásba lép a növényi DNS-en található láncszakadási, bázishiányos helyekkel. 2. Bázishiány keletkezése és láncszakadás a növényi DNS ellentétes szálán a kialakuló szálcsavarodás következtében. 3. Az egyes szálú T-DNS kovalens összekapcsolódása a növényi DNS-sel és a komplementerszál szintézise a növényi enzimek közreműködésével. 4. A növényi DNS-en keletkezett hiány kijavítása, az érintett szekvenciák replikációja, amely ismétlődő szakaszok kialakulásához, illetve szekvenciaátrendeződésekhez vezethet. Ezek a növényi- és a T-DNS találkozási pontja közelében megfigyelt átrendeződések, szekvencia-rendellenességek nehézségeket okozhatnak a DNS-szakaszok pontos illesztésében. E folyamaton keresztül a növényi genomba épült T-DNS a továbbiakban növényi szekvenciaként funkcionál. A rajta elhelyezkedő génekről az RNS-transzkriptumok szintézisét az alfaamanitin-érzékeny növényi RNS-polimeráz végzi. A fertőzött szövetekben kimutathatók T-DNS-specifikus fehérjetermékek, amelyek a tumor fenotípus kialakulásához vezetnek. Hormontermelésükben hibás és így növényregenerációra képes transzformánsok segítségével igazolni lehetett, hogy a T-DNS mendeli öröklődésű. 213 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


2.5.2. 7.5.2. A Ti-plazmidokra épülő vektormolekulák főbb elemei Megismerve a természetben lejátszódó génátviteli mechanizmust, amely során bakteriális gének épülnek be a fertőzött növény génállományába, világszerte kiterjedt kutatás indult meg a Ti-plazmidok transzformációs vektorként való felhasználására. Ennek a megközelítésnek az az alapja, hogy a határszekvenciák közé épített idegen DNS-szakasz a baktériumfertőzés folyamán a T-DNS-sel együtt kivágódik, átkerül a növényi sejtbe, majd integrálódik a sejtmagi DNS-be. Az elképzelés helyességét igazoló sikeres kísérletekről a kutatók 1983ban számoltak be. Az első kiméragének megnyilvánulása növényi sejtekben tudatos vektorépítés eredményeként vált lehetségessé, amikor a kialakított plazmidmolekulákba beépítették az idegen gén átviteléhez és kifejeződéséhez szükséges DNS-szekvenciákat, így A: Ti-plazmidot a virulenciához szükséges szekvenciákkal, amelyek lehetővé teszik a T-DNS átvitelét és integrációját; B: növényi promotert, olyan regulátorszekvenciát, amely felelős a növényi RNS polimeráz kötődéséért és a transzkripció elindításával az mRNS-szintézis megkezdéséért [pl.: nopalinszintetáz (NOS) gén promotere]; C: idegen gént. Az első kísérletekben prokarióta eredetű antibiotikum-rezisztencia géneket használtak, amelyek lehetővé tették a transzformált sejtek, szövetek felismerését, majd szelekcióját; klóramfenikolR – klóramfenikol acetil transzferáz (CAT), kanamicinR – neomicinfoszfotranszferáz (NPT II); methotrexát R – prokarióta dihidrofolát reduktáz (DHFR); terminációs szignált, mint pl. oktopin- vagy nopalinszintáz gének poliadenilációs jele (ocspA; nospA), amely leállítja a transzkripciót, és biztosítja az mRNS-ek poli+ A szekvenciáit.



7/22. ábra: Idegen gén átvitele a Ti-plazmidba homológ rekombinációval úgy, hogy a hormongének hiányoznak az ún. integratív vektorból Bár az első transzformációs kísérletekben igazolni lehetett az idegen gén termékének szintézisét, a tumorképződés miatt növényredifferenciáció nem volt lehetséges. Mivel a tumoros fenotípusért felelős hormongének nem szükségesek a fertőzési és átviteli folyamatokhoz, azokat génsebészeti módszerekkel el lehetett távolítani, és az így nyert, ún. legyengített (disarmed) T-DNS-t hordozó integratív vektorok már transzformáns növények létrehozását is lehetővé tették. A klónozási lépéseket nagymértékben megkönnyítette az a megoldás, amelynek során az E. coli pBR 322 klónozó vektorának egy részletével helyettesítették a tumorgéneket. Mint azt a 7/22. ábra szemlélteti, így lehetségessé vált az idegen gén génsebészeti manipulációja a könnyen kezelhető pBR plazmidon E. coli-ban, majd a pBR-szekvenciáknál bekövetkező homológ


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK rekombinációval a Ti-plazmidba való átvitel. Az Agrobacteriumban kialakult kointegráns plazmid rendelkezik a transzformációhoz szükséges valamennyi elemmel.

2.5.3. 7.5.3. Kétplazmidos, ún. bináris vektorok

7/23. ábra: A kétplazmidos, ún. bináris vektor klónozó plazmidjának fontosabb elemei (Koncz és Schell, 1986, valamint Jefferson és mtsai, 1987 nyomán Mol. Gen. Genet. 203: 383–396; The EMBO J., 6: 3901–3917.) A legfejlettebb vektorrendszerek kifejlesztéséhez az a fontos felismerés vezetett, mely szerint ha a T-DNS a határszekvenciákkal, valamint a virulenciarégió két külön plazmidon helyezkedik el az Agrobacteriumsejtekben, azok génátviteli képessége megmarad. Tehát a virulenciagének ,,transz‟‟ helyzetben is képesek a TDNS mobilizációjához szükséges funkciók ellátására. Így lehetővé vált e szekvenciák fizikai elkülönítése és kétkomponensű vektorok kialakítása. Az ún. segítő plazmid általában olyan Ti-plazmid, amelyből a határszekvenciákkal együtt eltávolítják a teljes T-régiót. A másik, a klónozóplazmid széles gazdaspecifitása révén mind E. coli-ban, mind A. tumefaciensben replikálódik, könnyen átvihető az egyik baktériumból a másikba. Egy ilyen klónozóvektor tökéletesített változatának fontosabb elemei a 7/23. ábrán láthatók KONCZ és SCHELL (1986), valamint JEFFERSON és mtsai (1987) munkája alapján. A vektor határszekvenciáik által közrefogott T-DNS részén helyezkedik el a növényi marker, amely valamelyik antibiotikum rezisztenciagénből és a terminációs szignálból áll. Segítségével szelektálhatók ki a transzformáns sejtek, szövetek. A T-DNS-en belül általában megtalálható egy további expressziós blokk, amelyben a promoterrégió, illetve a gén kódoló szekvenciái tetszés szerint változtathatók. A promoterszekvencia sajátosságaitól függ a növényekbe átvitt idegen gén kifejeződésének mértéke, szövet- vagy szervspecifitása. A klónozási műveletek elvégzését jelentősen 216 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK megkönnyítheti, ha a promoter- és a kódolószekvencia közé több restrikciós hasítóhelyet hordozó szintetikus DNS-szakaszt, ún. polilinkert helyeznek el (7/23. B ábra). A transzformációs vektor lényeges részeit jelentik a bakteriális markergének, továbbá a plazmid replikációjához és átviteléhez szükséges szekvenciák (oriV, oriT). A 7/23. A ábrán látható vektor tartalmazza az ún. cos régiót, amely lehetővé teszi, hogy a fág bepakolóenzimjei ezt a szekvenciát felismerjék, és 35–40 kb hosszúságú DNS-szakasz is becsomagolódhasson a keletkező fágfejbe. Így az átvitt szekvenciák visszaklónozhatók a növényi genomikus DNS-ből. A bináris vektorok legújabb változatai lehetővé teszik a növényi gének expressziójának kvantitatív analízisét transzgénikus növények segítségével. Ehhez a vektorépítés során egy jelző-, ún. riportergént építenek össze különbözőképpen szabályozott promoterszekvenciákkal. A riportergénnel szemben követelmény, hogy az általa kódolt enzim aktivitása megbízhatóan mérhető legyen. A leggyakrabban használt jelzőenzimek a következők: Neomicinfoszfotranszferáz (NPT II). Az NPT II egy 25 kD molekulatömegű fehérje, amely aminoglükozid antibiotikumokat (neomicin, kanamicin, gentamicin, G 418) foszforilál az ATP-molekula foszfátcsoportjának áthelyezésével az antibiotikum-molekulára, ami annak inaktivációját eredményezi. Klóramfenikolacetil-transzferáz (CAT). Az enzim a következő reakciót katalizálja: klóramfenikol + acetil-S koenzim CAT klóramfenikol 3-acetát + HS koenzim A. A klóramfenikol és acetilált formái vékonyrétegkromatográfiával szilikagélen szétválaszthatók. C14-gyel jelölt klóramfenikolt használva pontosan meghatározható az acetilált forma mennyisége. Béta-glukuronidáz (GUS). Az E. coli uidA lókusza által kódolt hidroláz a béta-glukuronidok több típusának lebontását katalizálja. Az enzim aktivitása spektrofometriával vagy fluorometriásan mérhető. Előnye, hogy az enzim hisztokémiai festéssel is kimutatható. Luciferáz. 62 kD fehérje, amely a következő reakciókat katalizálja: 1:luciferáz + luciferin + ATP Mg 2+ luciferáz + luciferil-AMP + PR, 2:luciferáz + luciferil-AMP+O2 luciferáz + AMP + CO2+ fény. A fényfelvillanás erőssége luminométerrel mérhető. Ez ideig a transzformációs vektorok kifejlesztésére elsősorban az Agrobacterium tumefaciens plazmidjait használták. Az A. rhizogenes Ri-plazmidja sok vonatkozásban hasonló vektorfejlesztés kiindulópontja lehet.

2.5.4. 7.5.4. A transzformáció lépései



7/24. ábra: A kanamicinrezisztencia génjének beépítése a lucerna genomjába A – zöld régió a lucerna kalluszszövetekben kanamicint tartalmazó táptalajon, B – jobb oldal: felszaporított kanamicinrezisztens szövetek, bal oldal: kontroll kolóniák, amelyek nem képesek növekedni kanamicin jelenlétében, C – kifehéredett kontroll növény kanamicint tartalmazó táptalajon, D – zöld transzformáns hajtás kanamicin jelenlétében, E – a talajba kiültetett transzformáns növény (Deák M. SZBK, Szeged kísérlete) A vektormolekulát hordozó Agrobacterium-mala transzformáció művelete nagyon egyszerű. A sebzett növényi szöveteket fertőzni kell a baktériumszuszpenzióval, és a génátvitel bekövetkezik az előzőekben tárgyalt folyamatokon keresztül. Tekintettel arra, hogy a végső cél transzgénikus növények felnevelése, in vitro célszerű fertőzni, majd a kezelt szöveteket hajtásregenerációt indukáló táptalajon tenyészteni. A következőkben DEÁK MÁRIA és mtsai (1986) munkája alapján a lucernatranszformáció példáján mutatjuk be a génbevitel folyamatát és a transzformánsok jellemzésének lépéseit. Ez a kísérlet azért is kiemelt figyelmet érdemel, mert ez volt az első hazai, idegen gént hordozó transzformáns. Egyúttal a világon az első génbeépítés lucernába. Mind a növény genotípusának, mind az Agrobacterium törzs típusának megválasztása kritikus lehet. Először is olyan lucernavonalra volt szükség, amely képes volt szomatikus embrióképzésre, és így hajtásszegmentekből megbízhatóan lehetett növényeket regenerálni. Több Agrobacterium törzs értékelése után az A 281 törzs bizonyult használhatónak, amely két plazmidot hordoz. A segítő Ti-plazmid (Bo 542) agropin típusú és széles gazdaspecifitású tumorképző molekula, a klónozó vektornak pedig a határszekvenciák között van egy neomicinfoszfotranszferáz (NPT II) génje, amely a nopalinszintetáz gén promoteréről működik. Így a transzformánsok szelekciójának alapja a kanamicinrezisztencia. Egyetlen Agrobacterium-kolóniából kiindulva


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK egy éjszakán át 28 °C-on, szelektív antibiotikumok jelenlétében végzett tenyésztéssel fertőzésre alkalmas baktériumszuszpenzió állítható elő. Az 1–1,5 cm-es lucernahajtás-darabok növényi táptalajba helyezése után mlenként 5x107 baktériummal inokulált táptalajon 3 napig 25 °C-on rázatás mellett a növényi szövetet és a baktériumokat együtt tenyésztjük. A kezelés végén a baktériumokat többszöri mosással eltávolítjuk, majd a szöveteket kalluszt indukáló agaros táptalaj felszínére helyezzük, amely kétféle antibiotikumot tartalmaz. Az egyik, pl. a Claforan (100 mg/ml) hatására elpusztulnak a szövetek felszínén maradt Agrobacteriumok, és így steril tenyészet nyerhető. A másik antibiotikumként használt kanamicin (100 mg/ ml) a növényi sejtek szelekcióját biztosítja. 3–4 héttel a kezelés után a vágott szöveti felületen kalluszosodás indul meg és a kanamicingátlás ellenére zöld régiók láthatók a kezelt tenyészetekben (7/24. ábra). A zöld szövetrészekből felnevelt növénykék megtartják kanamicinrezisztenciájukat (7/24. D ábra), a kontrollnövények kifehérednek, növekedésükben gátoltak az antibiotikumot tartalmazó táptalajon (7/24. C ábra). Az így szelektált növények aztán kiültethetők a talajba (7/24. E ábra). A kanamicinrezisztencia megnyilvánulása önmagában még nem elég bizonyíték a transzformáció igazolásához. További molekuláris adatok kellenek, amelyek kimutatják egyrészt az idegen gént, illetve annak termékét a transzgénikus növényekben. A kontroll és transzformáns növényekből izolált DNS-hez a P32 izotóppal jelölt NPT II gént hibridizálva látható, hogy a kezeletlen növényből hiányzik ez a szekvencia, a kanamicinrezisztens transzformánsok pedig egy vagy több példányban tartalmazzák ezt a gént (7/25. A ábra). A gén kifejeződését igazolja a neomicin foszfotranszferáz aktivitás jelenléte a transzformánsokból készített fehérjekivonatban (7/25. B ábra). Az előzőekben vázolt transzformáció igen hatékony. Hajtásdarabonként 10- 15 transzformáns növény is nyerhető. A pillangósvirágú lucerna transzformációját csak 2–3 évvel előzte meg a transzgénikus dohánynövények létrehozása. A dohány, mint kedvelt kísérleti növény, a leggyakrabban használt tesztrendszer. Hatékony génbevitel érhető el levélkorongok fertőzésével, majd hajtást indukáló táptalajon (0,1 mg/l naftilecetsav, 1 mg/l benziladenin) szelektív antibiotikum jelenlétében történő tenyésztéssel.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 7/25. ábra: Az idegen gén jelenlétének molekuláris bizonyítékai a lucerna transzformációja után A – Hind III. enzimmel emésztett DNS-ek hibridizációja 32P izotóppal jelölt kanamicin génnel 1., 2. és 3. transzformánsok, 4 kontroll lucernanövény; B – a neomicin foszfortranszferáz II enzim jelenléte a transzformáns növényekben (1., 2., 3., 4.), míg a kontroll (5.) növényből ez az aktivitás hiányzik Az Agrobacterium közvetítésével megvalósított génbeépítés ma már általánosan elterjedt genetikai manipulációs módszer, amely szinte minden gazdasági növény esetében sikeresen alkalmazható. Különösen fontos eredmény, hogy jelentős gabonanövényeinken, mint rizs, búza, kukorica szintén alkalmazható ez a megközelítés (HIEI és mtsai, 1991; ISHIDA és mtsai, 1996; MOONEY és mtsai, 1991). Így napjainkban egy fontos módszertani lehetőség, amelyet figyelembe lehet venni a közvetlen DNS beviteli módszerek mellett.

2.6. 7.6. Közvetlen DNS-bevitel A Ti-plazmid-vektorokkal elért hatékony transzformáció mellett, elsősorban a metodikai eszköztár bővítése érdekében a kutatókat alternatív módszerek kifejlesztésére ösztönözték. Mind a molekuláris alapkutatások, mind számos gyakorlati célú kísérlet szükségessé tette tisztított DNS-molekulák sejtbe juttatására alkalmas eljárások kidolgozását. Nyilvánvaló, hogy a sejtfal nélküli, plazmalemmával határolt növényi protoplasztok a legígéretesebb objektumok a DNS sejtbe viteléhez. Az előző fejezetekben láthattuk, hogy jelentős azoknak a növényfajoknak a száma, amelyek protoplasztjaiból teljes növény nevelhető fel, és így megvan a protoplaszt transzformációból származó transzgénikus növényelőállítás lehetősége is. A protoplaszt → növény rendszer hiánya azonban több esetben indokolttá teszi a sejtekbe vagy szövetekbe történő közvetlen DNS-bevitel feltételeinek tanulmányozását. A közvetlen DNS-felvételi kísérletekhez használt molekulák általában ugyanazok, mint a kétplazmidos vektorok klónozóelemei az Agrobacterium-rendszerben. Ilyen esetekben azonban nincs szükség a határszekvenciákra, és természetesen a virulenciagéneket hordozó kisegítő plazmidra sem. A transzformált sejtek, szövetek azonosítását és szelekcióját a növényi promoterről működő rezisztenciamarkergén teszi lehetővé, amely többnyire valamelyik növényi terminációs jellel ellátott antibiotikumrezisztenciáért felelős prokarióta gén. A plazmidkonstrukciókkal végzett metodikai kísérletek elsősorban a felvételi tényezők optimalizálását célozzák, amelyek aztán megteremtik az alapokat a növényi szekvenciákkal végzendő transzformációhoz. Itt érdemes figyelembe venni azt az igényt, hogy a transzformációval nemesített fajták ne tartalmazzanak bakteriális antibiotikum-rezisztencia gént. Így a transzformáció előtt ezek a DNS-darabok kivágandóak, illetve növényi rezisztencia gének használata javasolható. A növényi össz-DNS és a klónozott növényi gének sejtbe való bevitele egyaránt fontos módszer a növények genetikai manipulációjában.

2.6.1. 7.6.1. Plazmidmolekulák bejuttatása protoplasztokba A protoplasztszuszpenzióhoz adott DNS-molekulák a külső membránon kémiai és fizikai kezelésekkel egyaránt átjuttathatók. A plazmalemmán meglévő, vagy a kezelésekkel létrehozott folytonossági hiányok módot adnak a membránhoz tapadt molekulák citoplazmába kerülésére. Az idegen DNS-nek el kell jutnia a sejtmagba, hogy integrálódhasson a gazdasejt genomjában. Erős promoterrel rendelkező és több példányban bevitt plazmidmolekulákról a növény transzkripciós és transzlációs enzimjei segítségével a gén kifejeződhet integráció nélkül is. A riportergének átmeneti, ún. tranziens expressziója a DNS-felvételt követően 24–48 óra múlva tájékoztat a kezelés hatékonyságáról vagy a használt promoter sajátosságairól. A kiméragén integrációjával létrejött stabil transzformánsok gyakorisága csak a protoplasztok többhetes tenyésztése után, a megjelenő rezisztens kolóniák vagy növények száma alapján becsülhető. A szelekciós rendszerek hiányosságai miatt közvetlen molekuláris bizonyítékokkal kell igazolni a transzformáció bekövetkezését. A DNS-felvétel serkentése polietilén-glikol-kezeléssel Az első sikeres transzformációs kísérletekben (Davey és mtsai, 1980; KRENS és mtsai, 1982), még izolált Tiplazmidot használva, lényegében a protoplasztfúziónál alkalmazott kezelési körülmények között hormonauxotróf-transzformánsokat nyertek. A rezisztenciagénnel ellátott plazmidmolekulák segítségével, az optimalizálási munka eredményeként ma már hatékony és megbízható módszer áll rendelkezésre DNS protoplasztokba juttatásához. A Negrutiu és mtsai által 1987-ben közölt módszer lényeges elemei a következők: 1. A dohány- (Nicotiana tabacum SR1, N. plumbaginifolia) protoplasztokat az enzimoldatból történt kimosás után 106 protoplaszt/ml denzitás mellett az ún. MaMg oldatban szuszpendáljuk. A MaMg-oldat összetétele: 0,4– 0,5 mol mannitol, 15 mmol MgCl2, 0,1°/° MES (morfolinoetán-szulfonsav), pH 5,6.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 2. Hősokk. Bizonyos protoplaszttípusoknál, mint pl. az SR1, 5 percig 45 °C-on végzett hőkezelés, majd jéggel való lehűtés növelheti a transzformáció hatékonyságát. 3. DNS hozzáadása a protoplaszt-szuszpenzióhoz. Valamilyen restrikciós enzimmel hasított, ún. linearizált plazmid (optimális koncentrációja 5–10 ìg/ml) használata gyakori. 4. Polietilén-glikol- (PEG) kezelés. Az ún. PEG-CMS-oldat 40% 4000 vagy 6000 molekulatömegű PEG-et (Merck) tartalmaz, amelyet 0,4 mol mannitol és 0,1 mol Ca (NO 3)2.4 H2O vizes oldatában oldunk. A 7–9 pH-jú oldatot steril szűrés után –20 °C-on lehet tárolni. A protoplaszt-DNS-keverékhez adott PEG-CMS-oldat optimális végkoncentrációja 20–28%. A kezelési idő fél órától egy-két óráig változhat. 5. Az oldatot fokozatosan 0,2 mol CaCl2.2H2O-oldattal hígítjuk, majd az ötszörös térfogat elérésekor centrifugálás után a protoplasztokat tenyészoldatban reszuszpendáljuk. A bemutatott módszerrel a képződő kolóniák 3–4%-a szelektált fenotípusú (relatív transzformációs gyakoriság). A DNS-molekulák sejtbe jutásának mechanizmusáról jelenleg keveset tudunk. Tekintettel arra, hogy a transzformációs és fúziós kezelések körülményei lényegében ugyanazok, feltételezhető, hogy a protoplasztok felszínére tapadt molekulák a felszíni membrán hiányosságokon keresztül (lásd 6.3/1. ábra) kerülnek be a citoplazmába. Gondolhatunk a fúzió szerepére is. Pillanatnyilag nem állnak rendelkezésre citológiai adatok, amelyek a kromoszómakészlet megnövekedésére mutatnának a transzformáns növényekben.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 7/26. ábra: Finale (DL-foszfinotricin) gyomirtó szerrel szemben rezisztens kukoricanövények előállítása az embriogén protoplasztokba történő közvetlen plazmidbevitellel A: Embriogén genotípusból (HE/89) származó szuszpenziós sejtkultúra B: Frissen izolált protoplasztok, amelyekbe polietilénglikollal lehet plazmidmolekulákat bejuttatni C: Többsejtes protoplaszt eredetű mikrokolónia D: A hajtásregeneráció kezdete E: A DL-foszfinotricin-rezisztens transzformáns utódai között érzékeny és rezisztens szegregánsok hasadtak ki (Omirulleh, S.–Mórocz, S.–Szarka, B.–Dudits, D. kísérlete, 1993) A Mórocz Sándor által kifejlesztett magasan embriogén kukorica genotípus (HE/89) lehetőséget adott egy igen hatékony kukorica transzformációs rendszer kifejlesztésére, amely a protoplasztokba történő direkt plazmidfelvételre épül. A 7/26. A ábra szemlélteti a szuszpenziós kulturában fenntartott tenyészetet, mely kiváló protoplaszt forrásként szolgál (7/26. B ábra). A protoplasztok sejtfal szintézis után többször osztódnak és így mikrokolóniák alakulnak ki (7/26. C ábra). Ezeket a többsejtes struktúrákat agaros, hormonmentes táptalaj felszínére helyezve a hajtások differenciálódása könnyen indukálható (7/26. D ábra). Ennek a kísérleti rendszernek a felhasználásával több kukorica transzformáns előállítására került sor (OMIRULLEH és mtsai, 1993; GOLOVKIN és mtsai, 1993). A 7/26. E ábra példaként bemutatja a Finale herbiciddel szemben rezisztens kukorica tenyészanyagot. A második generáció hasadó növényei között érzékeny és rezisztens növények azonosíthatók a permetezést követően. Elektroporáció

7/27. ábra: Az elektroporáció általi DNS-felvétel folyamatának vázlata A) sejt felszínéhez tapadt DNS Ehomogén elektromos tér, X – az a hegyesszög, melyen belül az erőtér hatására a membrán permeabilissé válik, B) folytonossági hiány keletkezése a membránon, C) a citoplazmába kerülő DNSmolekula elérheti a sejtmagot, D) a lipiddomének elhelyezkedése a membránban, E) az erőtér hatására kialakuló lyuk Már az elektrofúzió folyamatának ismertetésekor láthattuk, hogy megfelelő nagyságú elektromos impulzus jelentős, de átmeneti változásokat okozhat a protoplaszt külső membránjában. Emlőssejteken dolgozva először NEUMANN és mtsai (1982) igazolták a DNS-felvétel megnövekedését elektromos impulzus hatására. Az általuk javasolt modell szerint (7/27. ábra) a rövid ideig (5 ìs) ható megfelelő erősségű elektromos erőtér (kV/cm) átmeneti, tranziens lyukképződést eredményez a bipoláris lipidcsoportok és az elektromos erőtér közötti kölcsönhatás folytán. A membránok szerkezetében meglévő hasonlóságok alapján várható volt, hogy hasonló permeabilitás növekedéssel járó események játszódnak le a növényi protoplasztok esetében is. 1986-ban több közlemény is megjelent növényi protoplaszt elektroporációjával indukált DNS-felvételről (FROMM és 222 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK mtsai, 1986; RIGGS és BATES, 1986). A nagyfeszültségű egyenáramú impulzus előállítására legjobban a kondenzátor kisüléses módszer vált be. Egy ilyen elektroporációs készülék leegyszerűsített változatát a 7/28. A ábra szemlélteti. Az egyenáramú áramforrással feltöltött kondenzátor kisülésekor erőtér jön létre a kezelőkamra fémelektródjai között. A kialakult áramimpulzus exponenciálisan csökkenő görbe szerint változik (7/28. B ábra), amelyet egyrészt a görbe maximumánál mért feszültség, valamint a pulzus hosszát kifejező őe idő jellemez. A őe függ a kondenzátor kapacitásától, illetve a kezelőoldatba mártott elektródok közötti ellenállástól (őe = RC. C). Így az oldat ellenállásának figyelembevételével megválasztott kondenzátorral biztosítható a kívánt pulzusidő, amelynek értékét protoplaszttípusonként, kísérletenként optimalizálni kell. Az U o értékét szintén empirikus úton lehet meghatározni. Az enzimoldatból kimosott protoplasztokat általában 0,5 mol mannitololdatban vesszük fel és keverjük össze a felveendő DNS-sel. Megmérve az oldat ellenállását, térfogatát és ionkoncentrációját úgy célszerű megválasztani, hogy a kezelőoldat ellenállása 1–1,2 kÙ legyen. Levélprotoplasztok esetében 100–5000 V/cm erőtér 10–200 ìs-os pulzusidővel már biztosítja a plazmidmolekulák felvételét, miközben a protoplasztoknak csaknem a fele károsodik és elpusztul. Riggs és Bates adatai szerint a dohány transzformánsok gyakorisága 2,2x10 -4 a kezelt protoplasztok számához viszonyítva. Ez két nagyságrenddel kisebb érték, mint amiről PEG-kezelés után beszámoltak. Így a módszerek versenyében a könnyen kezelhető dohánytesztnövényekkel végzett kísérletek alapján az elektroporációs megközelítés nem foglal el vezető helyet.

7/28. ábra: A) az elektroporáló készülék vázlata, B) a kondenzátor kisülése után az elektromos erőtér időbeni változása

2.6.2. 7.6.2. A DNS keresztüljuttatása a növényi sejtfalon: génpuska A növényekkel folytatott transzformációs kísérletek őskorában, már az 1970-es évek elején többen megpróbáltak Arabidopsis magok DNS-oldatban való csíráztatásával vagy pollenszemek DNS-kezelésével génátvitelt megvalósítani. Ezek a kísérletek főként a molekuláris módszerek elégtelensége és a megfelelő markerek hiánya miatt igen erős vitákat kiváltó eredményeket hoztak. A kérdés jelenleg is nyitott, bár az utóbbi években jelentek meg közlemények, amelyek arra utalnak, hogy a DNS bejuthat a fallal rendelkező növényi 223 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK sejtekbe is. Várhatóan sokkal megfelelőbb objektumok a DNS injektálásához az in vitro differenciálódott néhány sejtes embriók. Neuhaus és mtsai (1987) kísérletesen igazolták, hogy a repce portokkultúrákban kialakuló mikrospóra eredetű embriók sejtjeibe DNS-t injektálva transzformáns növények nyerhetők. A folyadéktenyészetben nevelt portokokból kiszabadulhatnak 10–12 sejtes embriók. Ezek tartópipettával rögzíthetők, majd elvégezhető az injektálás. Tekintettel a többsejtes inokulum kezelésére, a felnevelt növényeket kimérának kell tekinteni. Ezért egy második regenerációs ciklusra van szükség, hogy a heterogén genotípusú szövetek egyetlen transzformáns sejtjéből lehessen növényeket felnevelni. E megközelítés kiemelt jelentőségű, mert mikrospóra eredetű embriók, majd haploid növények fontos gabonaféléink, pl. a búza, a kukorica, a rizs esetében is nyerhetők. Igy remény van arra, hogy a totipotens haploid embriók sejtjeibe injektálva a plazmidmolekulát, hatékony transzformációs módszer fejleszthető ki a gabonafélék genetikai manipulációjához. A legutóbbi idők intenzív kutatásai eredményeként a részecskék belövésével történő DNS-bevitellel, a legkülönbözőbb növények felhasználásával állítottak elő transzformáns növényeket. A módszer lényege, hogy néhány ìm átmérőjű wolfram vagy arany részecskékre adszorbeálják a plazmid molekulákat. Majd az ún. génpuska nagy sebességgel (430 m/sec) lövi be a szövetekbe a hordozót és a DNS-t. A módszer részleteit JENES (1999) összefoglalója tartalmazza. A sejtfalon keresztüljutó részecskék egy része eltalálja a sejtmagot, ahol a DNS-ről transzkripció indulhat el. Egy génpuska fényképét PAUK JÁNOS nyomán a 7/29. A ábra mutatja be. A magasnyomású héliumgáz felgyorsítja a részecskéket. A belövést követően 2–3 nappal jól bemutathatók a találatot kapott szövetrészek, amennyiben a GUS gén működése folytán a szövetek kékre festődnek (7/29. B ábra). Mivel a plazmidon foszfinotricin acetil transzferáz (PAT) rezisztenciagén is megtalálható, a Finale herbiciddel lehet kiszelektálni a transzformáns hajtás kezdeményeket (7/29. D ábra). Ezekből fertilis növények nevelhetők fel, amelyek szintén rendelkeznek a herbicidrezisztencia tulajdonsággal.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK 7/29. ábra: Finale (DL-foszfinotricin) rezisztens búza transzformánsok előállítása DNS-molekulák belövésével A) Hélium gázzal működtetett génpuska, B) A β-glukuronidáz riportergén működése következtében kék festődést mutató szövetrészek a transzformáció után, C) A DL-foszfinotricin-rezisztens transzformáns szövetből regenerálódó búza hajtáskezdemény, D) Hasadó utódpopulációban megjelenő rezisztens és érzékeny szegregánsok (Pauk János kísérlete, GKI, Szeged) A részecskék szövetekbe történő belövése lehetővé teszi a kloroplasztiszok DNS-ébe történő génbeépítést. MALIGA PÁL összefoglalójában (1999) áttekinti a kloroplasztisz transzformáció főbb jellemzőit. A szelekciós markerként szpektinomicin antibiotikum használható. Ezzel a technológiával igen magas fehérjekifejeződési szint érhető el. Nem befolyásolja a transzgén működését a génbeépülés helye, illetve a génelhallgattatás. Felhasznált és ajánlott irodalom BALDWIN, D., CRANE, V., RICE, D. (1999): A comparison of gel-based, nylon filter and microarray techniques to detect differential RNA expression in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 2, 96–103. BENFEY, P. N., CHUA, N. H. (1990): The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. Science, 250, 959–966. BURKE, D. T., CARLE, G. F., OLSON, M. V. (1987): Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artificial chromosome vectors. Science, 236, 806–812. DAVEY, M. R., COCKING, E. C., FREEMAN, J., PEARCE, N., TUDOR, J. (1980): Transformation of Petunia protoplasts by isolated Agrobacterium plasmids. Plant Sci. Lett., 18, 307–313. DEÁK, M., KISS, G. B., KONCZ, C., DUDITS, D. (1986): Transformation of Medicago by Agrobacterium mediated gene transfer. Plant Cell Reports, 5, 97–100. EBY, M. J. (1990): Pulsed-field separations: continued evolution. Biotechnology (NY), 8,243–245. FREDERICKSON, R. M. (1998 ): Macromolecular matchmaking: advances in two-hybrid and related technologies. Curr. Opin. Biotechnol., 9, 90–96. FROMM, F., TAYLOR, L., WALBOT, V. (1986): Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature, 319,. 791–793. GALE, M. D., DEVOS, K. M. (1998 ): Comparative genetics in the grasses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 1971–1974. GALLIE, D. R. (1998 ): Controlling gene expression in transgenics. Curr. Opin. Plant Biol., 1, 166–172. GATZ, C., ENK, I. (1998): Promoters that respond to chemical inducers. Trends in Plant Science, 3, 352–358. GHEYSEN, G., VAN MONTAGU, M., ZAMBRYSKY, P. (1987): Integration of Agrobacterium tumefaciens DNA (T-DNA) involves rearrangements of target plant DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 6169– 6173. GOLOVKIN, V. M., ÁBRAHÁM, M., MÓROCZ, S., BOTTKA, S., FEHÉR, A., DUDITS, D. (1993) Production of transgenic maize plants by direct DNA uptake into embryogenic protoplasts. Plant Sci., 90: 41– 52. HIEI, Y., OHTA, S., KOMARI, T., KUMASHIRO, T. (1994): Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J., 6, 271–282. HIRT, H., PÁY, A., GYÖRGYEY, J., BAKÓ, L., NÉMETH, K., BÖGRE, L., SCHWEYEN, R. J., HEBERLEBORS, E., DUDITS, D. (1991): Complementation of a yeast cell cycle mutant by an alfalfa cDNA encoding a protein kinase homologous to p34cdc2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1636–1640. HORVÁTH, V. G. (1999): Élesztő kéthibridrendszer alkalmazása fehérje-fehérje kölcsönhatások kimutatására. Kézirat.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK ISHIDA, Y., SAITO, H., OHTA, S., HIEI, Y., KOMARI, T., KUMASHIRO, T. (1996 ): High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat. Biotechnol., 14, 745–750. JEFFERSON, R. A, KAVANAGH, T. A, BEVAN, M. W. (1987): GUS fusions: beta-glucuronidase as a selective and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J., 6. 3901–3907. JENES, B. (1999): Növényekbe történő közvetlen DNS-bevitel, egyszikűek transzformációja. Növény Molekuláris Biológia: Szemelvények. Szerk.: Balázs E., Dudits D., Akadémiai Kiadó. KEHOE, G. M., VILLAND, P., SOMERVILLE, S. (1999): DNA microarrays for studies of higher plants and other photosynthetic organisms. Trends in Plant Science, 4, 38–41. KONCZ, C., SCHELL, J. (1986): The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue specific expression of chimeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol. Gen. Genet., 204, 383–396. KOZIAN, D. H., KIRSCHBAUM, B. J. (1999 ): Comparative gene-expression analysis. Trends Biotechnol., 17. 73–78. KRENS, F. A, MOLENDIJK, L., WULLEMS, G. J., SCHILPEROORT, R. A. (1982): In vitro transformation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA. Nature, 296, 72–74. KURATA, N., UMEHARA, Y.–TANOUE, H., SASAKI, T. (1997): Physical mapping of the rice genome with YAC clones. Plant Mol. Biol., 35, 101–113. MALIGA, P. (1999): Engineering the plastid genome: problems and potential. In: Plant Biotechnology and In Vitro in the 21st Century. (eds) Altman, A., Ziv, M., Izhar, S., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-London 173–176. MARTIENSSEN, R. A. (1998): Functional genomics: probing plant gene function and expression with transposons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2021–2026. MOONEY, P. A., GOODWIN, P. B., DENNIS, E. S., LLEWELLYN, D. J. (1991): Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 25, 209–218. NEGRUTIU, J., SCHILLRRO, R., POTRYKUS, J., BIASINI, G., SALA, F. (1987): Hybrid genes in the analysis of transformation conditions. Plant Mol. Biol., 8, 363–373. NEUHAUS, G., SPANGENBER, G., MITTELSTEN, O., SCHEID, H., SCHWEIGER, G. (1987): Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore derived embryoids. Theor. Appl. Genet., 75, 30–36. NEUMANN, F., SCHAEFER-RIDDER, M., WANG, J., HOFSCHINEIDER, P. H. (1982): Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J., 1, 841–845. OMIRULLEH, S., ÁBRAHÁM, M., GOLOVKIN, M., STEFANOV, I., KARABAEV, M., MUSTÁRDY, L., MÓROCZ, S., DUDITS, D. (1993): Activity of a chimeric promoter with the doubled CaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants in maize. Plant Mol. Biol., 21: 415–428. OROZCO, B. M., OGREN, W. L. (1993 ): Localization of light-inducible and tissue-specific regions of the spinach ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (rubisco) activase promoter in transgenic tobacco plants. Plant Mol. Biol., 23, 1129–1138. RIGGS, C. D., BATES, G. W. (1986): Stable transformation of tobacco by electroporation: evidence for plasmid concatenation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5602–5606. RUAN, Y., GILMORE, J., CONNER, T. (1998): Towards Arabidopsis genome analysis: monitoring expression profiles of 1400 genes using cDNA microarrays. Plant J. 15, 821–833. SHIZUYA, H., BIRREN, B., KIM, U. J., MANCINO, V., SLEPAK, T., TACHIIRI, Y., SIMON, M. (1992): Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an Ffactor-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 8794–8797.


III. SZOMATIKUS SEJTGENETIKAI ÉS GÉNTECHNOLÓGIAI MÓDSZEREK SPIKER, S., THOMPSON, W. F. (1996): Nuclear matrix attachment regions and transgene expression in plants. Plant Physiology, 110, 15–21. WING, R. A., RASTOGI, V. K., ZHANG, H. B., PATERSON, A. H., TANKSLEY, S. D. (1993): An improved method of plant megabase DNA isolation in agarose microbeads suitable for physical mapping and YAC cloning. Plant J., 4, 893–898. YAMAMOTO, K., SASAKI, T. (1997): Large-scale EST sequencing in rice. Plant Mol. Biol., 35, 135–144. ZAENEN, J., VAN LAREBEKE, N., TENCHY, H., SCHELL, J. (1974): Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains. J. Mol. Biol., 86, 109–127. ZHANG, H.B., WING, R. A. (1997): Physical mapping of the rice genome with BACs. Plant Mol. Biol., 35, 115–127.


4. fejezet - IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 1. 8. Genetikailag módosított (GM) növények (Heszky L.) 1.1. 8.1. A GM növény A Földön élő valamennyi szervezet, így a növények tulajdonságai is az örökítő anyagban, a DNS-ben vannak kódolva. A növények genomiális DNS-e egy hosszú lineáris polimer, melyben 4 féle építőelem (nukleotid) random ismétlődik. A kultúrnövények genomjában lévő DNS hosszúsága 10 8 – 3 x 1010 nukleotid. A nukleotidok változó sorrendje jelenti a genetikai információt. Ez a primer információ (triplet sorrend) határozza meg a fehérjék aminosavsorrendjét, azaz a fehérje típusát és szerkezetét. A gén fogalmát a géntechnológia szempontjából úgy definiálhatjuk, hogy a DNS azon szakasza, mely egy vagy több fehérje kódját és annak megnyilvánulásához szükséges regulációs szekvenciákat tartalmazza. Végeredményben a gén egy olyan fehérjét, vagy fehérjéket kódoló programcsomagot jelent, mely – a tárolt információ szempontjából – szerkezeti és működési egységet alkot. A magasabbrendű növényeket körülbelül 30–50.000 gén határozza meg és az ezeket hordozó DNS molekula a növényt alkotó sejtek mindegyikében (a sejtmagban és részben az organellumokban) jelen van. A géneknek nagyjából 1/3-a az alapanyagcserében, további 1/3-a a szervek kialakulásában, és a fennmaradó körülbelül 1/3-a a speciális szövetek, sejtek differenciálódásában és működésében vesz részt. A növényi géntechnológia alkalmazása során tulajdonképpen egyes programcsomagokat kell átvinnünk a donor fajból a recipiensbe. A recipiens növényt nevezzük transzgénikus növénynek, transzformáns növénynek, genetikailag módosított növénynek, vagy GM növénynek, az eljárást pedig növényi rekombináns DNS technikának, transzformációnak, génsebészetnek vagy géntechnológiának, genetikai módosításnak stb. hívjuk. A GM növény minden sejtjének örökítő anyagában (a sejtmagi DNS-ben) tartalmazza a transzgént. Ez csak úgy lehetséges, ha az idegen géneket első lépésben a növények 1–1 izolált sejtjébe juttatjuk be, majd ezekből a sejtekből teljes növényt regenerálunk. A felnevelt növény minden sejtje végül is az eredeti GM sejtből származik, tehát tartalmazza a transzgént. Annak ellenére viszont, hogy a GM növények minden sejtje tartalmazza a transzgént, nem szükségszerű, hogy az minden sejtben működjön. Ez a szabályozó szekvenciáktól (promoter) függ, melyet molekuláris módszerekkel kapcsolunk a génhez. Jelenleg ismertek folyamatos működést biztosító, továbbá szövet- vagy szervpsecifikus, sőt induktív promoterek is. Tehát képesek vagyunk szabályozni, hogy a GM növényben a transzgén a növény élete során mely szövetében és szervében, és mikor működjön. A GM növények, végeredményben abban különböznek a hagyományosaktól, hogy egyrészt minden sejtjük sejtmagjában egy vagy több géntechnológiával alakított gént tartalmaznak, másrészt minden sejtjük – vagy csak egyes szöveteinek, illetve szerveinek sejtjei egy vagy több idegen fehérjét termelnek.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták

8/1. ábra: A transzgén származásának, típusának és eredetének lehetséges változatai a géntechnológiára alapozott molekuláris nemesítésben Ebből a szempontból a növényi géntechnológia hihetetlen távlatokat nyit a kutatók, nemesítők és vetőmag szakemberek számára. Azért, mert a transzgének horizontális rekombinációt is lehetővé tesznek, azaz nemcsak növényekből, hanem minden Földön élő fajból származhatnak, tehát alacsonyabbrendű élőkből, mint pl. a vírusok, baktériumok, gombák, rovarok, vagy magasabbrendű szervezetekből, mint pl. növények, állatok, ember stb. (8/1. ábra). Egyetlen kritérium van, nevezetesen az, hogy az átviendő gént növényben működő szabályozó szekvenciákkal kell ellátni (promoter, terminátor stb). Tovább növelheti a géntechnológiai stratégiák és a GM növények változatosságát, hogy a transzgéneken a laboratóriumban molekuláris módosításokat lehet végezni. Ennek megfelelően az eredeti (vad) génnek különböző mutáns, antiszensz vagy szintetikus, csonkolt stb. változatait is elő lehet állítani. De előállítható olyan GM növény is, mely egyszerre több gazdaságilag is hasznos gént tartalmaz (pl. rovar- és herbicidrezisztencia).

1.1.1. 8.2. Molekuláris növénynemesítés A klasszikus genetikai ismeretekre alapozott konvencionális növénynemesítés a fenotípusból indult ki és a keresztezéseket követő generációk tulajdonságaiból próbált következtetni a genotípusra. A géntechnológiára alapozott molekuláris növénynemesítés a genotípusból (genomból) indul ki és annak célirányos megváltoztatásával állítja elő a kívánt fenotípust. Ez a megközelítés tehát a növények tulajdonságait, teljesítményét és különböző képességeit, magának az információt hordozó molekulának (DNS) a szintjén, a gének megváltoztatásával kívánja elérni. Ez a lehetőség képes kiemelni a növénynemesítést az évszázados empíriából és racionális tudománnyá formálni (8/2. ábra).



8/2. ábra: A klasszikus és molekuláris növénynemesítés eltérő megközelítése A géntechnológia, mint molekuláris növénynemesítési módszer a molekuláris biológia, setjgenetika és szövettenyésztés különböző módszereit alkalmazza, melyek lehetővé teszik: a) az egyes tulajdonságokért felelős gének izolálását, jellemzését és felszaporítását (klónozását); aa) a gazdaságilag jelentős gén olyan vektorba építését, mellyel lehetővé válhat a gén átvitele a recipiens sejtbe, biztosítja továbbá a genomba való integrációját és működését; aaa) a genetikailag módosított sejtekből a kifejlett szervezet (transzgénikus növény) előállítását (regenerációját) (8/3. ábra).



8/3. ábra: A transzgénikus (GM) növényfajta előállításának főbb lépései és módszerei a gén izolálástól a köztermesztésbe kerülésig Egy transzgénikus fajta köztermesztésbe kerülése a molekuláris-, sejt- és klasszikus biológiai és genetikai, sejt- és szövettenyésztési, továbbá klasszikus növénynemesítési, állami elismerési, valamint termesztési diszciplínák és szakemberek szoros együttműködését igényli

1.1.2. 8.2.1. A molekuláris és a hagyományos nemesítés kapcsolata A géntechnológia molekuláris eszköztára végül is az emberiség kezébe adta azt a lehetőséget, hogy a termesztett növényfajokat olyan tulajdonságokkal ruházza fel, velük olyan anyagokat termeltessen, melyek az adott fajban az evolúció során nem alakulhattak ki, vagy nem az ember által kívánt mennyiségben és minőségben. A géntechnológia a molekuláris nemesítés első lépését jelenti, mely során a kívánt genotípust létrehozó fehérjéket kell megismerniük, majd azonosítani és izolálni kell ezen fehérjék génjeit. Az ilyen génnel transzformált növény termelni fogja a kívánt fehérjéket (enzimfehérjét). Ennek következményeként a GM növény nagy valószínűséggel a kívánt fenotípust fogja mutatni (pl. rezisztencia gén és rezisztens fenotípus). A GM fajták végül is csak 1–2 tulajdonságban térnek el a kiinduló fajtától. Ezeknek az új tulajdonságoknak azonban komoly termesztéstechnológiai, kereskedelmi vagy ipari értékük lehet. A géntechnológiai laborban előállított – gazdaságilag is jelentős gént hordozó – GM növényekből csak hosszú, kb. 8–10 éves további laboratóriumi vizsgálatok, majd szabadföldi kipróbálás és tesztelés, továbbá fajtaösszehasonlító vizsgálat után lehet elismert GM fajta, mely már a köztermelésbe kerülhet. Ez idő alatt kell bizonyítani, hogy a GM növénybe a transzgén stabilan beépült, a génről a kívánt sejtekben megfelelő 231 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták mennyiségben termelődik a gazdaságilag jelentős fehérje, továbbá, hogy e képességét a GM növény stabilan örökíti az utódokba. El kell végezni a környezetvédelmi, toxikológiai és allergológiai, élelmiszer forgalomba hozatali stb. engedélyekhez szükséges vizsgálatokat is. A géntechnológiára alapozott molekuláris nemesítéssel számos olyan probléma megoldható, melyekre a klasszikus nemesítési módszerek alkalmatlanok voltak. Ennek ellenére a molekuláris nemesítés nem képes helyettesíteni a hagyományos fajtaelőállítást. A GM fajták ugyanis általában nem új fajták, hanem a legjobb elismert és köztermesztésben lévő fajták GM változatai. Tehát kész fajtát érdemes géntechnológiailag módosítani. Ez azt is jelenti, hogy a GM fajták előállítása során a hagyományos nemesítésre a jövőben is szükség lesz. Tehát a jövőben is a klasszikus nemesítéssel kell előállítani azokat a kiegyenlített populációkat (vonalak, törzsek, fajtajelöltek, fajták), melyek alkalmasak arra, hogy a géntechnológiai módszerekkel tovább legyenek javíthatók. A két módszer tehát egymásra utalt és a jövőben is az lesz. A molekuláris nemesítés igényli a konvencionális módszereket, anélkül nem is tudna létezni. A géntechnológiai módszereket alkalmazó biotechnológiai világcégek e megfontolások alapján vásárolják meg a különböző vetőmag vállalatokat (pl. Du Pont a Pioneert, vagy a Monsanto a De Kalbot, Cargillt és az Asgrowt). A klasszikus nemesítés módszereit igényli még a GM fajták további javítása is, valamint alapanyagként való felhasználása az új, most már GM fajták előállítására irányuló konvencionális nemesítő munkában. A klasszikus és molekuláris növénynemesítés módszerei tehát nem kizárják, hanem kiegészítik egymást. E tudományos és szakmai egymásra utaltságot nem szabad összetéveszteni a világban a vetőmagipar területén lejátszódó globalizációs folyamatokkal, ami már gazdasági kategória.

1.2. 8.3. A növényi géntechnológia és a globalizáció A világon az elmúlt évtizedben géntechnológiai verseny alakult ki a transzgénikus növényfajták XXI. században várható piacainak megszerzéséért. E verseny a globalizáció jegyében zajlik, mely során vegyipari konszernek fúzionálnak vagy vásárolnak fel biotechnológiai, illetve vetőmag vállalatokat. Ennek következtében eddig nem ismert méretű tőkekoncentráció jött és jön létre a vetőmagiparban, mely évente dollármilliárdokat képes befektetni a gazdaságilag jelentős transzgénikus növények előállítására, a gének, eljárások, fajták, termékek, szabadalmi védelmére és az egész világon történő bevezetésére. E folyamat annyiban különbözik az eddigi fejlődéstől, hogy azoknak az országoknak, illetve cégeknek, akik most lemaradnak, minimálisra csökkennek a felzárkózási esélyei. Ennek okai a következőkben foglalhatók össze: • A géntechnológiára alapozott transzgénikus növényfajta előállítás minden lépése (a gének, az expressziós vektorok, a géntranszfer módszerek, a transzgénikus fajták) szabadalmaztatva vannak. • A szabadalmak az egész világra kiterjedően védettek, tehát a nemesítőnek nincs lehetősége arra, hogy a szabadalomtulajdonos engedélye nélkül hasonló GM fajtát állítson elő. • A géntechnológia tudományos és gyakorlati lépései, a transzgénikus fajták globális védelme és elterjedése óriási tőkebefektetést igényelnek, ami csak kontinentális méretekben térül meg, ezért a kis nemzetek és azok vetőmagvállalatai esélytelenek ebben a versenyben.

1.3. 8.4. A fontosabb géntechnológiai stratégiák Az első transzgénikus növényt, mely antibiotikum (kanamicin) rezisztenciával rendelkezett, 1983-ban állították elő a világon. Az első gazdaságilag is jelentős gént tartalmazó GM növényekről (vírus, rovar és herbicidrezisztencia) 1986-ban és 1987-ben számoltak be. A gazdaságilag jelentős géneket tartalmazó GM növények szántóföldi tesztelése 1988-ban kezdődött az USAban, amit az elmúlt évtizedben több ezer kísérlet követett Kanadában és az EU különböző országaiban, valamint Kínában. Az első transzgénikus növényfajta a későn puhuló paradicsom volt, mely 1994-ben jelent meg az USA piacain. A különböző stratégiák során előállított és szántóföldi körülmények között vizsgált GM növények száma ma 232 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták már 100 körüli. Természetesen ennél jóval kevesebb (kb. 25%-nyi) fajta került köztermesztésbe és kereskedelmi forgalomba. A GM növények előállítása és felhasználása gyors karriert futott be az elmúlt 15 évben. Tudományos szempontból e rövid időszak alatt sokféle transzgénikus növényt állítottak elő és szinte követhetetlen a különböző molekuláris stratégiák, megközelítések változatossága. A sokféle megközelítés ellenére a növényi géntechnológia stratégiák fő irányait és lehetőségeit biológiai szempontból az alábbiak jelentik: • Új fehérjék (enzimek) termeltetése • Fehérjék (enzimek) túltermeltetése • Mutáns fehérje (enzim) termelés • Fehérjék (enzimek) termelésének gátlása • Módosított fehérje (enzim) termeltetése A gazdaságilag jelentős transzgénikus növények három nagy csoportba sorolhatók.



8/4. ábra: Első generációs transzgénikus növények 8.4.1. Az első generációs transzgénikus növények (8/4. ábra) esetében a stratégia a mezőgazdasági termelés, az agrotechnika segítése volt. A konkrét genetikai módosítások céljait a biotikus (vírus, gomba, baktérium, rovar) rezisztencia, illetve az abiotikus (herbicid) rezisztencia kialakítása jelentették. Napjainkig tulajdonképpen a rovarrezisztens és herbicidrezisztens növények azok, melyeket a legnagyobb területen termesztenek a világon. Különösen sikeresnek tekinthetők a GM fajták gyapot, szója, repce és kukorica fajok esetében. Az 1995–96-os bevezetésüket követően termőterületük az USA-ban és Kanadában nulláról 30–60%-ra emelkedett. A zöld és környezetvédő mozgalmak ellenállása és aktivitása miatt, az első generációs transzgénikus növényfajták elterjedése a világon azonban sok akadályba ütközött és ütközik. A figyelem ezért a zárt rendszerben – főleg ipari feldolgozás céljára – termelhető GM növények előállítása felé fordult, melyek már a második generációs transzgénikus növényeket jelentik.



8/5. ábra: Második generációs transzgénikus növények 8.4.2. A második generációs transzgénikus növények (8/5. ábra) esetében a stratégiát speciális minőség előállítása jelenti, főleg a fogyasztói és élelmiszeripari igények jobb kielégítése céljából. A konkrét genetikai módosítások célja a növények anyagcseréjének, növekedésének és fejlődésének módosítása. Az első sikeres második generációs GM fajták paradicsom, repce és burgonya esetében már köztermesztésbe kerültek. Terjedésük azonban lényegesen lassúbb, mint az első generációs GM növényfajtáké.



8/6. ábra: Harmadik generációs transzgénikus növények 8.4.3. A harmadik generációs transzgénikus növények (8/6. ábra) esetében a cél olyan GM növények előállítása, melyeket mint bioreaktorokat lehet felhasználni speciális molekulák előállítására, főleg a gyógyszeripar, műanyagipar, takarmányipar számára. Ide tartoznak azok a transzgénikus növények is, melyekben a transzgén expressziója specifikus promoterekkel szabályozott. Tehát a gén a növény életének meghatározott szakaszában és a növény megfelelő szervében vagy szövetében működik, illetve működése kémiailag az ember által bármikor kiváltható. Az első sikeres termékét ennek az irányzatnak a GM banán ,,fogyasztható” vakcinája jelenti. Felhasznált és ajánlott irodalom BALÁZS E. (1999): A rezisztencia nemesítés új útjai a géntechnológiai eljárások alkalmazásával. AGRÁRFÓRUM 10–14. Heszky L. (1998): A növényi biotechnológia. Agro-21, 5, 37–55. HESZKY L. (1999): A növényi géntechnológia elmélete és gyakorlata. Vetőmag, 6, 3–5. HESZKY L. (1999): A magyar növénynemesítés jövője és a géntechnológia. Mag, 1, 9–11. DUDITS D., DOHY J. (szerk.) (1998): Biotechnológia, lépéstartás Európával. MTA, Budapest, 19–68.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták JAMES, C. (1997): Global status of transgenic crops in 1997. ISAAA Briefs, No. 5, 1–30.

2. 9. Biotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) 2.1. 9.1. Vírus eredetű molekulák a virális patogénekkel szembeni rezisztencia kialakításában Az ismert növényi vírusok száma meghaladja az ezret, és az általuk okozott termésveszteség igen jelentős. Csak Angliában a burgonyánál 40 millió fontra, az árpánál 6 millió fontra becsülik az évente keletkező kárt. Trópusi országokban a vírus okozta betegségek igen súlyos nehézséget teremthetnek a táplálék előállításában. A védekezés fontos eleme a vírusmentes szaporítóanyag használata és a rovar-, gomba-, nematodavektorok elleni vegyszeres védekezés. A környezet vegyszerterhelésének mérséklésében meghatározó tényezőnek kell tekintenünk a rezisztens tenyészanyagok használatát. A gazdanövény és a vírus kölcsönhatását az okozott kár alapján a következőképpen csoportosíthatjuk: tolerancia: az egész növény fertőzött, de a tünetek gyengék hiperszenzitív reakció: nekrózis (sejtelhalás) következtében a vírus a fertőzés helye körüli sejtekre korlátozódik küszöb alatti fertőzés: a vírus képtelen a fertőzött sejtekből új sejtekbe átkerülni valódi immunitás: a vírus replikációja gátolt a fertőzött sejtekben.



9.1/1. ábra: A) Az egyszálú RNS dohánymozaik-vírus (TMV) genomi szerveződése B) A kukorica csíkoltsági vírus (MSV) genomjának szerveződése A rezisztens tenyészanyagok nemesítése során többféle mechanizmusra épülhet a védettség. Mind domináns (paradicsom Tm-1), mind recesszív (bab bc-1) gén biztosíthat rezisztenciát. A természetes rezisztenciagének korlátozott száma és a fenotípus labilitása kiemelten indokolttá teszi új rezisztenciaforrások állandó létrehozását. Ennek során a molekuláris biológiai ismeretek felhasználása több lehetőséget is kínál. A vírus RNS- illetve fehérjemolekuláinak közvetítésével egyaránt kialakítható rezisztencia, ezért indokolt röviden áttekinteni a növényi vírusok genomjának főbb elemeit és a kódolt legfontosabb fehérjéket. Az RNS és DNS növényi vírusok lehetnek egyszálúak vagy kettősszálúak. A 9.1/1. ábrán példaként egy egyszálú RNS-vírus (dohánymozaikvírus, TMV) és egy egyszálú DNS-vírus (kukorica csíkoltsági vírus, MSV) genomi szerveződését láthatjuk. A plusz szálú RNS-vírusok a növényi citoplazmában replikálódnak a vírus által kódolt RNS-polimeráz közreműködésével. A replikáz komplex részét képezheti még a helikáz, amely elősegíti a kettősszálú nukleinsav-molekula szálainak szétválását lehetővé téve a negatív szál szintézisének elindulását. A vírusgenom biztosítja a vírus sejtről sejtre történő mozgásához szükséges fehérje szintézisét is. A terjedést elősegítő fehérjék hozzájárulnak a plazmodezmán való átjutáshoz. A vírus köpenyfehérje mint szerkezeti fehérje szükséges az RNS-molekula becsomagolásához. Szerepet játszik még a vírus növényen belüli hosszútávú mozgásában is. A kukorica csíkoltsági vírus (MSV) DNS-ének szekvencia-analízise lehetővé teszi a főbb funkcionális elemek behatárolását (9.1/1. ábra). A rekombináns DNS-módszerek nemcsak a vírusok molekuláris szerkezetének megismerését tették lehetővé, hanem alapot adtak az egyes funkcionális komponensek felhasználására rezisztens növények előállítása érdekében. Mivel ez a megközelítés a vírusból származó molekulákra épül, patogén eredetű


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták rezisztenciáról (PATHOGEN-DERIVED RESISTANCE, PDG) beszélhetünk. A felhasznált molekulák alapján megkülönböztethetünk fehérje illetve nukleinsav közvetítésével kialakított rezisztenciát.

2.1.1. 9.1.1. A köpenyfehérje gén kifejeztetésével kialakított rezisztencia A keresztvédettség jelenségét már régóta ismerik a növénykórtan kutatói. Egy gyengébb vírusfertőzést követően felülfertőzés esetén védettség figyelhető meg. Ennek a biológiai védekezési mechanizmusnak a kihasználása az, amikor a vírus köpenyfehérje (KF) cDNS-ét növényi promoterrel együtt építik be a transzformáns növényekbe. Az első sikeres kísérletről 1986-ban POWELL-ABEL és mtsai számoltak be, amikor a dohánymozaikvírus (TMV) köpenyfehérje génjének kifejeztetésével rezisztenciát tudtak elérni. Megfigyelték, hogy a rezisztencia kifejezettebb, ha vírussal fertőzik a növényeket, szemben az RNS inokulálásakor tapasztalt reakcióval. Ebből arra következtettek, hogy a köpenyfehérje jelenléte a fertőződő sejtben gátolja a vírus szerkezeti szétesését, ami szükséges a szaporodáshoz. A KF transzformáns hajtásokat kontrollnövényekre oltva igazolni lehetett a vírusmozgás gátlását a KF-t szintetizáló szövetekben. Ez a géntechnológiai megközelítés igen sikeresnek bizonyult, hiszen használhatósága nemcsak laboratóriumi, hanem szabadföldi körülmények között is igazolódott. Példaként a 9.1/2. ábra a BALÁZS ERVIN és mtsai által előállított dohány transzformánsokat mutatja be. A jobb oldali sor növényei a burgonya Y-vírus burokfehérje cDNS-ét tartalmazzák. Jól látható a növények tünetmentessége a bal oldali sor kontrollnövényeinek súlyos károsodásával összehasonlítva. Burgonya, sárgadinnye, szója, paradicsom és búza köpenyfehérje transzformánsok szabadföldi értékelése van folyamatban a világ különböző országaiban. Külön jelentőséget ad ennek a módszernek, hogy elhanyagolható a beépített virális szekvencia és egy felülfertőző vírus közötti rekombináció kockázata.



9.1/2. ábra: A burgonya Y-vírus köpenyfehérjegént kifejező dohány transzformánsok (jobboldali sor) tünetmentesek, míg a kontrollnövényeket (baloldali sor) súlyosan károsítja a vírusfertőzés (Balázs Ervin és mtsai kísérlete, Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ, Gödöllő)

2.1.2. 9.1.2. Módosított mozgási fehérjékre épített ellenállóság A DNS geminivírusok a sejtmagban replikálódnak, és más-más fehérje biztosítja az egyszálú genom kijutását a citoplazmába illetve a szomszédos sejtekbe. Az RNS-vírusok a citoplazmában replikálódnak és a sejtek közötti mozgáshoz az ún. mozgási fehérjék (MOVEMENT PROTEINS, MFS) szükségesek. Ezek a fehérjék in vitro egyszálú nukleinsavakat tudnak kötni, és a növényi sejtekben megtalálhatók mikrotubulusokhoz kacsolódva, illetve felhalmozódnak a plazmodezmatákban. A transzformáns növényekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a funkcióját elvesztett, mutáns MF kifejeztetése vezethet vírusrezisztenciához a betegség szisztemikus


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták terjedésének gátlásával. Fontos megfigyelés, hogy az ilyen transzformánsok különböző mértékben, de többféle vírussal szemben is rezisztensnek bizonyultak.

2.1.3. 9.1.3. A replikázgén kifejeztetése A különféle vírusokból származó replikáz-cDNS beépítése a gazdanövénybe több esetben is rezisztencia kialakulását eredményezte. A vírusok egy csoportjánál (burgonya X-vírus; csicseriborsó mozaik vírus, paprika tobamo vírus) RNS által megvalósított, homológia függő, így törzs-specifikus rezisztenciát tapasztaltak. Ezzel szemben a burgonya Y-vírus replikázgén kifejeztetésének hatékonysága a mutáns fehérje szintézisétől függött. A vad típusú fehérje nem eredményezett rezisztenciát.

2.1.4. 9.1.4. Nukleinsav-molekulák által közvetített rezisztencia Az előzőek szerint a transzformánsokkal végzett kísérletek egy része felhívja a figyelmet arra, hogy a rezisztencia kialakulhat a fehérjetermék hiányában. Számos próbálkozás történt RNS-molekulákra épített rezisztencia kialakításra. Így a szatellit RNS-ek és a hibás interferáló RNS-ek szolgálhatnak alapul újabb megközelítések kidolgozásához. A szatellit RNS-ek kis méretű molekulák, önmagukban nem, csak segítő (helper) vírus közreműködésével fejtik ki hatásukat fokozva a tüneteket. Bár a szatellit RNS kifejeztetése során több esetben a vírusfertőzés visszaszorult, mégsem javasolható ez a módszer, mert viszonylag nagy a veszélye új vírus–szatellit kombinációk kialakulásának, és ezzel veszélyes patogének keletkezésének. A replikcióra képes hibás interferáló RNS-ek illetve DNS-ek kifejeztetése rezisztenciát eredményezett.

2.1.5. 9.1.5. Vírusrezisztencia és transzkripció utáni génelhallgattatás Többek között a burgonya X-vírus-replikáz (RNS-polimeráz) cDNS-t hordozó transzformánsok tanulmányozása vezetett a homológia függő génelhallgattatás és a vírusrezisztencia összefüggésének felismeréséhez. A váratlan megfigyelés az volt, hogy a vírusrezisztens transzformánsokban a beépített polimeráz gén mRNS-ének mennyiségét kevésnek találták. Ha keresztezéssel bevittek egy újabb homológ példányát a polimeráz génnek, akkor az is inaktiválódott illetve a rezisztencia szigorúan vírustörzs-specifikusságot mutatott. A tapasztalt sajátosságokat a szerzők a szekvenciától függő RNS degradációjával magyarázták (MUELLNER és mtsai 1995). A poszttranszkripcionális génelhallgattatás (POSTTRANSCRIPTIONAL GENE SILENCING, PTGS) mechanizmusa a transzgén mRNS illetve azzal azonos vagy komplementer szekvenciájú virális vagy nukleáris eredetű RNS nagy specifitású degradációját jelenti. A lejátszódó molekuláris eseményekbe mélyebb betekintést enged WATERHOUSE és mtsai (1998) szellemes kísérlete. A burgonya Y-vírus proteáz génjét szensz és antiszensz orientációban építettek be dohánynövényekbe, majd keresztezéssel a két transzgént egy növényben kombinálták. A szensz és antiszensz mRNS egyidejű jelenléte a sejtekben rezisztenciát illetve immunitást eredményezett. Ez a kísérlet megerősíti, hogy a PTGS-hez illetve az immunitás kialakításához kettősszálú RNSmolekulák szükségesek, amelyek templátként szolgálnak a növényi RNS függő RNS-polimeráz számára. Mivel a folyamat lényege a szekvencia-specifikus RNS-degradáció, meghatározó lépés a kettősszálú RNS kialakulása. A kettősszálú RNS-ről helikáz közreműködésével komplementer egyszálú cRNS szintetizálódik, amihez RNázenzim kapcsolódik. A cRNS és RNáz komplexe a virális RNS-hez hibridizál, ami lehetővé teszi, hogy az RNáz leeméssze az egyszálú régiókat a hibridmolekulán. A nagyfokú homológián alapuló rezisztencia kialakulásában az antiszensz RNS szintézise fontos komponens. A fenti kísérletben ezt egy külön génbeépítés biztosította. Egyetlen szensz virális transzgén esetén több példányú beépülés szükséges, mégpedig fordított helyzetű ismétlődések formájában. Ebben az esetben a transzkripció önmagával komplementer RNS-eket is fog eredményezni. A rezisztencia megnyilvánulásának feltétele, hogy mind a virális, mind a transzgén mRNS mennyisége egy kritikus szintet elérjen. A kísérleti eredmények egy részét úgy értelmezhetjük, hogy aberráns, rendellenes szerkezetű, rövidebb méretű RNS-ek hatására vezethető vissza a génelhallgattatás vagy a rezisztencia (9.1/3. ábra).



9.1/3. ábra: A specifikus RNS-degradáción alapuló vírusrezisztencia és génelhallgattatás lehetséges molekuláris mechanizmusai. Transzformáció során a T-DNS és így a virális vagy növényi transzgén több példányban is integrálódhat a sejtmagi DNS-be. Előfordulhat egyszerűbb, egyirányú illetve komplexebb, többirányú beépülés a) RNS-ek által közvetített vírusrezisztencia: vírus eredetű gén (cDNS) beépítése esetén arról RNS-molekulák szintetizálódnak és kikerülnek a citoplazmába. A fertőző vírus-RNS (+ szensz) replikációja során antiszensz RNS-molekulák szintetizálódnak, amit genomikus RNS-ek vagy RNS-fragmentek szintézise követ. A vírus replikációja során képződő antiszensz RNS-ek és a transzgén RNS-ek homológiája esetén (60 nukleotid hosszú szakasz már elegendő) a kialakuló kettősszálú RNS-ek aktiválhatják a nukleázt és gátlódik a vírus replikációja b) Az RNS mennyiségi viszonyaira épülő modell. Ha nagy mennyiségben szintetizálódik a transzgénről RNS, akkor keletkezhetnek kettősszálú régiók, amelyek aktiválhatják a nukleázt. Másik lehetőség, hogy a kettősszálú szakaszok templátként szolgálnak a növényi kettősszálú RNS-polimeráz számára, és antiszensz RNS-ek szintetizálódnak. Így lehetővé válik további kettősszálú RNS-ek kialakulása és a nukleázaktiválás c) Aberráns RNS-képződési modell. Ellentétes irányú génbeépülés esetén egyrészt képződhetnek aberráns RNSmolekulák vagy kettősszálú RNS-molekula szakaszok, amelyek kináz közreműködése után nukleázaktivációhoz vezethetnek (Gallie,1998 nyomán) A PTGS folyamatának kutatása az utóbbi időben jelentősen kibővült (lásd összefoglaló: WASSENEGGER és PÉLISSIER, 1999). Érdemes megemlíteni, hogy a génelhallgattatás (GS) lehet szisztemikus, azaz átterjed ez a funkció a növény azon részeibe, amelyekbe nem került beépítésre a gén. A szisztemikus jel, feltételezhetően nukleinsav, mozogni képes a plazmodezmatákon keresztül a sejtek között illetve a floémben. Ezeknek a kísérleteknek a során meg kell említenünk a vírusindukált génelhallgattatás (VIRUS-INDUCED GENE SILENCING, VIGS) jelenségét (összefoglaló: BAULCOMBE, 1999). A burgonya X-vírus (PVX) cDNS-ében a köpenyfehérjét kódoló rész elé szensz és antiszensz orientációban beépítették a karotin-bioszintézis egyik génjét (fitoén-deszaturáz). Ezt a kimérakonstrukciót használva in vitro előállított PVX RNS-sel fertőztek dohánynövényeket. 10–15 nappal az inokulálás után a fertőzött levélrészek kifehéredtek jelezve, hogy nem működött a karotin-bioszintetikus út, amely fényen védettséget ad a klorofillmolekuláknak. Ezzel a vírusvektorral a fertőzött növény egy génjének működését specifikusan inaktiválni lehetett. Feltételezhető, hogy a VIGS mögött RNS-molekulákat érintő poszttranszkripcionális génelhallgattatási folyamatok vannak. Ez a megközelítés szerephez juthat a klónozott gének funkciójának meghatározásában. Gyorsabb, mint az inszerciós mutagenezis és használható letális funkcióvesztés analízisére is. 242 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A bemutatott koncepciók és kísérleti megközelítések széles választékot kínálnak vírusrezisztens tenyészanyagok létrehozására. A vírus-ellenállóság értékelése először üvegházi körülmények között történik. Tekintettel a probléma gazdasági és környezetvédelmi jelentőségére, nagyszámú szabadföldi kísérletet is végeztek. Balázs Ervin összefoglalójában (1999) 13 növényfajjal folytatott értékelést sorol fel, amelyek szabadföldön történtek az USA-ban. Engedélyezték 3 KF transzformáns növény termesztését is. Ezzel egyidőben értékelni kell a kibocsátással járó kockázatokat is. Az egyik szempont annak vizsgálata, hogy történik-e RNS-rekombináció a transzformáns növényekben ismételt vírusfertőzést követően, és ezzel keletkezhetnek-e új variáns vírusok. A válasz természetesen, igen. További kérdés, hogy ez a természetes folyamathoz viszonyítva milyen gyakorisággal következik be. Itt meg kell említeni, hogy a poszttranszkripciós génelhallgattatási rendszer használatakor a rekombináció kockázata igen alacsony. A kockázatértékelés és a gyakoriság megbecslésének az lehetne a kísérletes megközelítése, hogy a kétszeresen fertőzött kontroll, nem transzformáns növények az egyszeresen fertőzött transzformánsokkal hasonlítjuk össze. Kiindulva abból a feltételezésből, hogy a géntechnológiával nemesített vírusrezisztens fajták jelentős területen lesznek köztermesztésben, génkombinációnként szükséges a kockázatok becslése és kísérletes ellenőrzése.

2.2. 9.2. Bakteriális fertőzéssel szemben rezisztens transzgénikus növények Tekintettel a bakteriális kórokozók által okozott jelentős veszteségekre, (egy 1980. évi adat szerint a kár 100 millió dollár évente), világszerte intenzíven kutatják azokat a géntechnológiai lehetőségeket, amelyek ellenállóságot biztosítanak a gazdasági növények számára. A növénynemesítés során a nemesítők keresztezéssel építik be a rezisztenciagéneket, amelyeket a fajtagyűjteményekben vagy rokon vad fajokban fedeztek fel. A keresztezéssel végzett genetikai vizsgálatok egyértelműen alátámasztják rezisztenciagének meglétét. Így kézenfekvő ezeknek a géneknek az izolálása és a rezisztencia kialakítása transzformánsok előállításával. További rezisztenciát biztosító génbeépítési stratégiák kidolgozása feltételezi a baktérium–növény kölcsönhatást kísérő molekuláris folyamatok ismeretét. A patogén-válasz alapvetően két típusú lehet. Az inkompatibilis (rezisztens) válasz jellegzetessége a védekezéssel kapcsolatos HIPERSZENZITÍV REAKCIÓ (HR), amelyet először Klement Zoltán magyar növénypatológus írt le. Ennek során sejthalál következik be a fertőzés helyén, így gátlódik a fertőzés továbbterjedése. Az inkompatibilis kapcsolatot jelzi még az oxigéngyökök képződése, K+-kiáramlás/H+-beáramlás, valamint a védekezési gének gyors aktiválódása. Ezzel szemben a kompatibilis (fogékony) kölcsönhatást nem kíséri a HR, elmarad az oxigéngyökök képződése, mérsékelt az ionáramlás és késik a védekezési gének működésének beindulása. A HR közvetlenül kapcsolatba hozható a bakteriális hrp (HYPERSENSITIVE RESPONSE AND PATHOGENICITY) és avr (AVIRULENCE) génekkel, továbbá pektikus enzimek, toxinok és extracelluláris poliszacharidok szintézisével. Fontos felismerés még, hogy állati és növényi patogének hrs génjei fehérjekiválasztási rendszert is létrehoznak, amelyek képesek a virulencia fehérjéket a gazdasejtekbe juttatni.



9.2/1. ábra: A kórokozók széles körét érintően sikerült rezisztenciagént izolálni különböző növényekből A leucin-ismétlődésben gazdag fehérjerégió igen gyakori komponense ezeknek a géntermékeknek. A kinázok fehérjék foszforilációjával vesznek részt a jelátviteli folyamatokban. A membránon túlnyúló fehérjeszakaszok szerepet játszhatnak a bakteriális avirulencia (avr) gének termékeivel való kölcsönhatásban. Ez a kölcsönhatás létrejöhet a növényi sejten belül is (Baker, 1997 nyomán) A támadó kórokozó baktérium a gazdanövényt ,,gene for gene” kölcsönhatás során ismeri fel, ami azt jelenti, hogy a domináns avirulencia (avr) géneknek megfelelő domináns rezisztencia (R) gének működnek a növényben. Az elmúlt években több R gént sikerült megklónozni és meghatározni a felismerésben fontos fehérjék főbb szerkezeti elemeit (9.2/1 ábra). A leucinban gazdag ismétlődések a fehérje-fehérje kölcsönhatásban játszanak szerepet. Megfigyelhetők kináz funkciójú domének vagy nukleotid-kötő régiók. Ezekben a fehérjékben leucinzipzár vagy Toll/interleukin1-receptor-motívumok szintén előfordulnak. Az 9.2/1 ábra azt is szemlélteti, hogy az R gének termékei elhelyezkedhetnek a plazmamembránban vagy a sejten kívül is. A fehérjék foszforilációját, defoszforilációját végző kinázok és foszfatázok kulcsszerepet játszanak számos jelátviteli folyamatban. A paradicsom Pto illetve a rizs Xa 21 R gének szerin/treonin kinázokat kódolnak, ami megerősíti a foszforilációs módosítások jelentőségét a betegségrezisztenciában.



9.2/2. ábra: A patogén, illetve az általa termelt tüneteket okozó vegyület, az elicitor egy receptorral történt kapcsolat révén aktiválja a szignálátvitel korai szakaszát. Kiemelt szerepe van a hidrogén-peroxid (H2O2) képződésnek, amely mint másodlagos hírvivő, a szalicilsav szintézisét indukálja. A kinázok/foszfatázok több ponton is részesei a génexpressziós változások elindításának. A hiperszenzitív reakció (HR) és a szisztemikusan szerzett rezisztencia (SAR) lényeges tényezői a védekezési folyamatoknak (Yang és mtsai,1997 nyomán) A növényi védekezési mechanizmusok egyaránt épülnek az ún. korai és késői jelátviteli folyamatokra, amelyek nemspecifikus, szerzett rezisztenciát biztosíthatnak. A baktérium illetve az általa indukált, tüneteket kiváltó faktor, az ún. elicitor rövid időn belül megváltoztatja a növényi plazmamembránon keresztüli ionáramlást. Ezzel egy időben bekövetkezik az ún. oxidatív robbanás, reaktív oxigéngyökök (szuperoxid anion: O 2–, hidrogénperoxid: H2O2) halmozódnak fel (9.2/2. ábra). Ez a folyamat kétfázisú. A gyors, perceken belüli szabadgyök-képződés mind az inkompatibilis, mind a kompatibilis kölcsönhatás velejárója. Ugyanakkor a késleltetett válasz néhány óra múlva következik be, de csak az inkompatibilis kapcsolat esetén. A reaktív oxigéngyökök fontos szerepet játszanak a HR kialakulásában, lehet közvetlen antibakteriális hatásuk illetve serkenthetik a sejtfal lignifikációját. Nem utolsósorban részt vesznek a védekezési gének működésének beindításában. A korai, elsődleges jelátviteli folyamatokat további szignálmolekulák, mint a szalicilsav, benzoesav, etilén, jazminsav, amplifikálják. A szalicilsav szintjének megemelkedése szükséges a HR válaszhoz, koordináltan aktiválja a védekezési ún. PR (PATHOGENESIS-RELATED) géneket. Az általuk kódolt PR fehérjék igen különböző funkciókat látnak el. Így több PR fehérje esetében kimutatható in vitro antimikrobiális hatás, pl. a PR1, PR2 glükanázok; PR3: kitináz; PR5: thaumatin-típusú rendelkezik ilyen képességgel. Ebbe a csoportba sorolhatók a thioninok, proteáz-gátlók. A fitoalexinek is kis molekulatömegű, antimikrobiális hatással bíró vegyületek. A növényi védekezési gének aktiválódását az elicitorral történt kölcsönhatáskor a promoter régióban található 11 bp hosszúságú cisz elem (CTAATTGTTTA) biztosítja. A transzkripciós aktivációt egy homeodoménnel rendelkező fehérje kötődése indítja el. Az előzőekben vázolt növényi védekezési reakciók a fertőzés helyén lejátszódó folyamatokkal kapcsolatosak. Pedig ellenálló képesség, a tünetek mérsékelt megnyilvánulása bekövetkezhet a növény többi, patogénnel közvetlenül nem érintkező szöveteiben is. Ez a szisztemikusan szerzett rezisztencia (SYSTEMIC ACQUIRED RESISTANCE, SAR) széles spektrumú védettséget biztosít. A jelenség mögött SAR-specifikus gének aktiválódását lehet kimutatni, ami a korábban bemutatott antimikrobiális fehérjék (PR1-a: glükanáz; PR3: kitináz; PR2: â–1,3 glükanáz; PR5: ozmotin) szintézisét biztosítja. Kísérletek sora igazolja, hogy szalicilsavfelhalmozódás szükséges a SAR-t kísérő jelátviteli folyamatokhoz és a rezisztencia megnyilvánulásához. A fentiekben bemutatott jelentős, új ismeretanyag a baktérium–növény kölcsönhatás molekuláris alapjairól sok esetben transzgénikus növényekkel végzett kísérletekből származik. A génbeépítés lehetőséget ad a funkciók feltárására, fontos biológiai törvényszerűségek felismerésére. Ugyanakkor az így létrehozott tenyészanyagok felhasználásával a rezisztencianemesítés is új lehetőségekhez jut. Az alábbiakban néhány kiemelt példán 245 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták keresztül kívánjuk bemutatni a bakteriális fertőzésekkel szembeni ellenállóság kialakítását szolgáló ígéretes géntechnológiai megközelítéseket.

2.2.1. 9.2.1. Antibakteriális fehérjék túltermeltetése a transzformáns növényekben Rovarokban előforduló kisméretű, 35–37 aminosavból álló, a bakteriális membránt károsító peptidek közül a cecropint, illetve annak szintetikus analógjait (Shiva-1 és SB37) sikerült dohánynövényekben szintetizáltatni. A HUANG és mtsai által (1997) végzett kísérletben egy sebzésre aktiválódó, proteáz-g átlót kódoló gén PiII promoterével fejeztették ki a SB37 gént úgy, hogy a szintetikus peptid-kódoló régiója elé építették be az árpa áamiláz gén szekréciót biztosító szekvenciáját. Így kívánták elérni, hogy a peptid a növényi sejtek között fejtse ki hatását. A transzformánsok Pseudomonas syringae pv. tabaci-val történt levél-infiltráció után tünetmentesek maradtak. A peptidet szintetizáló dohánynövényekben 10-szer kevesebb baktériumot lehetett kimutatni, mint a kontrollnövényekben. Ezek az eredmények megerősítik ennek a megközelítésnek az alkalmazhatóságát, bár figyelembe kell venni, hogy a litikus peptidek toxikusak lehetnek a növények és emlős állatok sejtjeire. A baktériumsejtek falának peptidoglükánját hidrolizáló lizozimek szintén kipróbálásra kerültek mint antibakteriális faktorok. A T4 bakteriofágból illetve emberi génbankból származó lizozim gének beépítése burgonya- és dohánynövényekbe csak részleges rezisztenciát eredményezett. Talán figyelmet érdemel egy vaskötő fehérjével, a laktoferrinnel végzett transzformációs kísérlet. A tejben lévő laktoferrin antibakteriális hatása régóta ismert. Merész próbálkozásként MITRA és ZHANG (1997) az emberi laktoferrin cDNS-ét a CaMV35S promoterrel dohány szuszpenziós tenyészet sejtjeibe transzformálták. A felnevelt kalluszszövetekben egy kisebb méretű fehérjeterméket tudtak kimutatni, aminek több kórokozó baktérium (Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae, Clavibacter flaccumfaciens). növekedését jelentősen gátló hatása volt. A vas jelenléte nem befolyásolta az antibakteriális hatást.

2.2.2. 9.2.2. A patogenitási és virulencia faktorok gátlása Több kísérleti megközelítésben is sikeresnek bizonyult a baktérium által termelt toxin hatástalanítása akár inaktiváló mechanizmus vagy rezisztens enzim génjének kifejeztetésével. Maguk a kórokozók védettek saját toxinjaikkal szemben. Így lehetett a P. syringae pv. tabacitabtoxinját inaktiváló enzim génjét magából a baktériumból izolálni. Ez a toxin a növényi glutamin-szintetáz enzimet teszi működésképtelenné, és az ammónium-felhalmozódás károsítja a növényi sejteket. A ttr rezisztenciagén kifejeztetésével a tabtoxin inaktiválódott, ami tünetmentességet biztosított. Egy másik bakteriális toxin, a phaseolotoxin az argininszintézisben szerepet játszó ornitinkarbamoil-transzferáz (OCTáz) enzimet gátolja. Maga a kórokozó, a P. syringae pv. phaseolicola két OCTáz-aktivitással rendelkezik. Ezek közül az egyik enzimforma a phaseolotoxinnal szemben ellenálló. FUENTE-MARTINEZ és mtsai (1992) izolálták a rezisztens enzim génjét (argK) és RUBISCO kis alegység génjének promoterével fejeztették ki dohánynövényekben. A transzformánsok nem mutattak klorotikus tüneteket a toxinkezelés után, továbbá elmaradt a léziók és a szisztemikus betegség kialakulása a baktériummal történt fertőzés esetén.

2.2.3. 9.2.3. A növények természetes védekezési mechanizmusait serkentő géntechnológiák A növényi rezisztencia (R) gének klónozásában elért eredmények, a kódolt fehérjék szerkezetének és kölcsönhatásainak ismerete komoly tudományos alapot ad rezisztens fajták előállításához. Ugyanakkor a rezisztenciagének genetikai analíziséből származó ismeretek, a nemesítői tapasztalat jelentős segítséget nyújthatnak az R gének izolálásához. Jó példa erre a rizs Xanthomonas oryzae pv. oryzae-val szembeni ellenállósági Xa21 lókusz behatárolása és a gént hordozó genomikus klón azonosítása SONG és mtsai (1995) által. Mint a 9.2/1. ábrán látható, az Xa21 gén feltételezhetően egy transzmembrán receptort kódol, amelynek van egy külső, leucin-ismétlődésekben gazdag régiója és egy belső, szerin/treonin kináz része. Először a genomikus fragmentet transzformálták fogékony genotípusba, aminek eredményeként a X. oryzae pv. oryzae 6 rasszával szembeni rezisztencia alakult ki a regenerált rizsnövényekben. Érdekes továbbfejlesztése ennek a munkának az, amikor a molekuláris jellemzést kiterjesztették egy rizsfajtára (IRBB21), amely az Oryza longistaminata vad fajból származó rezisztenciával rendelkezik, és az ismert valamennyi X. oryzae pv. oryzae rasszal szemben ellenálló. Ebből az új genotípusból származó Xa21 gént hordozó transzformánsok széles rezisztenciaspektrumot mutattak, hasonlóan a vad fajhoz illetve az IRBB21 fajtához. WANG és mtsai (1996) szerint ezen az úton rezisztens fajták 2 év alatt állíthatók elő, szemben a keresztezéssel történő génátvitel 7–10 éves időigényével. 246 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Az izolált R gének nemesítési felhasználhatóságát bonyolítja, hogy a specifitást meghatározó bakteriális faktorok mellett többkomponensű jelátvitel szükséges a rezisztens fenotípus kifejeződéséhez. Egyetlen összetevő mennyiségének megváltoztatása nemkívánt hatásokhoz vezethet. Igen tanulságosak a paradicsom Pto génjével végzett transzformációs kísérletek eredményei. A Pto rezisztenciagén, amely eredetileg a Lycopersicon pimpinellifolium vad fajból került beépítésre a termesztett paradicsomba, ellenállóságot biztosít a Pseudomonas syringae pv. tomato baktérium avrPto gént kifejező törzseivel szemben (9.2/3. ábra). A Pto növényi gén egy, a citoplazmában található szerin/treonin kinázt kódol. Amennyiben a CaMV35S promoterrel folyamatosan túltermeltetik a Pto kinázt paradicsomnövényekben, a védekezési folyamatok működésbe lépnek a Pto-avrPto kölcsönhatás nélkül. Az ilyen transzformánsok levelein sejtelhalás mutatható ki, szalicilsav halmozódik fel és a PR gének fokozottan kifejeződnek. Ez a fokozott védekezési állapot ellenállóságot biztosít további más kórokozókkal (Xanthomonas, Cladosporium) szemben is. Amennyiben a nemkívánt tünetek kiküszöbölhetők és a Pto gén működése pontosabban szabályozható, akkor ez a széles spektrumú ellenállóság jól használható a növénynemesítésben.

9.2/3. ábra: Lehetséges modell a Pto rezisztenciagén működésének következtében aktiválódó jelátviteli rendszer összetevőiről A Pto és Prf fehérjék a plazmamembránon belül helyezkednek el. Az AvrPto faktor a baktériumból bekerül a citoplazmába és specifikusan kötődik a Pto kinázhoz. Ennek következtében a Pto fehérje autofoszforilálódik és aztán foszforilálja a Pti1 és Pti5 fehérjéket. A Pti1 fehérje szintén egy kináz, a Pti5 pedig feltételezhetően egy transzkripciós faktor, amely közreműködhet a védekezési gének aktiválásában (Bent, 1996 nyomán)

2.2.4. 9.2.4. A reaktív oxigéngyökök képződésének befolyásolása génbeépítéssel • Korábban már említettük, hogy szuperoxid (O2-) illetve hidrogénperoxid (H2O2) képződése a fertőzött sejtekben a korai védekezési folyamatok részét képezi. (9.2/2. ábra). A hidrogénperoxid többféle szerepet játszhat, úgy mint 1.Kiváltja a helyi hiperszenzitív reakciót és sejthalált 2.Közvetlen antimikrobiális hatást fejt ki 3.Módosítja a sejtfal struktúráját: prolingazdag fehérjék keresztkötése 4.Mint diffúziós szignál aktiválja a környező szövetekben a védekezési géneket, pl. PR1, glutation-Stranszferázt 5.Serkenti a fitoalexinek képződését.



• 9.2/4. ábra: A reaktív oxigéngyökök (ROS) képződésének főbb lépései A sejtek károsításában igen aktív hidroxilgyök (OH) kialakulásában szerepe van a szabad vas (Fe2+) jelenlétének (Hammond-Kosack és Jones, 1996 nyomán)

9.2/5 ábra: A lucerna vaskötő fehérjét, a ferritint leveleikben szintetizáló dohány transzformánsok az oxidatív stresszel szemben rezisztensek Az oxidatív károsítást paraquat-kezeléssel lehet kiváltani. A növények viselkedését a fotoszintetikus funkciók (Fv/Fm) alapján értékelhetjük. Látható, hogy a nem transzformáns SR1 növények teljesen elvesztik a fotoszintézis funkcióját. A ferritint termelő transzformánsok (RUBF3; CaMVF9) képesek ezt a károsító hatást kivédeni (Deák és mtsai, 1999 nyomán)



9.2/6 ábra: A bakteriális- illetve vírusfertőzés okozta tünetek mérsékeltebb formában jelennek meg a ferritint szintetizáló transzformánsok (A2, C8) levelein (Barna Balázs és Király Zoltán kísérlete, MTA Növényvédelmi Kutatóintézet) • Transzformáns növények előállításával közvetlenül lehetett bemutatni a H2O2 szerepét a védekezési folyamatban. WU és mtsai (1995) az Aspergillus niger-ből izolált glükózoxidáz gént fejeztették ki burgonyanövényekben. Ez az enzim a D-glükóz oxidációját katalizálja, amelynek során glükonsav és H 2O2 képződik. A gombagént egy virális CaMV35S promoterrel működtették a transzformánsokban, amelyek szöveteiben 2–3-szor több H2O2-t lehetett kimutatni. A transzformáns gumók erős rezisztenciát mutattak a baktériumos rothadást okozó Erwinia carotovora fertőzéssel szemben illetve mérsékelt tüneteket mutattak Phytophthora infestans gombafertőzést követően (lásd 9.3 fejezet ). A vázolt kísérlet eredményei igen érdekesek és biztatóak, ugyanakkor látnunk kell a veszélyeit annak, hogy H 2O2 fokozott mértékben termelődik a növényi szövetekben. Bár mind a szuperoxid anion (O2–), mind a H2O2 csak mérsékelt reaktivitással rendelkeznek és többféle enzim (peroxidázok, katalázok) is képes a H 2O2-t eltávolítani a sejtekből, azért számolni kell igen káros, nagyhatású szabad gyök, mint a hidroxilgyök (OH) képződésével is. A 9.2/4. ábra a reaktív gyökök képződésében szerepet játszó komponenseket mutatja be, és látható, hogy Fenton-reakció során Fe2+ közbenjárásával OH-gyök keletkezhet hidrogén-peroxidból. A keletkező OH-gyökök felelősek lehetnek a lipid-peroxidációért, a fehérjék illetve DNS-molekulák károsításáért. Mindezek alapján felvetődik a kérdés, lehet-e az oxidatív sejtkárokat mérsékelni a szabad vastartalom csökkentésével. Valamennyi sejtben vaskötő fehérjék, mint pl. a ferritin szabályozzák a szabad vas mennyiségét. A növényi ferritint kódoló gének működésbe lépnek stressz hatására illetve abszcizinsav-kezelést követően. Vastúladagolás is aktiválhatja ezeket a géneket a növények vegetatív szöveteiben. A ferritin cDNS-ek izolálásával lehetővé vált ennek a vaskötő fehérjének a folyamatos, magas szintű termeltetése transzformáns dohánynövényekben (DEÁK M. és mtsai, 1999). A 9.2/5. ábrán látható, hogy a ferritint túltermelő növények kevésbé károsodnak paraquatkezelés hatására. Ez a korábban gyomirtóként használt szer szabad oxigéngyököket generál a fotoszintetizáló növényi részekben. Az oxidatív stresszel szembeni rezisztencia ismeretében feltételezhető, hogy a ferritin transzformánsok megváltozott tüneteket mutatnak kórokozókkal történő fertőzés esetén. A 9.2/6. ábrán látható, hogy jelentősen csökkentek a léziós tünetek a Pseudomonas tabaci-val történt fertőzést követően. Ezek a transzformánsok nekrotikus vírus- és gombafertőzés esetén is mérsékelt tünetkialakulást mutattak (lásd 9.2/7. ábra). A ferritin vaskötő fehérjét túltermelő transzformánsok módot adtak a szabad vasnak az oxidatív károsodásban betöltött szerepének igazolására illetve új példát szolgáltattak a kórokozókkal szemben toleráns növények előállítására.



9.2/7. ábra: A lucerna vaskötő fehérjét, a ferritint szintetizáló dohánynövények (RubF2, RubF8) Alternariafertőzés után mérsékeltebb tüneteket mutatnak, mint az SR1 kontrollnövény (Deák és mtsai, 1999)

2.3. 9.3. Gombarezisztens transzgénikus növények A vírus- és rovarrezisztencia kialakításában a géntechnológia által bemutatott tudományos és gyakorlati eredményeket a kórokozó gombák esetében még nem lehetett elérni, legalábbis ami a kereskedelmi alkalmazást jelenti. Ennek legfontosabb okai részben a gazdanövény és a patogén gombák kapcsolatának bonyolultságával, a rezisztenciát kialakító folyamatban résztvevő molekulákkal és génekkel kapcsolatos ismeretek hiányával, továbbá azok viszonylagos nagy számával magyarázhatók.



9.3/1. ábra: A növényi sejt és kórokozó közötti molekuláris kapcsolat – a fertőzésben résztvevő és a növényi sejt válaszreakcióját alkotó molekulák – sematikus ábrázolása PR = fertőzéshez kapcsolt, HRGP = hidroxiprolin gazdag glikoprotein, RIP = riboszóma inaktiváló fehérje. GRP = glicin gazdag fehérje (Cramer C.L. és mtsai, 1993 J. Nematology 25, 507–518 nyomán) Abból a célból, hogy a géntechnológia megfelelő stratégiáit ki lehessen alakítani, először meg kell ismerni a gazda-parazita kapcsolatot meghatározó molekuláris folyamatokat és az abban résztvevő legfontosabb enzimeket, molekulákat (9.3/1. ábra). Ide tartoznak: • A passzív védelem különböző mechanizmusai, melyek eleve kizárják egyes gombafajok fertőzési lehetőségét; • A növény és a patogén gombák inkompatibilis kapcsolatának mechanizmusa, mely védetté teszi a növényt a fertőzés tényleges bekövetkezésével szemben; • A fertőzés bekövetkezését követően a rezisztens növény válaszreakciói, melyek megakadályozhatják és lokalizálják a fertőzést, illetve megakadályozzák a kórokozó terjedését a növényben:


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták • fitoalexinek termelése vagy túltermelése, • hidrolizáló és a gomba sejtfalát bontó enzimek termelése vagy túltermelése, • a növényi sejtfalat erősítő anyagok (pl. extenzinek, glicinben gazdag fehérjék, lignin bioszintézist gyorsító enzimek, tionin stb.) termelése vagy túltermelése, • proteináz inhibitorok termelése vagy túltermelése, • egyéb, a védekezést elősegítő fehérjék és anyagok termelése vagy túltermelése. A fogékony és rezisztens növény között a különbség azonban nemcsak az előbbiekben bemutatott folyamatokkal jellemezhető, hanem még azzal is, hogy a növény: a) milyen gyorsan ismeri fel a kórokozót, aa) milyen gyorsan képes aktivizálni a védekezési mechanizmusát. A kórokozó gomba és a növény kapcsolatának ilyen megközelítése lehetővé teszi a géntechnológiai stratégia különböző lehetőségeinek pontosítását. A molekuláris stratégia fő területei ezek alapján a következők lehetnek: a)A növény felépítésében, növekedésében és fejlő-désében olyan változások előidézése, melyek biztosítják a passzív rezisztenciát. b)A kompatibilis kapcsolat inkompatibilissé változtatása a molekuláris (pl. receptor molekulák) jelek módosításával. c)Felismerő faktorok és jelátvivő molekulák azonosítása és a növényi válasz gyorsítása. d)A védekezési mechanizmus gombaellenes fehérjéinek és gombaellenes anyagainak, vagy azok közül néhánynak termeltetése vagy túltermeltetése a növény fejlődésének kritikus szakaszában. e)Állati, mikrobiális stb. eredetű gombaölő vagy antifungális anyagok termeltetése növényekkel, ami a növényvilágra eddig nem volt jellemző. A stratégiák közül tulajdonképpen a d) pontban foglalt megközelítések azok, melyekkel kapcsolatban már sikeres előrelépésről lehet beszámolni.

2.3.1. 9.3.1. Gombaellenes enzimek A gombák sejtfala általában kitinből és â-1,3glükánból (â-1,3oligoszacharid lánc) áll. A növények különböző enzimeket (kitinázok, glükanázok) termelnek, melyek részei a védekezési mechanizmusuknak. 1. Kitinázok A kitinázok â-1,3 kapcsolt N-acetil-D-glükózaminból álló polimert, a kitint hidrolizálják. A kitináz a fertőzött növényben a hifák csúcsi részén szintetizálódó kitint bontja el, megakadályozva ezzel a gomba növekedését. A kitin a fonalas gombák sejtfalának meg-határozó eleme az Oomycetes-eket kivéve. A kitináz a növényekben kis mennyiségben termelődik, de fertőzéskor mennyisége megnő, és a vakuólumban, illetve a sejtközötti járatokban felhalmozódik. Tehát a kitináz gének a növényben részben konstitutív, részben induktív szabályozásúak. A kitináz gént (chiA) baktériumból, gombából és különböző növényfajokból izolálták (pl. rizs, burgonya, dohány, uborka stb.). A bakteriális eredetű kitinázok nem mutatnak homológiát a növényiekkel. Az első kitinázt termelő GM növényről (dohány) 1991-ben számoltak be. E növényben a bab endokitináz génjének (CH5B) működését a CaMV 35S promoter szabályozta. A transzgénikus növényekben a kitináz aktivitása 23–44-szeres volt a kontrollhoz képest. A 35S kitináz GM dohánynövények 22–37%-a pusztult el a Rhizoctonia solani fertőzést követően, a kontroll 53%-ához képest. Hasonló eredményt lehetett elérni GM olajrepcével is. A rezisztencia szintje szoros összefüggést mutatott az expresszió mértékével. Ezeket az eredményeket a növény fejlődésének korai (csírázást követő) fázisában kapták. A későbbi fenofázisokban a növények már rezisztensek voltak a kórokozóval szemben. Ezt a megállapítást viszont cáfolták a Cercospora nicotianae-val végzett későbbi kísérletek, ahol a kitináz nem volt meghatározó tényezője a rezisztenciának.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Trichoderma harzianum-ból izolált endokitináz génnel (ThEn-42) transzformált almanövények kifejezett rezisztenciát mutattak a Venturia inaequalis-szal szemben. A problémát viszont az jelentette, hogy a ThEn-42 expressziójának mértéke a GM növényekben negatív korrelációban volt a növények növekedési erélyével. 2. Kitinázok és glükanázok koexpressziója Nyilvánvaló, hogy a kitináz csak egy elem a növény védekezési mechanizmusában. Azok a gének, melyek a â1,3-glükanázokat, proteázokat, lipázokat és specifikus gombaellenes lektineket kódolják, szintén fontosak lehetnek. Ezért a kilencvenes évek közepén egyszerre több génnel transzformáltak növényeket. A kitináz és glükanáz gének közös konstitutív működtetésével a transzgénikus dohány növények sokkal jobb rezisztenciát mutattak az egygénes konstrukciókhoz képest. Ezt az eredményt burgonya kísérletek is megerősítették, melyekben a két gén koexpresszáltatása a Fusarium-mal szembeni rezisztencia mértékét már gazdaságilag is értékelhető szintre emelte. Árpa eredetű kitináz és glükanáz gének együttes működtetése transzformált dohányban szintén ennek a kettős megközelítésnek használhatóságát támasztotta alá. Ezért a kutatások újabb enzimek keresésére és felhasználására koncentráltak. E munka során több kitinkapcsolt fehérjét tisztítottak és klónoztak. Tesztelésük folyamatban van.

2.3.2. 9.3.2. Patogenezishez kapcsolt növényi fehérjék és peptidek 1. PR-fehérjék Szintáttörést jelentő fejlődés a fertőzéshez és a betegség megjelenéséhez (PR, pathogenesis related) kapcsolt fehérjék szerepének vizsgálatától és azok működtetésétől várhatók a transzgénikus növényekben. A PR-1 fehérje – biokémiai funkciója még nem ismert – a dohányban nagy mennyiségben termelődik az aktív általános rezisztencia (SAR, systemic acquired resistance) kialakulása során. A fehérje erős expressziója következtében a GM dohány toleranciát mutatott a Peronospora tabacina és a Phytophthora parasitica var. nicotianae fertőzéssel szemben. Ezeknek a fehérjéknek 5. osztálya (PR-5) is gombaellenes hatást mutatott in vitro. A PR-5 fehérjék közül, a dohányeredetű ozmotinnak a túltermeltetése GM burgonyában szignifikánsan lassította a Phytophthora infestans fertőzés tüneteinek megjelenését és fejlődését. 2. Riboszóma inaktiváló fehérje (RIP) A növények néhány faja folyamatosan termeli a riboszóma inaktiváló fehérjét (RIP), mely az in vitro kísérletekben gombaellenes hatást is mutatott. E fehérjék aktivitása jelentősen fokozódik sejtfalbontó enzimek jelenlétében. Árpa RIP gén expressziója a GM dohányban javította a gombarezisztenciát (Rhizoctonia solani), de annak mértéke még nagyobb volt akkor, amikor a RIP és kitináz együtt működött. 3. Gombaellenes peptidek A kilencvenes években fedezték fel a defenzineknek nevezett kis antifungális peptideket. A defenzinek 29–34 aminosavból álló, ciszteinben gazdag peptidek, melyek a növényben a kórokozó gombák hifáinak megnyúlását gátolják. Ezek közül néhányat a növények magvaiból izoláltak és in vitro bizonyították antifugális hatásukat számos kórokozó gombával szemben. A retekből izolált defenzin génnel (RS-AFP2) sikerrel transzformálták a dohányt, és a GM dohány ellenállóságot mutatott az Alternaria longipes kórokozóval szemben. A többi, már ismert peptid (pl. tioninok, lektinek, lipid transzfer fehérjék) jelentőségét és szerepét a kórokozó gombákkal szembeni rezisztencia kialakításban még bizonyítani kell. A tioninokat a növények leveleiben, gyökerében és a magvak endospermiumában mutatták ki. A fehérje 45–47 aminosavból áll, melyből 6–8 cisztein. Hatásukat a sejtmembránba épülve fejtik ki, növelve annak permeabilitását. A lipid transzfer fehérjék 90–93 aminosavból állnak és 8 diszulfidhoz kapcsolt ciszteint tartalmaznak. A foszfolipidek transzferét – a liposzómákból a mitokondriumokba – befolyásolják. 253 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 4. Fitoalexinek Kis molekulatömegű antimikrobiális anyagok, melyeknek nagy szerepük lehet a növények bakteriális és gombás megbetegedéseinek leküzdésében. A fitoalexin bioszintézis és a rezisztencia közötti kapcsolatot már többször bizonyították. Az Arabidopsis thaliana mutánsban, mely nem volt képes fitoalexineket szintetizálni, a kórokozó tünetei sokkal kifejezettebbek voltak. A szőlőből izolált stilbén-szintáz gén a GM dohányban expresszálódva egy új fitoalexin, a rezveratrol termelését eredményezte, mely jelentősen javította a Botrytis cinerea-val szembeni ellenállóságot.

2.3.3. 9.3.3. Aktív oxigénfajták Király Zoltán professzor több évtizedes kutatásaiból jól ismert az aktív oxigénfajták (AOS, active oxygen species) szerepe és jelentősége a kórokozók okozta tünetek megjelenésében, és újabban a rezisztencia kialakításában. Kísérleteiben a paraquat típusú herbicidnek ellenálló növényeken bizonyította, hogy a szuperoxid és egyéb reaktív oxigénfajták káros hatását tűrő növények rezisztensebbek a gombabetegségekkel (Colletotrichum és Botrytis) szemben is. Eredményeit azzal magyarázta, hogy a különböző kórokozók fertőzésekor kialakuló tünetek összefüggésben vannak a növényben keletkező aktív oxigénfajtákkal, és azok mennyiségével. WU és munkatársai gomba eredetű glükózoxidáz génnel transzformáltak burgonyát. A GM növények megemelt szintű H2O2-val rendelkeztek, ami javította rezisztenciájukat mind a gombás (Verticillium és Phytophthora), mind a bakteriális (Erwinia) megbetegedésekkel szemben. Ebből arra következtettek, hogy a növényben a megnövelt AOS szint javítja a kórokozókkal szembeni ellenállóképességet. További részleteket lásd a 9.2. fejezetben.

2.3.4. 9.3.4. Állati eredetű fehérjék és peptidek Más élő szervezetekben előforduló gombaellenes molekulák hatását a GM növényekben is bizonyították (pl. tyúktojás lizozim, békabőr eredetű magainin és emlős defenzinek). Sajnos, felhasználhatóságukat rontja, hogy nagyon kis mennyiségben termelődnek a GM növényi sejtekben. Összefoglalva, a közölt eredmények is megerősítik a bevezetésben elmondottakat, nevezetesen, hogy a kórokozó gombákkal kapcsolatos növényi rezisztencia kialakítása molekuláris szempontból rendkívül összetett folyamat. A rezisztencia egy komplex rendszer, mely 1–1 transzgénnel nem érhető el. Sokféle megközelítés javította a rezisztencia mértékét, és számos eredmény jelentősen bővítette a növény és a kórokozó gomba kapcsolatra vonatkozó ismereteinket. Egységes kép azonban még nem állt össze, és ennek megfelelően a problémák univerzális megoldása sem lehetséges a géntechnológia jelenlegi módszereivel. A gombarasszok kérdését még csak fel sem vetettük. A következő évszázad elején minden bizonnyal megjelennek az első gombarezisztens GM növények. Abban azonban biztosak lehetünk, hogy a megfelelő megközelítést, gént, géneket és módszereket minden egyes gazda-parazita kapcsolatra (esetről-esetre) külön-külön kell meghatározni és kidolgozni.

2.4. 9.4. Rovarrezisztens transzgénikus növények A növények általában rendelkeznek bizonyos fokú rovarrezisztenciával. A növények természetes védekezési mechanizmusa általában olyan másodlagos anyagcseretermékek előállítását jelenti, melyek károsak a rovarokra. Ennek az a következménye, hogy a növényevő rovarok specializálódtak bizonyos fajokra. A növények, fajok és fajon belül az egyedek természetes rezisztenciája különböző. A hagyományos nemesítés ezt próbálta felhasználni rovarrezisztens növényfajták előállítására, de eddig átütő sikert és eredményességet nem tudott felmutatni. Ezért napjainkig a megoldást a kémiai és a biológiai rovarölőszerek jelentették. A géntechnológia azonban növényi és bakteriális gének felhasználásával kiugró eredményeket ért el az elmúlt 10 évben. Az első sikeres GM rovarrezisztens növényről 1987-ben számoltak be. Azóta 40 különböző gént próbáltak ki a rezisztencia kialakítása céljából. Az első rovarrezisztens fajták (gyapot, kukorica és burgonya) – melyekben a Bacillus thüringiensis (Bt) delta-endotoxin génje biztosította a rovarrezisztenciát – 1995-ben kerültek köztermesztésbe az USA-ban. A rovarrezisztencia gének származhatnak mikroorganizmusokból, növényekből, sőt állatokból is. Hatásuk azonban hasonló: mind a rovarok emésztőrendszerét károsítja.



2.4.1. 9.4.1. Mikroorganizmus eredetű gének Bacillus thüringiensis (Bt) delta-endotoxin gén A B. thüringiensis egy spóraképző talajbaktérium, mely a spóraképzés során rovarokat károsító kristályos fehérjét (Bt toxin, delta-endotoxin) termel. A baktérium spóráit és endotoxinját, mint mikrobiális eredetű rovarölőszert (biopeszticid), már az 1950-es évek óta használják a növényvédelmi technológiákban. A Bt toxin hatásmechanizmusa csak részben ismert. Miután a rovar elfogyasztotta, a fehérje oldhatóvá válik és a középbélben lévő lúgos pH, valamint a proteázok aktiválják. E folyamat során a fehérje (pl. cry1A, 130 kDa) NH2 terminális végéből egy rovarölő hatású aktív fragmentum (65–70 kDa) keletkezik. A rovar érzékenységét a Bt toxinra az dönti el, hogy az aktív forma hozzá tud-e kapcsolódni a középbél epitél hámsejtek receptorához, vagy nem. Az aktivált toxin – fogékony rovar esetében – képes a középbél epitél sejtjeinek receptoraihoz kapcsolódni. A kapcsolódást követő folyamatok még nem ismertek teljes részletességgel, de az biztos, hogy miután a toxin bejutott a membránba, azon pórusok keletkeznek, megszakad annak elektromos és pH gradiense. A sejtek lizálnak, ami végül is visszafordíthatatlan károkat okoz a középbél falában. Megszűnik a bélmozgás, és a bélsejtek elhalnak. Mindez jó feltételeket teremt a baktérium számára a vegetatív szaporodáshoz. A Bt baktérium különböző törzsei sokféle kristályos toxint termelnek, melyek más és más rovarfajokra hatnak. A Bt delta-endotoxinok részei a homológ fehérjék nagy és egyre növekvő családjának. 1999-ig 130 gént (fehérjét) azonosítottak. Ezek a gének a különböző fajspecifitások molekuláris hátterének nagy variációs tárházát adják, ugyanis mindegyik fehérje csak egy vagy néhány fajra toxikus. A specifitást a fehérje szerkezete és a rovar receptor molekulája adja. A Cry géncsalád – a fehérjék specifitása alapján – Lepidoptera (lepkék és molyok), Diptera (legyek és szúnyogok), valamint Coleoptera (bogarak) ellen ható alcsaládra osztható. A kristályos fehérje három doménből áll. Valószínűleg az 1-es domén felelős a membránon kialakuló lyukakért, a 2-es domén a receptorhoz való specifikus kapcsolódást teszi lehetővé, a 3-as domén funkciója még nem ismert. Napjainkig legalább 10féle Bt génnel (cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca, cry1H, cry2Aa, cry3A, cry6A, cry9C) transzformáltak növényeket. A cry1A alcsaládba tartozó gének fehérjéi viszonylag szűk spektrumban hatnak pl. lepkék (Lepidoptera) lárvái és a kukoricamoly ellen. A B. thüringiensis var. kurstaki Berliner törzs a cry1A(b) gént tartalmazza. A gént sokféle gazdasági növényben (26 faj) expresszáltaták. A rezisztencia mértéke attól függött, hogy az eredeti (vad-típusú) gént vagy a ,,csonkolt” gént használták-e. Az eredeti, teljes hosszúságú génnel történő transzformáció esetén legfeljebb, vagy nagyon gyenge hatást kaptak. Ennek magyarázata az, hogy a rovarok bélcsatornájában az aktiválás során proteolízissel az eredeti fehérje (1155 aminosav) amino-terminális feléből keletkezik az aktív toxin (614 aminosav). Ezért a gént megrövidítették. A csonkolt génnel, mely az eredeti fehérjének már csak az aminoterminális felének kódját tartalmazza, jobb expressziót és rovarölő hatást lehet elérni. A géncsonkítás azonban nem bizonyult elegendőnek a szántóföldi kísérletekben. Ezért a gént szintetikusan is módosították, mely kiterjedt a poliadenilációs hely, a transzkripciót esetlegesen leállító helyek eltávolítására, továbbá a gén eredeti 37%-os guanin-citozin (G+C) tartalmának növelésére (49%) stb. A csonkolt és kodon-optimalizált gént napjainkig gyapotba, kukoricába, burgonyába, lucernába, brokkoliba és káposztába építették be. Ezek a növények 10–100-szoros mennyiségben termelték a toxint, ami elegendő volt a károsítók 97–99,8%-ának elpusztításához. Az expressziónövelés alternatív stratégiáját jelentheti a jövőben az a megközelítés, amikor a cry1A(c) gént a kloroplasztiszba kívánják bejuttatni. Ezzel különlegesen nagy expressziós szint érhető el. A Bt. toxint sikerrel használták az egyszikű növények ellenállóságának növelésére is. Ezek közül csak a kukorica példáját említjük. Az ismert volt, hogy a cry1A(b) delta-endotoxin (B. thüringiensis var. kurstaki HD1) hatásos a kukoricamoly ellen. Az eredeti endotoxin gén azonban nem expresszálódott a kukoricában, és ezért annak kukoricára optimalizált szintetikus változatát is előállították. A kukoricára optimalizált gén a cry1A(b) fehérje 1155 aminosavából az első 648-at kódolja, mely viszont 100%-ban homológ az eredeti vad típussal. A G+C tartalmat 65%-ra növelték. A konsrukciók által termelt toxin mennyisége a promotertől függően 1000– 4000 ng/mg oldható fehérje, mely viszont elég nagy variabilitást mutatott a különböző genotípusok, sőt azon belül az egyes egyedek között is. 255 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A B. thüringiensisvar. tenebrionis törzs a cry3A delta endotoxint termeli, mely toxikus a bogarakra (Coleoptera), beleértve a burgonyabogarat is. A cry3A génnel transzformált növények alig mutattak expreszsziót, ami a csonkolással sem volt érdemben növelhető. A megfelelő expressziót csak a cry3A gén szintetikus és módosított változatával lehetett elérni, hasonlóan az előbbiekben tárgyalt cry1A alcsaládhoz. A molekuláris módosítás magában foglalta a poliadenilációs hely, az A+T gazdag régiók eltávolítását és a G+C tartalom 49%-ra való növelését. A szintetikus génnel transzformált burgonya 100%-ban ellenálló volt a burgonyabogár lárvákkal szemben és jelentősen csökkentette a kifejlett rovarok számát és kártételét is. A szántóföldi kísérletek eredményei bizonyították, hogy a Bt növényeken rezisztens rovarpopulációk alakulhatnak ki. Abból a célból, hogy ezek mennyisége szabályozható legyen ,,nagy dózis és menedék” (highdose/refuge) stratégiát dolgoztak ki. E teoretikus modell alapja, hogy csak a homozigóta rovarok rezisztensek a Bt toxinra. Abban az esetben, ha a rezisztenciagén heterozigóta formában van jelen a rovarban, annak érzékenysége kisebb, mint a rezisztenciagént nem tartalmazóké, de a Bt növény által termelt toxin még képes elpusztítani. Tehát a cél az, hogy a rovarpopulációban minél nagyobb arányt érjenek el a rezisztenciagénre nézve heterozigóta egyedek. Ennek gyakorlati megvalósítását jelenti a ,,nagy dózis és menedék” technológia. Lényege, hogy a Bt növényfajta táblája közé Bt mentes fajtát is vetnek, mely sávokban a rezisztenciával nem rendelkező egyedek is élhetnek, szaporodhatnak. A Bt táblán lévő homozigóta rezisztens egyedek ezekkel párosodva hozzák létre a heterozigóta utódokat, melyek a Bt táblán elpusztulnak. A Bt burgonya (New Leaf, Monsanto) volt az első 1995-ben, mely köztermesztésbe került. A Bt-burgonya (Cry3A fehérje) termesztése során, a burgonyabogár ellen felhasznált inszekticid mennyiségét 40%-kal lehetett csökkenteni. Azóta Kanadában, Japánban, Mexikóban is termesztik. A Bt gyapotot (Bollgard, Monsanto) 1996 óta termesztik az USA-ban (2 millió ha). A dohány bagolylepke (tobacco budworm, Heliothis virescens) elleni teljes védelem mellett, részben hatásos az amerikai kukorica bagolylepke (cotton bollworm, Heliocoverpa zea) és a gyapottok moly (pink bollworm, Pectinophora gossypiella) ellen is. A cry1A(c) fehérjét termelő Bt gyapottal 14% terméstöbbletet értek el, a felhasznált rovarirtó szerek mennyiségének jelentős csökkentése mellett. Azóta bevezetésre került Ausztráliában (0,4 millió ha), Kínában , Mexikóban és Dél-Afrikában is.



9.4/1. ábra: Star Link rovarrezisztens kukorica. A kukoricamoly (Ostrinia nubilalis) kártétele (A és C) a kukoricaszárban, (B) a csövön, (D): fogékony növény (bal) és a cry9C Bt génnel transzformált rezisztens Star Link növény (jobb) (Jekkel Zs. és Farády L. kísérlete, AgrEvo, Budapest) A Bt kukoricát 1996-ban több cég is piacra dobta (AgrEvo (9/4/1. ábra), Novartis (9.4/2. ábra), Mycogen, Monsanto, DeKalb Genetics). A hibridek zöme a Cry1A(b) gén eredeti, illetve szintetikus változatát tartalmazza. A Bt kukoricán a trópusi kukoricamoly (Ostrinia nubilalis) lárváinak első generációja 99%-ban elpusztult. A termesztését engedélyezték Argentínában, Kanadában, Japánban és az EU-ban.



9.4/2. ábra: Csonkolt és kodon optimalizált Bt. gént tartalmazó kukoricamoly rezisztens transzgénikus kukorica növények (balra) és a fogékony kontroll (jobbra) (NOVARTIS Hungaria Kft. kísérlete)

2.4.2. 9.4.2. Növényi eredetű gének A növényi eredetű géneknek két nagy csoportja van: 1. az inhibitorok (proteáz és amiláz inhibitorok), 2. a lektinek génjei. Ezeket tulajdonképpen eredeti formájukban transzformálták a növényekbe, mégis a kodonoptimalizált Bt-toxinokkal azonos mértékű rezisztenciát adtak. Ennek ellenére még nem jelentek meg a köztermesztésben. 1. Proteáz inhibitorok Rovarkártételkor a növényekben gombafertőzéshez hasonló folyamatok játszódnak le. A növény válasza a mechanikai sérülésre egyrészt helyi, másrészt szisztemikus, tehát az egész szervezetre kiterjedő. Az élettani változások magukba foglalják részben lignin és szuberin lerakódását a sejtfalban, részben bizonyos fehérjék felszaporodását: pl. PAL, peroxidázok, zsírsav-szintáz, extenzin (burgonyagumóban), hidroxiprolinban gazdag glikoproteinek (sárgarépa gyökérben), proteináz inhibitorok (Solanaceae, Fabaceae levelekben) stb. Ezek közül a proteináz vagy proteáz inhibitorok érdemelnek különös figyelmet. A burgonya és paradicsom leveleiben mechanikai sérülés hatására szerin típusú proteináz gátlók halmozódnak fel, mind a károsított, mind az érintetlen levelekben, azokban is, melyek távol helyezkednek el a sérült levéltől. A nem károsított növényekben ezek a fehérjék általában a magvakban (pl. kimotripszin inhibitor az árpában) vagy a gumókban (pl. patatin a burgonyában) halmozódnak fel. Szerepük az, hogy rovarkártétel esetén a rovar proteázainak gátlásán keresztül bizonyos fokú védelmet biztosítsanak azáltal, hogy megzavarják az emésztési folyamatokat. A szisztemikus válasz csak úgy lehetséges, ha a növényben a mechanikai károsodásnak van egy specifikus jele, mely viszonylag gyorsan el tud jutni a növény különböző részeibe. Ezt a molekuláris jelet proteináz inhibitor indukáló faktornak (PIIF) nevezték el. Nagy a valószínűsége annak, hogy ezek a jelátvivő molekulák, melyek a szisztemikus választ indukálják, a mechanikai károsodás során felszaporodó oligoszacharidok. Hatá-sukra megnő a poligalakturonáz aktivitás, mely indukálja a proteináz inhibitorok akkumulációját. 258 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A fentiek alapján a géntechnológia stratégiája kétirányú lehet. Az első: különböző proteináz inhibitor génekkel kell a növényeket transzformálni, hogy új inhibitorokat is képesek legyenek termelni. A második: ezeket a géneket ún. induktív promóterekhez kell kapcsolni, melyek károsításkor biztosítják a specifikus expresszió. A rovarokban működő proteázok (szerin, cisztein, aszpartát és metallo proteázok) az elfogyasztott fehérjéből szabadítják fel az aminosavakat. A különböző rovarcsoportokban más és más a meghatározó proteáz. Például a Lepidoptera lárvákban a szerin-típusú proteáz a meghatározó. A 90-es évek végéig 14 különböző proteáz inhibitor gént izoláltak és juttattak be növényekbe. A proteáz inhibitorok a Lepidoptera és Coleoptera fajok lárváinak növekedését és fejlődését gátolják. Hatásmechanizmusuk még nem teljesen ismert, de az biztonsággal állítható, hogy a pusztulás közvetlen oka nem az enzimek gátlása, hanem az enzimek túltermelése a sejtekben, amit a hiányzó aminosavak váltanak ki. Az emésztőenzimek mellett az inhibitorok hatással vannak a sejtek vízháztartására és az enzimműködés szabályozására is. A legnagyobb csoportot a szerin-típusú proteáz inhibitorok alkotják, melyeket a Fabaceae, Solanaceae és Gramineae család tagjaiból izoláltak. Felhasználásuk célja elsősorban a Lepidoptera és néhány Coleoptera, valamint Orthoptera fajok elleni védelem volt. Ezek közül a legismertebb a tehénborsó tripszin inhibitor génje (CpTI), mellyel napjainkig körülbelül 10 fajt transzformáltak. A transzgénikus növényekkel végzett kísérletek eredményei szerint a CpTI a fajok széles skálájára hat. A dohány szántóföldi kísérletekben a amerikai kukorica bagolylepke (Heliocoverpa zea, cotton boll worm) lárvák jelentős pusztulása következett be, melynek mértéke elérte a csonkolt Bt gén hatásáét. A szójából izolált szerin-proteáz inhibitor génekkel (KTi3, CII, PI IV) transzformált dohány növényekben a trópusi lápi bagolylepke (Spodoptera littoralis, cotton leaf worm) lárváinak első generációja 100%-ban elpusztult. Ezzel szemben ugyanezek a konstrukciók a burgonya esetében nem eredményeztek pusztulást, csak lassúbb fejlődést. Az árpa tripszin inhibitora (BTI-CMe) a legjobban jellemzett tagja a gabonafélék tripszin inhibitorai multigénes családjának. Az árpa tripszin inhibitor az endospermiumban halmozódik fel, és először az árpa lisztből tisztították a 14 kDa tömegű fehérjét. A Lepidoptera lárvák középbeléből izolált tripszinszerű proteázokat in vitro körülmények között specifikusan gátolta, az emlősök emésztőrendszerében viszont hamar lebomlik. A BTI-CMe-vel transzformált búzában a tripszin inhibitor hatását az egyik leggyakoribb raktári kártevővel, a mezei gabonamollyal (Sitotroga cerealella) szemben vizsgálták. A GM búzaszemekben a BTI CMe fehérje mennyisége elérte az összfehérje 1,1%-át. Toxikus hatását a kártevő lárvák korai fejlődési fázisában tudták csak megfigyelni. A későbbi stádiumokban a tripszin inhibitor hatását már nem lehetett kimutatni. 2. á-amiláz inhibitorok Az alfa-amiláz inhibitor (á-AI-Pv) hőstabil glikoprotein, ami a rovar és emlős á-amilázokkal 1:1 arányú komplexet alkot. A növényi és bakteriális á-amilázokkal viszont nem képes erre. A á-AI-Pv gátolja a Coleoptera-fajok középbelében működő á-amilázt. Különösen hatásos a Callosobruchus és Bruchus nemzetségek raktári kártevőinek lárváira, melyek fejlődését gátolja. 3. Lektinek A lektinek, növények által termelt szénhidrát-kapcsolt fehérjék, melyek közül több toxikus a rovarokra. Nagyon sok lektinről bizonyították már, hogy toxikusak a Homeoptera, Coleoptera, Lepidoptera és Diptera fajokra. A lektinek hatásmechanizmusa még nem tisztázott, az viszont biztos, hogy közülük néhány képes a rovarok középbél epitél sejtjeihez kapcsolódni. Az is igaz viszont, hogy a rovarölő lektinek egy része (bab, szója, búza) az emlősökre is toxikus, másik csoportja (borsó, hóvirág) kevésbé toxikus. A kutatások jelenleg a hóvirág lektinre (GNA) koncentrálnak, mert hatásosan pusztítja a levéltetveket és a rizs kabócáját (rice brown planthopper). A GNA-t kilenc különböző növényfajon tesztelték, többek között burgonyán, olajrepcén és paradicsomon. Bebizonyosodott, hogy a GNA nem növelte a burgonya levéltetvek pusztulását, illetve nem befolyásolta fejlődésük idejét, viszont jelentősen rontotta szaporodásuk mértékét, csökkentve ezzel a populáció gyors növekedését. A lektinekkel kapcsolatos kísérletekből végül is azt a következtetést vonták le, hogy nem inszekticideknek, hanem táplálkozásgátlóknak tekinthetők.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 4. További növényi gének, melyek termékeinek rovarrezisztenciát tulajdonítottak és vizsgálatuk folyamatban van, a bab kitináz, dohány peroxidáz, paradicsom kitináz stb.

2.4.3. 9.4.3. Állati eredetű gének Az emlős eredetű szerin-proteáz inhibitor gén hatását GM dohányban vizsgálták. Ezenkívül még a Manduca sexta eredetű anti-kimotripszin, antielasztáz, á-antitripszin és szarvasmarha hasnyálmirigy tripszin inhibitor génjével transzformáltak növényeket. Az eredmények ellentmondásosak. Általában nem lehetett a rezisztenciát növelni, sőt az á-antitripszint termelő burgonyán a burgonyabogár lárvák gyorsabban és nagyobbra nőttek, mint a kontroll lárvák. Összefoglalva megállapítható, hogy a géntechnológia számos stratégiája közül a mikroorganizmus eredetű Bt génnel való megközelítés bizonyult a legjobbnak. A Bt toxinok sokfélesége és specifitása lehetővé teszi, hogy az adott rovarfajra specifikus Bt toxin gént lehessen szintetizálni. A rovar érzékenysége a toxinra a toxin és a bélhámsejt receptor molekuláris kapcsolatával jól magyarázható. A rovarok receptor molekuláinak ismeretében a fajspecifikus Bt toxin gén szintetikusan elvileg minden kártevővel szemben előállítható lesz a jövőben. Előnye továbbá, hogy specifitása miatt más rovarokra, állatokra, sőt az emberre is hatástalan, azok emésztőcsatornájában lebomlik. Viszonylag kis koncentrációban hatásos, tehát termelése nem von el sok energiát a növénytől. További feladatok közé tartozik azonban a szervspecifikus expressziót biztosító promoterek keresése és felhasználása. A proteáz inhibitorokkal és lektinekkel stb. kapcsolatos eredmények szerények és ellentmondásosak, bizonyos fajtáik veszélyesek is lehetnek az állati és emberi táplálkozásban. Ezért ezek várhatóan még sokáig a kutatás stádiumában maradnak. Új lehetőségeket jelentenek viszont a Bacillus spp.-ben napjainkban felfedezett és klónozott vegetatív inszekticid fehérjéi (VIP), melyek a Diabrotica virgifera és D. lonficornis (kukoricabogár) ellen is hatásosak. Felhasznált és ajánlott irodalom BAKER, B., ZAMBRYSKI, P., STASKAWICZ, B., DINESH– KUMAR, S. P. (1997): Signaling in plantmicrobe interactions. Science, 276, 726–733. Balázs E.: 1999. A rezisztencia nemesítés új útjai a géntechnológiai eljárások alkalmazásával. Agrofórum, 10– 14. BAULCOMBE, D. C. (1999): Fast forward genetics based on virusinduced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol., 2: 109–113. BENT, A. F. (1996): Plant disease resistance genes: function meets structure. The Plant Cell, 8, 1757–1771. Broglie, K., I. Chet, M. Holliday, R. Cressman, P. Biddle, S. Knowlton, C. J. Mauvais, R. Broglie (1991): Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solani. Nature, 254, 1194–1197. CRAMER, C. L., WEISSENBORN D., COTTINGHAM, C. K., DENBOW C. J., EISENBACK, J. D., RADIN D. N., YU, X. (1993): Regulation of defense-related gene expression during plant-pathogen interactions. Jornal of Nematology, 25, 507–518. DE LA FUENTE-MARTINEZ, J. M., MOSQUEDA-CANO, G., ALVAREZ-MORALES, A., HERRERAESTRELLA, L. (1992): Expression of a bacterial phaseolotoxin-resistant ornithyl trans-carbamylase in transgenic tobacco confers resistance to Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Biotechnology (NY), 10, 905– 909. DEÁK, M., HORVÁTH, V. G., DAVLETOVA, S., TÖRÖK, K., SASS, L., VASS, I., BARNA, B., KIRÁLY, Z., DUDITS, D. (1999): Plants expressing the iron-binding protein, ferritin ectopically are tolerant to oxidative damage and pathogens. Nature Biotechnology, 17, 192–196. HAMMOND-KOSACK, K. E., JONES, J. D. G. (1996): Resistance gene-dependent plant defense responses. The Plant Cell, 8,1773–1791. HUANG, Y., NORDEENR. O., DI, M., OWENS, L. D., McBEATH, J. H. (1997): Phytopathology, 87, 494– 499. 260 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Király Z., Hornok L. (1996): A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a rezisztencianemesítésben. II. Rezisztenciagének, transzgénikus növények. Növénytermelés, 45, 307–316. Király Z., Hornok L. (1996): A gazda-patogén kapcsolatok molekuláris hátterének tanulmányozása új távlatokat nyit a rezisztencianemesítésben. I. Mikroorganizmusokból klónozott gének. Növénytermelés, 45, 195–206. Koiwa, H., R. A. Bressan, P. M. Hasegawa (1997): Regulation of protease inhibitors and plant defense. Trends in Plant Science, 2, 379–383. Maagd, R. A., D. Bosch, W. Stiehema (1999): Bacillus thuringiensis toxin-mediated insect resistance in plants. Trends in Plant Science, 4, 9–13. MITRA, A., ZHANG, Z. (1994): Expression of a human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein(s). Plant Physiol., 106. 977–981. MUELLNER, E., GILBERT, J. E., DAVENPORT, G., BRIGNETI, G., BAULCOMBE, D.C. (1995): Homology-dependent resistance: Transgenic virus resistance in plants related to homology-dependent gene silencing. Plant J., 7, 1001–1013. Ohashi Y. (1996): Molecular breeding for resistant transgenic plants against pathogen-attack. Gamma Field Symposia, 35, 97–1110. Oppenheim, A. B., I. Chet (1992): Cloned chitinases in fungal plant pathogen control strategies. Trends in Biotechnology, 10, 392–394. Peferoen M. (1997): Progress and prospect for field use of Bt genes in crops. Trends in Biotechnology, 15, 173– 177. Schuler, T. H., G. M. Poppy, B. R. Kerry, I. Denholm (1998): Insect-resistant transgenic plants. Trends in Biotechnology, 16, 168–175. Shah, D. M., C. M. T. Rommens, R. N. Beachy (1995): Resistance to diseases and insects in transgenic plants: progress and applications to agriculture. Trends in Biotechnology, 13, 362–368. SONG, W. Y., WANG, G. L., CHEN, L. L., KIM, H. S., PI, L. Y., HOLSTEN, T., GARDNER, J., WANG, B., ZHAI, W. X., ZHU, L. H. et al. (1995): A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21. Science, 270, 1804–1806. WANG, G. L., SONG, W. Y., RUAN, D. L., SIDERIS, S., RONALD, P. C. (1996 ): The cloned gene, Xa21, confers resistance to multiple Xanthomonasoryzae pv. oryzae isolates in transgenic plants. Mol. Plant Microbe Interact., 9., 850–855. WASSENEGGER, M., PÉLISSIER, T. (1999): Signalling in gene silencing. Trends in Plant Science, 4. 207– 209. WU, G., SHORTT, B. J., LAWRENCE, E. B., LEVINE, E. B., FITZSIMMONS, K. C., SHAH, D. M. (1995 ): Disease resistance conferred by expression of a gene encoding H 2O2-generating glucose oxidase in transgenic potato plants. Plant Cell, 7, 1357–1368. YANG, Y., SHAH, J., KLESSIG, D. F. (1997 ): Signal perception and transduction in plant defense responses. Genes Dev., 11, 1621–1639.

3. 10. Abiotikus stressz-rezisztens transzgénikus növények (Dudits D. és Heszky L.) 3.1. 10.1. Herbicidrezisztens transzgénikus növények 3.1.1. 10.1.1. A géntechnológiával kialakított herbicidrezisztencia jelentősége Az első generációs transzgénikus növények közül a herbicidrezisztencia talán a legjelentősebb, legalábbis gazdasági szempontból. A herbicidrezisztenciára irányuló géntechnológiai stratégia lényege, hogy a totális 261 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták herbicidekkel szembeni rezisztenciát lehessen kialakítani a növényben. Ennek komoly gazdasági következményei vannak. A totális herbicidek szelektív gyomirtószerként használhatók, sőt szelektivitásuk nem faj-, hanem fajtaspecifikus lesz. A totális gyomirtószer ugyanis mindent megöl, ami ,,növény” az alacsonyabbrendűtől a magasabbrendű fajokig, továbbá egy-egy faj minden fajtáját, csak azt a fajtát nem, mely tartalmazza a rezisztenciát biztosító gént. Végeredményben: a totális gyomirtószerek a rezisztens fajtában szelektív gyomirtásra is felhasználhatók, mely jelentősen bővíti felhasználási területüket. • A fajtaspecifikus herbicidrezisztencia esetében a totális gyomirtókat gyártó vegyipari konszernek (pl. Du Pont, Monsanto, Hoechst stb.) a rezisztens fajta vetőmagjához kapcsoltan árusíthatják a vegyszert is. • A szelektív vegyszeres gyomirtás minden fajnál bevezethetővé válik, mert a rezisztenciát hordozó gének minden kultúrfaj fajtáiba beépíthetők. Tehát azoknál a fajoknál, ahol a gyomirtás eddig megoldatlan volt, most egy csapásra megoldható lesz, a gazdának csak az adott faj herbicidrezisztens transzgénikus fajtáját kell termesztenie.

3.1.2. 10.1.2. Géntechnológia stratégiái

10.1/1. ábra: A fontosabb gyomirtószerek hatóanyagai A totális gyomirtókkal szembeni rezisztencia kialakításának stratégiáit a herbicid hatóanyaga (10.1/1. ábra) és a növényben a hatóanyag által károsított enzim molekuláris kapcsolatának módosítási lehetőségei határozzák meg.



10.1/2. ábra: A biotechnológia megközelítési lehetőségei a gyomirtószer rezisztencia kialakításában A rezisztencia három különböző mechanizmus működtetésével érhető el a növényekben: a) a károsított fehérje aminosavsorrendjének megváltoztatása (mutáns gén), mely meggátolja a hatóanyaghoz való kapcsolódását. aa) a herbicid hatóanyagának kémiai módosítása (detoxifikáló gén), mely meggátolja a megfelelő fehérjékhez való kapcsolódást, aaa) a herbicid hatóanyaga által károsított fehérje túltermeltetése (génamplifikáció, génreguláció) (10.1/2. ábra). 1. Rezisztencia mutáns génnel Ez a megközelítés a herbicid hatóanyaga által károsított enzim mutáns változatának előállítását igényli. Ebben az esetben a megtámadott enzim génjében kell in vitro olyan mutációkat kialakítani, a gén nukleotid sorrendjét úgy módosítani, hogy a mutáns génről szintetizálódó enzimfehérjéhez a hatóanyag ne tudjon kapcsolódni. A rezisztencia lényege, hogy mutáns génnel történő transzformációt követően a rezisztens transzgénikus növények sejtjeiben az adott enzimfehérjének kétféle – a korábbi érzékeny és egy új rezisztens (mutáns) – változata termelődik. Mivel az utóbbi változathoz a hatóanyag nem tud kapcsolódni, a mutáns enzim működése biztosítja, hogy a sejt anyagcseréje ne károsodjon. A mutáns génnel történő transzformációval sikeres volt a rezisztencia kialakítása a glifozát és a klórszulfuron típusú herbicidek esetében. Hátránya ennek a stratégiának, hogy a rezisztenciát kiváltó mutációk a gyomokban is kialakulhatnak, tehát a gyomok is rezisztensekké válhatnak. 2. Rezisztencia detoxifikáló génnel A megközelítés lényege, hogy a növényt olyan enzim detoxifikáló génjével transzformáljuk, mely enzim képes hatástalanítani a herbicid hatóanyagát. Ezeket a géneket általában különböző, a herbicidre rezisztens mikroorganizmusokból izolálják. A transzgénikus növény minden sejtje termeli ezt az enzimet. A rezisztencia lényege, hogy a permetezést követően a növény sejtjeibe jutó hatóanyagot a detoxifikáló enzim olyan formává


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták alakítja át, mely már nem tud a megfelelő enzimfehérjéhez kapcsolódni. Tehát a sejt anyagcseréje nem károsodik. A detoxifikálásra alapozott stratégiát sikerrel alkalmazzák a glufonizát és a bromoxinil típusú herbicidek esetében. Előnye ennek a megközelítésnek, hogy a gyakorlatban elvileg nem alakulhat ki rezisztencia. 3. Rezisztencia a génexpresszió javításával Ez a megközelítés jelenleg önmagában nem használatos. Valószínűleg a génműködés regulációjával, illetve a promoterek működésével kapcsolatos ismeretek hiányosságai miatt. Ennek a lehetőségnek létjogosultságát a foszfinotricin rezisztens lucerna sejtek izolálása erősítette meg, miután molekulárisan bizonyították, hogy a reziszencia oka a GS gének amplifikációja következtében, a glutamin-szintáz (GS) túltermelése a sejtekben. Használatos viszont az előbbiekben bemutatott két stratégia során, amikor is mind a mutáns gén, mind a detoxifikáló gén expresszióját stabilan olyan szinten kell tartani, ami garantálja a rezisztenciát többszörös herbicid dózis esetén is. E célból újabb konstitutív promotereket vizsgálnak és alkalmaznak , pl. r-act (rizs aktin1 génjének 5‟ régiója), illetve a CaMV 35S promoter expresszióját különböző technikákkal pl. intronok (Ihsp70) vagy erősítő elemek (E35S) beépítésével fokozzák.

3.1.3. 10.1.3. Glifozát rezisztencia A glifozát (N-foszfonometil-glicin) totális gyomirtószer. Hatóanyaga az aromás aminosavak (fenilalanin, tirozin, triptofán) bioszintézisét állítja le a kloroplasztiszban úgy, hogy gátolja az egyik kulcsenzim, az EPSPszintáz (enolpiruvilsikiminsav-3-foszfát szintáz) működését (10.1/3. ábra). Az EPSP-szintáz (EPSPS) katalizálja az enol-piroszőlősav foszfátból és a sikiminsav-3-foszfátból az 5-enolpiruvil-sikiminsav-3-foszfát kialakulását. Az enzim gátlásának következménye az aromás aminosavak hiánya, illetve a sikiminsav akkummuláció, ami a sejtek halálát eredményezi.

10.1/3. ábra: Az EPSP-szintáz szerepe az aromás aminosavak bioszintézisében (a részleteket lásd a szövegben)


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Az EPSPS a sejtmagban van kódolva, de a kloroplasztiszban működik, ezért az enzim génjében egy 72 aminosavból álló tranzit peptid információja is megtalálható. A tranzit peptid biztosítja az EPSPS célbajuttatását a kloroplasztiszba, ahol proteolitikus hasítást követően alakul ki a 48 kD tömegű aktív enzim. A glifozát nem toxikus az állatokra, és a talaj mikroorganizmusai is gyorsan lebontják. A glifozát rezisztencia az előbbi pontban bemutatott három módon is elérhető. A gyakorlatban alkalmazott géntechnológiai stratégiát jelenleg azonban csak a mutáns EPSPS (mEPSPS) génnel való transzformáció jelenti. A mutáns gént először a Salmonella typhimurium-ból (aroA-gén) izolálták, később azonban az Escherichia coli mutáns aroA génjének használata vált általánossá. A mutáns gén tulajdonképpen egy helyen okoz aminosavcserét az enzimben, a prolin helyett szerin épül be. Kiváló rezisztenciát kaptak, miután a petúniából származó kloroplasztisz tranzit peptid szekvenciáját tartalmazó cDNS-t is beépítették az expressziós vektorba. Az első glifozát rezisztens transzgénikus növény a Monsanto szójája (Roundup Ready szója) volt, mely 1995ben került köztermesztésbe az USA-ban, Kanadában és Nagy Britanniában. Ezt 1996-ban a GM repce (Roundup Ready (RR) repce), majd néhány évvel később a „Roundup Ready‟ kukorica (RR kukorica) és cukorrépa (RR cukorrépa) követte (10.1/4. ábra).

10.1/4. ábra: A glifozát rezisztens Roundup Ready cukorrépa szántóföldi kísérlete. Előtérben a totális gyomirtószer hatása, háttérben a gyomos kontroll (Czepó M. kísérlete, Monsanto Kereskedelmi Kft.) Az RR szója érte el 1998-ban a legnagyobb vetésterületet, 16 millió hektárt a világon. Az USA-ban az RR szója termesztése meghaladta a teljes vetésterület 40%-át, ami rendkívül gyors terjedésre és népszerűségre utal. Az RR kukoricában jelenleg használatos konstrukciókban (expressziós vektor) a mutáns EPSP-szintáz gén (1,34. kb) a kukoricából származik. Az mEPSP és a vad típusú fehérje közötti molekuláris (aminosav sorrend) hasonlóság 99,3% feletti. Az mEPSPS enzim 47,4 kDa tömegű és 445 aminosavból áll. A kloroplasztisz tranzit peptid kódját (0,37 kb) részben napraforgó, részben kukorica (RUBISCO) génekből állították össze. A működést a rizs aktin-1 génjének egy intront tartalmazó promotere biztosítja. Az RR cukorrépa esetében a módosított 35S promoterhez az Arabidopsis EPSPS gén tranzit peptidjének szekvenciáját (0,31 kb) és az Agrobacterium CP4-es törzsének mutáns EPSPS génjét (1,363 kb) kapcsolták.

3.1.4. 10.1.4. Szulfonilurea rezisztencia A szulfonilurea típusú gyomirtószerek hatóanyagai, mint pl. szulfometuronmetil vagy a klórszulfuron, a gabonafélék szelektív gyomirtószerei, de a kukoricában nem alkalmazhatók. A herbicid hatására a nyíltláncú aminosavak (valin, leucin, izoleucin) bioszintézise leáll, az egyik kulcsenzim, az acetolaktát-szintáz (ALS) 265 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták működésének gátlása miatt. Az imidazolinon típusú gyomirtószerek is az ALS gátlásán keresztül fejtik ki hatásukat. Az enzim e kettős hatását lásd az Imidazolinon rezisztencia c. 10.1.5. pontban (10.1/5. ábra).

10.1/5. ábra: Egy enzim kétféle (ALS és AHAS) szerepe a nyíltláncú aminosavak bioszintézisében. A részleteket lásd a szövegben (Lindsey és Jones, 1989 nyomán) Az ALS a sejtmagban van kódolva, de az aminosavak szintézise a kloroplasztiszban történik. Ezért az ALS génjének N-terminális végén a tranzit peptid is kódolva van. A géntechnológia stratégiáját a mutáns génnel való transzformáció jelenti. A mutáns ALS gént sikerrel izolálták mikroorganizmusokból (pl. élesztő) és növényekből (pl. Arabidopsis). A mutáns génnel transzformált dohány 30-szoros herbicid koncentrációt is elviselt károsodás nélkül. A mutánsok molekuláris analízise bizonyította, hogy a tolerancia kialakulásához az ALS-ben meghatározott helyen bekövetkező 1 aminosav cseréje is elegendő. A Du Pont szabadalmában 7 olyan helyet jelöl meg az ALS génben, ahol a triplet megváltoztatásával az aminosavcsere a fehérje meghatározott helyén toleranciát eredményez. A mutáns ALS gén tehát alig különbözik a vad típustól, hiszen aminosavcsere (prolin→szerin) esetében 1 triplet 1 bázisának megváltoztatása is elegendő (CCT–TCT). Természetesen ez azt is jelenti, hogy a gyomokban is viszonylag könnyen bekövetkezhetnek olyan spontán mutációk az ALS génben, melyek rezisztens fenotípust eredményeznek. Gazdasági jelentősége kisebb ezeknek a gyomirtóknak, mert GM fajta nélkül is sikeresen alkalmazhatók pl. a gabonafajokon. A kukorica esetében is csak akkor van jelentősége, ha a kukoricát búza vagy valamilyen kalászos után vetjük, amit szulfonilurea vagy imidazolinon típusú herbiciddel gyomirtottak. Jelenleg már köztermesztésben vannak olyan fajták, melyek szulfonilurea rezisztenciával rendelkeznek (SUMO-fajták). Ezeket azonban sejtszintű szelekcióval állították elő (lásd a 10.1.5. pontban).

3.1.5. 10.1.5. Imidazolinon rezisztencia


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Az imidazolinon típusú gyomirtószerek, mint pl. imazamox, imazetapir vagy az imazapir hatására – a szulfonilurea típusú szerekhez hasonlóan – a valin, leucin és izoleucin aminosavak szintézise leáll az egyik kulcsenzim, a hidroxiecetsav-szintáz (AHAS) gátlása miatt. Az AHAS azonos az ALS-zal, mert ennek az enzimnek kettős funkciója van (10.1/5. ábra). • Az enzim képes katalizálni a piroszőlősavból és acetil-aldehidből az á-acetolaktát (á-keto-izovaleriánsav) kialakulását. Ez az ALS típusú hatás, ezt a funkciót gátolják a szulfonilurea típusú herbicidek. • Az enzim képes továbbá az á-acetil-á-hidroxivajsav kialakulását is katalizálni az á-ketovaj- savból és a piroszőlősavból, mely az AHAS funkciót jelenti. Ezt gátolják az imidazolinon típusú herbicidek. A növények, különösen a merisztéma régiók növekedése az aminosavak hiányában leáll, és először a sejtek pusztulnak el, végül a növény is. A biotechnológia stratégiáját a mutáns gén előállítása jelentette, ezt azonban az American Cyanamid Company nem a mutáns gén géntechnológiai előállításával, hanem a mutáns génekre (sejtekre) történő in vitro szelekcióval érte el. A kukorica szövettenyészeteket imidazolinon herbicidek szubletális dózisát tartalmazó táptalajon tenyésztették mindaddig, amíg túlélő sejteket nem kaptak. Az első ellenálló sejtvonal az XA17 volt, ez azonban csak homozigóta formában mutatott teljes rezisztenciát az imidazolinon típusú gyomirtókkal, és keresztrezisztenciát a szulfonilureákkal szemben. Az XI12 sejtvonal heterozigóta formában is biztosítja a teljes ellenállóságot, de nem ad keresztvédettséget a szulfonilureákkal szemben. A rezisztens sejtvonalakban levő mutáns AHAS (mAHAS) gén – hasonlóan az mALS-hez – végülis a vad típustól egy tripletben különbözik, mely egy aminosavcserét eredményez az AHAS-ban. A rezisztens sejtvonalakból regenerált ellenálló növényekkel visszakeresztezési nemesítési programot indított a Pioneer 1985-ben abból a célból, hogy az imidazolinon gyomirtószerekekkel szembeni rezisztenciát a saját kukorica hibridjeiben is kialakítsa. E program eredményeként hazánkban 1996-ban kapott állami elismerést a „Marista‟ SC-IR (single cross imidazolinol rezisztencia) változata, melyet azóta több IMI-nek nevezett hibrid (Pioneer, Novartis) köztermesztésbe kerülése követett.

3.1.6. 10.1.6. Foszfinotricin rezisztencia A foszfinotricin (PPT) hatóanyagú (hidroxi (metil) foszfinol-DL-homoalanin) gyomirtók totális herbicidek, hasonlóan a glifozáthoz. A foszfinotricin – mint á-glutaminsav analóg – a glutamin szintáz (GS) kompetitív inhibitora a növényi sejtekben. A GS, mint az ammónia asszimiláció kulcsenzimje, fontos szerepet tölt be a növények nitrogén anyagcseréjének szabályozásában. A GS a glutaminsav átalakulását katalizálja glutaminná. A növények pusztulása részben a glutaminsav csoportba tartozó aminosavak hiányával, részben a glutaminszintézis blokkolása miatt felhalmozódó ammónia mérgező hatásával magyarázható. A nyolcvanas évek első felében lucerna szövettenyészetben sikerült toleráns sejteket izolálni, melyekről később bebizonyosodott, hogy rezisztenciájuk a GS gén amplifikációjának következménye. Ezek a sejtek ugyanis olyan mértékben túltermelték a GS-t, hogy az inhibitor jelenlétében is maradt annyi szabad enzimfehérje, amennyi a glutamin szintéziséhez elegendő volt. Ez a megközelítés azonban nem tudott széles körben elterjedni. A gyakorlatban is bevált stratégiát a detoxifikálás jelentette. A 80-as évek második felében sikerült a Streptomyces hygroscopicus-ból izolálni a bar gént. A S. hygroscopicus termeli a bialaphost – egy tripeptid antibiotikumot – mely a PPT-t tartalmazza. A PPT azonban nem károsítja a baktériumot, aminek oka a bar-gén volt. A génről később bebizonyosodott, hogy a foszfinotricin-acetil-transzferáz enzimet (PAT) kódolja, mely a PPT-t inaktiválja úgy, hogy a szabad NH2 csoportját acetilálja. A PAT génnel transzformált kultúrnövények rezisztensekké váltak a PPT-típusú herbicidekkel (Basta, Liberty, Finale, Ignite, stb.) szemben. Ezek hatóanyaga a glufozinát-ammónium (ammónium-DL-homoalanin-4-metilfoszfinát).


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A herbicid rezisztenciát szántóföldi körülmények között tesztelve bebizonyosodott, hogy a GM növények a normál dózis többszörösét is elviselik károsodás nélkül. A minimális PAT expresszió szintje – ami még rezisztenciát vált ki – 0,001% PAT az összfehérje százalékában. A növényekben nem halmozódik fel ammónia, és fenotípusosan sem térnek el a kiinduló egyedektől. Az első glufozinát rezisztens fajta az AgrEvo Liberty Link GM repcéje volt, mely 1996-ban került köztermesztésbe az USA-ban, Kanadában, valamint az Egyesült Királyságban. Azóta számos kultúrfaj glufozinát rezisztens változatát állították elő (pl. kukorica, szója, cukorrépa stb.), melyek szántóföldi vizsgálata folyamatban van (10.1/6. ábra).

10.1/6. ábra: A Liberty Link kukorica gyomirtási kísérlete Glufozináttal (450 g/ha) permetezett rezisztens hibrideket tartalmazó kisparcellák (nyíl), és a hagyományos herbiciddel kezelt parcellák (A, B) a kezelést követő 5. napon. Azonos időpontban kijuttatott Liberty herbicid (sárga nyíl) és a hagyományos gyomirtószer


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták (piros nyíl) herbicid aktivitása (C). A glufozinát totális hatása (D). Liberty vegyszer elsodródása által kiváltott fitotoxikus tünetek a hagyományos kukoricán (nyíl) (E) (Jekkel Zs. és Farády L. kísérlete, AgrEvo, Budapest) Ezekbe a GM fajtákba már a bakteriális eredetű PAT gén szintetikusan előállított változatát építették be. A legfontosabb módosítás, amit a génen végeztek, a viszonylag nagy G:C arány csökkentése volt, a növényi génekre jellemző szintre. A szintetikus gén kódsorrendje a Streptomyces viridochromogenes PAT enzimje aminosavsorrendjén alapul. A vad és szintetikus gének (551 bp) 70% homológiát mutatnak. A Liberty Link kukorica, cukorrépa és kukorica fajták stabil rezisztenciát mutatnak az AgrEvo (AVENTIS) glufozinát típusú herbicidjével szemben (pl. Hoechst glufozinát-ammónium).

3.1.7. 10.1.7. Bromoxinil rezisztencia A bromoxinil (bx) hatóanyaga a 3,5-dibromo-4-hidroxi-benzonitril, mely a növényekben gátolja a fotoszintézist. A talajban gyorsan lebomlik. Géntechnológiai stratégiája a detoxifikálásra alapul. A Klebsiella ozaenae talajlakó baktériumból 1987-ben sikerült klónozni a bxn-gént, mely egy nitrilázt kódol. A bromoxinilspecifikus nitriláz (bxn) a bromoxinilt inaktív formává alakítja át (3,5-dibromo-4-hidroxi-benzoesav). Az első géntechnológiával előállított bx-rezisztens növény a GM gyapot (Calgene) volt, mely 1995-ben került köztermesztésbe az USA-ban. Azóta sikerrel építették be a gént részben konstitutív, részben fényspecifikus promoterrel dohányba, paradicsomba, repcébe, sárgarépába, herefélékbe és tojásgyümölcsbe.

3.1.8. 10.1.8. Atrazin rezisztencia Az atrazin típusú herbicidek (atrazin, simazin stb.) a kloroplasztisz tilakoid membránjához kapcsolódva gátolják az elektrontranszportot a fotoszintézis II. rendszerben. A fogékony növényekben a kinon/plasztokinon oxidoreduktáz aktivitása gátlódik. A herbicid a membrán 324 Da-os fehérjéjéhez kapcsolódik, melyet a psbA gén kódol. A gén szekvenciája erősen konzervált. A természetben előforduló atrazin rezisztencia a kloroplasztisz genomban bekövetkező mutáció eredménye, ezért extrakromoszómálisan, anyai úton öröklődik. Molekuláris analízis bizonyította, hogy a psbA gén által kódolt 324 Da-os fehérjében egy aminosavcsere (szerin-glicin) – a 264-es pozícióban – elegendő a tilakoid membránhoz való kötődés csökkenéséhez. A rezisztencia kialakítása biotechnológiai módszerekre alapulhat, egyrészt protoplasztfúziós eljárásokra, másrészt a géntechnológiára. A protoplaszt rendszerrel lehetséges a cibridizáció, azaz a rezisztens gyomok kloroplasztiszainak bevitele kultúrnövényekbe, sőt a rezisztens és szenzitív kloroplasztisz populációk cseréje (pl. Brassica fajok között). Lehetőség kínálkozik továbbá az atrazin rezisztens sejtszintű szelekcióra is. A rezisztens sejtekből rezisztens növények regenerálhatók, illetve a rezisztens kloroplasztiszok protoplasztfúzióval átvihetők más fajokba (pl. Nicotiana fajok között). Használható stratégiát jelent az a rendszer, melyben a mutáns génnel, mely a kloroplasztisz tranzit peptid kódját is tartalmazza, a sejtmagot transzformáljuk. A génexpresszió, és ezzel a szintetizálódó mutáns 324 Da-os fehérje megfelelő termelése fényspecifikus promoterrel biztosítható, a mutáns fehérjét pedig a tranzit peptid juttatja célba. E megközelítéssel sikerült az Amaranthus hybridus módosított psbA génjét dohányba átvinni. A transzgénikus dohány a citoplazmában termelte a mutáns fehérjét, mely a kloroplasztiszban is kimutatható volt. Ennek megfelelően a növények atrazin rezisztensek voltak. A siker ellenére ilyen típusú GM növények még nincsenek a köztermesztésben. Az atrazin rezisztencia kialakításának másik géntechnológiai lehetősége a detoxifikálás. Ismert, hogy a glutation képes módosítani a triazin herbicidet, melyben a főszerep a glutation-S-transzferázé. A gén klónozása folyamatban van. Összefoglalva, a géntechnológia az elmúlt 10 évben szintáttörést jelentő eredményeket ért el a herbicidrezisztencia kialakításában és annak gyakorlati alkalmazásában. A szóbajöhető stratégiák közül a mutáns génekre és a hatóanyag semlegesítésére irányuló megközelítések váltak be (10.1/1. táblázat). Ezek sikere a jövőben jelentősen kibővítheti a herbicidként szóbajöhető vegyszerek körét, hiszen elvileg minden molekula, ami képes elpusztítani az anyagcsere gátlásával a növényi sejtet, potenciális herbiciddé válik akkor, ha annak hatását egy mutáns fehérjével vagy kémiai módosítással meg tudjuk szüntetni, és ez a molekula nem káros más prokarióta és eukarióta sejtekre.



A herbicidrezisztens transzgénikus növényeket több tízmillió hektáron termesztik problémamentesen. A transzgénikus herbicidrezisztencia gazdasági jelentőségét az adja, hogy totális gyomirtószerek is szelektívvé tehetők, azonban a rezisztencia nem faj, hanem fajtaspecifikus, ami lehetővé teszi a gyomirtószer és a vetőmag kapcsolt áruként való értékesítését. Lehetővé teszi a herbicid alkalmazását minden kultúrfaj esetében, tehát azoknál is, melyek esetében a vegyszeres gyomirtás még nem volt általános. Az imidazolinon- és szulfonilurea-rezisztens fajták szövettenyésztéssel, mutáns (rezisztens) sejtek in vitro szelekciójával is előállíthatók. Elképzelhető, hogy a zöld és környezetvédő mozgalmak aktív tevékenysége a jövőben előtérbe fogja állítani ezt a ,,környezetbarát” megközelítést a glifozát és a glufozinát hatóanyagok esetében is.

3.2. 10.2. Szárazság és ozmotikus stresszrezisztencia a transzformáns növényekben A Föld élelmiszertermelő-képességét már jelenleg is, de a jövőben még fokozottabb mértékben a növénytermesztés számára hozzáférhető víz mennyisége határozza meg. A klímaváltozás, az erdők kipusztítása felgyorsítja az elsivatagosodást, hosszantartó aszályok tragikus helyzetet teremthetnek a világ legkülönbözőbb részein. Az átmeneti vízhiány is jelentős terméskiesést okozhat. A növények károsodása és felépülése 1–2 hetes száraz periódus után közvetlenül függ a genotípusok stressztűrőképességétől. A kevés víz mellett a sóstressz tovább növeli a problémákat. A természetes védekezési mechanizmusok hatékonyságának növelése, jobb alkalmazkodóképességet biztosító, új molekuláris folyamatok kialakítása a károsodás mérsékléséhez vezethet. Az extrém vízhiányt elviselni képes fajták előállításán túl fontos növénynemesítői feladat a vízhasznosítás optimalizálása. Olyan fajtákra van szükség, amelyek kevesebb vizet használnak egységnyi termés létrehozásához. A szárazságtűrés igen összetett biológiai folyamat, amelyet a növény morfológiai tulajdonságai (gyökérzet mérete, levél szerkezete) mellett az agrotechnikai beavatkozások közvetlenül befolyásolnak. A vízhiány vagy ozmotikus stressz által aktivált jelátviteli hálózatok vagy a védekezési mechanizmusok molekuláris hátterének feltárása segíthet a stresszadaptáció mikéntjének megismerésében és a metabolikus folyamatok optimalizálásában új gének beépítésével vagy regulátor elemek működtetésével. A vízhiány okozta növényi válaszreakciók a stressz érzékelésével kezdődnek, ezután a szignálátviteli rendszer aktivációja génexpressziós változásokat eredményez, fehérjék szintetizálódnak. A vízstressz érinti a sejteket, az élettani és fejlődési folyamatokat. A válasz mikéntje függ a stressz erősségétől, tartamától, a növény genotípusától, fejlődési stádiumától. A sejtszintű víz-hiányt kiválthatja szárazság, sóhatás vagy akár alacsony hőmérséklet. A génexpressziós változások követése, a stesszgének azonosítása igen fontos lépés, ugyanakkor nem szükségszerű, hogy egy stresszaktivált gén illetve annak terméke egyben a károsodás mérséklésében


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták felhasználható legyen. Számos stressz esetén, így vízhiánykor is kitüntetett szerepe van az abszcizinsavnak (ABA) és az általa aktivált jelátviteli folyamatoknak, valamint géneknek. A vízhiány körülményei között nagyszámú gén működésbe lépése szolgálja a védekezési folyamatok beindítását. BRAY (1993) nyomán a 10.2/1. ábra bemutat néhány kulcsfontosságú védekezési fehérjét, funkciót. Ezek felhasználásával számos géntechnológiai stratégia kísérletes kipróbálására került sor (NUCCIO és mtsai, 1999).

10.2/1. ábra: A vízhiány állapotában aktivált gének termékei, amelyek hozzásegíthetik a sejteket az ozmotikus állapot és az élettani funkciók megőrzéséhez (Bray, 1993 nyomán)

3.2.1. 10.2.1. A sejtstruktúra megőrzését szolgáló fehérjék Az ún. LEA (LATE EMBRYOGENESIS ABUNDANT) fehérjék, mint késői fejlődési stádiumú embriókban nagy mennyiségben előforduló fehérjék génjeiről kiderült, hogy vízstressz esetén a vegetatív növényi szövetekben is működnek. Különböző típusai közül a 3. és 5. csoport fehérjéire egy jellegzetes aminosavmotívum (TAQAAKEKAGE) ismétlődése jellemző, és a kialakuló fehérjeszerkezet ionok megkötését teszi lehetővé. Ebbe a csoportba tartozik az árpa aleuron rétegében felhalmozódó HVA1 fehérje. A gén aktív a vízvesztés stádiumában lévő embrióban, de csíranövényben ABA-kezelés, sóstressz és dehidratáció hatására is működésbe lép. Ezt az árpagént (cDNS) aktin promoterrel építették be rizsbe és vizsgálták a növények stressztoleranciáját (XU és mtsai 1996). A mért növekedési paraméterek (levélnövekedési ráta, növénymagasság, gyökérsúly) alapján a transzformánsok megnövekedett tűrőképességet mutattak. A vízstressz során a növényeket kétszer 5 napig 10%-os víztartalmú talajban növesztették. A sókezeléskor a tenyészedényeket 200 mM NaCl-oldatba helyezték 10 napig. A hervadás, idős levelek elsárgulása, nekrotikus elhalások a fiatal leveleken, mint a károsodás tünetei, később jelentek meg a transzformánsokon. A LEA fehérjék egy másik csoportjába a vízkötési képességgel rendelkező fehérjék tartoznak. Ezek a polipeptidek töltéssel rendelkező aminosavakban és glicinben gazdagok. Más LEA fehérjék képesek a membránban a vizet helyettesíteni és így biztosítják annak szerkezetét. Talán külön figyelmet érdemelnek az aquaporinok, vízcsatorna-fehérjék. A hat membránban elhelyezkedő régióval rendelkező fehérjék nagy hatékonysággal és szelektivitással képesek vizet transzportálni. A növényi aquaporin gének működését hormonok (ABA, gibberellin), kék fény, vízstressz vagy patogénfertőzés befolyásolhatja. Az Arabidopsis RD28 gén aktiválódik vízvesztés hatására. Az aquaporinok fiziológiai szerepére rámutat az egyik plazmamembránfehérjét kódoló gén (PIP1b) antiszensz változatát hordozó Arabidopsis transzformánsok vizsgálata (Kaldenhoff és mtsai 1998). A transzformánsokban a mRNS-szint kisebb (20–60%) volt a kontrollnövényekéhez viszonyítva. Ennek megfelelően a fehérjemennyiség lecsökkent, következésképpen a transzformáns növények protoplasztjai kisebb vízpermeabilitást mutattak. Hipotónikus oldatban lassabban duzzadtak és később estek


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták szét. Érdekes megfigyelés, hogy a transzformánsok gyökérzete ötször nagyobb volt, míg a zöld részek tömege nem különbözött a kontrollnövényekkel összehasonlítva.

3.2.2. 10.2.2. Ozmotikus védelmet biztosító vegyületek (ozmolitok) szintetizáltatása Vízhiány esetén a sejtek víztartalmának elvesztésével csökken az ozmotikus érték, ami lehetővé teszi a vízfelvételt. Ezt a folyamatot segíthetik elő az ozmolitok, melyek elsődleges feladata a turgor fenntartása, de védhetik a makromolekulákat is a dehidratálódó sejtekben. Bizonyos növényekben az ozmolitok szintézise részét képezi a természetes védekezési folyamatoknak. A géntechnológia kiterjeszti az ilyen funkcióval rendelkező növények körét és ozmolitokra alapozott stresszellenállóságot alakít ki a gazdasági növényekben. A fontosabb tanulmányozott ozmolitok a következők: Prolin

10.2/2. ábra: A prolin-bioszintézis kulcslépései növényekben Ozmotikus stresszkörülmények között a prolin szerepe sokoldalú lehet. Funkcionálhat mint ozmoregulátor, a sejten belüli struktúrák stabilizátora, szabadgyök-fogó, energiatároló vagy akár stressz-szignál. A 10.2/2. ábrán látható, hogy a prolin glutaminsavból két intermedieren keresztül szintetizálódik. Mind a Ä1-pirrolin-5karboxilát-szintáz (P5CS), mind a reduktáz enzimek (P5CR) génjeit klónozták már növényekből. Az is elfogadott, hogy a P5CS enzim meghatározó faktor a prolin bioszintézisében. Arabidopsis növényekben szárazság-, magas só- és alacsony hőmérsékleti stressz hatására a P5CS gén aktiválódik, amit prolinfelhalmozódás követ. A prolin többirányú hatását tekintve kézenfekvő, hogy a P5CS gén túltermeltetéséből valamint a prolinszint emelésétől megnövekedett stresszrezisztenciát várjunk. Akishar és mtsai (1995) egy Vigna P5CS gént expresszáltattak dohánynövényben, amelyben 10-18-szor több prolin halmozódott fel a stressz előtt. Vízhiány esetén a különbség csak kétszeres volt. A transzformánsok két-három nappal később hervadtak. Sótűrésük 0,4 M NaCl adásakor kifejeződött a nagyobb gyökér- és hajtástömegben. Bár ezt a közleményt többen kritizálták, a legújabb P5CS antiszensz Arabidopsis növényekkel végzett kísérletek azt mutatták, hogy a prolinszint csökkentése fokozta a stresszérzékenységet. Glicin-betain



10.2/3. ábra: A glicin-betain szintézise növényekben és prokariótákban Kivételes növényekben, mint a spenót és a cukorrépa, ozmotikus stresszkörülmények között kolinból glicinbetain (GB) szintetizálódik a kloroplasztiszokban (10.2/3. ábra). Több géntechnológiai próbálkozás is történt a GB-ra épülő védekezési mechanizmus kialakítására más növényfajokban is. A E. coli-ból származó kolindehidrogenáz mindkét enzimatikus reakcióra képes, így a bakteriális gén beépítése növényekbe lehetőséget adott a koncepció ellenőrzésére. A transzformáns dohányok 0,3 M NaCl-ot tartalmazó táptalajon csökkent károsodást mutattak a kontrollnövényekhez viszonyítva. Egy másik prokarióta gén, az Arthrobacter génből származó codA (kolin-oxidáz) gén kifejeztetése szintén sótűrést eredményezett. A tolerancia kifejezettebb volt Arabidopsis, mint rizsnövény esetében. Egy új anyagcsereút kialakításakor tekintetbe kell venni, hogy a működési feltételek biztosítottak-e. A lehetséges korlátokra utal, hogy míg a transzgénikus növényekben kevés GB mutatható ki friss súly grammonként, addig a GB mennyisége 10–100-szor nagyobb a természetes védekezéssel rendelkező növényekben. A kolinszint lehet meghatározó tényező. Trehalóz A nem redukáló diszaharid trehalóz (T) kiszáradáskori védelmet nyújt mikrobiális (élesztő) és állati sejteknek, de ritkán fordul elő növényekben. in vitro a T hatékonyan tud stabilizálni fehérjéket és lipid-membránokat vízmentes körülmények között. Az első transzformációs kísérletekben élesztő terhalóz-6-foszfát-szintáz gént építettek be dohánynövényekbe. A kis mennyiségben szintetizálódott T (kevesebb, mint 5 mM) elegendő volt ahhoz, hogy a levágott levelek vízvesztése lelassuljon, a rehidratáció után a transzformánsok képesek legyenek a turgort visszanyerni és tovább növekedni. Ebben a kísérletben a RUBISCO kis alegység gén promoterével fejeztették ki az élesztő gént. Egy másik laboratórium a CaMV35S promotert használta ezzel a génnel. Az így nyert dohány transzformánsok súlyos növekedési zavarokat mutattak, csökkent a növények cukortartalma, bár a szárazságtolerancia kimutatható volt. Ezek a példák felhívják a figyelmet arra, hogy a génbeépítési technológiák nem várt hatásúak is lehetnek. Mannitol, szorbitol • A cukoralkohol-szintézist célzó géntechnológiai kísérletek szintén nem várt problémákat hoztak a felszínre. A bakteriális mannitol-1-foszfát-dehidrogenáz (mtlD) gén beépítése dohányba növekedésgátláshoz vezetett. A kis mennyiségben képződő mannitol hatását nem mint ozmolit fejti ki, hanem más indirekt úton javíthatja a transzformáns sejtek ozmotikus alkalmazkodóképességét. Ezt a feltételezést megerősíti az a megfigyelés, hogy a kloroplasztiszban szintetizáltatott mtlD enzim oxidatívstressz-rezisztenciát (paraquat) biztosított a dohány transzformánsoknak. Megnőtt ugyanis a kloroplasztiszok hidroxilgyök-befogó (OH) képessége. A szorbitolt szintetizáló transzformánsok nekrótikus töneteket és növekedési rendellenességeket mutattak.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A bemutatott kísérleti eredmények alátámasztják az ozmolitokra alapozott megközelítések létjogosultságát, ugyanakkor felhívják a figyelmet, hogy nem várt anyagcsere és növekedési hatások alakulhatnak ki. Ezeknek a vegyületeknek a szintetizáltatását nem célszerű az erős, konstitutív promoterekkel szabályozni. Indokolatlan a növényeket terhelni nem stresszelt állapotban. Stresszaktivált promoterek használata finom szabályozást és hatékony védelmet biztosít.

3.2.3. 10.2.3. Károsító molekulák hatástalanítását biztosító mechanizmusok

10.2/5. ábra: A lucerna aldóz/aldehidreduktáz cDNS-t kifejező transzformáns növények (1/1, 1/5, 1/9) magjai csírázni képesek toxikus koncentrációjú NaCl jelenlétében (Oberschall Attila és mtsai, 1999) Elégtelen vízellátás körülményei között a sejtek makromolekulái degradálódnak és toxikus anyagcseretermékek tovább fokozhatják a károsodást. A fehérjék lebomlását biztosító proteázok aktívak a vízstressznek kitett növényekben. A lipidek anyagcseretermékei közül a lipid-aldehidek toxikusak a sejtekre. Többek között a hidroxinonenal (HN) képződése jelentősen fokozhatja a sejtkárosodást. Így azok az enzimek, anyagcsereutak, amelyek kiküszöbölik a toxikus termékeket, alapot adhatnak az ellenállóság javításához. Példaként az 10.2/4. ábra bemutatja, hogy az aldóz/aldehid-reduktázok képesek a toxikus lipid-aldehideket lipid-alkoholokká alakítani és így hatástalanítani pl. a hidroxinonenált. Aldóz-reduktázt kódoló géneket több növényből, mint árpa, Bromus, lucerna, is izoláltak. A stresszválaszban betöltött szerepükre utal, hogy ozmotikus vagy ABA-kezelésre megnő az aldóz-reduktáz mRNS mennyisége a növényi sejtekben, szövetekben. Egy, a lucernából származó aldóz-reduktáz cDNS-t konstitutív virális promoterrel kifejeztetve dohánynövényekben jelentős stresszrezisztenciát lehetett kialakítani. A 10.2/5. képen látható, hogy sóoldattal (250 mM NaCl) kiváltott ozmotikus stressz esetén a transzformánsok kevésbé károsodnak. Ha növényeket 35 napig öntözés nélkül neveljük üvegházban, akkor a kontroll dohányok már elvesztik fotoszintetikus funkcióikat, elpusztulnak. Ezzel szemben az aldóz-reduktázt túltermelő transzformánsok a súlyos vízhiány ellenére képesek fotoszintézisre. Víz újraadását követően visszanyerik leveleik a turgort és jelentős mértékben felépülnek (10.2/6. ábra). Figyelmet érdemel, hogy az aldóz-reduktáz transzformánsok nemcsak szárazság és ozmotikus stresszrezisztenciával rendelkeznek, de képesek jelentős UV-B károsodást is kompenzálni. Kimutatható, hogy stresszkörülmények között alacsonyabb a toxikus aldehidek mennyisége a transzformánsokban. Ez egy olyan géntechnológiai példa, amely a növények természetes védekezési mechanizmusát használja fel. A kialakított detoxifikáló folyamatok sokféle károsodás esetén biztosíthatnak védelmet a transzgénikus növények számára. 274 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


10.2/6. ábra: A lucerna aldóz-reduktáz fehérjét termelő transzformánsok hosszantartó vízhiány után is regenerálódni képesek Az SR1 kontrollnövények és a nem expresszáló transzformánsok (1/4, 1/7) olyan súlyosan károsodnak a 35 napos vízhiány alatt, hogy nem képesek helyreállítódni. Az aldóz-reduktáz enzimet szintetizáló transzformánsok (1/1, 1/5, 1/9) újraöntözés után képesek a fontosabb funkciójukat helyreállítani. A) A növények állapota 35 napos öntözés nélküli periódus után. B) A növények állapota újraöntözést követően. C) Az aldóz-reduktáz fehérje mennyiségének kimutatása immunológiai módszerrel (Oberschall és mtsai, 1999)

3.2.4. 10.2.4. A vízhiányt kísérő jelátviteli és génexpressziós szabályozás: az abszcizinsav szerepe



10.2/7. ábra: A Ca2+, a fehérje foszforiláció és az abszcizinsav jelközvetítő szerepe a vízhiány okozta károk kivédését szolgáló védekezési mechanizmusok aktiválásában (Shinozaki és Yamaguchi- Shinozaki, 1997 nyomán) A vízvesztéshez, dehidratációhoz történő alkalmazkodás lehetőségeinek megteremtésében központi szerepe van a sejtek transzkripciós átprogramozásának. Mint a 10.2/7. ábra szemlélteti, a vízhiányt és a magas sókoncentrációt a sejtek érzékelik, hiszen megváltoznak az ozmotikus viszonyok. Oxigén-szabadgyökök képződése mellett a citoplazma szabad Ca2+-szintje hirtelen megemelkedik. Ennek a jelnek a továbbításában a Ca2+ függő fehérjefoszforilációs folyamatok vesznek részt. A kinázok oldaláról a Ca2+ függő, kalmodulin független ún. CDPK fehérjék szerepét igazolják a kísérletek. Korábban említettük az árpa stresszaktivált génjét (HVA1), melynek promoterét a zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) összekapcsolva a fluoreszcencia alapján követhető a promoter működése. Ha ezt a riportergén-konstrukciót tranziens kísérletben kotranszformálják az Arabidopsis CDPK1 cDNS és CaMV35S promotert hordozó plazmiddal, akkor megfigyelhető a stresszérzékeny promoter aktiválódása. Így megállapítható, hogy a CDPK1 fehérje pozitív hatású szabályozó a stresszjelátvitelben. A foszfatázok szerepét transzgénikus növények előállításával lehetett bemutatni (PARDO és mtsai, 1998). Élesztőben a calcineurin, mint PP2B típusú foszfatáz, szerepet játszik a Na +-tolerancia kialakításában. A Ca2+ illetve kalmodulin függő enzimaktivitáshoz egy katalitikus (CNA) és egy szabályozó (CNB) alegység komplexe szükséges. Na+-tolerancia kialakításához mindkét polipeptid kell úgy, hogy a CNA alegységről hiányzik a kalmodulin-kötő és egy gátló régió. CaMV35S promoterrel kifejeztetett élesztő gének konstitutív calcineurin-szintézist biztosítottak a transzformáns dohánynövényekben. Vízkultúrában nevelve a növényeket, 200 mM NaCl 7 napig tartó adása után a transzgénikus növények jelentős sótűrést mutattak. A foszfatáz folyamatos szintézise láthatóan nem befolyásolta a növények növekedését és fejlődését. Oltási kísérletek alapján megállapítható, hogy a calcineurin főként a gyökérrendszer rezisztenciáját eredményezte.



10.2/8. ábra: A szárazság-, só- illetve hidegstressz ellen négy parallel jelátviteli úton, különböző transzkripciós faktorok és fehérjekötő DNS cisz régiók közvetítésével léphetnek működésbe a védekezéshez szükséges gének (Shinozaki és Yamaguchi- Shinozaki, 1997 nyomán) SHINOZAKI és SHINOZAKI (1997) modellje szerint (10.2/8. ábra) a dehidratáció által indukált gének legalább négy független szignálátviteli utat követve aktiválódhatnak a stresszelt növényekben. Az egyik ABA függő jelátvitelhez fehérjefaktorok szintézise szükséges. Így pl. a szárazságra bekapcsolódó rd22 gén promoterében több MYC és MYB DNS-kötő fehérjefelismerő szekvenciarégió található. Maga a transzkripciós faktor (MYC-homológ, rd22BP1) génje is víz- és sóstressz-aktivációt mutat. Az ABA függő gének másik csoportjánál (búza Em vagy rizs Rab gének) a promoter részben az ún. ABRE (ABA RESPONSIVE ELEMENT) PyACGTGGC szekvencia található. Ezekről a génekről a transzkripció leucinzipzár-motívumot tartalmazó fehérjék kapcsolódásával indul el. Az ABA független szignálátviteli folyamatok részleges átfedést mutatnak a szárazság és hidegstressz esetében működő szabályozási mechanizmusokkal. Az rd29A gén, amely vízhiányra és alacsony hőmérséklet hatására egyaránt bekapcsol, promoterében az ún. DRE (DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT) motívum (TACCGACAT) található. A DRE régióhoz kötődő transzkripciós faktorok (DREB1A és DREB2A) cDNS-ét szintén izolálták. Így lehetővé vált annak kísérletes vizsgálata, hogy a DREB1A fehérje konstitutív túltermeltetése milyen hatással van a stresszgének működésére, a rezisztencia kialakulására (KASUGA és mtsai, 1999, 10.2/9. ábra). A DREB1A cDNS-t kétféle promoterrel működtették Arabidopsis transzformánsokban. A virális CaMV35S promoter a faktor folyamatos túltermeltetését biztosította, míg a stresszaktivált gén (rd29A) promotere csak stresszkörülmények között tette lehetővé a regulátorfehérje szintézisét. Mindkét vektorkonstrukciót hordozó transzformánsok szárazság-, só- és hidegellenállóságot mutattak. Fontos eredménye ennek a kísérletnek az a megfigyelés, hogy a DREB1A fehérjét folyamatosan túltermelő transzformánsokon komoly növekedési zavar jelentkezett, ugyanakkor a stresszfüggő szintézis nem okozott fenotípusos változást. Ez a példa is megerősíti, hogy a transzgének kifejeztetésének finom szabályozottsága mennyire kívánatos.



10.2/9. ábra: Stresszpromoterrel (DRE) túltermeltetett transzkripciós faktor (DREB1A) biztosítja védekezési gének (cor, rd, kin) aktív működését, amivel növelhető a transzformáns növények szárazság- és sótűrése (Smirnoff és Brayant, 1999 nyomán)

3.3. 10.3. Szélsőséges hőmérsékleti viszonyokat tűrő transzgénikus növények Szántóföldi körülmények között a különböző stresszfaktorok egyidejűleg károsíthatják termesztett növényeinket. A szárazság gyakran párosul magas hőmérséklettel. Hősokk (minimum 10 °C-kal magasabb hőmérséklet, mint a növény optimális növekedési hőmérséklete) hatására a sejtek membránjának jelentősen megnő a fluiditása, megbomlik a molekulák rendje. A membrán fizikai állapotának megváltozását érzékelik a sejtek és különböző védekezési mechanizmusokat aktiválnak (lásd összefogaló: VÍGH és mtsai 1998). Így a hősokkfehérjék (HEAT SHOCK PROTEINS, HSPs) génjei bekapcsolódnak, és az ún. chaperone-molekulák védelmet nyújtanak a fehérjék és membránok struktúrájának és funkciójának megőrzéséhez. A növények esetében is több tagot magukba foglaló hősokkfehérje-családok ismerhetők fel a szekvenciák és funkciók összehasonlításakor. Bizonyos hősokkfehérjéknek kiemelt jelentősége lehet a termotolerancia kialakítása szempontjából. A HSP70 fehérje kölcsönhatásban a HSP fehérjék génjeinek működését szabályzó transzkripciós faktorral (HSF) negatív regulátora a hősokkválasznak. Ezért tanulságos eredményekhez vezetett olyan Arabidopsis transzformánsok vizsgálata, amelyekbe dohány HSP70 gén fordított, antiszensz orientációban került beépítésre egy hősokk-promoterrel összekapcsolva (LEE és SHÖFFL 1996). A kiválasztott antiszensz növényekben a HSP70 mRNS szintje igen alacsony volt és hősokk hatására teljesen eltűnt, annak ellenére, hogy a hősokk-promoter működésének megnövekedését várhatnánk. Az antiszensz növények túlélési hőmérséklete 2 °C-szal csökkent a kontrollnövényekhez viszonyítva, ha a hősokkot egy enyhébb hőkezelés előzte meg. Ez a transzformációs kísérlet nem igazán támasztja alá a HSP70 dereguláló szerepét és jól szemlélteti a rendszer bonyolultságát. Szükség van az alapvető molekuláris folyamatok feltárására, amihez a transzgénikus növények egyedülálló lehetőséget biztosítanak. Élesztőben van rá példa, hogy egyetlen hősokkfehérje (HSP104) túltermeltetése elegendő a hőtűrés kialakítására. Ugyanakkor az is feltételezhető, hogy több HSP koordináltan szabályozott szintetizáltatása nyújthat védelmet. Ennek elérésében egy lehetséges megközelítés a hősokk transzkripciós faktor (HSF) fehérje túltermeltetése.



10.2/10. ábra: A hősokk transzkripciós faktor (HSF9 egybeépítése a β-glukuronidáz riportergénnel Így olyan fehérjeszerkezet alakult ki, amely érzéketlenséget biztosított a normális hőmérsékleti viszonyok között érvényesülő gátlásokkal szemben. Ennek következtében a HSF-komplex állandóan egy fokozott (20%-kal növelt) hősokkfehérje-szintézist eredményezett a transzformánsokban. Ennek hatására javult az alap hőmérsékleti tolerancia ezekben a növényekben (Lee és mtsai, 1995) A hősokkfehérjék génjeinek promoterében egy erősen konzervált szekvenciamotívum, a hősokkelem (HSE): CAAGGACTTTCTC GAA ACTAC található. A hozzá kapcsolódó transzkripciós faktor (HSF) bár konstitutív módon szintetizálódik a sejtekben, a DNS-kötő képességét a hőstressz során nyeri el, amikor három HSF összekapcsolódik és ún. trimer-t képez (10.2/10. ábra). Önmagában a HSF-t kifejező transzformánsokban nem alakult ki a DNS-kötő képesség, és így nem módosult a hősokkválasz. Lee és mtsai (1995) meglepő megoldásként az Arabidopsis HSF1 GUS fúziós fehérjét szintetizáltatták a kiméragénnel. A fúziós termék képes volt trimerképzésre és DNS-kötő képességgel bírt. Feltételezhető, hogy a trimer kialakulását gátló faktor a GUSfehérje miatt nem tudja funkcióját ellátni. Ennek megfelelően a transzformánsokban a hősokkfehérjék konstitutív módon szintetizálódtak szobahőmérsékleten. Egy kis hősokkfehérje, a HSP18 körülbelül 20%-nyi mennyiségben keletkezett normál hőmérsékleti viszonyok mellett a hősokk alatti fehérjeszinthez viszonyítva. Az transzformánsok alaphőtűrése jelentősen javult, ami azt jelentette, hogy képesek voltak ezek a növények 1 órás 50 °C-os hőkezelést túlélni. A kontrollnövények elpusztultak a 46 °C-os stressz alatt. A szerzők értékelték a növények ún. szerzett hőtűrését is. Ilyenkor egy gyenge hőstresszt (35 °C, 2 óra) alkalmaznak, ezután emelik meg lényegesen a hőmérsékletet. Mind a kontroll-, mind a transzformáns növények 54 °C-ig túléltek, de 56 °Con elpusztultak. Így megállapítható, hogy ez a molekuláris megközelítés az alap-termotoleranciát fokozta. A génizolálási programok során kiderült, hogy az Arabidopsisban legalább három hősokk transzkripciós faktor van (HSF1, 3, 4). A két új cDNS-t felhasználva transzformánsokat állítottak elő GUS-fúzióval illetve a faktorfehérjét magában kifejeztetve. A HSF3 transzformánsok mindkét kombinációban a HSP gének aktivációját mutatták normál hőmérsékleten és ezzel együtt 2–3 °C-kal megnőtt az alap-termotoleranciájuk. A HSF4 transzformánsok a kontrollnövényekkel azonos reakciókat mutattak. A kísérletek meggyőzően szemléltetik, hogy mennyire eltérő hatásokhoz vezethet a különböző génvariánsok felhasználása. Itt meg kell említeni, hogy a korábban bemutatott géntechnológiai megoldások némelyike szintén alkalmazható a hőstressz esetében. Így pl. a glicin-betaint termelő Arabidopsis transzformánsok jelentős termotolerancával rendelkeztek. 279 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A magok csírázását és a növények növekedését kisebb mértékben gátolta a magas hőmérséklet (ALIA és mtsai 1998). Az időjárás szeszélyeinek kitett növényeknek nemcsak a magas hőmérsékleti periódusokat kell túlélniük, hanem alkalmazkodniuk kell a 0–15 °C-os alacsony hőmérséklethez illetve a 0 °C alatti fagyhatáshoz. A fagytűrő fajok esetében is az ún. hidegakklimatizálódás folyamán alakul ki a védekezési képesség. Az alacsonyhőmérsékleti stressz egyik azonnali érzékelői és az alkalmazkodás fontos résztvevői a sejtmembránok. A hőmérséklet csökkenésével megnő a membránlipidekben a telítetlen, kettős kötésű zsírsavak mennyisége. Ez teszi lehetővé a sejtfunkciókat biztosító membránfluiditás megőrzését. A többszörösen telítetlen zsírsavak, mint 18:3 linolénsav, felhalmozódása jellemzi a hidegadaptálódott növényeket, illetve a kettős kötések kialakulását biztosító deszaturázokat érintő Arabidopsis mutációk (fad2, fad5, fad6) alacsonyhőmérsékleti érzékenységet eredményeztek fiatal leveleken. A fad7 mutáció következtében csökkent a hármas kötésű zsírsavak mennyisége. Megklónozva a mutációt helyreállító kloroplaszt Ù-3-zsírsav-deszaturázt, lehetővé vált túltermelő transzformánsok előállítása (KOMADA és mtsai 1994). A kloroplasztisz fad7 gént a virális CaMV35S promoterrel építették be dohánynövényekbe. A deszaturáz gén hatására körülbelül 10%-kal növekedett a hármas kötésű zsírsavak mennyisége levelekben. Ez a változás elegendő volt ahhoz, hogy a transzformánsok levelei jobban növekedjenek 25 °C-on, miután a csíranövényeket 7 napig 1 °C-on nevelték. A transzformánsokon kisebb mértékben jelentek meg klorotikus tünetek. Egy későbbi kísérletben egy cianobaktériumból származó 9deszaturázt szintetizáltak a dohánynövények kloroplasztiszában. A zsírsav telítettség jelentősen csökkent a főbb membránlipidekben és ezzel összefüggésben megnőtt az alacsonyhőmérsékleti tolerancia a transzformánsokban. Hasonlóan a vízstresszhez, az alacsonyhőmérsékleti válasz is különböző szignálátvivő mechanizmusok, mint a Ca2+-közvetített jelek vagy fehérjefoszforiláció közvetítésével jelentős génexpressziós változásokat okoz a növényi sejtekben. Mára már igen nagyszámú alacsony hőmérsékletre aktiválódó ún. COR (COLD REGULATED) gén került izolálásra (lásd összefoglaló THOMASHOW 1998). Ezek egy részét a dehidratáció, az ozmotikus stressz vagy az ABA szintén szabályozza. Természetesen a különböző mutánsok is segíthetnek a molekuláris hőmérséklet-adaptáció megismerésében. Érdekes pl. az Arabidopsis eskimo1 mutáns, amely hidegadaptáció nélkül folyamatos fagyásrezisztenciát mutat (XIN és BROWSE 1998). Akklimatizáció nélkül a mutáns túlél –8 °C-ot. A hidegtűrési fenotípus mögött prolinfelhalmozás áll. Az egyik fagytűrési Arabidopsis gén (COR15a) egy kloroplasztiszban lévő 9,4 KDa polipeptidet kódol. Ezt a gént a virális CaMV35S promoter és a kloroplasztisz lokalizációs szekvenciával összekapcsolva Arabidopsis transzformánsokat állítottak elő (Artus és mtsai 1996). A COR15a gén termékét szintetizáló növényeknek 2 °C-szal javult a fagyástoleranciájuk. A fagyás-ellenállóság megnyilvánult a levél eredetű protoplasztokon és kloroplasztiszokon, amelyek –5 és – 8 °Cközött fagytak meg. Ugyanakkor transzformáns protoplasztok nem mutattak jobb túlélést hidegkezelés után. A feltételezés az, hogy a COR15a gén terméke a kettős lipidréteggel lép kölcsönhatásba és megakadályozza membránhiányosságok kialakulását. A növények hidegadaptációja során a COR gének egész csoportja lép koordináltan működésbe. Ezt a szabályozottságot a gének promoterében megtalálható cisz regulátor, az ún. CRT/DRE elem (C REPEAT/DEHYDRATION RESPONSIVE ELEMENT) biztosítja. A CCGAC motívum mind az alacsonyhőmérsékleti, mind a szárazságstresszben szerepet játszik. Az ehhez a DNS-régióhoz kötődő transzkripciós faktor (CBF1: CRT/DRE BINDING FACTOR) génjét is sikerült megklónozni. Ez lehetővé tette a szokásos funkcionális vizsgálatot a gént konstitutívan kifejező transzformánsok előállításával (JANGOOTTOSEN és mtsai 1998), 10.2/9. ábra. A transzformánsokban több COR gén is működött akklimatizáció nélkül is. A CBF1 gén működése jelentős fagytoleranciát eredményezett. A transzgénikus Arabidopsis növények túlélték a 2 napig tartó –5 °C-os kezelést. Fagypont alatti hőmérsékleten a jégképzés jelentős mértékben hozzájárul a sejtek károsításához. Az élőlények sora, mint pl. halak, rovarok, ún. fagyás elleni fehérjék (ANTIFREEZE PROTEINS, AFPs) szintézisével védekeznek. Ezek a kisméretű (3–5 KDa) fehérjék alaninban gazdagok, a képződő jégkristályra tapadnak, mérséklik annak növekedését. Lecsökkentik azt a hőmérsékletet, amelyen a kristályképződés megindul. WALLIS és mtsai (1997) Északi-tengeri hal AFP fehérjéjének aminosav-sorrendje (az érett polipeptid 37 aminosavból épül fel) alapján megszintetizálták úgy a gént, hogy figyelembe vették a növényi kódhasználatot. A szintetikus gént virális CaMV35S promoterrel transzformálták burgonyába. A transzformáns és kontrollnövényeket –2,0–4,0 °C-os fagyásnak kitéve az elektrolit-kiáramlást mérték. A –2,5 és –3 °C-os hőmérsékleti tartományban a transzformánsok megnövekedett fagytűrést mutattak. Természetesen ennek a géntechnológiai megközelítésnek akkor lesz agronómiai jelentősége, ha szabadföldi körülmények között is jobbnak bizonyulnak a transzformánsok. A kukoricával végzett hazai kísérletekben azt tapasztaltuk, hogy az AFP jelenléte zavart okozhat a kallusztenyészetek növényregenerációs képességében. Új kutatási területet jelent a növényekben megtalálható AFP jellemzése és biotechnológiai felhasználása.



3.4. 10.4. A reaktív oxigéngyökök károsító hatását mérséklő anyagcsere-folyamatok

10.4/1. ábra: Az aszkorbátglutation ciklus fontosabb összetevői, amelyek számos sejtvédekező mechanizmusban meghatározó szerepet játszanak A hidrogén-peroxid (H2O2) hatástalanításában az aszkorbát-peroxidáz (APX) kiemelt jelentőségű (Noctor és Foyer, 1998 nyomán) glutation-reduktáz aszkorbát-reduktáz dehidro-aszkorbát glutation (redukált forma) oxidált glutation aszkorbát monodehidroaszkorbát szuperoxid-dizmutáz elektronátvitel az oxigénre • Az előzőekben több példát láthattunk arra, hogy akár biotikus stressztényezők (vírus-, baktérium-, gombafertőzés), akár az abiotikus stresszfaktorok (szárazság, só, szélsőséges hőmérséklet, UV-B sugárzás) hatására reaktív oxigéngyökök (ROS), mint szuperoxid (O -), hidrogén-peroxid (H2O2), hidroxil (OH) képződése indul meg a növényi sejtekben. Ezek a folyamatok integráns részét képezik a védekezési reakcióknak, beleértve a kapcsolódó szignálátviteli folyamatok elindítását. A ROS képződésében illetve hatástalanításában résztvevő komponenseket egy korábbi ábra (9.2/4.) bemutatta. Az alábbi 10.4/1. ábra az antioxidáns-rendszerek többi résztvevőjét és kapcsolatukat tünteti fel. A szuperoxid-dizmutáz (SOD) fehérjecsalád tagjai a hidrogén-peroxid (H2O2) képződését katalizálják. A Cu/ZnSOD enzimek a kloroplasztiszban és a citoplazmában, a Fe/SOD a kloroplasztiszban, míg a Mn/SOD enzimek a mitokondriumban fejtik ki hatásukat. A nukleárisan kódolt SOD gének transzkripciója jelentősen fokozódik szárazság-, ozmotikus és alacsonyhőmérsékleti stressz hatására. Tekintettel a SOD enzimek kulcsszerepére, 281 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták több laboratóriumban is előállítottak túltermelő transzformáns növényeket. Az oxidatív stresszel szembeni ellenállóság ugyan változott az egyes kísérletekben, de többségükben a hatás megbízható volt. Az oxidatív gyökök képződését a paraquat gyomirtószer hatóanyagával, a metil-viologénnel (MV) történő kezeléssel biztosították. A mitokondriális MnSOD kifejeztetése dohány kloroplasztiszban MV-toleranciához vezetett. Ezt a konstrukciót lucernába építve a fagytűrés fokozását tapasztalták. Más laboratóriumok a kloroplasztisz Cu/ZnSOD enzimet termeltették túl kloroplasztiszban. A transzformáns dohányok jelentős rezisztenciát mutattak MV-kezeléskor vagy nagy intenzitású megvilágítás okozta fénygátlás esetén. A transzformánsokkal végzett kísérletek értékelése során több általános érvényű következtetés vonható le (Slootem és mtsai 1995): • a MnSOD-túltermeltetés a transzformánsokban elnyomja a saját SOD-aktivitások kifejeződését • az MV-rezisztencia nagy fényintenzitás körülményei között mutatható ki • valószínűsíthető, hogy további antioxidánsok, mint aszkorbát-peroxidáz, dehidroaszkorbát-reduktáz, monodehidroaszkorbát-reduktáz, megnövekedett aktivitása is szükséges az MV-tolerancia létrejöttéhez McKERSIE és mtsai (1996) a dohány MnSOD cDNS-t kloroplasztisz tranzitpeptiddel történt összekapcsolás után a virális CaMV35S promoterrel fejeztették ki lucerna transzformánsokban. A megnövekedett enzimaktivitású növények 9 napig öntözés nélkül nevelve jobban bírták a kedvezőtlen körülményt. Különösen figyelemre méltó az a megfigyelés, hogy 3 éves szabadföldi kísérletben a transzformánsok jelentősen több növénytömeget produkáltak. A stressz hatására keletkező H2O2 hatástalanításában a kataláz (CAT) és aszkorbát-peroxidáz (APX) enzimeknek van kitüntetett szerepe. A különböző kataláz gének és enzim izoformák funkcionális vizsgálatához jól használhatók a transzgénikus növények. Így pl. szensz-antiszensz konstrukciók felhasználásával hiányos dohánynövényeket lehetett előállítani (CHAMNONGPOL és mtsai, 1996). Alacsony fényintenzitás mellett a növények nem mutattak fenotípusos változást. Erős fényben ezeken a transzformánsokon súlyos nekrotikus tünetek jelentek meg, és a PR1 gén aktiválódott patogén hiányában. A katalázok szerepe a patogénválaszban összefüggésbe hozható azzal, hogy bizonyos izoformák, pl. dohány Cat2Nt, gátolhatók szalicilsavval, mint szignálvegyülettel. Ezzel szemben a burgonyahomológ Cat25b nem képes szalicilsavat kötni. Ha a dohány Cat2Nt cDNS-t burgonya transzformánsokba építették, akkor patogénrezisztenciát tapasztaltak (YU et al. 1999). A géntechnológiai megközelítések közül talán érdemes megemlíteni SHIKANAI és mtsai (1998) kísérletét. A szerzők az E. coli catE génjét fejeztették ki dohány kloroplasztiszokban. Ez a bakteriális kataláz nagyobb H 2O2affinitású, mint a növényi kataláz. A fény függő RUBISCO kis alegység promoterét használták az idegen gén működtetéséhez. A transzformánsok a paraquat-tolerancián túl rezisztensek voltak szárazságstressz körülményei között. Ezek a vizsgálatok átvezetnek a másik oxigéngyök-hatástalanító enzimhez az aszkorbát-peroxidázhoz (APX). Mint az 10.4/1. ábrán látható, az APX a H2O2 lebontásához aszkorbátot használ mint elektrondonort. Az oxidált aszkorbát aszkorbáttá alakítását a mono-dehidroaszkorbát-reduktáz (MDHAR) és a glutation-reduktáz (GR) végzik. Éppen SHIKONAI és mtsai megfigyelése, hogy az APX-aktivitás a kloroplasztiszban szárazságstressz hatására gátlódik, teszi kérdésessé ennek az enzimnek a géntechnológiai használhatóságát stresszrezisztencia kialakítására. A redukált glutation (GSH) képes reakcióba lépni szinglet oxigénnel, hidroxilgyökkel és védelmet nyújt az enzimek tiol csoportjának. A glutation-S-transzferáz (GST) enzim közreműködésével detoxifikáló szerepet játszik a sejtekben. A GST-szintézis aktiválódik a stressz- és hormonhatások következtében. Egy, a dohányból izolált GST cDNS a virális CaMV35S promoterrel összeépítve megnövekedett GST aktivitást eredményezett transzformáns növényekben. Alacsonyhőmérsékleti és sóstressz körülmények között a GST-t túltermelő növények csökkent növekedésgátlást mutattak a kontroll dohányokhoz viszonyítva (ROXAS és mtsai, 1997). Felhasznált és ajánlott irodalom ALIA, HAYASHI, H., SAKAMOTO, A., MURATA, N. (1998): Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine. Plant J., 16, 155–161. ARTUS, N. N., UEMURA, M., STEPONKUS, P. L., GILMOUR, S. J., LIN, C., THOMASHOW, M. F. (1996): Constitutive expression of the cold-regulated Arabidopsis thalianaCOR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13404–13409. BRAY, E. A. (1993): Molecular responses to water deficit. Plant Physiology, 103, 1035–1040.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták CHAMNONGPOL, S., WILLEKENS, H., LANGEBARTELS, C., VAN MONTAGU, M., INZÉ, D., VAN CAMP, W. (1996): Transgenic tobacco with reduced catalase activitiy develops necrotic lesions and induces pathogenesis-related expression under high-light. Plant J., 10, 491–503. Freyssinet, G., D. J. Cole (1999): Herbicid tolerance in crops: a commercial reality. In: Altman A., M. Ziv, S.Izhar (eds.): Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21 st Century. 481–486. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht–Boston–London. JAGLO–OTTOSEN, K. R., GILMOUR, S. J., ZARKA, D. G., SCHABENBERGER, O., THOMASHOW, M. F. (1998): Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science, 280, 104–106. JEKKEL ZS., FARÁDI L. (1999): Vetőmagba csomagolt glufozinát rezisztencia: a Liberty Link. Növényvédelmi Tanácsok, 8, 23–24. KALDENHOFF, R., GROTE, K., ZHU, J. J., ZIMMERMANN, U. (1998): Significance of plasmalemma aquaporins for water-transport in Arabidopsis thaliana. Plant J., 14, 121–128. KASUGA, M., LIU, Q., MIURA, S., YAMAGUCHI–SHINOZAKI, K., SHINOZAKI K. (1999): Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotechnology, 17, 287–291. KAVI KISHOR, P. B., HONG, Z., MIAO, G-H., HU, C-A. A., VERMA, D. P. S. (1995): Overexpression of a 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase increase proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol., 108, 1387–1394. KOMADA, H., HAMADA, T., HORIGUCHI, G., NISHIMURA, M., IBA, K. (1994): Genetic enhancement of cold tolerance by expression of a gene for chloroplast -3 fatty acid deasaturase in transgenic tobacco. Plant Physiol., 105, 601–605. LEE, J. H., HUBEL, A., SCHOFFL, F. (1995): Derepression of the activity of genetically engineered heat shock factor causes constitutive synthesis of heat shock proteins and increased thermotolerance in transgenic Arabidopsis. Plant J., 8, 603–612. LINDSEY, K., JONES, M. G. K. (1989): Plant Biotechnolgy in Agriculture. Open University Press, Milton Keynes, pp. 230. Oxtoby, E., M. A. Huges (1989): Breeding for herbicide resistance using molecular and cellular techniques. Euphytica, 40, 173–180. LEE, J. H., SCHOFFL, F. (1996): An Hsp70 antisense gene affects the expression of HSP70/HSC70, the regulation of HSF, and the acquisition of thermotolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet., 252, 11–19. McKERSIE, B. D., BOWLEY, S. R., HARJANTO, E., LEPRINCE, O. (1996): Water-deficit tolerance and field performance of transgenic alfalfa overexpression superoxide dismutase. Plant Physiol., 111, 1177–1181. NOCTOR, G., FOYER C. H. (1998): Ascorbate and glutathione. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 49, 249–279. NUCCIO, M. L., RHODES, D., McNEIL, S. D., HANSON, A. D. (1999): Metabolic engineering of plants for osmotic stress resistance. Current Opinion in Plant Biology, 2, 128–134. OBERSCHALL, A., DEÁK, M., TÖRÖK, K., SASS, L., VASS, I., KOVÁCS, I., FEHÉR, A., DUDITS, D., HORVÁTH, V. G. (2000): Protective function of a novel aldose/aldehyde reductase against oxidative damage under chemical and drought stresses in transgenic plants. The Plant J., 24, 437–446. PARDO, J.M., REDDY, M.P., YANG, S., MAGGIO, A., HUH, G. H., MATSUMOTO, T., COCA, M. A., PAINO-D‟URZO, M., KOIWA, H., YUN, D. J., WATAD, A. A., BRESSAN, R. A., HASEGAWA, P. M. (1998): Stress signaling through Ca2+/calmodulin-dependent protein phosphatase calcineurin mediates salt adaptation in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95.,9681–9686.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták ROXAS, V. P., SMITH, R. K. Jr., ALLEN, E. R., ALLEN, R. D. (1997): Overexpression of glutathione Stransferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress. Nature Biotechnology, 15, 988–991. Salamini, F., M. Motto (1993): The role of gene technology in plant breeding in: Hayward, M. D., N.O. Bosemark, I.Romagosa (eds.): Plant Breeding Principles and Prospects, 138–159. Chapman and Hall, London SHIKANAI, T., TAKEDA, T., YAMAUCHI, H., SANO, S., TOMIZAWA, K-I., YOKOTA, A., SHIGEOKA, S. (1998): Inhibition of ascorbate peroxidase under oxidative stress in tobacco having bacterial catalase in chloroplasts. FEBS Lett., 428, 47–51. SHINOZAKI K., YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. (1997): Gene expression and signal transduction in waterstress response. Plant Physiology, 115, 327–334. SLOOTEN, L., CAPIAU, K., VAN CAMP, W., VAN MONTAGU, M.–SYBESMA, C., INZÉ, D. (1995): Factors affecting the enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco overexpressing manganese superoxide dismutase in chloroplasts. Plant Physiol., 107, 737–750. SMIRNOFF, N., BRYANT, J. A. (1999): DREB takes the stress out of growing up. Nature Biotechnology, 17, 229–230. THOMASHOW, M. F. (1998 ): Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiology, 118, 1–8. VIGH, L., MARESCA, B., HARWOOD, J. L. (1998) Does the membrane‟s physical state control the expression of heat shock and other genes? Trends Biochem. Sci., 23, 369–374. WALLIS, J.G., WANG, H., GUERRA, D. J. (1997): Expression of a synthetic antifreeze protein in potato reduces electrolyte release at freezing temperatures. Plant Mol. Biol., 35, 323–330. XIN, Z., BROWSE, J. (1998 ): Eskimo1 mutants of Arabidopsis are constitutively freezing-tolerant. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 7799–7804. XU, D., DUAN, X., WANG, B., HONG, B., HO, T-H. D., WU, R. (1996): Expression of a late embryogenesis abundant protein gene HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice. Plant Physiol., 110, 249–257. YU, D., XIE, Z., CHEN, C., FAN, B., CHEN, Z. (1999): Expression of tobacco class II catalase gene activates the endogenous homologous gene and is associated with disease resistance in transgenic potato plants. Plant Mol. Biol., 39, 477–488.

4. 11. Anyagcseréjükben módosított transzgénikus növények 4.1. 11.1. A fehérje és aminosav anyagcsere módosítása A növényi géntechnológia egyik fő iránya az emberek és a tenyésztett állatok számára még táplálóbb élelmiszerek, takarmányok előállítása. A növények tápértékét – a szénhidrátokon, olajokon és zsírokon kívül, melyek módosítását külön fejezetekben tárgyaljuk – elsősorban a raktározott fehérjék mennyisége, de főleg minősége, azaz aminosav összetétele határozza meg. Ennek megfelelően a géntechnológiai módosítások alapvető célja – közvetlenül vagy közvetve – kedvezőbb aminosav arányok kialakítása a GM növények raktározott fehérjéiben, illetve táplálékként szolgáló szerveiben, szöveteiben. A géntechnológiai megközelítések lehetőségeit az alábbiak jelentik: 1. Új fehérje termeltetése; 2. Fehérje túltermeltetése; 3. Módosított fehérje termeltetése;


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 4. Fehérjetermelés gátlása; 5. Aminosav/ak túltermeltetése. A növények képesek a fehérjéket felépítő 20-féle természetes aminosavat előállítani szervetlen tápanyagokból. Az ember és az állatok, a fehérjék felépítéséhez szükséges 20 aminosav közül 10-et képtelenek szintetizálni. Ezeket az ún. esszenciális aminosavakat tehát az élelmiszerekben és takarmányokban kell biztosítani. Nem elég azonban pótolni a hiányzó aminosavakat, hanem az aminosavaknak kiegyensúlyozott arányát kell biztosítani a táplálékban. Ennek oka az, hogy amennyiben fehérjeszintézis közben a sejtekben egy aminosav nem áll rendelkezésre, a fehérjeszintézis leáll és a szintetizálódó fehérjék lebomlanak, majd kiürülnek a szervezetből. Ez utóbbi szempontból a növények nem tekinthetők optimális tápanyag forrásoknak, mert például a gabonafélék magvai általában lizinben, a pillangósok magvai viszont metioninban és ciszteinben szegények. A vegetáriánusok esetében ez krónikusan hiányos tápanyagellátást eredményezhet. A hagyományos növénynemesítés régóta foglalkozik az aminosavtartalom módosításával, főleg mutánsok (pl. opaque2, floury2 kukorica) felhasználásával, azonban általánosan alkalmazható eredményeket nem tudott felmutatni. A növényi géntechnológia célja ezekben az esetekben a limitáló aminosavak arányának növelése a GM növényekben. Ez a cél kétféle megközelítéssel érhető el: a/ az aminosavak bioszintézisének módosításával, illetve aa/ limitáló aminosavakban gazdag új fehérjék termeltetésével vagy túltermeltetésével.

4.1.1. 11.1.1. Az aminosav bioszintézis módosítása A pillangós növények magvai lizinben gazdagok és ezért alkalmasak a gabonafélékből (kukorica, búza, rizs stb.) készült élelmiszerek és takarmányok lizin hiányának pótlására, azonban szegények metioninban és ciszteinben. A metionin azért is nagyon fontos aminosav, mert a sejtek képesek átalakításával az összes kéntartalmú aminosavat előállítani. A cisztein viszont nem konvertálható. Végeredményben a legfontosabb feladat a pillangós növények (borsó, bab, szója stb.) metionin tartalmának javítása. A metionin az aszparaginsav-családba tartozó aminosav, melybe további esszenciális aminosavak is tartoznak, úgymint a lizin, a treonin és az izoleucin. Bioszintézisük a citrát-ciklus (Szent-Györgyi–Krebs-ciklus) egyik intermedierjéből, az oxálecetsavból transzaminálással keletkező aszparaginsavból indul ki. A szintézis kulcslépéseit az aszparaginsav-kináz (AK) és a dihidropikolinát-szintáz (DHPS) jelentik. Az enzimek aktivitása feedback szabályozással történik, a DHPS esetében lizinnel, az AK két izoenzimje esetében pedig lizinnel és treoninnal (11/1. ábra).



11/1. ábra: Az aszparaginsav családba tartozó aminosavak bioszintézisének főbb lépései, valamint a géntechnológia kulcsenzimjei és azok feedback gátlása A szaggatott nyilak azt jelentik, hogy a szintézis több lépésből áll és abban több enzim vesz részt. Részleteket lásd a szövegben (Karchi, és mtsai, 1993. Plant J., 3, 721–727 alapján) A genetikai módosítás mindkét enzim esetében a feedback szenzitivitás megszüntetésére irányult. A klónozott inszenzitív (E.coli eredetű) AK és DHPS génekkel konstitutív, illetve szervspecifikus promoterhez kapcsolva transzformált növényekben a transzgének együtt és külön-külön is jelentősen növelték a szabad lizin tartalmat. Magspecifikus promoterhez kapcsolt inszenzitív gének a repce és szója magvakban 100%-kal emelték a szabad lizin mennyiségét. Ez a teljes magra vonatkoztatva is 25–100%-os lizin növekedést jelent. Abban az esetben, amikor csak inszenzitív AK-val transzformálták a dohányt, a magvakban 17-szeresére növekedett a szabad treonin tartalom és 3-szorosára a metionin tartalom. A fehérjékhez kötött aminosavak aránya egyáltalán nem változott a treonin esetében és alig növekedett a metionin esetében. Végeredményben a teljes magra számított treonin szint 6,5%-kal, a metionin tartalom 6,8%-kal növekedett.

4.1.2. 11.1.2. Metioninban gazdag fehérjék termeltetése Az állatok metionin igénye 1,6–1,9 g 100 g-1 fehérje. A hüvelyes növények metionin tartalma viszont 0,8 g (borsó), 0,6 g (csillagfürt), 1,2 g (szója) 100 g -1 fehérje. Az élelmiszer és takarmánynövények metionin tartalmának növelése tehát elsőrendű feladat.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták E cél elérése érdekében kidolgozott géntechnológiai stratégiák magukba foglalják a) metionin szegény növényi raktározott fehérjék génjeinek molekuláris módosítását, aa) metioninban gazdag fehérjék génjeinek felhasználását, valamint aaa) metioninban gazdag fehérjék (szintetikus gének) előállítását, mint alternatív megközelítési lehetőségeket. 1. Metioninban szegény fehérjék génjeinek módosítása A bab (Phaseolus vulgaris), fazeolin génjébe a kukoricaszem 15 kDa-os zein raktározott fehérjének metioninban gazdag régióját (45 bp) építették be. A metioninban gazdag fazeolin génnel transzformált dohányban a transzgén expressziója elérte az eredeti fazeolin génét. Ennek ellenére a módosított fehérje felhalmozódása a magban nagyon csekély volt. Ez a fejlődő magban a metioninban gazdag fazeolin fehérje instabilitásával magyarázható. A dohányon kívül más fajok raktározó fehérjéinek génjeit is megpróbálták metioninban gazdag szekvenciák beépítésével módosítani úgy, hogy a kódolt fehérje aminosavainak legalább 2%-a metionin legyen. Ez a módosítás viszont nem teszi lehetővé annak a gyakorlati célnak az elérését, mely a metionin szintet a magfehérje 1,6%-a fölé kívánja emelni. Ez csak a módosított fehérje irreális mértékű expresszáltatásával lenne elérhető, tehát ez a megközelítés ebben a stádiumban még az alkalmazhatóság szempontjából eredménytelennek tekinthető. 2. Mesterséges fehérjék termeltetése sszintetikus génnel A laboratóriumban megtervezett fehérjék nagy mennyiségben tartalmazhatnak lizint, triptofánt és metionint. A transzgénikus dohányba épített szintetikus génről szintetizálódott mesterséges fehérje megfelelően expresszálódott és stabil volt. A magfehérje metionin tartalmát 20%-kal növelte. Hasonló eredményeket értek el batátával (édes burgonya, Ipomoea batatas). Az esszenciális aminosavak aránya szignifikánsan növekedett a raktározó szervekben. Érdekes megfigyelés volt, hogy az összfehérje tartalom szignifikánsan nőtt a levelekben és a gyökerekben is. A GM batáta jelenleg szántóföldi kipróbálás alatt van, további vizsgálatokat igényel viszont az új mesterséges fehérje emészthetőségének és tényleges tápértékének meghatározása. Mindenesetre ez a megközelítés már sikerrel kecsegtet és különös jelentőségre tehet szert a fejlődő országok legfontosabb élelmiszer növényei – általában gyenge tápértékének – javításában. Ennek gazdasági és társadalmi következményei szinte beláthatatlanok. 3. Metioninban gazdag fehérjék termeltetése természetes génekkel Néhány növényfaj fehérjéje kiugróan nagy metionin tartalommal rendelkezik. A metionin mennyiségét g 100g -1 egységben kifejezve, az átlagos 0,6–1,2 g értékhez képest a kukorica 21 kDa-os zein 37 g, a brazil dió 2S albumin (BNA 2S) 23 g, a napraforgómag albumin (SSA) 20 g metionint tartalmaz. Hasonló metionin tartalommal rendelkezik még a rizs 10 kDa-os prolamin és a kukorica 10 kDa-os zein fehérjéje is. Ezeknek a fehérjéknek klónozott génjeivel az egyszikűek közül a kukoricát, a kétszikűek közül a szóját, a repcét, a burgonyát és főleg egyes hüvelyes növényfajokat transzformálták. a) A 10 kDa-os zein gén transzformációjával próbálták a kukoricaszem metionin tartalmát növelni. A magfehérje 0,9%-át érte el a metionin tartalom a transzgénikus növényekben, ami 30%-os növekedést jelentett. b) A BNA 2S-t kódoló génnel transzformálták a repcét. A géntechnológiai módosítást – a többi fajtól eltérően – nem a kéntartalmú aminosavak alacsony szintje indokolta, hanem az, hogy a takarmánykeverékekben a szója hiányosságai a javított GM repcével pótolhatók legyenek. A GM repcében a BNA 2S tartalom elérte a magfehérje 4%-át, ami a metionin tartalom 33%-os növekedését jelentette. A BNA 2S génnel transzformált szójában az expressziót a bab fazeolin promoter biztosította. A transzgénikus szójában a BNA 2S tartalom elérte az összes magfehérje 10%-át, ami a metionin tartalom 50%-os növekedését eredményezte. Végülis a transzgénikus szója metionin tartalma súlyszázalékban elérte az 1,8%-ot, ami önmagában is elegendő az állatok optimális növekedéséhez. A BNA 2S-t nagy mennyiségben termelő GM szója vonalakban viszont egyes fehérjék mennyiségének csökkenését is megfigyelték. A transzgénikus Vicia narbonensis-ben a BNA gént a lóbab legumin génjének promotere szabályozta. A BNA 2S tartalom elérte a magfehérje 4,8%-át, ami az eredeti genotípushoz képest a mag metionin tartalmának 100%os növekedését jelenti.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A BNA 2S felhasználását korlátozza, hogy emberen kimutatták annak allergén hatását. Természetesen ez az allergén jelleg a transzgénikus növények által termelt fehérjére is vonatkozik. Nyilvánvaló, hogy a BNA 2S-t termelő GM-növények emberi fogyasztásra korlátozott mértékben, illetve csak az állatok takarmányozására használhatók fel. c) Az SSA (sunflower seed albumin) génnel való transzformáció esetében ilyen problémák nem merültek fel. A GM feketebükköny (Vicia angustifolia) magjában az SSA tartalom elérte az oldható fehérjék 5%-át, ami a V. narbonensis-hez hasonlóan 100%-os metionin tartalom növekedést jelentett. Az állatetetési kísérletekben (birka) a GM bükköny mag biológiai értéke 15%-kal növekedett, ami azt jelenti, hogy a takarmányfehérje átalakulása állati fehérjévé ennyivel javult. A GM bükkönyt szántóföldi kísérletekben is kipróbálták, és jelenleg Ausztráliában kereskedelmi bevezetése is várható. Különös jelentőséget ad az SSA-t – mint kéntartalmú aminosavakban gazdag fehérjét – termelő bükkönynek az, hogy egyrészt az összetett gyomrú állatok emésztőrendszerében ellenáll a lebomlásnak, másrészt javíthatja a gyapjútermelést. Az utóbbi oka az, hogy a gyapjúrost fehérjék ciszteinben gazdagok, ami miatt a gyapjútermelés ,,hajtóanyagainak” a kéntartalmú aminosavak tekinthetők. Nyugat-Ausztráliában, ahol legelőhiány van a bükkönyfélék fontos takarmányt jelentenek a juhtenyésztésben. Újabban már a rét és a legelő különböző fű és pillangós fajaiba juttatták be az SSA gént, melyek közül a legbiztatóbb eredményeket a Trifolium subterraneum mutatja. Természetesen ezekben a megközelítésekben már más, főként a vegetatív szervekben expresszálódó promotereket használnak. A GM T. subterraneum leveleiben az SSA felhalmozódás elérte az összes levélfehérje 0,75%-át.

4.1.3. 11.1.3. A búzaliszt minőségének javítása A búza az egyik legrégebbi kultúrnövényünk, melyet jelenlegi változatában (Triticum aestivum) körülbelül 9000 éve termesztenek. Napjainkban a legszélesebb körben termesztett növény a világon. A búzaszem szárazanyag tartalmának 10%-a fehérje, melynek legnagyobb része az endospermiumban prolaminok formájában raktározódik. A prolaminoknak a búza esetében – tápértékük mellett – funkcionális szerepük is van. A prolaminok egyik fajtájának, a glutenineknek van egy speciális tulajdonsága, mely nem jellemző a többi gabonafaj raktározott fehérjéire. Ez adja meg a lehetőségét annak a sokféle terméknek, melyek a búzalisztből készíthetők. 1. A sikér szerkezete és funkciója (11/2. ábra)



11/2. ábra: A búzaszem raktározott fehérjéi és a sikérminőség javításának molekuláris stratégiái 11/3. ábra: A keményítő bioszintézis fő lépései Rövidítések: ATP adenozin trifoszfát; ADP adenozin difoszfát; UTP uridin trifoszfát; UDP uridin difoszfát; PP szervetlen pirofoszfát, számok: 1 ADP-glükóz pirofoszforiláz; 2 oldható keményítő szintáz; 3 szemcséhez kötött keményítő szintáz; 4 elágazási enzim; 5 UDPglükóz- pirofoszforiláz; 6 szacharóz-6-foszfát szintáz; 7 szacharóz-6-foszfát-foszfatáz; 8 invertáz; 9 szacharóz szintáz; 10 UDP-glükóz pirofoszforiláz; 11 hexokináz; 12 hexóz-6-foszfatáz; 13 glükóz-foszfát-mutáz. A szaggatott nyilak azt jelzik, hogy a szintézis több lépésből áll és abban több enzim vesz részt (Kleczkowski L. A. 1996. Trends in Plant Sci. 1, 363–364; Visser R. G. F., Jacobsen E.: 1993. TIBTECH 11, 63–68 alapján) A búzaszem raktározott fehérjéinek körülbelül 50%-át alkotó sikér prolaminokbók áll, amelyek tulajdonképpen a keményítőszemcséket veszik körül, először különálló fehérjék, később összefüggő mátrix formában. Jelentőségük a tésztakészítéskor van, amikor víz hatására a sikérfehérjék térhálós szerkezetet alkotnak. A búzaliszt és a belőle készült kenyér minőségét e fehérjeháló viszkozitása és rugalmassága határozza meg. A rugalmasságot és viszkozitást pedig a háló szerkezete, tehát azt alkotó fehérjék arányai és kölcsönhatásai befolyásolják. A sikér 70–80%-át adják a prolaminok, melyeknek több mint 50 fajtája ismert. Két fő csoportba oszthatók, a gliadinokra és a gluteninekre.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A gliadinok monomer molekulák (30 000–75 000 kDa), melyek több osztályba (á, ã és ù gliadinok) sorolhatók. A fehérjeláncok között nem alakul ki diszulfid kötés és nem tartalmaznak ciszteint. A gliadinok a sikér viszkozitását (nyúlósságát) adják és a sikér 75%-át alkotják. A gluteninek rendkívül polimorf szerkezetet mutatnak a láncok között kialakuló diszulfid kötések miatt. Emellett a glutenin polimerek a természetben előforduló legnagyobb fehérjemolekulákat is jelentik, Mr értékük (monomerek száma) meghaladhatja a 10 milliót. A gluteninek a sikér 25%-át alkotják és annak rugalmasságát biztosítják. A jó kenyér elkészítéséhez nagyon rugalmas sikér kell, mely képes visszatartani a kelesztés során képződött CO2-ot. A rugalmasságot biztosító gluteninek két csoportba sorolhatók: kis molekulatömegű glutenin alegységekre (LMW-GS, low-molecular-weight glutenin subunits) és nagy molekulatömegű glutenin alegységekre (HMW-GS, high-molecular-weight glutenin subunits). A nagy molekulatömegű HMW gluteninek (65000–90000 kDa) mennyisége a magfehérjék 5–10%-a. A HMW glutenin alegységeket kódoló gének száma 3–6. A legtöbb fajtában ezekből csak 3–4 működik. Egy alegységet 1 gén kódol. A géntermékek között különböző allélváltozatok fordulnak elő, melyek elektroforetikus mobilitásuk és izoelektromos pontjuk alapján különbözethetők meg, mint pl. a nagy (x-típus) és kis (y-típus) molekulatömegű formák. 2. HMW-GS mennyiségének növelése Bebizonyosodott, hogy a nagy molekulatömegű géntermékek (pl. 1A kromoszóma x-típusú génje által kódolt alegység) és a minőség közötti kapcsolat mennyiségi eredetű. Ezekben az esetekben a géntechnológia stratégiája az, hogy a gének számának növelésével és a gének fokozott expresszáltatásával az alegység fehérjét túltermeltessük, és ezzel a sikér minőségét javítsuk. A nagy molekulatömegű alegység génjeivel (1Ax1, Dy10, Dx5) végzett transzformációt követően a GM-búzában a HMW alegységek aránya növekedett. Más alegységek génjei esetében ez a mennyiségi kapcsolat nem volt kimutatható. Ezekben az esetekben az alegységek szerkezete az, ami a minőséget befolyásolja. 3. HMW-GS minőségének módosítása A HMW alegységek átlagosan 627–827 aminosavból állnak és szerkezetük hasonló. A fehérje három részből áll, a kisebb N-terminális (88–104 aminosav, ezek közül 3–5 cisztein) és C-terminális (42 aminosav, ezek közül 1 cisztein) egység között egy nagyméretű (481–690 aminosav, ezek közül 0–1 cisztein), rövid ismétlődő peptid szekvenciákat tartalmazó egység helyezkedik el. A molekula belső nagy egysége spirális szerkezetű, és sok glutamint tartalmaz. A ciszteineknek a fehérjeláncok közötti keresztkötések, a glutaminoknak pedig a hidrogénhidak kialakításában lehet szerepe. Valószínűleg ezek mennyisége határozza meg a sikér rugalmasságát. Abból a célból, hogy a géntechnológia a minőség vonatkozásában is racionális stratégiát dolgozzon ki, részletesebben kellene ismerni a glutenin alegységek centrális részének spirális szerkezete, és a sikér minősége közötti összefüggéseket. Választ kellene kapni arra is, hogy milyen mértékben befolyásolja a sikér minőségét a keresztkötések helye és száma. Nagy valószínűséggel szintetikusan előállított ,,mutáns” génekkel, megtervezett mesterséges HMW alegységekkel lehet majd választ kapni ezekre a kérdésekre. HMW glutenin génekkel és módosított változataival sikeresen transzformálták a búzát. Napjainkig azonban stabil és érdemi változást a sikér minőségében még nem sikerült elérni.

4.2. 11.2. A szénhidrát anyagcsere módosítása A növényekben a szénhidrátoknak két nagy csoportja van: a nagy molekulasúlyú glükánok, mint pl. a cellulóz, keményítő, valamint a kis molekulasúlyú cukrok, mint pl. a glükóz, fruktóz, szacharóz. A cellulóz a növényi sejtfal keménységét, ezen keresztül a növények szilárd vázát, a keményítő a szén és energia forrását, raktározását, a szacharóz a szén és energia növényen belüli transzportját biztosítja. A szénhidrátoknak, mint megújuló erőforrásoknak nagy a gazdasági jelentősége. A cukrokat többek között a gyógyszeripar (aminosav, B12 vitamin stb.), a vegyipar (festékek, ragasztók), a szappan és mosószeripar (mosóporok) használja fel. A cellulóz a papíripar, textilipar, a hadiipar (nitrocellulóz), a kozmetikai ipar (krémek, fogkrém) alapanyaga. A keményítő meghatározó (2/3) részét az élelmiszeripar és az italgyártás


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták használja fel. A fennmaradó 1/3 részt alkalmazza a papíripar (papír, karton), az építőipar (műanyag lapok, rost lapok), a vegyipar (ragasztók, fóliák), a mosószeripar (szappan, mosópor), a kozmetikai ipar (púder, száraz sampon, fogkrém) és a gyógyszeripar (tabletták, antibiotikumok, Cvitamin). A keményítő a növényben A keményítő, mint raktározott szénhidrát nagy menynyiségben található a növényekben. A növények magvaiban (gabonafélék és hüvelyesek), gyökereiben (répafélék), illetve gumóiban (burgonya) halmozódik fel. A magasabbrendű növények sejtjeiben részben a kloroplasztiszok, részben az amiloplasztiszok tartalmaznak keményítőt. A kloroplasztiszokban rövid időre az ún. tranzit keményítő halmozódik fel. Az amiloplasztiszokban viszont a keményítő hosszú időre raktározódik (raktározott keményítő). A tranzit és raktározott keményítő szemcséi különböznek egymástól. A tranzit keményítő szemcséi kisebbek, a raktározott keményítő szemcsék alakja pedig jellemző az adott növényfajra. A keményítőnek két fő komponense van, az amilóz és az amilopektin. A raktározott keményítő 11–37%-a amilóz, mely fajonként változik. A klasszikus waxy-mutánsok nem tartalmaznak amilózt.

4.2.1. 11.2.1. A keményítő bioszintézise (11/3. ábra)



11/3. ábra: A keményítő bioszintézis fő lépései Rövidítések: ATP adenozin trifoszfát; ADP adenozin difoszfát; UTP uridin trifoszfát; UDP uridin difoszfát; PP szervetlen pirofoszfát, számok: 1 ADP-glükóz pirofoszforiláz; 2 oldható keményítő szintáz; 3 szemcséhez kötött keményítő szintáz; 4 elágazási enzim; 5 UDPglükózpirofoszforiláz; 6 szacharóz-6-foszfát szintáz; 7 szacharóz-6-foszfát-foszfatáz; 8 invertáz; 9 szacharóz szintáz; 10 UDP-glükóz pirofoszforiláz; 11 hexokináz; 12 hexóz-6-foszfatáz; 13 glükóz-foszfát-mutáz. A szaggatott nyilak azt jelzik, hogy a szintézis több lépésből áll és abban több enzim vesz részt (Kleczkowski L. A. 1996. Trends in Plant Sci. 1, 363–364; Visser R. G. F., Jacobsen E.: 1993. TIBTECH 11, 63–68 alapján) A mono- és oligoszacharidok bioszintézisének kiinduló vegyülete a Calvin-ciklusban (fotoszintézis) köztestermékként keletkező szabad fruktóz-6-foszfát. Ebből két lépésben alakul ki a glükóz-1-foszfát, mely a keményítő építőegysége. Az oligoszacharidok bioszintézisekor első lépésben a glükóz-1-foszfát aktiválódik, amikor cukor nukleotid keletkezik, melynek két formája van: a) uridin-difoszfát-glükóz (UDP-glükóz), aa) adenozin-difoszfát-glükóz (ADP-glükóz). 292 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A nukleotid kötésben lévő glükózból (ADP és UDP-glükóz) különféle cukrok, illetve poliszacharidok szintetizálódhatnak. A citoplazmában az UDP-glükózból – kapcsolódva a fuktóz-6-foszfáthoz – keletkezik a szacharóz (szacharóz-6foszfát), mely a növények elsődleges transzport anyagcsereterméke, a szénhidrátok szállítható formája. A tranzit keményítő szintézise és felhalmozása a levelek kloroplasztiszaiban fényben, tehát nappal történik. A keményítő hidrolízise viszont éjjel zajlik. A raktározott keményítő szintézise az egyedfejlődés bizonyos szakaszára (magvak, gumók stb. differenciálódása és fejlődése) jellemző. Ebből az következik, hogy a kétféle keményítő bioszintézise eltérő szabályozást igényel (11/3. ábra). A keményítő szintézise általában szacharózból indul ki és 4 fő lépésből áll: 1.aktiválás (kulcsenzim: ADP-glükóz-pirofoszforiláz, AGP-áz); 2.láncnövekedés (kulcsenzim: keményítő-szintáz); 3.elágazás (elágazást kialakító enzim; branching enzyme, BE); 4.szemcse kialakulás (kulcsenzim: keményítő-szintáz). A legtöbb növényfajnál a folyamatban legalább 13 különböző enzim vesz részt. Az 1–3. lépések a tranzit keményítő szintézisét jelentik, tehát ezek a kloroplasztiszban játszódnak le. A 4. lépés történik az amiloplasztiszokban. 1. lépés: cukor nukleotid (ADP/UDP-glükóz) kialakulása ATP + glükóz-1-foszfát → ADP-glükóz + pirofoszfát A keményítő szintézis glükóz egységének forrása az ADP-glükóz, melynek kialakulását a glükóz-1-foszfátból az ADP-glükóz pirofoszforiláz (AGP-áz) katalizálja. Az ADP-glükóz, mint aktivált forma, képes a glükózból álló láncok nem redukáló végeihez kapcsolódni. 2. lépés: amilóz (á-1,4-oligoszacharid lánc) szintézise ADP-glükóz + á-1,4-glükán → á-1,4D-glükán polimer (amilóz) + ADP A keményítő amilóz láncainak á-1,4 kötéseit a cukor nukleotidok transzglükozidációs reakcióval alakítják ki. Minden egyes reakció során egy glükóz egység épül be a láncba és közben ADP vagy UDP válik szabaddá. Ezt a folyamatot a keményítő-szintáz katalizálja. Az amilóz lineáris polimer, á-1–4 kötésű glükóz egységekből áll, melyek száma 300–1200 között változhat, molekula tömege 50–150 kDa. 3. lépés: amilopektin (á-1,4 á-1,6 elágazó oligoszacharid lánc) szintézise á-1,4 oligoszacharid lánc → á-1,4-á-1,6 elágazó glükán polimer (amilopektin). A 2. lépésben bemutatott á-1,4 kötéssel a D-glükóz molekulák 20–25 egységből álló lánccá kapcsolódnak össze. Ezeket az elágazási enzim (branching enzyme, BE) á-1,6 kötéssel kapcsolja egymáshoz. Az amilopektin tehát elágazó polimer, á-1,4-á-1,6 kapcsolt glükóz egységekből áll, melyek száma 1500–12000 között változhat, molekula tömege 300–2000 kDa. Az elágazás általában minden 25. glükóznál alakul ki. 4. lépés: keményítőszemcsék kialakulása Az amiloplasztiszokban kétféle keményítő-szintáz enzim van. Az egyik aktivitása a keményítőszemcse kialakulásához (GBSS, Granule-bound starch synthase, szemcséhez kötött keményítő-szintáz), a másik pedig a keményítő oldhatóságához (SSS, soluble starch synthase, oldható keményítő-szintáz) kapcsolható. Mind a kétféle keményítő-szintáznak több változatát írták le. A keményítő-szintáz különböző típusainak ismerete azért nagyon fontos, mert hatással vannak az amilóz: amilopektin arányra. Többek között a waxy mutánsokról, melyek csak amilopektint tartalmaznak, bebizonyosodott, hogy az amilózhiány oka a szemcséhez kötött keményítő szintáz (GBSS) hiánya. A mutánsokban csak az oldható keményítő-szintáz (SSS) működik.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A növényekben az amilóz és amilopektin egyszerre szintetizálódik. A keményítő-szintázok szubsztrátja az ADP-glükóz. Korábban úgy tűnt, hogy mind a két keményítő-szintáz képes a glükóz egységeket a növekvő amilóz és amilopektin lánchoz kapcsolni. Napjainkban az látszik valószínűnek, hogy a GBSS képes az amilóz szintézisre, de olyan formában, mely nem lehet szubsztrátja az amilopektint szintetizáló BE enzimnek. Bizonyos fajokban a raktározott keményítő foszforilálódik (pl. burgonya), mely hátrányosan befolyásolja a keményítő viszkozitását a feldolgozás során. Más fajok (pl. kukorica) esetében a keményítő in vivo nem foszforilálódik. A géntechnológia stratégiái A keményítő bioszintézisből kiindulva a géntechnológiai módosítások két fő irányban történhetnek: a) a keményítő mennyiségének megváltoztatása, aa) a keményítő minőségének (szerkezetének) megváltoztatása. A mennyiségi változások kulcsenzimje az AGP-áz (ADP-glükóz-pirofoszforiláz). A minőség kulcsenzimjei a GBSS (szemcséhez kötött keményítő-szintáz), a BE (elágazási enzim) stb. A géntechnológia konkrét céljai ezeknek az enzimeknek mutáns, módosított vagy antiszensz génjeivel történő transzformáció.

4.2.2. 11.2.2. A keményítő mennyiségének módosítása Keményítő mennyiségének növelése A burgonya keményítő tartalmát sikerült növelni az E. coli-ból izolált AGP-áz génnel (glgC 16). A gént patatin promoterrel a gumóban expresszáltatták, és az enzimet az Arabidopsis-ból származó Rubisco kis alegységének tranzit peptidjével juttatták be az amiloplasztiszba. A transzformáns burgonyában a keményítő tartalmat maximálisan 50% fölé sikerült növelni, mely 35%-kal volt több, mint az eredeti fajta (Russett Burbank Williams) keményítő tartalma. Keményítő mennyiségének csökkentése A keményítőtartalom csökkentését az AGP-áz antiszensz konstrukciójával próbálták elérni, CaMV 35S promoterrel. A GM burgonya keményítőszintézise módosult a gumóban úgy, hogy az oldható cukrok szárazanyagra számított mennyisége megnőtt pl. szacharóz (30%-kal), glükóz (8%-kal). Ezek az eredmények bizonyítják az AGP-áz kulcsszerepét a keményítő bioszintézisében.

4.2.3. 11.2.3. Amilóz és amilopektin arány módosítása A keményítő ipari célú felhasználhatóságát és ipari minőségét jelentősen befolyásolja az amilóz és amilopektin arány, a keményítőszemcsék szerkezete és a lipidek, fehérjék mennyisége. Amilóztartalom csökkentése Az amilózmentes burgonya előállításával a hagyományos mutációs nemesítés is foglalkozik. Az amilózhiányos mutánst 1986-ban írták le. A klasszikus nemesítéssel legalább 15 évre van szükség egy új fajta előállításához. Ennek oka, hogy a burgonya poliploid és idegentermékenyülő faj. Az eddigi eredmények azt bizonyították, hogy a keményítő összetételének megváltozása mindig a termőképesség csökkenésével járt együtt. Ez is indokolja a géntechnológia alkalmazását. Antiszensz technikával, konkrétan a GBSS antiszensz génjével történő transzformációval, a nemesítési idő 5 évre csökkenthető. Az antiszensz gén ebben az esetben úgy működik, mint egy domináns szupresszor gén, mely független a ploidszinttől és a gének számától. Mivel a szóbanforgó gén az amilóz szintézis kulcsenzimje, gátlásával az amilóztartalom jelentősen csökkenthető. A gátlás mértéke a különböző transzformánsokban 70–100% között változott. 100%-os gátlás esetén a gumó egyáltalán nem tartalmazott amilózt. Hasonlóan 100%-os gátlás volt elérhető a maniókából izolált GBSS génnel, melynek nukleotid sorrendje 74%-os azonosságot mutat a burgonyáéval. A teljes gátlás elérhető volt mind CaMV35S, mind gumóspecifikus promoterrel. Az amilózmentes GM-burgonyák szántóföldi kísérletei bizonyították a tulajdonság stabil jellegét, és azt, hogy a genetikai módosítás érdemben nem befolyásolta a termőképességet és a szárazanyagtartalmat. Napjainkban már szántóföldön vizsgálják a teljesen, illetve részlegesen amilózmentes GM-rizs, kukorica és búza növényeket is.

4.2.4. 11.2.4. Cukortartalom módosítás 294 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 1. Cukortartalom növelése Az E. coli-ból izolált glikogén-szintáz, mint mikroorganizmus eredetű keményítő-szintáz működtetése a burgonyagumó amiloplasztjaiban (patatin promoter + tranzit peptid), komoly változásokat eredményezett a GM burgonya keményítő összetételében. Annak ellenére, hogy a gén expressziója alacsony volt, az oldható cukortartalom 60-80%-kal növekedett, a keményítőtartalom pedig 20-50%-kal csökkent. Az amilopektin aránya és különösen az elágazások száma növekedett, csökkent viszont a keményítő foszforiláltsága. Az elágazási enzim (BE) antiszensz gátlása semmiféle változást nem eredményezett a transzgénikus burgonyában. 2. Szacharóztartalom módosítása A szacharóz az elsőszámú édesítőszer az élelmiszeriparban. A szacharóz bioszintézis kulcsenzimje a szaharóz6-foszfát-szintáz (SPS). A GM-paradicsomban Rubisco promoterrel expresszáltatott kukorica SPS-gén a levélben 50%-kal növelte a cukortartalmat, a keményítőtartalom egyidejű csökkenése mellett. Összefoglalva a géntechnológiával módosított keményítő gazdasági jelentősége a jövőben várhatóan növekedni fog. Nagy valószínűséggel gazdaságilag is versenyképes termékeket lehet belőle előállítani a jövőben (pl. alkohol üzemanyag) a jelenlegi kőolajjal, illetve cellulózzal szemben. Azért valószínűsíthető ez, mert a keményítő megújítható polimer, mely a piac igényeinek megfelelő mennyiségben állítható elő, természetbarát és biológiailag lebomló anyag.

11/1. táblázat: A keményítő géntechnológiai módosításának alternatív lehetőségei A géntechnológiával a keményítő mennyisége és minősége (szerkezete) a felhasználó igényei szerint módosítható (11/1. táblázat). A genetikailag módosított keményítő nem igényel fizikai, kémiai vagy enzimes kezelést a feldolgozás előtt, tehát kíméli a környezetet, illetve az élelmiszerekben nem maradnak az előkezelésből származó melléktermékek (pl. NaCl). A géntechnológiával módosított keményítő új piacokat teremthet az élelmiszeripar számára is. A nagyobb keményítőtartalmú burgonya sokkal kevesebb zsírt vesz fel, ami lehetővé teszi, hogy a sült burgonyát (hasábburgonya, burgonya chips-ek stb.), mint alacsony kalóriatartalmú ételt lehessen árusítani. Az amilózmentes burgonya sokkal könnyebben emészthető és belőle sokkal kellemesebb és homogénebb püré készíthető, mely nem csomósodik. Nagy valószínűséggel a 100%-ban amilopektint tartalmazó, továbbá a nagyobb keményítő tartalmú burgonya és kukorica lesznek az első szénhidrát anyagcserében módosított GM növények, melyek még ebben az évtizedben köztermesztésbe kerülnek.

4.3. 11.3. A zsírsav bioszintézis módosítása


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Az olajok és zsírok az élelmiszereknek és a takarmányoknak energiában (kalória) leggazdagabb elemei. A világtermelés évente 80–100 millió tonna, melyből 87%-ot az emberi táplálkozásban, illetve az állatok takarmányozásában használnak fel. A növényi zsírok és olajok telített és telítetlen egybázisú karbonsavak glicerinésztereinek keverékei, tehát két legfontosabb összetevőjük a zsírsavak és a glicerin. Növényekben, magvakban és gyümölcsökben halmozódnak fel. Az ismert zsírsavak száma 210. Általános képletük CnH2n+1COOH. A zsírsavak a) a szénlánc hosszúságában, aa) a kettőskötések és a funkcionális csoportok számában és helyében különböznek egymástól. A szobahőmérsékleten szilárd zsírokban a telített, a folyékony zsíros olajokban pedig a telítetlen zsírsavak (karbonsavak) fordulnak elő. A zsírsavaknak csak egy kis részét használják ipari célokra. Ezek közül a laurinsav (C 12:0) különösen jelentős a kozmetikai iparban és a mosószergyártásban; a linolsav (C18:2) és linolénsav (C18:3) a festék- és lakkgyártásban; a ricinolsavat (C18:1)kenőanyagként; az erukasavat (C22:1) pedig habzásgátlóként, csúszásgátló anyagként, valamint nejlon gyártásra használják (11/2. táblázat).

11/2. táblázat: Gazdasági szempontból fontosabb zsírsavak és felhasználásuk főbb területei A világon évente előállított növényi olaj 77%-át négy növény, a szója, az olajpálma, az olajrepce és a napraforgó adja, mely felsorolás egyben rangsor is. Az általuk termelt olajban a 16–18 szénlánchosszúságú zsírsavak a meghatározók, ezek a palmitinsav (C16:0), a sztearinsav (C18:0), az olajsav (C18:1), a linolsav (C18:2) és a linolénsav (C18:3). A mag érése folyamán ezek a zsírsavak glicerinnel észtert alkotnak és trigliceridek formájában a mag raktározó szöveteiben halmozódnak fel. A különböző növényfajok által előállított olajok zsírsav összetételükben különböznek egymástól. Géntechnológiai szempontból ez úgy értelmezhető, mint az egyes zsírsavak bioszintézisében résztvevő enzimek (gének) jelenlétének vagy hiányának a következménye.

4.3.1. 11.3.1. A zsírsavak bioszintézise A zsírsavak bioszintézisének helye a növényben a kloroplasztiszok. A bioszintézis alapanyagai a levélből a fejlődő mag perikarpiumába szállítódnak. A szintézis köztes termékei tioészter-kötéssel egy hordozó fehérjéhez (acyl-carrier protein, ACP) kötődnek (11/4. ábra). A de novo szintézis az acetil-CoA-ból indul ki, mely egy CO2 felvétellel malonil-CoA-vá alakul. Ezt követően az ACP acileződik úgy, hogy az acetil-CoA-acetil csoportja és a malonil-CoA malonil csoportja egy-egy ACPre helyeződik át. Az így keletkezett acetil-ACP és malonil-ACP kondenzálódik. A kondenzáció során keletkező acetil-S-ACP acilcsoportja adja a növekvő acil-lánc (szénlánc) 3. és 4. szénatomját. Ezzel egy ciklus véget ért. A következő 2 szénatom beépülése az acetil-CoA és a malonil-CoA kondenzációjával kezdődik. A zsírsavak


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták bioszintézise tehát egymást követő ciklusokból áll, és minden ciklusban a szénlánc (acil-ACP) hosszúsága C2 egységgel hosszabbodik. A folyamatot a zsírsav-szintáz katalizálja. A legtöbb növényben nyolc ciklus után kialakul a 18 szénatomos sztearinsav (C 18:0), pontosabban a palmitil-SACP (C16:0-ACP), melyből a s9 deszaturáz 16:1-ACP formát állít elő. A 18:1-ACP-ból deacilálással keletkezik az olajsav (C18:1). A növényi zsírsavak szénlánchosszúsága 8-18 szénatom között változik (C8-18:0)-ACP. A szénlánc növekedés terminációját (leállítását) a tioészterázok (acil-ACP-tioészterázok) biztosítják. Minden zsírsavnak megvan a saját tioészteráza, ami a szénlánc növekedését a megfelelő szénatomszámnál leállítja, és a láncot az ACP-ről leválasztja. A zsírsav bioszintézis során tehát telített (C8–18:0) zsírsavak keletkeznek a kloroplasztiszban (11/4. ábra).

11/4. ábra: Zsírsavak és gliceridek bioszintézisének főbb lépései növényi magvakban. A bioszintézis fontosabb fázisai és enzimjei: (a) acetil-CoA keletkezése; (b) acetil-CoA karboxiláz; (c) zsírsav szintáz; (d) acil-ACP tioészteráz; (e) zsírsav módosítás; (f) acil-CoA szállítás; (g) β-oxidáció; (h) acil transzferázok; (i) triglicerid átalakulás és (j) a növényi olajokra tározó formáinak kialakulása. Rövidítések: DG diglicerid; G6P, glükóz-6foszfát; Gli3P glicerin-3 foszfát; LFS lizofoszfatidsav; OT olaj-raktározó testek; FS foszfatidsav; Pir piruvát; TG triglicerid (Murphy, 1996. TIBTECH 14, 206–213 alapján) A telítetlen zsírsavak is a kloroplasztiszban alakulnak ki a (C16–18:0 szénlánchosszúságú) telített zsírsavakból, a 9. szénatomnál keletkező telítetlen (kettős) kötéssel. A folyamatot a deszaturázok katalizálják, mindegyik telítetlen zsírsavnak megvan a saját deszaturáza. Egy telítetlen kötést tartalmaz a palmitoleinsav (C 16:1) és az olajsav (C18:1). A fejlődő növényi embriók kloroplasztiszaiban tehát C4–18 hosszúságú zsírsavak alakulnak ki. A szintézis utolsó terméke az olajsav (C18:1), mely a telített sztearinsavból (C18:0) keletkezik, az olajsav-specifikus deszaturáz (s9 deszaturáz) katalizálásával. Ezt követően a zsírsavak, és a legnagyobb hányadukat kitevő olajsav kikerül a kloroplasztiszból és a további folyamatok már a citoplazmában zajlanak (11/4. ábra). A C20–24 zsírsavak a citoplazmában keletkeznek a következőképpen: • Az olajsav (C18:1), mint köztestermék a citoszólban az endoplazmatikus retikulumhoz kapcsolódva az acilCoA-szintáz hatására aktiválódik oleil-CoA-vá és a malonil-CoA-val együtt acilálódik, ami során újabb C2 egységek épülnek be a láncba (C20–24). Az olajsavból (C18:1) két ciklus után alakul ki az erukasav (C22:1). A kettős kötés kialakulásáért a s13 deszaturáz a felelős. • Az olajsavból (C18:1) további kettőskötések kialakulásával újabb telítetlen zsírsavak, a linolsav (C18:2) és a linolénsav (C18:3) keletkeznek. E folyamatokat specifikus deszaturázok ( s12 és s15) katalizálják.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták • A zsírsavak szabad formában alig fordulnak elő. Ennek oka, hogy a kloroplasztiszból kikerülve trigliceridekké alakulnak. Az észterifikációt követően a raktározó sejtekben, szövetekben rakódnak le, vagy mint foszfolipidek a biológiai membránokba épülnek be. Összefoglalva tehát megállapítható, hogy a növényekben a szabad zsírsavak bioszintézise két meghatározó lépésből áll: • Szénlánc (acil-lánc) növekedése, melynek hosszúságát a tioészterázok határozzák meg; • A szénlánc telítetlensége kettős kötések (redukálatlan kötések) kialakulása melyet a deszaturázok katalizálnak. A zsírsavakat a szénlánc hosszúsága alapján három csoportba sorolják: rövid szénláncúak (C 4–8); közepes szénláncúak (C10–14) és hosszú szénláncúak (C16–24). • A trigliceridek kialakulása a zsírsavak észterifikációjával történik. Géntechnológiai stratégiák A zsírsavak páros szénatomszámú monokarbonsavak, egymástól a szénlánc hosszúságában, illetve a kettőskötések számában különböznek. A szénlánc (acil-lánc) hosszúságát a tioészterázok, telítetlenségét pedig a deszaturázok határozzák meg. Ennek megfelelően a géntechnológia lehetőségei a következők: −A szénlánc hosszúságának megváltoztatása (növelése, rövidítése): a megfelelő szénlánc hosszúságnál a terminációt kiváltó tioészteráz génnel történő transzformációval (új zsírsav termelés), illetve a többi tioészteráz gátlásával (részarány növelés). −A telítetlenség módosítása (telítettség, telítetlenség): a megfelelő deszaturáz enzim gátlásával (telítettség növelés), vagy az enzim génjével történő transzformációval (telítetlenség növelés).

11/5. ábra: Repceolaj zsírsavösszetétel módosítása géntechnológiával. A: a hagyományos repcefajta olajának összetétele, B: a sztearinsav tartalom növelése a GM repcében, C18 ACP deszaturáz enzim génjének antiszensz gátlásával, C: a laurinsav tartalom növelése a GM-repcében, a C12:0 ACP tioészteráz enzim génjének transzformációjával. Fontosabb rövidítések: 12:0 = laurinsav, 18:0 = sztearinsav, 18:1 = olajsav. További magyarázatot lásd a szövegben (Voelker, 1996 alapján)


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A kilencvenes években elért eredmények bizonyították, hogy egy génnel való módosítással is komoly, 30–40%os eltéréseket lehet kiváltani a zsírsavak arányában (11/5. ábra).

4.3.2. 11.3.2. Rövid- és közepes láncú zsírsavak arányának növelése Laurinsav tartalom növelése A rövid és közepes láncú zsírsavak közül a laurinsavnak (C12:0) van a legnagyobb gazdasági jelentősége (mosószergyártás, kozmetikai ipar). Főleg a trópusi növények (olajpálma, kókuszpálma) termelik, a világ legnagyobb exportőrei a Fülöp-szigetek és Malajzia. A repceolaj egyáltalán nem tartalmaz laurinsavat, mert a 12 szénatomot tartalmazó lánc terminációját végző enzim hiányzik a repcéből. A kaliforniai babérfa (Umbellulariacalifornica) magvaiban viszont a laurinsav arány eléri a 70%-ot, ami a laurinsav specifikus acil-ACP-tioészteráz működésének a következménye. Az enzim kódját tartalmazó cDNS-t magspecifikus promoterhez (napin) kapcsolva, vektorba építve juttatták be a repcébe. A GM-repce termelte a laurinsavat, melynek nagyságrendje elérte a 45%-ot. Ennek a változásnak semmiféle negatív következménye nem volt a GM-repce növekedésére, fejlődésére és termőképességére. A magban a trigliceridek szintézise normális volt (11/5. ábra). A nagy laurinsav tartalmú repce 1995-ben köztermesztésbe került az USA-ban (Georgiában). Az első olyan GM fajta volt a világon, melyben az olaj összetételét géntechnológiai módszerekkel módosították. Erre a sikerre alapozva más fajokból (Cuphea kookeriana, C. lanceolata és Carthamustinctorius) is izolálták a különböző zsírsavlánc hosszúságot meghatározó acil (ACP) tioészteráz géneket abból a célból, hogy a repce képes legyen a C8:0, C10:0 és a C14:0 zsírsavak termelésére, illetve arányuk növelésére.

4.3.3. 11.3.3. Hosszú láncú zsírsavak arányának növelése 1. Petrozelinsav tartalom növelése A petrozelinsav (C18:1) az olajsav izomérje, mely a koriander magban az olaj 80%-át is elérheti. A petrozelinsav (C18:1) oxidációja eredményeképpen keletkező laurinsavnak (C12:0) és adipinsavnak (C6:0) van gazdasági jelentősége. Az utóbbi dikarboxilsavat mint monomert használják fel a nejlon-gyártásban. A korianderből izolált petrozelinsav specifikus acil (ACP)deszaturáz génnel azonban csak 5%-os petrozelinsav termelést lehetett elérni a GM-dohányban. Az okokat vizsgálva bebizonyosodott, hogy a petrozelinsav bioszintézisben még további enzimek (pl. palmitinsav-(ACP-deszaturáz, petrozelinsav-(ACP)-tioészteráz) vesznek részt. 2. Olajsav tartalom növelése A hagyományos nemesítési módszerekkel is jelentősen növelhető volt az olajsav aránya a napraforgóban (90%) vagy a repcében (62%), a linolénsav aránya a lenben (57%) és a sztearinsav aránya a szójában (30%). Ezek a változások nem befolyásolták a magvak csírázóképességét, illetve a növények fejlődését. A %-os növekedés általában a többi telítetlen zsírsav mennyiségének rovására történt. A többszörösen telítetlen zsírsavak arányát azonban egy bizonyos szint alá nem lehetett csökkenteni, mert a sejtekben azok specifikus deszaturázai működtek. Az olajsavtartalom géntechnológiával tovább lenne növelhető, ha a többszörösen telítetlen zsírsavak kialakulásáért felelős deszaturázok működését molekulárisan gátolni tudnánk. Ebből a célból izolálták a linolsav specifikus deszaturáz enzim génjét (C 18:0-ACP-deszaturáz, s12 deszaturáz), és antiszensz (fordított orientációjú) változatával transzformálták a repcét. A GM repcében az olajsav tartalom 83%-ra növekedett. A szójaolaj esetében hasonló megközelítéssel az olajsav tartalom 84%-ra nőtt, a többszörösen telítetlen zsírsavak aránya 6% alatt maradt. Az olajsavtartalom 90%-ra történő növelésének gazdasági jelentőségét az adja, hogy ezzel jelentősen csökkentheti az ipari alkalmazást megelőző downstream folyamatok költségeit. 3. Sztearinsav tartalom növelése A sztearinsav (C18:0) tartalom növelhető, ha az olajsav (C18:1) kialakulást katalizáló deszaturázt (s9 deszaturáz) molekulárisan gátoljuk. Az s9 deszaturáz gént a sáfrányos szeklicéből (Chartamus tinctorius) izolálva antiszensz orientációban kell visszajuttatni a repcébe. A GM repcében tehát egyidőben jelen van a s9 deszaturáz vad típusú és antiszensz 299 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták génje. A különbség a két gén között az, hogy egymáshoz képest 180 °-kal elfordítva találhatók a promoter mögött. Az átíráskor ennek az a következménye, hogy az eredetiről a szensz vagy kodogén szál fog átíródni RNS-re (+RNS), az antiszensz génről pedig a nem kódoló szál (-RNS). A két RNS komplementer egymással, ezért összetapadva kétszálú RNS-t alkotnak, melyről nem tud fehérje szintetizálódni. Végeredményben tehát egy gént specifikusan gátolni tudtunk úgy, hogy a növényt a gén antiszensz változatával transzformáltuk. Pontosabban a gént nem gátoltuk, hiszen RNS átírás volt, hanem az mRNS-ről a transzlációt akadályoztuk meg. Végül is nincs a génműködésnek fehérjeterméke, tehát a deszaturáz enzim specifikusan hiányozni fog a GM sejtekből. A specifikus gátlás következménye az, hogy a repcében az átlagos 4% helyett a sztearinsav tartalom 40% fölé növekedett (11/5. ábra). 4. Ricinusolaj tartalom növelése A világon évente fél millió tonna ricinusolajat állítanak elő. A ricinusmagból nyert olaj 90%-a ricinusolaj (C12 hidroxi-ricinolsav), mely a szénláncban egy hidroxilcsoportot tartalmaz. Széles körben használatos a gyógyászatban, motorok kenésére és a mosószergyártásban. A ricinus termesztése a világon nem megoldott. A termésátlagok a klimatikus változásoknak megfelelően ingadozók. Ezért célszerű lenne a ricinusolaj előállítása a mérsékelt égöv fő olajnövényeivel, pl. a repcével. A géntechnológia célja ebben az esetben az, hogy az olajsav hidroxilációját maga a növény végezze el. E célból a ricinus hidroxiláz génjét már több laboratórium is izolálta. 5. Erukasav tartalom növelése Az erukasav (C22:1) főleg az ipari felhasználás szempontjából jelentős. Alkalmas a szövetek puhítására, de oldószerként, kenőanyagként és nejlon alapanyagként is használatos. A hagyományos módszerekkel előállított nagy erukasav tartalmú fajtákban az átlagos érték 45-55%. Ez az érték a hagyományos nemesítéssel – ismerve a faj genetikai formagazdagságát – maximum 66%-ra növelhető. Géntechnológiával viszont olyan repce is előállítható, melyben az erukasav tartalom 90%. Ehhez azonban több génnel való együttes transzformációra van szükség. Összefoglalva, a zsírsav bioszintézis szerencsés esetben egy gén, de általában 2–3 gén beépítését igényli. A modellnövény a repce. Az első sikeres megközelítést laurinsavat (40%) termelő repcefajta előállítása jelentette, mely 1995 óta köztermesztésben van. A hagyományos nemesítés és a géntechnológia eredményei azt bizonyítják, hogy az egyes olajnövények magvai jól tolerálják a zsírsavösszetétel változását, a magvak csírázóképesek. Az új génekkel (tioészterázok) és az antiszensz génekkel (deszaturázok stb.) tulajdonképpen mindenféle zsírsavat elő lehet majd állítatni a fontosabb mérsékeltövi olajnövényekkel (pl. repce, napraforgó). Felhasznált és ajánlott irodalom Anonym (1998): Engineering plant protein composition for improved nutrition. Trends in Plant Science, 3, 282– 285. Jacobs, M., Frankard, V., Vanterin, M., Suharianto, E., Tadesse, J. (1999): Manipulating esential amino acid metabolism in plants. In: Altman, A., M. Ziv., S. Izhar (eds.) Plant Biotechnology and in vitro Biology in the 21st Century. Kluwer Acad. Publishers, Dordrecht, Boston, London. 303–306, Karchi, H., Saul, O., Galili, G (1993): Seed specific expression of a bacterial desensitised asparate kinase increases the production of seed threonine in transgenic tobacco, Plant J., 3, 721–727. Kinney, A. J. (1994): Genetic modification of storage lipids of plants. Current Opinion in Biotechnology, 5, 144–151. KLECZKOWSKI, L. A. (1996): Back to the drawing board: redefining starch synthesis in cereals. Trends in Plant Sci., 1, 363–364. Martin, C., A. M. Smith (1995): Starch biosynthesis. The Plant Cell, 7, 971–985. Murphy, D. J: 1996. Engineering oil production in rapeseed and other oil crops. Trends in Biotechnology, 14, 206–213. Rees T.: 1995. Prospects of manipulating plant metabolism. Trends in Biotechnology, 13, 375–378.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Saalbach I., T. Pickardt, F. Machemehl, G. Saalbach, O. Schieder, K. Müntz (1994): A chimeric gene encoding the methionine-rich 2S albumin of the Brasil mit (Bertholletia excelsa H.B.K.) is stably expressed and inherited in transgenic legumes. Mol.Gen. Genet., 242, 226–236. Shewry, P. R., A. S. Tatham (1995): Biotechnology of breadmaking: unraveling and manipulatings the multiprotein gluten complex. Biotechnology, 13, 1185–1190. Shewry, P. R. P. Lazzeri (1997): Molecular approaches to wheat quality improvement. Chemistry and Industry, 14, 559–562. Smeekens S.: 1997. Engineering plant metabolism. Trends in Plant Science, 2, 286–288. Vasil, I. K., O. D. Anderson (1997): Genetic engineering of wheat gluten. Trends in Plant Science, 2, 292–296. Visser, R. G. F., E. jacobsen (1993): Toward of modifying plants for altered starch content and composition. Trends in Biotechnology, 11, 63–68. Voelker, T. A. (1996): Genetic manipulation of plant oil composition. Proc. Int. Symp. On the use of induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement. IAEA-SM-34/58, 93–99.

5. 12. Fejlődésben módosított transzgénikus növények (Heszky L. és Dudits D.) 5.1. 12.1. Transzgénikus hímsterilitás és hibrid előállítás 5.1.1. 12.1.1. Citoplazmás és génikus hímsterilitás A heterózis, ami a XX. századi növénynemesítés egyik legnagyobb felfedezése volt, a heterozigóta (F 1) hibridek fölényét jelenti valamilyen tulajdonságban, a homozigóta szülőkhöz viszonyítva. Annak ellenére, hogy a heterózis szinte minden kultúrnövény fajban bizonyítható volt, a hagyományos nemesítési módszerekkel csak néhány esetben (pl. kukorica, napraforgó, cirok, köles, cukorrépa stb.) sikerült a gyakorlatban is hasznosítani. A hibrid előállítás lényege, hogy a genotípusosan különböző szülő törzseket vagy vonalakat (beltenyésztett vonal) irányított módon úgy kereszteznek egymással, hogy 100%-ban hibrid magvakat (F1) kapjanak. Az F1 mag jelenti a vetőmagot, és az F1 hibrid nemzedék termőképessége 5–25%-ban haladhatja meg a nem hibrid fajtákét. Repce esetében ez a különbség elérheti a 40–70%-ot is. A hibrid előállítás legfontosabb lépése a megporzás irányítottsága, tehát az, hogy az anyavonal csak az apavonal pollenjétől termékenyülhessen meg. Ez az a feltétel, mely sok növényfaj esetében nehezen, vagy egyáltalán nem volt biztosítható. A megporzás irányítottságát a hagyományos megközelítés esetén vagy kasztrálással (a hímvirágok, a portokok eltávolításával), vagy hímsterilitást kiváltó genetikai mutációkkal, újabban vegyszeres permetezéssel lehet elérni és biztosítani. A legtöbb növényfajnak kicsi és egylaki virága van, ezért a kasztrálás kivitelezése nehéz és lassú. Kereskedelmi volumenű hibrid vetőmag csak úgy állítható elő, ha az anyavonal hímsteril. A hímsterilitás kiváltható citoplazmás és nukleáris (sejtmag) génekkel is. A citoplazmás hímsterilitás (cytoplasmic male sterility, CMS) a mitokondrium genom genetikai hibájára vezethető vissza. A mitokondrium anyai úton öröklődik, ezért egy hímsteril anya és egy fertilis apavonal (O CMS x P fertil) keresztezéséből az anyanövényen fejlődő magvak és azokból fejlődő utódok 100%-ban hímsterilek lesznek. A citoplazmás hímsterilitást feloldó (restorer) domináns gének (Rf) viszont a sejtmagban kódoltak. Ezek a gének képesek helyreállítani a CMS növények fertilitását. Tehát ha egy hímsteril anya és egy restorer génnel rendelkező apa vonalat keresztezünk (O CMS x P Rf fertil), az utódok (F1) 100%-ban fertilisek lesznek.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A CMS-rendszer széles körben használatos azoknál a fajoknál, ahol a CMS és Rf gének rendelkezésre állnak és a szülővonalakba beépíthetők (cirok, napraforgó, köles, cukorrépa). Kipróbálás, és részben fejlesztés alatt van a CMS-rendszer búzában, rizsben és repcében. A CMS-rendszer sajnos nem tudott olyan mértékben elterjedni, mint várható lett volna, aminek legfontosabb okai a CMS-hez kapcsolt kedvezőtlen tulajdonságok (pl. betegség fogékonyság, glükozinolát-tartalom növekedés, környezeti instabilitás, restorer hiánya stb.) voltak. A sejtmagban kódolt hímsterilitás (dominant nuclear male sterility, NMS) a genomban bekövetkezett mutációk eredménye. Sajnos alkalmatlan a hibridvetőmag kereskedelmi méretekben való előállítására, mert felhasználásával csak 50%-os hímsteril növényállományt lehet előállítani (O MSms x P msms → 50% MSms + 50% msms; O msms x P MSms → 50% MSms + 50% msms). A növényi géntechnológia azonban lehetőséget adott arra, hogy az NMS-re alapozott technika széles körben használható legyen. Ennek lehetőségét a Gent-i (Belgium) Plant Genetics System kutatócsoportja bizonyította a Nature-ben 1990-ben bemutatott eredményeivel. Transzgénikus hímsterilitás A géntechnológia stratégiája a pollen fejlődéséért felelős szövet sejtjeinek specifikus elpusztításán alapul. A megközelítés végül is két lépésből áll. Egyrészt keresni kell egy olyan enzimfehérjét, mely ha termelődik a sejtben, elpusztítja azt, másrészt kell találni egy olyan promotert, mely biztosítja, hogy az előbbi toxikus fehérje a portoknak csak a megfelelő szövetében termelődhessen. A kivitelezhetőség legkritikusabb pontját a szövetspecifitás molekuláris biztosítása jelenti.

5.1.2. 12.1.2. Hímsteril transzgénikus növények előállítása A pollen a portokban alakul ki. A portok falának szövetei (exothecium, endothecium, és tapétum) közül a néhány sejtsoros tapétumszövet az, melyet ha specifikusan el tudunk pusztítani, akkor pollenfejlődés sem lesz. Ennek oka az, hogy a tapétumszövet, mint szomatikus szövet a portokfal belső oldalát borító sejtrétegeket jelenti, és a tapétumsejtek termelik azokat az enzimeket, melyek a meiózist követő tetrád stádium után a 4 mikrospóra kiszabadulását segítik elő a kallóz burokból, továbbá tápanyagokat és a pollenfal építéséhez szükséges komponenseket (pl. sporopollenin) juttatnak a fejlődő pollenszemeknek. A mikrospóra fejlődése során a tapétumsejtekben legalább 10 000féle mRNS szintetizálódik. A portok specifikus RNS-ek izolálását követően cDNS-eket szintetizáltak. A TA29 cDNS-sel hibridizálták a dohány genomikus klóntárat és így találtak rá a TA29-nek nevezett génre. A gén vizsgálata során megállapították, hogy egy sejtfal fehérjét kódol és a tapétum szövetben expresszálódik. Ezt követően az 5‟ végekről különböző hosszúságú szakaszokat hasítottak le és építettek a GUS gén elé, hogy meghatározzák és megkapják a promoter régiót. Bizonyították, hogy a dohány TA29 génje 5‟ upstream régiójának 1,5 kb hosszúságú fragmentuma (promoter) tartalmazza mindazon információkat, melyek a tapétum-specifikus expresszióhoz szükségesek. Ezt követően a TA29 gén 1,5 kb szabályozó fragmentumához különböző ribonukleáz géneket kapcsoltak, melyek közül a Bacillus amyloliquefaciens-ből izolált ,,barnase”-nak nevezett gén kiválónak bizonyult a tapétumszövet sejtjeinek specifikus elpusztításához. A TA29-barnase transzformáns növények 92%-a teljesen hímsteril volt. A hímsterilitás ebben az esetben azt jelenti, hogy a portok kifejlődik ugyan, de egyáltalán nem tartalmaz pollent. Ennek oka, hogy a transzformánsokban a portok differenciálódás során a tapétumszövet elhal, mert a sejtjeiben expresszálódó RN-áz a sejtekben lévő RNS-t feldarabolja. Ezzel a sejt funkcióképtelenné válik, nincs fehérjetermelés. Tapétumszövet hiányában a meiózist követően a mikrospórák nem tudnak kiszabadulni a kallóz burokból, fejlődésükhöz tápanyag nem áll rendelkezésre, ezért a mikrospórák is elhalnak. A hímsteril transzgénikus növények morfológiailag és fenológiailag semmiben sem különböztek a kiinduló fajtától, a női ivarszervek fertilisek maradtak. 1990 óta további NMS-t kiváltó génről számoltak be, melyek két fő csoportra oszthatók: • Az első csoportba tartoznak azok a gének, melyek valamilyen portok-, pollen- vagy portokszövet-specifikus promoterből és ahhoz kapcsolt valamilyen citotoxikus fehérje információjából állnak (pl. pTA29-RN-ázT1, pA3-â-1,3 glükanáz, pA9-barnase stb.).


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták • A második csoportba tartoznak azok a gének, melyek a növényben mindenhol működnek, de az egyetlen fenotípusos hatásukat a hímsterilitás megjelenése adja [pl. p35S-rolc, p35S pCHS (chalkon szintáz)antiszensz CHS cDNS, p35S-CHS cDNS stb.]. Végeredményben a TA29-RN-áz gén indukálta hímsterilitás új lehetőséget teremtett a hibridnövények előállításában (12.1/1. ábra). A TA29 RN-áz gén sikeres felhasználása a hibridvetőmag előállításában a PGS és az AgrEvo új hibridizációs rendszere a ,,Seedlink”, melyben a transzgénikus hímsterilitás kiváltását a TA29 RN-áz génnel oldották meg.

5.1.3. 12.1.3. A hímsteril transzgénikus növények fenntartása és felszaporítása A TA29-barnase alapú hímsteril növények csak úgy tarthatók fenn, ha azokat az eredeti vonallal keresztezzük. Az utódok 50%-a hímsteril, 50%-a fertilis lesz. Abból a célból, hogy az 50% fertilis növény ne zavarja a vetőmagelőállítást, azokat szelektíven el kell pusztítani. Ezért a TA29 RN-áz génhez kapcsolni kell egy szelektálható markergént, pl. herbicid rezisztencia gént. A foszfinotricin hatóanyagú totális gyomirtószer (glufozinát ammónium) rezisztenciát a bar gén biztosítja (lásd a Herbicidrezisztens transzgénikus növények c. 10.1. pontban). Tehát abban az esetben, ha a hímsterilitást kiváltó génnel együtt a herbicidrezisztenciát biztosító gént is átvisszük, akkor a hímsteril növény még herbicidrezisztens is lesz (TA 29 RN-áz + bar). A hímsterilitáshoz kapcsolt herbicidrezisztencia lehetővé teszi, hogy a hímsteril vonal fenntartása során kapott 50% fertilis növényt herbicid permetezéssel szelektíven elpusztítsuk (12.1/1. ábra).



12.1/1. ábra: Transzgénikus hímsteril alapon történő hibridkukorica vetőmag előállítása A permetezés már csíranövény korban elvégezhető. A problémát az jelenti, hogy a táblán életben maradó 50% hímsteril növény véletlenszerűen fog elhelyezkedni a sorokban, tenyészterületük tehát rendkívül változó lesz. E hátrány különböző agrotechnikai módosításokkal részben csökkenthető. Ez a hímsteril állomány a vonal nem transzgénikus – tehát hímfertil – változatával keresztezve tovább szaporítható és ezek a ciklusok addig ismételhetők, amíg a kívánt magmennyiséget a kereskedelmi célú F 1 vetőmag előállításához el nem értük.

5.1.4. 12.1.4. Fertilis F1 vetőmag előállítás Hibrid vetőmag előállításkor a hímsteril transzgénikus anyavonalat a partner szülővonallal kell keresztezni a maximális heterózis elérése céljából (12.1/1. ábra). A partner vonalnak fertilisnek kell lennie, mely alapján az F1


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták állomány 50% fertilis és 50% steril egyedekből állna. Tehát szükség van egy restorer rendszerre, egy restorer génre (Rf). Az első ,,Rf” transzgén a ,,barstar” gén volt, mely RN-áz inhibitor, pontosabban a ,,barnase” specifikus inhibitora, amit szintén a B. amyloliquefaciens-ből izoláltak. A barstar a barnase-vel a sejtben kettős komplexet alkot. A baktérium ily módon védi meg magát a saját RN-ázával szemben. Abban az esetben tehát, ha a barstar gént a TA29 promoterhez kapcsoljuk és azzal (TA-29-barstar) transzformáljuk a fertilis apa vonalat, akkor az F1-ben 100%-ban fertilis növényeket kapunk, mivel a növények 50%-a amúgy is fertilis lenne, a barnase-t termelő egyedekben pedig az RN-áz nem tudja kifejteni hatását, mert a tapétumsejtekben a barstar inhibitor fehérje is termelődik és a két fehérje összekapcsolódva működésképtelen komplexet alkot. Végeredményben a másik 50% is hímfertil lesz, tehát a farmer már 100%-ban fertilis F1 hibrid vetőmagot fog vásárolni. A fentieken kívül Rf (restorer) génként szóba jöhetnek még az antiszensz barnase gén, illetve a barnase specifikus ribozim gén is. A fertilitás visszaállításának további molekuláris lehetősége a kémiai kezelés. A jelenlegi kísérleti rendszer a chalkon szintáz (CHS) gátlásán alapul. Azokban a növényekben, melyekben a CHS gátolva van, a pollen érése nem zajlik le, ezért a pollen nem funkcióképes. Abban az esetben viszont, amikor a pollent bibe-flavonoiddal permetezzük, vagy összekeverjük, a pollen funkcióképes lesz. Ez a rendszer a hímsteril anyavonalak felszaporítására használható. A recesszív sterilitás elérésnek legfontosabb célja szintén a fertilitás könnyű helyreállítása, mert ebben az esetben a domináns partner automatikusan restorer lesz. Arabidopsis-ban állítottak elő, pontosabban izoláltak olyan NMS géneket, melyek hibás génterméke, vagy hiánya sterilitást okozott. Amennyiben ismertek a pollenfertilitásért felelős gének, akkor azok célirányosan elronthatók. Az elrontott gének recesszíven öröklődnek és a fertilis, hibátlan gént hordozó növénnyel keresztezve 100%-ban fertilis heterozigóta utódokat kapunk.

5.1.5. 12.1.5. Hímsterilitás kémiai kezeléssel GM növényekben Kémiai úton, permetezéssel kiváltott hímsterilitással 50 éve foglalkoznak. A különböző kémiai hibridizációs anyagok (chemical hybridizing agent, CHA) azonban nem tudtak széles körben elterjedni, mert alkalmazásuk során számos probléma merült fel, pl. részleges hímsterilitás, rövid ideig tartó hímsterilitás, csökkent női fertilitás stb. A géntechnológia új stratégiáját olyan megközelítés jellemzi, melyben a transzgén meghatározza a CHA hatását a növényen helyileg is és módjában is. A stratégia a citokróm P450 génre alapul, melyet a Streptomyces ariseolus-ból izoláltak. A P450 gén terméke a szulfonilurea R7402 hatóanyagát közömbös formából toxikussá alakítja. A gént a TA29 promoterhez kapcsolva biztosítható volt a tapétumspecifikus expresszió a virágzás stádiumában. A GM növények (TA29-P450) permetezés nélkül hímfertilisek. Amennyiben virágzáskor az R7402 szerrel kezeljük őket, a hímsterilitás bekövetkezik, mert a tapétum sejtekben termelődik a P450 enzim, mely az R7402-szert a sejtek számára toxikussá alakítja át. A problémát az jelenti, hogy elhúzódó virágzás esetén a permetezést többször el kell végezni, mert a permetezéskori kis bimbókból, ahol a TA29 promoter még nem működik, hímfertilis virágok fejlődhetnek. Végeredményben a R7402/P450 rendszer lehetővé teszi a nemesítő számára, hogy törzseinek hímfertilitását vagy sterilitását saját céljai szerint módosítsa. Abban az esetben, ha a vonalat akarják felszaporítani, akkor nem kell permetezni, ha hibrid F1 magot akarnak előállítani akkor permetezni kell. E rendszer előnye továbbá, hogy nincs szükség Rf génre.

5.1.6. 12.1.6. Gyakorlati alkalmazás Az NMS (TA29-barnase) x Rf (TA29-barstar) rendszert (AgrEvo Seedlink) sikerrel alkalmazták olajrepce, cikória és kukorica nemesítési programokban. A három faj közül a transzgénikus hibrid olajrepce 1995-ben került köztermesztésbe Nagy-Britanniában, majd 1996-ban a transzgénikus hibrid cikória termesztését engedélyezték az EU-ban (12.1/2. ábra).



12.1/2. ábra: Génikus hímsterilitás repcében és kukoricában. Hímfertil repce (A) és kukorica (C) növények fejlett portokokkal (nyilak). A barstar gént tartalmazó Seed Link hímsteril transzgénikus repce (B) és kukorica (D) (Jekkel Zs. és Farády L. kísérlete, AgrEvo) Ezek az eredmények valószínűsítik, hogy a géntechnológia felhasználásával a hibrid nemesítés olyan fajokra is kiterjeszthető (paradicsom, dinnye stb.), melyeknél a hagyományos módszerekkel a kereskedelmi méretű hibrid vetőmag előállítás nem, vagy nehezen lehetséges. Összefoglalva, a transzgénikus hímsterilitás kiváló példája annak, hogy specifikus promoterekkel hogyan befolyásolható a sejtek élete vagy halála. A hímsterilitás ily módon történő kiváltása kézenfekvőnek és egyszerűnek tűnik. A hibridnemesítésben való alkalmazás azonban már olyan részproblémákat is felvet, ami további módosításokat tesz szükségessé. Az első közlemény a transzgénikus hímsterilitás sikeres kiváltásáról 1990-ben jelent meg a Nature-ben, és 1995-ben már köztermesztésbe került a GM hibrid repce, ami a fejlődés és fejlesztés felgyorsulását bizonyítja. Nagyon biztató a géntechnológia és a kémiai kezelés kombinált alkalmazása, mely valószínűleg hosszútávú megoldást fog jelenteni egyszerűsége és praktikussága miatt. 306 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


5.2. 12.2. A növények növekedését, fejlődését és morfológiai felépítését érintő géntechnológiai beavatkozások A gazdaember számára a növény különböző szervei jelentik a betakarítandó termést. A növénytermesztés eredményessége az egyes szervek méretétől, morfológiai, beltartalmi sajátosságaitól függ. Zöldtakarmányok esetében a növény magassága, a növekedés üteme, a földfeletti szervek, mint a levél, a szár struktúrája határozzák meg a termést. A cukorrépa-termesztés biológiai hátterét a gyökér szerkezeti felépítése és anyagcsere-folyamatai jelentik. A kenyérgabonák szemtermését alkotó embrió és endospermium szintén nagyon összetett fejlődési program terméke. A reproduktív szervek sajátosságai vitathatatlanul fontos agronómiai tényezők. Így érthető, hogy viszonylag nagy kutatási kapacitásokat köt le a növények egyedfejlődési programját meghatározó gének, szabályzó mechanizmusok, hormonális anyagcsereutak feltárása és szerepük megismerése. A géntechnológia módszerét is felhasználó sejt- és fejlődésbiológia alapvető, új felismerésekkel teremti meg azt az ismeretanyagot, amely egy ponton lehetővé teheti majd a gazdasági növények struktúrális és funkcionális megtervezését és átalakítását. Lényegében a növénynemesítők évszázadok óta munkálkodnak hasonló céllal. Ehhez a tevékenységhez ad új koncepciókat és eszközöket a molekuláris és sejtbiológia. A növények egyedfejlődése során a hormonszerű növekedésszabályzók (auxinok, citokininek, etilén, gibberellinek, abszcizinsav) igen fontos szerepet játszanak a merisztémák kialakulásában, a szervek differenciálódásában, az embriók kifejlődésében. Ennek figyelembevételével több próbálkozás is történt a hormonok szintézisének, lebontásának módosítására, a sejtek hormonérzékenységének megváltoztatására a génizolálás és beépítés módszerét alkalmazva. Többek között számos laboratórium használta génbeépítésre az Agrobacterium citokinin génjét (ipt), amely az izopentenil-transzferáz enzimet kódolja. Az enzim működése következtében a transzformáns dohánynövényekben jelentős mértékben megemelkedett a zeatin- és a zeatin ribozid-tartalom. Erős virális CaMV35S promoterrel működtetve a gént a transzformánsok súlyos fejlődési rendellenességeket (törpe növekedés, sok oldalhajtás képződése, deformált levelek) mutattak, így agronómiai jelentőséggel nem rendelkeztek. A géntechnológiai megközelítések lehetőségeit szemlélteti GAN és AMASINO (1995) szellemes kísérlete. Ismert, hogy citokinin adásával késleltethető a levelek öregedése, elszáradása a szeneszcencia folyamán. Ezért az ipt gén működtetését a szeneszcens levelekre korlátozták azzal, hogy egy szeneszcencia függő gén (SAG12) promoterét használták. A dohány transzformánsok levelei meghosszabbított ideig maradtak épek és funkcionálisak. Az etilén, mint növekedést szabályozó gáz, igen sokirányú hatást fejt ki a növény egész életciklusa alatt. Arabidopsisban ismert az etilénreceptor-fehérje mutáció etr1-1, amely etilén érzéketlenséget alakít ki a növényekben. Az etr1-1 cDNS-t a virális CaMV35S promoterrel történt összeépítése után WILKINSON és mtsai (1997) paradicsom transzformánsokat állítottak elő. Mivel ez egy domináns mutáció, a transzformánsok etilénre érzéketlen fenotípust mutattak, aminek következtében a virágok késve hulltak le, késett a termés érése. Az előzőekben láthattuk, hogy az abszcizinsav (ABA) kiemelt szerepet játszik a legkülönbözőbb stresszreakciókban, de hasonlóan fontos a mag fejlődése, érése során kifejtett hatása is. Így érthető, hogy az ABA biológiai hatásait befolyásoló mechanizmusok különösen az érdeklődés középpontjában állnak. A különböző ABA-anyagcsere mutánsok mellett az ABA-specifikus ellenanyagok használata hasznos információkkal szolgálhat. Az ABA-hoz nagy specifitással és affinitással kapcsolódó monoklonális ellenanyagot egér hibridómasejtekkel lehetett megtermeltetni. cDNS-bankot készítve ezekből a tenyésztett egérsejtekből izolált mRNS felhasználásával kikereshetők az immunoglobulin (IgG) nehéz (V H) és könnyű (VL) láncait kódoló cDNS-klónok. A cDNS-ek szekvenciája a két láncra specifikus PCR primerekkel amplifikált próbákkal lehetséges. A kiválasztott cDNS-klónokat bakteriális expressziós vektorba építhetve megszintetizálhatók és ELISA módszerrel kikereshetők az immunoglobulin-láncok, amelyek keresztreagálnak az ABA-val. A két lánc cDNS-ét már a bakteriális kifejeztetéshez egy összekötő felhasználásával egymáshoz kell kapcsolni. Az így létrehozott egyszálú scFv ellenanyag specifikusan felismeri az ABA antigént. Az összeállított scFv gén aztán növényi expressziós vektorba építhető, amelynek főbb elemeit az 12.2/1. ábra mutatja. Mint látható, ez a konstrukció egy magspecifikus regulátorszekvenciával a lóbabból származó ún. USP promoterrel működik. Az N-terminális végén elhelyezett legumin B4 szignálpeptid és a C-terminális részen lévő KDEL szekvencia azt a célt szolgálja, hogy az ellenanyag az endoplazmatikus retikulumban halmozódjon fel. A c-myc szekvencia mint címke (tag) szerepel és a fehérjetermék immunológiai kimutathatóságát biztosítja. Az előállított dohánytranszformánsok magjainak fejlődése jelentősen megváltozott, hiszen a teljes ABA mennyisége 30–60szorosára emelkedett, ugyanakkor a szabad ABA nem volt kimutatható az embriók 21 napos koráig. A fejlődő magvakban a kotiledonok megzöldültek, kevesebb raktározott magi fehérje és olajzárvány szintetizálódott. A magok korai csírázást mutattak illetve teljes beérés után már nem tudtak kicsírázni. Mindezek szerint hormonspecifikus ellenanyagok szintetizáltatásával alapvetően befolyásolható a növények egyedfejlődési programja. 307 Created by XMLmind XSL-FO Converter.


12.2/1. ábra: Biológiai hatás elérésére lehetséges ellenanyagok szintetizáltatása transzgénikus növényekben Az ábra felső részén egy antitestmolekula főbb összetevői láthatók. Az antigénkötésben a könnyű és nehéz lánc NH2- végén elhelyezkedő variábilis régióknak (VL és VH) van szerepük. Ha az egyik lánc Fvfragmentjeit egy rövid szintetikus peptid összekapcsolja, akkor keletkezik az scFvs struktúra. Hibridoma sejtvonalból, amely a kívánt ellenanyagot termeli, cDNS-bank készítése után megfelelő PCR-primerek segítségével izolálhatók a VL és VH régiókat kódoló cDNS-ek. Növényi expressziós vektorral biztosítható a kialakított ellenanyag szintézise növényben. Az ABA elleni ellenanyag szintézisét magspecifikus szignálmolekulák irányítják (Tavladoraki és mtsai, 1993, valamint Phillips és mtsai, 1997 nyomán) A petesejt megtermékenyítésével kialakuló zigóta első aszimmetrikus osztódásával indul el a növény egyedfejlődési programja. Az embrió kialakulása során az egymást követő osztódások eredményeként meghatározott helyzetű, funkciójú sejtek koordinált együttműködése vezet a hajtás- és gyökérmerisztémák megjelenéséhez. Ezzel alapozódik meg a növény testének polarizált növekedése és fejlődése. A hajtásmerisztémák szintén átalakulnak egy genetikai program szerint az ivarszervek differenciálódását megvalósító virágzati majd virágmerisztémává. Az egyedfejlődés, ún. ontogenezis belső szabályozottsága a gének koordinált működésével, hormonális jelátviteli rendszerek egymásra épülésével biztosítható. Így megalapozottnak látszik az a felismerés, amit nagyszámú kísérleti tény is megerősít, hogy a fejlődési mestergének sokszor transzkripciós faktorokat kódolnak. A többsejtű eukarióta szervezetben, mint a növények esetében is, az ún. homeoboxgének termékei, a homeorégióval rendelkező fehérjék határozzák meg a szervek helyét, identitását és a sejtek sorsát. Ezek a fehérjék DNS-kötő illetve transzkripciót elindító funkcionális elemekkel rendelkeznek, és specifikus fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakítására képesek. Mint a stresszválasz géntechnológiai befolyásolásakor láthattuk, transzkripciósfaktor-gének kifejeztetésével jelentős hatások érhetők el, és hasonló lehetőséget kínálnak a fejlődést befolyásoló transzkripciósfaktor-gének is. A transzformációval kiváltható morfológiai, fejlődési hatások valóban igen jelentősek. Sok esetben ezek a növények a funkciók tisztázását segítik és közvetlenül nem jelentenek agronómiai értéket. Jól kiegészítik a mutánsokkal végzett vizsgálatok következtetéseit. Természetesen az ilyen gének izolálásával és beépítésével a végső cél hasznos, új növényvariánsok előállítása. 308 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A korai és késői embriógenezis során az ún. LEC1 (LEAFY COTYLEDON1) gén szükséges a szuszpenzor sejtek funkciójához, a kotiledon (sziklevél) specializációjához, az érési folyamatokhoz és a csírázás megakadályozásához. Lotan és mtsai (1998) ezt az Arabidopsis gént CaMV35S promoterrel túltermeltették a lec1 mutáns növényekben. Meglepetésre a transzformánsok levelein több embrió- és kotiledonszerű struktúra alakult ki minden külső hormonkezelés nélkül. A LEC1 fehérje egy CCAAT-boxhoz kötődő transzkripciós faktor. Ismertek olyan recesszív mutációk, mint pl. az ún. pickle mutáció, amely szomatikus embriók megjelenését okozta Arabidopsis gyökerekben. A gyökérepidermisz érése során kétféle sejttípus alakulhat ki, a gyökérszőrsejt illetve a gyökérszőr nélküli sejt. Több gén is befolyásolja a gyökérszőrsejtek helyét és számát. A CAPRICE (CPC) fehérje egy Myb típusú DNSkötő régióval rendelkező transzkripciós faktor (Wada és mtsai 1997). Ha a gén mutációt szenved, kevesebb és rendezetlen elhelyezkedésű gyökérszőr differencálódik. A CPC cDNS-t CaMV35S promoterrel kifejeztetve a gyökereken igen nagyszámban találhatók gyökérszőrök. A CPC fehérje túltermelődése a leveleken a trichómák kialakulását gátolta. Eredetileg a kukoricában leírt domináns knotted1 (kn1) homeoboxgén mutációja hívta fel a figyelmet a merisztéma funkciójában és a levélkezdemények kialakulásában szerepet játszó KN fehérjére. A kukoricán kívül rizsből (OSH1), Arabidopsis-ból (KNAT1), szójából izolálták a KN fehérjét kódoló transzkripciósfaktor-gént és jelentős számban állítottak elő túltermelő transzformáns növényeket. Dohányban a virális CaMV35S promoterrel kifejezve akár a kukorica, rizs vagy szója cDNS-t, igen jellegzetes fenotípus figyelhető meg. Nevezetesen megváltozik a levelek alakja, erősen fodrozott a levéllemez, apikális dominancia hiányában sok oldalhajtás fejlődik illetve merisztémák jelennek meg a leveleken. (3/8. ábra) A növények elég jól hasonlítanak a citokinint túltermelő transzformánsokhoz. Természetesen a morfológiai sajátosságok egyedi transzformációs eseményenként változnak. A rizs OSH1 gént kifejező transzformánsok esetében meghatározták az egyes hormonok szintjét (KUSABA és mtsai, 1998). Az immunoreaktív gibberellin 0,4–3,5%-a volt a kontrollnövényekben mért GA-szintnek. Csökkent a transzformánsok ABA-tartalma is. A zeatin szint 3–10szeresére emelkedett, de a zeatin-ribozid mennyisége nem változott. Ezek a hormonmennyiségi adatok rámutatnak a fejlődési gének és hormonális folyamatok feltételezhető kapcsolatára. Arabidopsis növények morfológiáját és fejlődési ütemét módosíthatja egy speciális homeobox géncsalád cDNSének beépítése transzformáns növényekbe (Schena és mtsai, 1993). A HAT4 gén terméke nemcsak a homeorégióval hanem egy leucinzipzár motívummal is rendelkezik. Ha a HAT4 gént szensz illetve antiszensz formában építették be, az Arabidopsis transzformánsok felgyorsult illetve redukált növekedési ütemet mutattak. A virágzási időt szabályozó gének szintén lehetőséget adnak az egyedfejlődés befolyásolása: a vegetatív fázisból a generatív fázisba való átmenet bekövetkezését változtathatják meg (lásd összefoglaló: NILSSON és WEIGEL, 1997). Botanikai tanulmányainkból tudjuk, hogy a növényfajok rendszertani hovatartozásának, a faji határok kialakításának fontos meghatározói a virág szerveinek (csésze-, sziromlevél, porzók száma és helyzete) jellemzői. Ezért különösen meglepőek a virágok felépítését érintő homeotikus mutációk. Ezek jelentősen megváltoztathatják a virágok szerkezeti felépítését (összefoglaló: THEISSEN és SAEDLER, 1995). A virágszervek kialakulását közvetlenül irányítják az ún. MADS-box gének, amelyek az ún. MADS-régióval rendelkező fehérjéket kódolják. A MADS fehérjeszakasz DNS-kötő képességgel rendelkezik, és fehérje-fehérje kölcsönhatásokban vesz részt. A MADS-box gének mind kétszikű, mind egyszikű növényekben megtalálhatók. A mutánsok vizsgálata szerint az APETALA1 (AP1) és APETALA2 (AP2) gének irányítják a csésze- és sziromlevelek kialakulását. Az APETALA3 (AP3) és PISTILLATA (PI) gének szerepet játszanak a sziromlevelek és porzók kifejlődésében. Az AGAMOUS (AG) gén szükséges a porzók és a bibe morfogeneziséhez. Egyetlen MADS-box gén, pl. az AP3 konstitutív kifejeztetése azt eredményezte, hogy a termő helyén is portokok alakultak ki (JACK és mtsai 1994). A MADS-box gének lehetséges kertészeti alkalmazására világít rá a gerbera transzformánsok előállítása (YU és mtsai 1999). Az agamous csoportba tartozó gaga2 gént valamint a globosa típusú gglo1 gént szensz és antiszensz formában transzformálták gerberanövényekbe. A GaGa2-t túltermelő növények virágaiban nagyszámú porzó fejlődött. Az antiszensz gglo1 expresszió szintén jelentős változást eredményezett a virág megjelenésében.

5.3. 12.3. A terminátor technológia A terminátor technológia tulajdonképpen a magban az embrió abortálás – generációfüggő – kiváltásának géntechnológiai eljárását jelenti. A technológia kiváló példája annak, hogy a géntechnológia a magasabbrendű növényekben a következő évszázadban milyen kifinomult megközelítéseket tesz lehetővé. A terminátor technológia kidolgozásának elvi és gyakorlati lehetőségeit az Egyesült Államokban 1998-ban ,,Növényi génexpresszió szabályozása” címmel elfogadott szabadalom (USA-patent No. 5, 723, 765) tartalmazza.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A szabadalomban foglalt eljárás és megközelítés elvileg lehetővé teszi a szabadalom tulajdonos számára, hogy előre megtervezett molekuláris program szerint a transzgénikus növényben géneket kapcsoljon be, illetve kapcsoljon ki. Ezzel a növények fejlődésének bizonyos fázisában és a növények különböző szerveiben, szöveteiben, vagy sejtjeiben olyan fehérjék termelését indíthatja el vagy gátolhatja, amelyek valamilyen gazdasági előnyt jelentenek. A terminátor technológia a szabadalomban foglalt lehetőségek gyakorlati megvalósítására irányuló kezdeményezés. Célja, hogy a vetőmagot felhasználó termelő minden évben megvásárolja a termeléshez szükséges vetőmagot. A technológia ezt a gyakorlati célt egy briliáns géntechnológiai rendszerrel éri el. A siker eléréséhez 3 molekuláris feltételt kell teljesíteni: • rendelkezni kell egy sejtre toxikus génnel (terminátor gén) és egy embrióspecifikus promoterrel, • molekulárisan biztosítani kell a terminátor gén reverzibilis kikapcsoltságát, • rendelkezni kell a terminátor gén bekapcsolhatóságát biztosító molekuláris rendszerrel. A fenti három követelménynek az 12.3/1. és 12.3/2. ábrákon közölt konstrukció felel meg.

12/3.1. ábra: Terminátor konstrukció kikapcsolt állapotban (Részleteket lásd a szövegben Az 1. ábra alapján a sejtekre toxikus fehérjét az ún. RIP-gén (riboszóma inaktiváló fehérje) kódolja, melynek átírását specifikus LEA (az embriógenezis késői fázisára specifikus) promoter szabályozza. Ez a gén tehát a növény fejlődésének ún. magérés stádiumában és csak az embrió sejtjeiben kapcsol be. Ennek megfelelően az embrió sejtekben leáll a fehérjeszintézis, az embrió elpusztul. Mivel a mag erre az időre már kifejlődött, a termés nem csökken, a mag viszont csírázásra képtelen lesz.



12/3.2. ábra: Terminátor konstrukció bekapcsolt állapotban (Részleteket lásd a szövegben) Abból a célból, hogy ezt a transzgénikus növényt fel lehessen szaporítani, a GM növényben ezt a gént működésképtelenné kell tenni, de úgy, hogy a gén később, amikor mi akarjuk, működhessen. Ezért a LEA promoter és RIP gén közé egy DNS szekvenciát (inszert DNS) építettek be, mely amíg jelen van a génben, átírás nem történik. Ez lehetővé teszi, hogy a gént tartalmazó fajtát több generáción keresztül is felszaporítsuk. A terminátor gén bekapcsolásához az inszert DNS-t el kell távolítani, ezért az inszert 5‟ és 3‟ végére ún. fordítva ismétlődő szekvenciát kapcsoltak, mely szekvenciát hasítani képes enzim génjét (rekombináz gén) szintén beépítették a vektor konstrukcióba. A rekombináz gén működését egy represszor függő promoter szabályozza, tehát az enzim csak akkor termelődik, amikor a promoterhez nem kapcsolódik represszor fehérje. Abból a célból, hogy ez a transzformáció során eleve gátolt legyen, egy harmadik gént is építeni kell a konstrukcióba, amely az előbbi promoterre specifikus represszort termeli. Ezt a represszor gént egy folyamatosan működő promoter gén mögé építették. A konstitutív promoter miatt a represszor folyamatosan termelődik és a represszor függő promoterhez kapcsolódik. A promoter és represszor kapcsolódása miatt a rekombináz nem tud termelődni, ennek megfelelően az inszert DNS a helyén marad. Ez a terminátor konstrukció represszált (gátolt) alaphelyzete (12.3/1. ábra). Ebben az állapotban a transzgénikus növények ugyanolyan termékenyek, mint a normál növények és csíraképes magot teremnek. Abban az esetben, amikor a tulajdonos felszaporította és előállította a szükséges mennyiségű vetőmagot, akkor a kereskedelmi forgalmazás előtt a magot egy olyan oldatban áztatja, melyből a magba bekerülhet az a molekula (pl. antibiotikum), mely a sejtekben képes a represszor fehérjéhez kapcsolódni. E kapcsolódás következményeként a represszor fehérje nem tud a rekombináz gén represszor függő promoteréhez kapcsolódni, tehát a rekombináz gén átírása megkezdődik (12.3/2. ábra). A rekombináz enzim pedig a DNS-t pontosan azoknál a szekvenciáknál tudja hasítani, mely szekvenciák határolják az inszert DNS-t. A következmény az lesz, hogy az inszert DNS kivágódik a toxin génből. Azonban a RIP toxin nem jelenik meg a sejtekben, mert azt egy embriógenezis specifikus promoter szabályozza, tehát csak az embrió sejtjeiben, illetve az embrió késői fejlődési fázisában fog bekapcsolni. Ennek következtében a gazda által megvásárolt vetőmag csírázóképessége, növekedése és fejlődése, termőképessége semmiben sem fog különbözni a hagyományostól. A különbség a magérés folyamán csak specifikusan az embriósejtekben jelentkezik, amikor is a LEA promoter bekapcsolja a RIP gént. A bekapcsolás következménye az embrió elhalása lesz, ami azonban nem befolyásolja a mag


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták gazdasági, ipari, élelmiszeripari értékét, viszont alkalmatlan vetőmagnak, mert csírázásra képtelen (12.3/2. ábra). E rendszer – amennyiben működőképes – sok hasznos gazdasági cél elérését is szolgálhatja a jövőben. Felhasznált és ajánlott irodalom GAN, S., AMASINO, R. M. (1995): Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin. Science, 270, 1986–1988. JACK, T., FOX, G. L., MEYEROWITZ, E. M. (1994): Arabidopsis homeotic gene APETALA3 ectopic expression: transcriptional and posttranscriptional regulation determine floral organ identity. Cell, 76, 703–716. KUSABA, S., KANO-MURAKAMI, Y., MATSUOKA, M., TAMAOKI, M., SAKAMOTO, T., YAMAGUCHI, I., FUKUMOTO, M. (1998): Alteration of hormone levels in transgenic tobacco plants overexpressing the rice homeobox gene OSH1. Plant Physiology, 116, 471–476. Leemans J. (1992): Genetic Engineering for Fertility Control. In: Dattée, Y., Dumas, C., Gallais, A. (eds.): Reproductive Biology and Plant Breeding. 101–106. Springer Verlag, Berlin–Heidelberg–New-York. LOTAN, T., OHTO, M., YEE, K. M., WEST, M. A., LO, R., KWONG, R. W., YAMAGISHI, K., FISCHER, R. L., GOLDBERG, R. B., HARADA, J. J. (1998): Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryo development in vegetative cells. Cell, 93, 1195–1205. Mariani, C., M. D. Beuckeleer, J. Truettner, J. Leemans, R. B.Goldberg (1990): Induction of male sterility in plants by a chimaeric ribonuclease gene. Nature, 347, 737, 741. MARTIN, C. (1996): Transcription factors and the manipulation of plant traits. Curr. Opin. Biotechnology, 7, 130–138. NILSSON, O., WEIGEL, D. (1997): Modulating the timing of flowering. Curr. Opin. Biotechnology, 8, 195– 199. PHILIPS, J., ARTSAENKO, O., FIEDLER, U., HORSTMANN, C., MOCK, H-P., MÜNTZ, K., CONRAD, U. (1997): Seed-specific immunomodulation of abscisic acid activity induces a developmental switch. The EMBO Journal, 16, 4489–4496. SCHENA, M., LLOYD, A. M., DAVIS, R. W. (1993): The HAT4 gene of Arabidopsis encodes a developmental regulator. Genes. Dev., 7, 367–379. TAVLADORAKI, P., BENVENUTO, E., TRINCA, S., DE MARTINIS, D, CATTANEO, A., GALEFFI, P. (1993): Transgenic plants expressing a functional single-chain Fv antibody are specifically protected from virus attack. Nature, 366, 469–472. THEISSEN, G., SAEDLER, H. (1995): MADS-box genes in plant ontogeny and phylogeny: Haeckel‟s „biogenetic law‟ revisited. Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 628–639. WADA, T., TACHIBANA, T., SHIMURA, Y., OKADA, K. (1997): Epidermal cell differentiation in Arabidopsis determined by a Myb homolog, CPC. Science, 277, 1113–1116. WILKINSON, J. Q., LANAHAN, M. B., CLARK, D. G., BLEECKER, A. B., CHANG, C., MEYEROWITZ, E. M., KLEE, H. J. (1997): A dominant mutant receptor from Arabidopsis confers ethylene insensitivity in heterologous plants. Nature Biotechnology, 15, 444–447. Williams M. E. (1995): Genetic engineering for pollination control. Trends in Biotechnology, 13, 344–349. YU, D., KOTILAINEN, M., POLLANEN, E., MEHTO, M, ELOMAA, P., HELARIUTTA, Y., ALBERT, V. A., TEERI, T. H. (1999): Organ identity genes and modified patterns of flower development in Gerbera hybrida. Plant J., 17, 51–62.



6. 13. Transzgénikus növények, mint bioreaktorok (Heszky L.) A korábbi fejezetekben közöltekből egyértelműen következik, hogy a növényekkel, pontosabban a növényi sejtekkel bármilyen eredetű fehérje megtermeltethető (vírus, baktérium, gomba, rovar, emlős, ember stb.) abban az esetben, ha a fehérje génjét a növényi sejtekben működő szabályozó DNS szakaszokkal (promoter, terminátor stb.) összekapcsolva juttatjuk a növénybe. Abból a célból, hogy az idegen fehérje ne okozhasson problémát a növényi sejtek anyagcsere és egyéb életfolyamataiban, illetve a rekombináns fehérjét a sejt enzimjei ne bontsák le, a génkonstrukcióba célba juttató peptid szekvenciák génjeit is beépítik, melyek a vakuólumba vagy a sejtközötti járatokba juttatják a termelt, vagy túltermelt génterméket. Ebben a megközelítésben a GM növénnyel olyan anyagokat termeltetünk, melyekre nem a növénynek, hanem az iparnak (gyógyszeripar, műanyagipar, élelmiszeripar stb.) van szüksége. A GM növények sejtjei termelik ezeket az anyagokat, azok felhalmozódnak a növényben, vagy bizonyos részeiben, és a feldolgozás során kivonják őket a GM növényekből. Nyilvánvaló, hogy csak akkor éri meg a GM növényeket bioreaktorként felhasználni, ha egyrészt a megtermelt és kivont anyag közvetlenül, vagy kisebb módosításokat követően felhasználásra alkalmas, és az előállítás gazdaságos. Amennyiben gazdaságos, még mindig nem biztos, hogy felhasználásra kerülnek ezek a GM növények, mert a piacon versenyezniük kell a hagyományos fermentációs előállítással, illetve a GM állatok – mint bioreaktorok – által előállított hasonló termékekkel. Tehát nem csak a GM növények, hanem a GM állatok is felhasználhatók bioreaktorként, sőt a hagyományos fermentációs bioreaktorok hatékonysága is javítható megfelelően módosított GM mikroorganizmusok alkalmazásával. Az idő, az árak, a gazdaságosság, az előállítás nagyságrendje stb. szempontok fogják eldönteni a jövőben, hogy egy-egy vegyületet GM növényben, GM állatban vagy GM mikroorganizmusokat használó hagyományos bioreaktorban fognak-e előállítani. Az ipari célú anyagcsere-módosításokat (zsírsav, keményítő, fehérje) korábbi (11.) fejezetekben már részleteztük. Ebben a pontban azokat a stratégiákat mutatjuk be, melyek a GM növények alapvetően új termesztési és ipari felhasználási lehetőségeinek megteremtését célozzák. Ezek a megközelítések jelentik az alapjait egy új irányzatnak, a molekuláris gazdálkodásnak (molecular farming).



13/1. ábra: Fehérjék, peptidek nagy mennyiségű előállításának alternatív útjai növényekben, mint bioreaktorokban A: termeltetés idegen fehérjék, peptidek génjeinek működtetésével GM növényekben, B: termeltetés rekombináns vírusokkal, a fertőzött növényekben Ipari felhasználási célra kétféle módon termeltethetők idegen fehérjék a növényekben (13/1. ábra): az adott fehérje génjének működtetésével GM növényben, vagy GM vírus szaporodásával a fertőzött növényben.

6.1. 13.1. Idegen fehérjék, peptidek génjeinek működtetése GM növényekben Ebben az esetben a növények által termeltetni kívánt fehérje génjét növényekben működő transzformációs vektorba építik be, amely a termelés céljának megfelelő szabályozó szekvenciákat tartalmaz. Ilyenek a termelés és felhalmozás helyét és idejét biztosító specifikus promoterek (pl. gyümölcs, mag, gumó stb.), továbbá célbajuttató szekvenciák (pl. amiloplaszt, vakuólum, sejtközötti járat stb.) és a túltermelésüket biztosító elemek (pl. intron, enhancer elemek). A transzgénikus növények – a vektorkonstrukciónak megfelelően – fejlődésük meghatározott szakaszában, a megfelelő növényi részben elkezdik termelni és felhalmozni a kívánt fehérjét (13/1. ábra). Az így elérhető fehérjemennyiség az oldható fehérjék 0,01–1,0%-a. Az oldható fehérjetartalom viszont a növények szárazanyag termelésének átlagosan 4–5%-a. Ez azt mutatja, hogy a termelt idegen fehérje mennyisége még elég kicsi.



6.2. 13.2. Idegen fehérjék termeltetése rekombináns vírusokkal fertőzött növényekben Alapjaiban új megközelítés, mely a 90-es évek második felében került előtérbe abból a célból, hogy a növényekben termelt fehérjék és peptidek mennyisége jelentősen növelhető legyen (13/2. ábra).

13/2. ábra: Vakcina antigének termelésének alternatív lehetőségei növényekben. A1–A5: alegység vakcina termelés az alegység génjével transzformált GM-növényben. B1–B4: a kórokozó antigénje epitópjának kódját


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták tartalmazó szekvencia bejuttatása a vírus genomba, majd a kiméra gént tartalmazó vírussal növényfertőzés, a vírus szaporodása során a vírusfehérjék termelésével a vakcina antigén is felszaporodik a fertőzött növényben (Mason, S.H., Arntzen, C.J: 1995. TIBTECH. 13, 388–392) Lényege, hogy a termeltetni kívánt fehérje génjét a vírusba vagy annak genomjába építik be. A vírusalapú génvektor előállítható úgy, hogy az idegen gént külön promoterrel önállóan építik be a vírusgenomba egy meghatározott helyre, vagy egy vírusgén helyébe. Ilyen vírusalapú génvektorrá alakították át a TMV-t (dohánymozak vírus), melynek 4 génje van. Ezek közé építettek be egy új promotert az idegen gének számára. Ez egyben meghatározza az idegen gén későbbi beépítésének helyét is. Újabban a vírusgenom legnagyobb mértékben kifejeződő génjébe, a burokfehérje génbe építik be a termelendő peptidszekvencia génjét. E célra a tehénborsó mozaik vírust (CPMV) alakították át. A molekuláris kísérletek bizonyították, hogy a burokfehérje két alegységből épül fel, és a fehérjében mindegyiknek 60 másolata van jelen. Ezért a burokfehérje egyik alegységének génjét úgy módosították, hogy abba beépíthető legyen maximum 30 aminosavból álló peptid információja anélkül, hogy a burokfehérje funkcionálisan megváltozna. Ennek az a következménye, hogy minden vírus a köpenyfehérjében 60 másolatát tartalmazza a peptidnek. Ezért ezt a módszert köpeny-módszernek is hívják és a CPMV-n kívül újabb vírusokat, a TMV-t és a PVX-et (burgonya Xvírus) alakítottak át erre a célra. A PVX vektorral 240 növényfajt lehet megfertőzni, nincs biológiai vektora, maggal, virágporral nem terjed, nem épül be a gazdanövény DNS-ébe. A beépíthető fehérje mérete 5 kDa – 33 kDa. A fenti előnyök miatt a PVX vektorrendszer gyors elterjedése várható a közeljövőben. Az így előállított rekombináns (kiméra) vírussal fertőzik a növényeket. A vírus szisztemikus elterjedésével és szaporodásával a transzgén kópiaszáma is óriási mértékben felszaporodik. A vírusgének expressziójával nagy számban szintetizálódnak a kívánt fehérjék és peptidek. A növényből ezután ki kell nyerni a fehérjéket és peptideket, melyek nagyságrendje elérte pl. vakcina esetében a növényi oldható fehérjék 2%-át, a GFP esetében a 10%-át. Ez óriási mennyiség a hagyományos géntechnológiával elérhető 0,01–0,1% termelt mennyiséghez képest. Napjainkban ezt az eljárást még csak vakcina, illetve antitest előállítására tesztelik. Ez a megközelítés azonban nem csak a vakcinák, hanem különböző célokra felhasználható fehérjék ,,üzemi méretű” előállítását teszi lehetővé. A fehérjék tisztítása a vírusrészecskéktől történhet enzimatikusan vagy kémiailag. Az így termelt fehérjék felhasználhatók közvetlenül is, pl. bioremediációra, tápérték javítására, illetve növényvédelmi célokra. A vírus vektorokra alapozott termeltetés előnyeit a következők jelentik: −A növényi vírusok könnyen izolálhatók és módosíthatók; −A módosított vírussal a növények könnyen fertőzhetők; −Az idegen gén kifejeződése a vírusvektor alkalmazásával 100x-os a növényi genomba épített transzgén expressziójához képest; −A növényfajok száma nem korlátozott, mert minden növényfajnak van fertőző vírusa; −Olyan növényfajokkal is termeltethető GM fehérje, melyek esetében a „klasszikus” géntechnológia rutinszerűen még nem alkalmazható; −Nem igényli GM növények előállítását és a növényi vírusok nem veszélyesek az állati, illetve emberi szervezetre.

6.3. 13.3. A gazdaságos fehérjetermelés feltételei Az ipari célú fehérjetermelés GM növényekkel komplex folyamatot jelent, melynek egyes lépéseit is optimalizálni kell abból a célból, hogy a végtermék mennyisége és minősége megfelelő, és az előállítás gazdaságos legyen.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták 1. Megfelelő génkonstrukciók kialakítása: szerv és szövetspecifikus expressziót (pl. mag) biztosító promoterrel; fehérje lebomlás gátlása megfelelő kompartmentbe juttatással (vakuólum, sejtközötti járatok stb.); az expresszió mértékének fokozása erősítő (enhancer) elemekkel, intronokkal stb. 2. Megfelelő növényfajok kiválasztása: olyan fajok tűnnek a legmegfelelőbbnek, melyek nagy mennyiségben raktároznak anyagokat (fehérjék, zsírok, olajok) a magban pl. repce, gabonafélék. 3. Fehérje termelésének fokozása új rekombináns vírusokkal. 4. A termelődő fehérje glükozilációjának megelőzése: a glükozilálásra alkalmas szekvenciák génből történő eltávolításával, illetve módosításával azoknál a fehérjéknél, ahol az káros. 5. A fehérjebontás megakadályozása: a fehérje kinyerése során a magvak, növényi részek homogenizálása, extrahálása, centrifugálása során a fenolok és fenolszármazékok okozta fehérjebontás megakadályozásával. 6. A fehérje tisztítása és elválasztása: a rekombináns fehérjére speciális eljárások kidolgozásával. A fenti szempontok szerinti módosításokkal egyre több fehérje kereskedelmi méretű termelése várható a közeljövőben. A rendkívül erős piaci verseny miatt ezekről a fejlesztésekről kevés információ jelenik meg. A következőkben a legfontosabb fejlesztési irányokat ismertetjük.

6.4. 13.4. ,,Ehető vakcinák” termeltetése A vakcinázás az egyik legdrágább orvosi megelőző beavatkozás. Az aktív immunizálás jelenlegi formájában az elölt, vagy legyengített kórokozó bejuttatását jelenti az emberi vagy állati szervezetbe. A problémát az okozza, hogy a kórokozók egy része egyáltalán nem, vagy csak drágán szaporítható fel. A vakcinák új GM generációja már nem tartalmazza a teljes kórokozót, hanem annak csak egy alegységét (subunit). Ennek az alegységnek az előállítása történhet GM állatokban, vagy GM növényekben. Ez az alegység tulajdonképpen a kórokozónak azt a fehérjéjét – vagy annak is egy részét – jelenti, melyet a fertőzött szervezet, mint antigént ismer fel és ellene antitestet termel. A vakcinatermelő GM növényektehát nem a kórokozót, hanem annak speciális molekuláris jelét (epitópját) tartalmazó fehérjéjét (antigén peptidek) termelik (13/2. ábra). A GM növények által termelt vakcinákat ezért alegység vakcináknak, vagy epitópos vakcináknak is hívják. Az epitóp vagy más néven antigén determináns, a vírusok, baktériumok stb. fehérjéinek az a viszonylag rövid 10–30 aminosavból álló szakasza, melyet az emlősök immunrendszere antigénként azonosít, és amely molekuláris jelhez specifikusan kapcsolódni tudó molekuláris kötőhellyel rendelkező antitestet (immunfehérjét, immunglobulint) termel. Az antitest az antigénhez kapcsolódva megjelöli azt. Az antigén-antitest komplexeket az immunrendszer már képes elpusztítani. Az immunogén peptidek az emésztőcsatornán (nyálkahártyán) keresztül is képesek az állati vagy emberi szervezet immunrendszerét aktivizálni, és az antigén peptid molekuláris jelére specifikus antitest termelését kiváltani. Az alegység vakcinák GM növényekben való előállításának gondolata 1992-ben merült fel, mert a növényekkel lehet a legolcsóbb fehérjét és ennek következtében GM növényekkel a legolcsóbb transzgénikus fehérjét előállítani. Ez adja az emberiség kezébe azt a lehetőséget, hogy a szegény vagy fejlődő országok számára is nagy mennyiségben lehessen előállítani a vakcinákat. Különös jelentőségét a GM vakcina növényeknek az adja, hogy a vakcinázást az immunogén fehérjét tartalmazó GM gyümölcs elfogyasztása jelenti, tehát az – a korábbi vakcinázáshoz képest – nem igényel különösebb egészségügyi hálózatot vagy szervezetet, az a piacon vásárolt, vagy az utcán osztogatott gyümölccsel pl. banán is megoldható. 1997-ben az első immunogén fehérjét tartalmazó GM burgonya klinikai kipróbálása embereken sikeres volt. A GM növények tehát képesek a legkülönbözőbb emberi vírusos és baktériumos betegségeket okozó kórokozók sepcifikus immunválaszt kiváltó fehérjéit termelni. A GM növények ,,ehető vakcinákat” termelnek, ami azt jelenti, hogy a GM növény vagy annak termését közvetlenül elfogyasztva az immunogén peptidek az emésztőrendszer nyálkahártyáján keresztül képesek felszívódni és a megfelelő immunválaszt kiváltani. 317 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Természetesen a GM növényekből kivonható az immunogén GM fehérje és hagyományos vakcinázással – a vérbe juttatva – is felhasználható. Napjainkig az alábbi antigének expresszáltatása sikerült GM növényekben: • Hepatitisz B felületi antigén (HBsAg, Hepatitis B surface antigen) a GM dohány oldható fehérjének 0,01%-a volt. A GM dohányból tisztított kivonata az emberi és állati klinikai tesztekben immunválaszt váltott ki. Hatása megegyezett a jelenleg forgalomban is kapható „Recombivax”-hatásával, mely rekombináns vakcinát GM élesztőből kinyert HBsAg-ből állítják elő. • Veszettség vírus glikoprotein (1995). • Norwalk-vírus burokfehérje (1996). Általános gyomor és bélhurutot okozó vírus, az újszülöttek kiszáradását eredményező akut hasmenést idézi elő. • E. coli hőérzékeny enterotoxin B-alegység és kolera-toxin alegység (1997–98). Az újszülöttek és csecsemők krónikus hasmenését kiváltó kórokozók évente közel 1 millió gyermek halálát okozzák a fejlődő országokban. Az E. coli enterotoxin és a Vibrio cholerae esetében először meghatározták azt a fehérjét és annak azt az alegységét, amely mint antigén, a természetes fertőzést követően kiváltja a szervezet immunrendszerének specifikus immunválaszát, az antitest termelést. A CT-B-vel (kolera toxin B alegységek) transzformált burgonya viszont nem termelte elegendő mennyiségben a fehérjét. Ezért előállították annak szintetikus változatát, melynek koncentrációja elérte az oldható fehérjék 0,15%-át. A GM burgonyagumók – négyszeri (4-5g/alkalom) etetést követően – kiváltották az antitest termelést egerekben. Az emberi klinikai kísérletek is sikeresek voltak. • Rotavirus vírusszerű egységei (1999) . Vakcinák tranziens expressziója rekombináns vírussal fertőzött növényekben (13/2. ábra). A vírusvektorok lehetséges felhasználását a fejezet bevezetőjében már említettük. Felhasználása a vakcinák előállítására történhet úgy, hogy: • A gént a vírus promotere mögé építjük. E technikával sikerült a á-trichosanthin-t (antivirális fehérje) nagy mennyiségben előállítani. • A gént a burokfehérje génjébe vagy a gén C-terminális végéhez kapcsolva építik be a vírusba. A maláriából izolált epitópot is tartalmazó peptid génjét sikeresen fúzionáltatták a TMV (dohány mozaik vírus) burokfehérje gén C-terminális végével. Az ELISA tesztben a rekombináns burokfehérje specifikusan kapcsolódott a malária monoklonális antitestjéhez. Ez azt jelenti, hogy ez a fehérje emlősben malária antigénként fog viselkedni. A vírus mennyisége 1–2 g volt a növényi szövet 1 kg-jában. A 90-es évek végére már csak egyetlen kérdés – a növényfaj meghatározása – maradt a globális terjesztés elindításához. A választás a banánra esett, mely az egész világon széles körben fogyasztott gyümölcs. Az állatok számára a pillangós növényeket választották, melyek mind zöldtakarmányként, mind szemes takarmányként széles körben használatosak, és fehérjetartalmuk is nagy.

6.5. 13.5. Antitestek termeltetése Az előző pontban bemutatott vakcinatermelés célja az emberek aktív immunizálásához szükséges vakcinák nagymennyiségű, olcsó és egyszerű előállíthatósága volt. A géntechnológiával GM növényekben előállított alegység vakcinák a szervezetbe kerülve nem tudnak betegséget okozni, de az immunrendszerben a védekezést, az antitest termelést képesek kiváltani. Ezzel a szervezet egy későbbi fertőzéssel szemben védettséget szerez. Ez jelenti az aktív immunizálást. Ezzel szemben az antitestek olcsó és nagymennyiségű előállításnak legfontosabb célja az, hogy a már megbetegedett szervezet immunrendszerét támogassuk olyan oltóanyag bejuttatásával, mely a kórokozó leküzdéséhez a szervezet számára segítséget ad. Az oltóanyag ebben az esetben az adott kórokozóra specifikus antitesteket tartalmazza. Ez jelenti a passzív immunizálást. Az antitestek 4 láncból, 2 nehéz és 2 könnyű láncból álló fehérjék, melyek egyik végén van az antigén kötőhely. Az antitest kórokozó (antigén) specifitását ennek a kötőhelynek a molekuláris szerkezete határozza meg. Az antitesteket az állatok vérében lévő speciális sejtek, a â-limfociták vagy egyszerűen a B-sejtek termelik. 318 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Feladatuk, hogy az állati szervezetbe került, vagy ott szaporodó antigéneket (vírusok, baktériumok stb.) felismerjék, és azokhoz hozzákapcsolódjanak. Az antitesttel megjelölt antigéneket az immunrendszer más sejtjei (pl. makrofágok, ciotoxikus T-sejtek stb.) elpusztítják. További részleteket lásd Heszky és Sutka (1987) és Falus (1998) könyvében.

6.5.1. 13.5.1. Ex situ felhasználás (egészségügy, ipar stb.) Az antigén-antitest kapcsolódás rendkívül specifikus folyamat, melyet a két fehérje bizonyos szakaszainak molekuláris szerkezete határoz meg. Az antitestekkel tehát lehetőség van speciális molekulák jelenlétének bizonyítására, pl. orvosi diagnosztikában, vírusdiagnosztizálásban, speciális ipari molekulák kinyerésére, rendkívül kis mennyiségű anyagok szétválasztására, mely utóbbiak már különböző ipari felhasználást is jelentenek (13/3. ábra).

13/3. ábra: A GM növények által termelt antitestek és antitest fragmentumok (plantibodies) felhasználásának lehetséges területei a jövőben Végeredményben kórokozók, fehérjék, molekulák stb. felismerésére és azonosítására képes specifikus antitestek nagymennyiségű előállítása mind az egészségügy, mind más gazdasági ágazatok szempontjából fontos.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Az első antitestet termelő növényről 1989-ben számoltak be a Nature-ban. Az egér 6D-4-es antitestjét sikerült GM dohányban termeltetni. A kétlépéses megközelítés során külön növénybe jutatták be a nehézlánc, és külön növénybe a könnyűlánc génjeit, majd ezeket a növényeket keresztezve kapták azt a GM dohányt, mely mind a kétféle láncot termelte. A 6D-4 fehérje mennyisége az oldható fehérje 1%-át érte el a transzgénikus F1 növényekben. Abból a célból, hogy a GM növények által termelt antitestekkel a passzív immunizálás közvetlenül, tehát szájon keresztül is kivitelezhető legyen: a) az antitestek génjeit élelmiszernövényekbe célszerű beépíteni; aa) az antitesteknek a növény ehető részeiben kell termelődniük; aaa) az antitesteknek az elfogyasztott növényi rész szöveteiből és sejtjeiből könnyen kell kiszabadulnia. Az antitestek más célú (diagnosztikai, ipari stb) felhasználása esetén az antitesteket ki kell vonni a GM növényből és tisztítani kell.

6.5.2. 13.5.2. In situ felhasználás növényekben (növényvédelem) Fehérjék működésének gátlása (13/3. ábra) Az antitesttermeléssel, amennyiben az bizonyos növényi fehérjékre (enzimekre) specifikus, gátolni lehet ezeknek a fehérjéknek a működését, hasonlóan az antiszensz megközelítéshez. Ebben az esetben viszont van fehérjetermelés, csak a fehérje nem tud működni. A cél elérése érdekében ismerni kell a növényi fehérjére specifikus antitest aminosav sorrendjét. Napjainkban bizonyítottá vált, hogy az antitest specifitásáért felelős variábilis régió egyik könnyű láncának (sc) meghatározott fragmentumára (Fv) is elegendő gént konstruálni. Az scFv gének által termelt antitest fragmentummal a teljes antitesthez hasonló hatások érhetők el, ez a fragmentum is képes az ,,antigént” felismerni és hozzákapcsolódni. Az anti-ABA scFv-t termelő GM növények az ABA hiánymutánsokhoz hasonló fenotípust mutattak. További részleteket lásd a Fejlődésben módosított transzgénikus növények c. 12. fejezetben (12.2/1. ábra). Új védekezési mechanizmus kialakítása (13/3. ábra) Az antitestek az állatok és az ember esetében a kórokozókkal szembeni védelmet szolgálják. A növényekben nem működik ilyen rendszer. Az in situ felhasználások igazi jelentőségét a növényekben egy új védekezési mechanizmus kialakíthatósága jelenti. Feltételezik, hogy a kórokozók (vírusok, baktériumok) speciális molekuláris jeleit (epitópját) felismerő és hozzájuk kapcsolódni tudó antitestek a transzgénikus növényekben bizonyos fokú rezisztenciához vezetnek azáltal, hogy megakadályozhatják a kórokozók szaporodását, illetve elterjedését a növényben. Tulajdonképpen ezt a feltételezést erősítették meg az AMCV (articsóka ,,mottled crinkle” vírus) specifikus antitestet termelő dohány növényeken végzett vizsgálatok is. A GM dohány növények kevésbé voltak fogékonyak a vírusra és a tünetek később jelentek meg. A TMV-re (dohány mozaik vírus) specifikus antitest könnyű és nehéz láncainak génjeivel egy lépésben transzformált dohánynövények által termelt antitestek a sejtközötti járatokban halmozódtak fel. A GM növényekben a mesterséges vírus inokulációt követően szignifikánsan csökkent a nekrotikus léziók száma. A nekrotikus léziók továbbá negatív korrelációt mutattak az antitestek mennyiségével. Összefoglalva, a GM növények által termelt antitestek (plantibodies) in situ és ex situ is alkalmazhatók a jövőben. Egyre több közlemény számol be a növényekben funkcióképes antitestek vagy antitest fragmentumok sikeres termeltetéséről. A termelt antigén mennyiségét az anti-ABA scFv (az antitest variábilis régiója egyik láncának fragmentuma) esetében – az endoplazmatikus retikulumba juttatva – az oldható fehérjék 4,8%-ára sikerült növelni. Napjainkban még nem ismert olyan „plantibody“ (GM növény által termelt antitest vagy antitest fragmentum), melyet kereskedelmi méretekben állítottak volna elő. Az antitestek kivonása és tisztítása valószínűleg nem lesz olcsó, különösen azokban a felhasználási esetekben, ahol teljesen tisztított fehérjéket használnak. E vonatkozásban megoldást jelenthetne a növényekben a zsírsavanyagcserénél már ismertetett speciális szállító fehérjék, az oleozinok esetleges módosításával speciális felhalmozás elősegítése és biztosítása a magban. Tehát a rekombináns antitestek felhalmozását a raktározott fehérjék vagy zsírsavak szállításához és beépüléséhez hasonlóan kellene szabályozni a növényekben, illetve a magban. Az új típusú rezisztencia kialakításának jelentősége a növényekben beláthatatlan távlatokat nyithat. Azonban ehhez ismerni kellene a vírusok, baktériumok, gombák és nematódák, ,,antigén” fehérjéit, hogy azokra 320 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták specifikus (molekuláris) antitest géneket lehessen szintetizálni. Jelentőségét növeli továbbá, hogy a specifikus antitestekkel gátolni lehet a kórokozók kulcsenzimjeinek működését is és ezáltal is kiváltható, illetve javítható a rezisztencia. A kompatibilis gazda-parazita kapcsolat kialakulásában résztvevő speciális receptor fehérjék, jelátvivő molekulák, fitotoxinok, sejtfalbontó enzimek stb., antitesttel való gátlásának lehetősége is új utakat nyithat a molekuláris rezisztencianemesítésben.

6.6. 13.6. Heterológ fehérjék és peptidek termeltetése A GM növényekkel heterológ fehérjék is előállíthatók, főleg a gyógyszer és élelmiszeripar számára. E vonatkozásban a növényi rendszernek több előnye is van a mikrobiális fermentációval és a transzgénikus állatokkal szemben. A mikrobiális rendszerben az eukarióta fehérjék transzlációját követő módosításokra kicsi a lehetőség, a bakteriális fermentáció során gyakran oldhatatlan aggregátumok keletkeznek és az oldható natív fehérje előállítási költségei ezért jelentősen megnőnek. A fermentáció, és különösen az állati sejttenyésztés emellett nagyon tőkeigényes beruházást jelent. Ezenkívül a GM állatokkal kapcsolatos etikai problémák súlyosabbak, mint a GM növényeké. A fehérjék GM növényekben való előállítása (upstream folyamat) a legolcsóbb. Bár a heterológ fehérjék expressziója sok esetben még alacsony, de javítására több lehetőség is kínálkozik. A feldolgozási és tisztítási (downstream) eljárások drágábbak, bár azokat még részletesen nem vizsgálták. A relatív nagy költségek oka, hogy a teljes biomassza produkcióhoz képest a rekombináns fehérje aránya kicsi. Ezért első lépésben a koncentrálás és a tisztítás az, mellyel a költségek csökkenthetők. A koncentrálásra felhasználhatók az olajos növényekben termelődő olajtestek, mint fehérje és peptid szállítók. Az olajtestek szerkezeti fehérjéjével, az oleozinnal fuzionáltatott fehérjék várhatóan az olajos növények magjaiban, az olajtestek felületén akkumulálódnak. E rendszer első sikeres alkalmazását a trombin-inhibitor, a hirudin termelése jelentette. A GM növényekben a heterológ fehérjék koncentrációját általában az oldható fehérjék százalékában fejezik ki, ami egyben utal a génexpresszió mértékére is. A legnagyobb érték, amit GM növénnyel napjainkig elértek, az 1% fitáz termeltetés volt a GM dohányban. A géntechnológia lehetőségei a heterológ fehérjék mennyiségének növelésére GM növényekben a következők: • megfelelő promoter használata, • a promoter aktivitását fokozó enhancer (erősítő) elemek és intronok beépítése, • a genetikai kód optimalizálása növényi rendszerre, • a mRNS destabilizáló szekvenciák eltávolítása, • az integráció függő expresszió ismerete, • az idegen fehérje célbajuttatása megfelelő kompartmentekbe, • az idegen fehérje elbomlásának megakadályozása.

6.6.1. 13.6.1. Bioaktív peptidek Az első gyógyszeripari peptid, a (leu)enkefalin volt, melynek génjét a 2S1 albumin génjéhez kapcsolták. A 2S albuminok a legkisebb magban raktározott fehérjék közé tartoznak. Két alegységük van, egy 94 Da-os és egy 34 Da-os, melyeket diszulfid hidak kapcsolnak össze. Génjük konzervált, illetve változékony régiókból áll. A 2S albumin mint raktározott fehérje a magban halmozódik fel, mennyisége a mag raktározott fehérjéinek 20–60%a, fajtól függően. Az Arabidopsis 2S1 albumin és a repce 2S albumin gének variábilis régiójához kapcsolták az enkefalin génjét. A kiméra gén az eredeti 2S1 promoterrel működött az Arabidopsis-ban is és a repcében is. A szintetizálódó peptid (enkefalin) mennyisége 1g Arabidopsis magban 113 µg volt. A leválasztás az albuminról proteolitikus hasítással (tripszin) lehetséges.

6.6.2. 13.6.2. Emberi fehérjék 321 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták Transzgénikus burgonyában sikerült a humán szérum-albumint (HSA) termeltetni. Ez a fehérje a klinikai gyakorlatban széles körben használatos, azért nagy a gazdasági jelentősége. Az emberben a HSA először mint proalbumin szintetizálódik, ezt követően egy szerin-proteáz lehasítja a HSA 6 szerin-csoportját és a HSA NH2 terminális végén lévő szignál peptidet. A burgonya transzformáció során felhasznált vektor promotere a CaMV 35S volt. Ehhez kapcsolták a HSA szekvenciáját, a lucernamozaik vírus szintetikusan előállított vezető szekvenciáját, valamint a dohány PR-S extracelluláris fehérjéjének szignál peptidjét. A GM burgonyában a proHSA termelődött és kijutott a sejtközötti járatokba. Mivel a növényekben a szerin-proteázok ritkák, ezért a proHSA poszttranszlációs módosítása elmaradt. A HSA mennyisége a GM burgonya összfehérje 0,02%-a volt. A burgonyagumóból a keményítő kinyerése során a HSA nem mutatott változást és az ipari eljárást követő folyékony melléktermékben halmozódott fel. Ez azt jelenti, hogy az ipari célra termesztett burgonyával a HSA, ,,melléktermékként” is megtermeltethető, mely annak előállítási költségét jelentősen csökkentheti. Az interferonokat, mint védekező fehérjéket, az emberi sejtek általában a vírusfertőzés során termelik. Nagyon értékesek, ezért jelenleg bakteriális és állati sejttenyésztéses rendszerben állítják elő őket. A növényekből is izoláltak már interferonszerű fehérjéket, melyek azonban nem mutattak szerkezeti homológiát az interferonnal, ezért ezeket patogén-kapcsolt (PR) fehérjéknek nevezik. A CaMV-t mint expressziós vektort is használták a növények ilyen célú transzformációjához. A CaMV II. nyitott leolvasási keretének helyére építették be a humán-á-interferon génjét. A vírussal fertőzött növényekben az interferon gén expressziója nagy volt, és a termelődött fehérje mennyisége elérte a 2 µg/g friss súlyt. A humán â-interferon génjével transzformált GM növényekben termelődő interferon mennyisége viszont csak 0,17 µg/g friss súlyt ért el. A növények által termelt â-interferon aktív volt az emberben.

6.6.3. 13.6.3. Ipari enzimek A GM növényekben termelt fitáz jó példája annak, hogy GM növény eredetű enzimek közvetlenül felhasználhatók a gyakorlatban. A fitáz katalizálja a fitát konverzióját szervetlen foszfáttá és mio-inozitollá. A fitát a legtöbb növényfaj magjában a foszfor tárolására szolgál, az egyszerű gyomrú állatok azonban ebben a formában nem tudják hasznosítani, ezért a takarmányba szervetlen foszfort kell adagolni. Abban az esetben, ha a fitázt a takarmányba lehetne keverni, akkor a takarmány fitátban lévő foszfort az egyszerű gyomrú állatok is hasznosítani tudnák. Ezzel egyrészt a szervetlen foszfor adagolás megszüntethető, másrészt az állatok bélsarában lévő foszfor mennyisége is csökkenthető lenne. Az utóbbinak kedvező környezetvédelmi hatása sem lenne lebecsülendő. Az Aspergillus niger-ből származó fitáz génnel transzformált dohány magjából készült liszt – közvetlenül a takarmányba keverve – annyi foszfátot szabadított fel a fitátból, amennyi teljes mértékben képes volt helyettesíteni az addig a takarmányba adagolt foszfátot. A broiler csirkék növekedése emellett még gyorsabb is volt, mint foszfát adásakor. A fitáz mennyisége a GM dohány magjában elérte az oldható fehérjék 1%-át. Maga az enzim 67 kDa tömegű volt, kisebb, mint az Aspergillus enzim. A különbség oka az eltérő glikoziláció. A fitáz mennyisége a magvak tárolása során nem csökkent, és a magvak csírázóképessége sem változott. A jövőben a fitáz génnel olyan növényfajt célszerű transzformálni, mely általánosan használt a takarmánykeverékekben (pl. kukorica). Az á-amiláz a keményítő két komponensét (amilóz és amilopektin) felépítő cukormolekulák á-1,4 glikozid kötéseit hidrolizálja. A világon évente 5 millió tonna keményítőt hidrolizálnak, részben a keményítőt feldolgozó ipar, részben az élelmiszeripar (üdítőital gyártás, söripar, boripar stb.) számára. E célra a Bacillus licheniformis á-amiláza használatos. Ennek oka hőstabilitása és stabil aktivitása széles pH tartományban. A B. licheniformis-ból izolált á-amiláz gént CaMV 35S promoterrel működtették dohányban. A célbajuttatáshoz a dohány extracelluláris térben felhalmozódó RR-S fehérje szignál peptidjének kódját építették be. A GM dohányban termelődött á-amiláz a glikoziláció miatt 64 kDa volt, nagyobb, mint a baktériumé (55,2 kDa). A teljes deglikozilálást követően kapott enzim molekula tömege 55 kDa lett.


IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták A GM dohánymagból őrölt liszt hidrolizálta a kukorica és burgonya keményítőt. A hidrolízis termékeinek HPLC analízise alapján megállapítható volt, hogy nincs semmiféle különbség a növényi és bakteriális eredetű áamiláz hatása között. A növényben termelődő enzim tehát nem igényel további tisztítást. A GM növények morfológiailag megkülönböztethetetlenek voltak a nem transzformált növényektől. Az áamiláz termelése és a sejtközötti járatokban való raktározása nem befolyásolta sem a dohány-, sem a burgonyakeményítő termelését és felhalmozódását.

6.7. 13.7. Ciklodextrin termelés A dextrin a keményítő részleges lebontásakor keletkező oligoszacharidok keveréke. A ciklodextrinek 6 (á), 7 (â) vagy 8 (ã) á-1,4 D-glükóz egységből álló polimerek, melyeknek két vége összekapcsolódik. Szerkezetük henger alakú, melynek külső peremén helyezkednek el a glükózegységek hidroxilcsoportjai, a henger belső felületét pedig hidrogén és oxigénatomok alkotják. A henger belseje tehát apoláros, kívül viszont poláros, azaz vízben oldódó. A ciklodextrinek gazdasági szempontból azért jelentősek, mert mint molekuláris csomagoló anyagok, más vegyületeket – melynek molekulái beleférnek a ciklodextrin hengerekbe – meg tudnak kötni belsejükben. Ezeket nevezzük zárványkomplexeknek. A zárványkomplexek úgy tekinthetők, mint ciklodextrin kapszulákba zárt molekulák tömege. A ciklodextrin és a bezárt molekula között – ez nagyon lényeges – kémiai kötés nem alakul ki. A ciklodextrineket ezért széles körben alkalmazza a gyógyszeripar, és felhasználásuk terjed az élelmiszeriparban is. A ciklodextrint a részlegesen elbontott keményítőből a bakteriális ciklodextrin glikoziltranszferázzal (CGT) lehet in vitro előállítani. A CGT gént a Klebsiella pneumoniae-ból klónozták és a génnel a burgonyát transzformálták. A gumóspecifikus patatin promoter biztosította a célzott expressziót, tehát a CGT a gumóban szintetizálódott, ahol a burgonyában amúgy is sok keményítő termelődik. Mivel azonban a keményítőszintézis és tárolás helyei az amiloplasztok, a génbe még célbajuttató szekvenciát is beépítettek, mely ebben az esetben a RUBISCO kis alegységének tranzit peptidje volt. A GM burgonyagumóban 2–20 µg á, illetve 2–5 µg â-ciklodextrin termelődött 1 g friss súlyra vonatkoztatva. A burgonyagumó átlagosan 14% keményítőt tartalmaz. Ennek tehát körülbelül 0,001– 0,01%-ából sikerült ciklodextrint előállítani. A kereskedelmileg is gazdaságos arány 1–10% lenne.

6.8. 13.8. Műanyag termelés A napjainkban használatos műanyagok bővülő alkalmazása egyre nagyobb környezetszennyezéssel jár, mert lebomlásuk különösen hosszú időt igényel. A figyelem ezért a biológiailag lebomló műanyagok felé fordul. A poli-hidroxi-butirát (PHB, poli-D-3-hidroxibutirát) nagy molekulasúlyú alifás poliészter, melyet a baktériumok számos faja raktározott anyagként halmoz fel, és szénforrásként használ. A PHB biológiailag lebomló, hőre lágyuló, környezetbarát műanyag. Jelenleg bakteriális fermentációval állítják elő, ami költséges folyamatot jelent. Ennek során az Alcaligenes eutrophus baktérium az acetil-koenzim A-ból (CoA), három lépésben állítja elő a PHB-t. Az egyes átalakulásokat katalizáló enzimek: 3-ketotioláz (phbA), acetoacetil-CoA-reduktáz (phbB) és PHB-szintáz (phbC). A géneket klónozták, és az azokkal transzformált E.coli termelte a PHB-t. A növényekben a 3-ketotioláz megtalálható, mert résztvesz a mevalonsav szintézisében. Ezért az Arabidopsis-t csak a phbB és phbC génekkel transzformálták külön-külön, majd keresztezték őket. Az alkalmazott promoter a CaMV 35S volt. PHB termelést csak azokban a hibrid növényekben kaptak, melyek mind a három enzim génjét tartalmazták. A PHB legnagyobb koncentrációja a levélben 100 µg/g friss súly volt. A PHB szemcsék mérete megegyezett az Alcaligenes baktérium által termelttel. Maguk a szemcsék megfigyelhetők voltak a vakuolumban, a citoplazmában, sőt a sejtmagban is. A GM növények azonban fejletlenebbek lettek és magtermésük is csökkent. Ennek javítása a jövő feladata, mely során meg kell oldani a szerv- és szövetspecifikus expressziót, a sejten belüli lokalizációt (plasztisz), továbbá újabb energiatermelő fajok (pl. repce, gabonafélék) kipróbálása is szükséges. Figyelemmel az óriási gazdasági 323 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

IV. GÉN-TECHNOLÓGIAI STRATÉGIÁK ÉS TRANSZGÉNIKUS fajták igényre, ezeket a problémákat várhatóan hamarosan meg fogják oldani. Cél, hogy a repceolaj 50%-a PHB-vel legyen helyettesíthető a repce magban anélkül, hogy annak a csírázóképessége romlana. Felhasznált és ajánlott irodalom Chapman, S., Wilson, T.M. (1997): Plant viruses as pharm-implements. Chemistry and Industry, 14, 550–554. Dove, A. (1998): Pulling green biotechnology out of the red. Nature Biotechnology, 16, 1022–1024. Falus A. (1998): Az immunológia élettani és molekuláris alapjai. Semmelweis Kiadó, Budapest. GoddiJn, O. J. M., Pen J. (1995): Plants as bioreactors. Trends in Biotechnology, 13, 379–387. HESzky l. és sutka j. (1987): Genetika (Jegyzet). Egyetemi Nyomda, GATE, Gödöllő Julian, K. C., M. B. Hein (1995): Immunotherapeutic potential of antibodies produced in plants. Trends in Biotechnology, 13, 522–527. Krebbers, E., E. Vann de kerckhove (1990): Production of peptides in plant seeds. Trends in Biotechnology, 8, 1–3. Kusnadi, A. R., Nikolov, Z. L. Howard, J. A. (1997): Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations. Biotechnology and Bioengineering, 56, 473–481. Mason, H. S., Arntzen, C. J. (1995): Transgenic plants as vaccine production systems. Trends in Biotechnology, 13, 388–392. Miele L. (1997): Plants as bioreactors for biopharmaceuticals: regulatory considerations. Trends in Biotechnology, 15, 45–49. Mor, T. S., Arntzen, C. J. (1999): Pharmaceutical food stuffs: oral immunization with transgenic plants. In: Altman, A., Ziv, M., Izhar, S. (eds): Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. 17–21. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Boston–London. PoIrier, Y., D. E. Dennis, K. Klomparens, C. Somerville (1992): Pholyhydroxybutyrate, a biodegradable thermoplastic produced in transgenic plants. Science, 256, 520–521. Whitelam G. C., W. Cockburn (1996): Antibody epxression in transgenic plants. Trends in Plant Science, 1, 268–272.


5. fejezet - V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái 1. 14. Transzgénikus fajtákkal és termékekkel kapcsolatos kockázatok A géntechnológia – mint azt a bevezetésben is említettük – alapjában új megközelítést jelent az emberiség számára, mely két szempontból kelt félelmet: Az egyik az evolúció folyamatába való ,,illetéktelen” beavatkozás várható következményeiből, a másik a horizontális rekombináció irreálisnak feltüntetett lehetőségéből és gyakorlatából táplálkozik.

1.1. 14.1. A géntechnológia és az evolúció Abból a célból, hogy megérthessük ezt a kapcsolatot, egyszerűsítsük le napjaink mezőgazdasági termelését. A növénytermesztés végül is nem több, mint néhány tucat növényfaj életfolyamatainak hasznosítása a társadalom számára. E megközelítés első lépéseként gazdasági növényeink megkötik a nap sugárzó energiájának egy kis hányadát (1–3%), azt szerves vegyületekben raktározzák, majd a második lépésben számos makromolekulát szintetizálnak. Ez utóbbiakat hasznosítjuk élelmiszerként, takarmányként, tüzelő- és ipari alapanyagként stb. Napjaink növénytermesztését – biotechnológiai szempontból – felfoghatjuk úgy is, hogy nem búzát, kukoricát, napraforgót stb., hanem cukrot, fehérjét, olajat, cellulózt, alkaloidokat stb. termelünk a szántóföldön. A vegyi üzemek, melyek ezeket az anyagokat előállítják, a növények, pontosabban a növényi sejtek. A termelő folyamat a növények anyagcseréje. Ezzel el is érkeztünk ahhoz a ponthoz, ahol a géntechnológia kapcsolatba hozható az evolúcióval. A növények anyagcseréjét ugyanis – közvetlenül, illetve közvetve – a genetikai program szabályozza, mely a növény minden egyes sejtjében megtalálható. A genetikai programot a sejt DNS-e tárolja a genetikai kód szabályai szerint. Biotechnológiai szempontból ez azt jelenti, hogy a növények minden sejtjének DNS-ében kódolva van az egyedre (fajra) jellemző minden fehérje szerkezetére (struktúr szekvenciák) és szintézisére (regulátor szekvenciák) vonatkozó információ. Eddigi tanulmányaink alapján nyilvánvaló, hogy a mintegy négy milliárd éves földi élet során az evolúció (mutáció, rekombináció, szelekció stb.) az embertől függetlenül módosította ezt a molekulát (DNS), illetve az általa kódolt programot. Tehát a napjainkban termesztett növényeket nem mi, emberek konstruáltuk, azok tőlünk függetlenül alakultak ki az evolúció során. Jelenleg nem azért termesztjük ezeket a fajokat, mert kitaláltuk őket magunknak, hanem mert őseink évezredekkel ezelőtt ezeket választották a természet adta kínálatból. A modern mezőgazdaság és az azt szolgáló tudományok az elmúlt évszázadok során igyekeztek a maximumot kihozni azokból a konstrukciókból (szántóföldi, kertészeti, erdészeti fajok), melyeket a természet felkínált. Nem tették meg azonban azt a kicsi, de mégis óriási lépést, mely ezek mesterséges megváltoztatását tette volna lehetővé. A géntechnológia lényege tehát, hogy az élő szervezetek – jelen esetben a növények – működését (életét) vezérlő genetikai programot mi, emberek változtatjuk meg, az emberiség (gazdaság) igényeinek megfelelően. Ez az új géntechnológia lényege, stratégiája és lehetősége. Óriási lehetőség ez az emberiség kezében, mellyel élnie kell. Az első lépéseket megtettük ebben az irányban, de ismereteink hiányosságai miatt tettünk következményeit nem minden esetben tervezhetjük meg előre pontosan. Ez okoz félelmet sok emberben. A törvényi szabályozás a garancia arra, hogy a kutatások és fejlesztések a társadalom számára hasznos mederben folyhassanak.

1.2. 14.2. A géntechnológia és a horizontális rekombináció 325 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái A természetes evolúcióban a fejlődés motorját a mutációk és a rekombinációk, tehát a genetikai információ megváltozásai és az egyes információk új kombinációi jelentik. A természetes (in vivo) rekombinációk általában a fajokon belül, egyedek és populációk között, szülő– utód viszonylatában fordulhatnak elő, melyet vertikális rekombinációnak is nevezhetünk. Az élővilágban lejátszódó természetes rekombinációval szemben a géntechnológia lehetőséget ad a horizontális rekombinációra. Az in vitro rekombináció alkalmazásával vírus, baktérium, gomba, rovar, állati és emberi gének építhetők be a növényi genomba, sőt azok ott működnek is, ami sokakban etikai problémákat vetett és vet fel. Ezeknek a félelmeknek a forrásai leginkább a korábbi évtizedek hiányos ismereteire és oktatására vezethetők vissza. Napjainkban, amikor már ismert, hogy a Földön az élet információja azonos molekulákban, azonos elvek szerint van kódolva és ez a genetikai információ pl. az ember és majom viszonylatában több mint 90%-ban azonosságot mutat, akkor a horizontális rekombináció csak mint óriási lehetőséget és nem problémát jelent, melytől félni kellene. Tovább csökkentheti félelmünket, hogy egyre több bizonyítékot publikálnak a természetben is előforduló horizontális rekombinációról pl. baktérium és növény, vírus és ember stb. között. Természetesen ez nem zárja ki, hogy a jelenlegi ismereteink hiányosságai miatt előre nem tervezhető és várható következményekkel nem kell számolni. Ezek az ún. nem célzott következmények azok, melyek a géntechnológia rizikófaktorait jelentik napjainkban és melyek száma és súlya csökkenni fog a jövőben úgy, ahogy a molekuláris biológiai ismereteink gyarapodnak. Addig is az adott ország felelős állami szerveinek és szakmai bizottságainak a feladata, hogy döntéseik (GM kérelem engedélyezés vagy visszautasítás) meghozatala előtt a rizikótényezőket esetről esetre az alábbi szempontok szerint mérlegeljék: • A veszély pontos meghatározása: a lehetséges nemkívánatos hatások pontos definiálása és jellemzése • A veszély nagyságrendjének becslése: a lehetséges nemkívánatos hatások veszélyessége mértékének megállapítása • A veszély bekövetkezése valószínűségének becslése: egy speciális nemkívánatos esemény bekövetkezése lehetőségének meghatározása • A veszély nagyságrendjének számszerűsítése: a veszély nagyságrendjére és a bekövetkezés valószínűségére alapozva • A veszély végső értékelése: a becsült veszély összevetése a várható haszonnal A konkrét veszélyt jelenthető faktorok két nagy csoportba – biológiai és gazdasági – sorolhatók.

1.3. 14.3. Biológiai (ökológiai) rizikótényezők A biológiai rizikófaktorok okai magukra a GM növényekre vezethetők vissza, pontosabban azokra a genetikai és élettani különbségekre, melyekben a GM növények eltérnek a természetestől. A bevezetőben közölt definíció szerint a GM fajták azok abban különböznek a hagyományos fajtáktól, hogy minden sejtjük sejtmagjában egy vagy több, géntechnológiával alakított gént (transzgént) tartalmaznak és ennek megfelelően minden sejtjükben vagy egyes szerveik és szövetek sejtjeiben egy vagy több új fehérjét termelnek. Ennek megfelelően külön kell értékelnünk magának a génnek (vektor) a hatását és a termelődő új fehérje lehetséges következményeit.

1.3.1. 14.3.1. Transzgén hatások A GM növényt közvetlenül élelmiszerként vagy takarmányként fogyasztva a transzgén DNS-e az emésztőcsatornában lebomlik, hasonlóan a növény többi génjéhez. A transzgén a növény teljes génkészletének (genomiális DNS-ének) amúgy is csak tízezred vagy százezred részét jelenti, tehát mérete elenyésző a genom nagyságához képest. Abban az esetben viszont, ha a transzgént tartalmazó expressziós vektor antibiotikum rezisztencia gént (pl. kanamicin rezisztencia) is tartalmaz, speciális állatetetési kísérletekkel kell meggyőződni arról, hogy az antibiotikum rezisztenciát jelentő neomicin-foszfo-transzferáz gén (nptI) lebomlik-e és hogyan az összetett gyomrú állatok emésztőrendszerében. A WHO (World Health Organization) által is támogatott etetési kísérletek bizonyították, hogy az nptI. a bendőben élő baktériumok genomjába integrálódásának veszélye gyakorlatilag 326 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái nulla, de ha bekövetkezne, akkor sem jelentene veszélyt, mert a kanamicin a gyógyászatban nem használatos. A tényleges biztonság elérése érdekében a transzformációs vektorok már nem tartalmazzák az nptI gént. Transzgén megszökése csak akkor jelenthet problémát, ha abból problémát csinálunk. Ugyanis nyugodtan állíthatjuk, hogy a transzgén megszökése nem akadályozható meg. Ebből az következik, hogy nem a megszökés lehetősége, hanem a veszélyes gén megszökése az ami tényleg veszélyes lehet. Tehát arra kell törekednünk, hogy veszélyes gén véletlenül se kerülhessen a környezetbe. A transzgén megszökése azt jelenti, hogy a gén vagy a gént hordozó növény, növényi rész kikerül az ember kontrollja alól, mely magában hordozza annak lehetőségét, hogy később kereszteződéssel átkerülhessen más fajba, fajtába stb. A transzgén tehát megszökhet átkereszteződéssel, maggal vagy vegetatív résszel. Az ivaros úton való átkereszteződéstörténhet pollennel, amit a szél vagy a rovarok olyan növényfajok vagy fajták bibéibe juttatnak, melyeken a pollen képes a termékenyítésre. A transzgén pollennel átkerülhet a rokonfajokra (pl. repce) vagy a faj vad formáira (pl. füvek, pillangósok), illetve kultúrfajtáira. E folyamat során a transzgénre heterozigóta növények keletkeznek, melynek utódai már csak 50%-ban fogják tartalmazni a transzgént. A veszély azonban nem olyan nagy, mint azt a fentiek alapján gondolnánk, mert a legfontosabb szántóföldi kultúrfajainknak (pl. kukorica, búza, napraforgó, szója stb.) a magyar vad flórában nincsenek olyan rokonfajaik, melyekkel kereszteződni tudnának és ezek a növények csak kultúrkörnyezetben tudnak életben maradni. Európában az őszi káposztarepcének (Brassica napus) vannak olyan gyomfajai, pl. a Brassica campestris (a B. rapa vad formája), melyekkel ivarosan is kereszteződik és az utódok fertilisek. Megszökhet a gén maggal is, betakarításkor (aratás). Elszóródva a talajra, vagy a betakarítást követő szállításkor. A mag a nagy raktárakban, silókban mechanikailag keveredhet más fajták (nem GM fajták) magjaival. Ezekből a magvakból kikelt GM növények pollenjével a transzgén az előbbiekben leírt módon kerülhet át más fajokra, az adott faj vad változataira és fajtáira. Az ivartalan úton való megszökésre a vegetatív úton szaporított és szaporodó növények esetében van lehetőség, amikor gyökerek, gumók maradhatnak a talajban, melyekből (pl. gyökérsarjak) újabb növények, fák fejlődhetnek. Új vírusok törzsek keletkezése is felmerült azoknál a vírusrezisztens transzgénikus növényeknél, melyek genomjába valamilyen vírusgén (pl. burokfehérje) integrálódott. A feltételezés arra alapult, hogy a GM növények sejtjében a vírusgénekről (DNS) szintetizálódó vírus RNS-ek rekombinálódhatnak a növényt fertőző vírus RNS-ekkel. A 90-es évek vizsgálatai megerősítették ezt a hipotézist (Greene és Allison 1994). Tudnunk kell viszont, hogy a természetben is folyamatosan keletkeznek új vírusok, e vonatkozásban a GM növények érdemi változást nem okoznak. Azt sem szabad elfelejtenünk, hogy sok vírusról – amikkel együtt élünk – még nincs is tudomásunk, mert még nem izolálták és nem írták le őket.

1.3.2. 14.3.2. A transzgén termékének (fehérje) hatásai (14/1. ábra)


V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái

14/1. ábra: A transzgénikus fajták elterjedésének, termesztésének, forgalmazásának, a belőlük készült élelmiszereknek és takarmányoknak biológiai (ökológiai) kockázati tényező A transzgén terméke vagy fehérje, vagy enzimfehérje. Utóbbi valamilyen szintézist katalizál, mely során a GM növényben további fehérjék, szénhidrátok, zsírsavak, antitestek stb. termelődnek. A termelődő új, idegen vagy rekombináns fehérjék a promotertől függően a növény minden szervében és sejtjében, vagy csak bizonyos szerveiben és sejtjeiben jelennek meg. A transzgén termékével (fehérje) kapcsolatban fontos szempont, hogy ismerjük hatását a természetes flórára, faunára, kultúrflórára, az emberre és a nem célzott élővilágra. Toxikológiai, allergológiai tesztek, állatetetési kísérletek szükségesek ahhoz, hogy a környezetre esetleg veszélyes génkonstrukciókat és az azokat hordozó GM növényeket még a kísérleti stádiumban ki lehessen szűrni. A nem célzott hatások a növény minden sejtjében termelődő fehérjék, azok közül is különösen a kórokozók és kártevők, vagy gyomnövények elpusztítása céljából termelt fehérjék esetében merülhetnek fel. A rovarok ellen termelt és a gyökérben is expresszálódó proteáz inhibitorok hatása a talajban élő rovarokra, illetve lárváikra, vagy a totális gyomirtók hatása a talajban élő alacsonyabbrendű növényekre, illetve algákra mindenképpen többéves, részletes ökológiai hatásvizsgálatokat igényel. Toxikológiai vizsgálatok szükségesek élelmiszerként vagy takarmányként történő felhasználás esetén. A köztermesztésben lévő rovarrezisztens GM növények zöme a Bt. gén által kódolt cryIIIA fehérjét vagy annak valamelyik változatát termelik. Mindenképpen tisztázni kell, hogy a GM növényeket takarmányként elfogyasztó állatokban mi történik ezzel a fehérjével. Egerekkel végzett etetési kísérletek bizonyították, hogy a fehérjét az állatok biztonsággal fogyaszthatják. Többszörös dózisban adagolva sem jelentkezett semmiféle negatív hatás az állatok növekedésében, fejlődésében és szaporodásában. A tisztított cryIIIA fehérjével végzett in vitro emésztési 328 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái kísérletekben a Bt. fehérje különösen rövid felezési időt mutatott. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a Bt. toxint termelő rovarrezisztens növényeket vagy azokból készült élelmiszereket az ember is nyugodtan fogyaszthatja. Az anyagcseréjükben módosított és főleg a bioreaktor GM növények különböző enzimeket, peptideket, emberi fehérjéket, műanyagot, ciklodextrint stb. termelnek vagy túltermelnek és azt a magjaikban halmozzák fel. Semmilyen értékelhető adattal nem rendelkezünk még arról, hogy az ezeket a magvakat fogyasztó madarakban vagy emlősökben milyen nemkívánatos hatások jelentkezhetnek. Az allergiában szenvedők többségére az E-típusú immunoglobulin (IgE) által kiváltott azonnali túlérzékenység a jellemző. A növények közel 100.000 különböző fehérjét termelnek. Ezeknek csak egy kis része okoz allergiát. Az allergiát kiváltó növényi fehérjék több mint 90%-a a földimogyoróból, a szójából, a közönséges mogyoróból és a búzából származik. A GM növényekből előállított élelmiszereket, amennyiben azok új vagy rekombináns fehérjéket, illetve módosított zsírsavakat, szénhidrátokat tartalmaznak – az utóbbiak esetében a fehérje szennyeződés miatt – a kereskedelmi forgalmazás engedélyezése előtt allergológiai vizsgálatoknak kell alávetni. A rekombináns fehérjét meg kell vizsgálni in vivo és in vitro immunológiai tesztekben. Elemezni kell az aminosav sorrendjét, a fehérje biológiai, fizikokémiai tulajdonságait és össze kell hasonlítani az ismert allergén fehérjékkel. A fehérjék esetleges változását is elemezni kell, olyan hatásokat is, mint például a glikoziláció következményei (pl. stabilitás a proteolízissel szemben, hőstabilitás), vagy a fehérje – túltermeltetéséből következő – nagy mennyiségének hatása stb. Amennyiben a fehérje allergén szekvenciákat tartalmaz, azokat a génből kivágva a hatás megszüntethető. A továbbiakban a gén módosított változata használható. A fehérje anyagcsere módosításánál (11.1.2. pontban) említettük a brazil dió 2S albumin fehérjéjét, mely 18,8% metionint tartalmaz és ezért alkalmas más növények esszenciális aminosav tartalmának javítására. A brazil dió fehérjék allergén hatása közismert. A BNA2S fehérje génnel transzformált szója és repce magjaiból készült táplálék elfogyasztása kilenc – brazil dióra érzékeny – ember közül nyolcban allergiát váltott ki. Mivel ez esetben még nem ismert az allergén hatást kiváltó szekvencia, ezért annak géntechnológiai úton való eltávolítására még nincs lehetőség. Ennek következtében a BNA2S génnel transzformált növényekből készült élelmiszerekre rá kell írni, hogy a brazil dióra érzékenyek nem fogyaszthatják. Napjainkban már nagyon sok növényi eredetű fehérje allergén hatása ismert. Fontos, hogy a géntechnológiai megközelítések kidolgozói lehetőség szerint ne használják ezeknek a fehérjéknek a génjeit. Ezzel a későbbi engedélyezési és forgalmazási problémák megelőzhetők. A géntechnológia viszont megoldást is kínál a valamilyen élelmiszer allergiában szenvedők számára. Lehetőség van arra, hogy allergén fehérjéket termelő növényfajokban az allergén fehérjék termelését géntechnológiai úton (antiszensz génnel) megakadályozzuk (pl. búza allergén gliadinok). Így a lisztérzékenyek nyugodtan fogyaszthatják az ilyen GM búzából készült termékeket. Rezisztens gyomok, kórokozók és kártevők megjelenése – spontán mutációval – mind a totális gyomirtókkal és a Bt. toxinokkal, mind az antibakteriális és fungicid hatású GM termékekkel szemben várható. Ezek egyrészt a hagyományos vegyi védekezéssel elpusztíthatók, másrészt elindíthatnak egy molekuláris koevolúciós versenyt a génsebészek, illetve a célzott szervezetek között. Ez utóbbit megelőzendő, különböző technológiai megoldásokkal próbálkoznak, melyek közül a Bt. toxin rezisztens rovarok elleni technológia a szaporodásuk lassítására irányul. Ennek lényege, hogy a rovarok csak homozigóta állapotban rezisztensek. A homozigóta alakok felszaporodása gátolható a heterozigótaság fenntartásával úgy, hogy minden GM tábla köré nem GM fajtát vetnek, melyen a szenzitív rovarok is túlélnek. A homozigóták ezekkel párosodva mindig heterozigóta utódokat hoznak létre, melyeket a Bt.toxin képes elpusztítani (lásd a 9.4.1. pontot). Összefoglalva talán további megnyugtatást jelenthet, hogy az 1994-től köztermesztésbe került transzgénikus növényekkel kapcsolatban – pedig termőterületük 1998-ban már megközelítette a 30 millió hektárt – semmiféle 329 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái rizikótényező vagy káros biológiai, ökológiai, illetve egészségügyi (toxikus, allergén) hatás sem merült fel. Ez azért nagyon fontos, mert bizonyítja, hogy az engedélyező és ellenőrző hatóságok komolyan veszik feladataikat.

1.4. 14.4. Gazdasági (szociális) hatások (14/2. ábra)

14/2. ábra: A transzgénikus fajták elterjedésének és forgalmazásának várható gazdasági hatásai A gazdasági rizikótényezőt a genetikai gyarmatosítás lehetősége jelenti, mely magában foglalja a) a különböző országok vad és kultúrflórája génjeinek mások általi esetleges megszerzését és géntechnológiai hasznosítását az adott ország kizárásával, továbbá aa) a géntechnológiai (módszerek, gének, GM fajták stb.) szabadalmak monopol helyzetével való visszaélés lehetőségeit. Negatív gazdasági és szociális hatások várhatók azon fejlesztések következményeként, melyek a fejlett országokban lehetővé teszik GM növényekkel számos fejlődő ország gazdaságának fő exportbevételét jelentő anyagok (pl. trópusi növényi fehérjék, zsírsavak, pálmamag olaj, kakaóvaj stb.) előállítását. A transzgén jelenlétének bizonyítása nagyon nehéz, mert a GM fajták, növények általában semmiben sem különböznek a hagyományos fajtáktól. A magvak és növények GM eredete csak speciális molekuláris módszerekkel (nukleinsav hibridizációs és PCR technikák) bizonyítható, de ezekkel a módszerekkel is csak akkor, ha tudjuk, hogy milyen vektor konstrukciót tartalmazhatnak. A bizonyításhoz ugyanis a vektor egy bizonyos szekvenciájára specifikus nukleinsav próbát vagy primert kell alkalmazni. Összefoglalva meg kell állapítani, hogy a géntechnológiai megközelítések nagy száma, és a GM növények sokféle típusa és eltérő alkalmazási céljai miatt a rizikótényezők nagyon sokfélék lehetnek. Egységes rendszerbe nem vagy csak nehezen foglalhatók. Ezért a lehetséges rizikófaktorokat minden egyes GM növény, illetve vektorkonstrukció esetében külön-külön (case by case) kell vizsgálni és elemezni. Felhasznált és ajánlott irodalom Astwood, J. D., R. L. Euchs, P. B. Lavrik (1996): Food biotechnology and genetic engineering. In: MetcalfeSampson-Simon (eds.): Food Allergy. 65–91. Blechwell Science Inc.,


V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái Greene, A. E., Allison, R. F. (1994): Recombination between viral RNA and transgenic plant transcripts. Science, 263, 1423–1425. HESZKY L. (1999): Genetikailag módosított (GM) növények és élelmiszerek. Konzervipar, 3, 68–72. JEKKEL Zs. (1999): Biotechnológiai rendszerek a fenntartható növénytermelés szolgálatában. Vetőmag, 3, 10– 11. KÄppeli, O., L. AUberson (1998): How safe is safe enough in plant genetic engineering? Trends in Plant Science, 3, 277–281. Kareiva, P., J. Stark: Environmental risks in agricultural biotechnology. Chemistry and Industry, 17, 52–55. Mellon M., J. Rissler: 1995. Transgenic crops: USDA data on small scale tests contribute little to commercial risk assessment. Bio/Technology, 13, 96–97. Mihhelsen, T. R., Andersen, B., Jorgensen, R. B. (1996): The risk of crop transgene spread. Nature, 380, 31–32. TOENNIESSEN G.H. (1995): Plant biotechnology and developing countries. Trends in Biotechnology, 13, 404–409. Williamson, M. (1996): Can the risk from transgenic crop plants be estimated? Trends in Biotechnology, 14, 449–450.

1.5. 15.1. A ,,lényegi azonosság elve” Az előző pontban ismertetett rizikótényezőkből logikusan következik, hogy a géntechnológia egyes fejlesztési irányai esetleg veszélyesek lehetnek a környezetre. Ez indokolja, hogy a kutatások, fejlesztések, a gyakorlati kipróbálás és kereskedelmi bevezetés törvényben szabályozott, hatóságilag ellenőrzött keretek között történjen. A GMO-k környezeti és táplálkozási veszélyességének megítélésékor a ,,lényegi azonosság” (substantial equivalence) elvéből indulnak ki. Ennek lényege, hogy a GM növényeket és az azokból készült termékeket a legközelebb álló (pl. eredeti) nem GMO termékekhez, illetve növényekhez (fajtákhoz) kell hasonlítani úgy, hogy a hasonlítás alapját jelentő termékeket a környezetre veszélytelen standardnak tekintjük. Ezt a koncepciót a FAO (United Nations Food and Agricultural Organization) és a WHO (United Nations World Health Organization) javasolta 1991-ben és az OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development) 1992-ben vezette be, mint önálló terminológiát. A ,,lényegi azonosság” elvének érvényesítése két lépésből áll: • Az elsőben a GM fajta vagy termék legfontosabb tulajdonságait (agronómiaitól a molekulárisig) kell összehasonlítani az „eredeti”, hagyományos úton előállítottal. Ennek keretében kell értékelni a természetes formagazdagságot (biodiverzitás) védelmező szempontokat is. • A másodikban kell bizonyítani – a megvalósított változtatás részletes elemzésével – hogy a GM fajta vagy termék nem veszélyes a környezetre és az egészségre. Az utóbbinak magában kell foglalnia az új fehérjék részletes molekuláris jellemzését és a veszélytelenségük bizonyítását. Ezt az elvet magukénak vallják a különböző országok, és ebben azonos az USA és az EU felfogása is, a különbség csak a végrehajtásban van.

1.6. 15.2. Törvényi szabályozás az USA-ban és az EU-ban Az USA-ban a GM növények kísérleti célú kipróbálása a 80-as évek második felében kezdődött. Az OSTP (United States Office of Science and Technology Policy) 1986-ban már megjelentette a biotechnológia szabályozásával kapcsolatos ajánlásait, és kijelölte a felelős hatóságokat is. A szabályozás alapelvéül a tudományos megalapozottságot és a kockázati (veszély) tényezőket jelölte meg. A felügyeleti és irányító hatóságok az FDA (Food and Drug Agency), az EPA (Environmental Protection Agency) és az USDA (United States Department of Agriculture) lettek. Az USDA a GM növényfajták köztermesztésbe kerüléséért, a szántóföldi kibocsátással kapcsolatos kísérletekért felelős, melyet egyik hatósága, az APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) végez. 331 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái Az EPA biotikus stresszrezisztens GM növényekkel foglalkozik, különös tekintettel a GM növények által termelt peszticidekre. Az FDA felelős a GM növényekből készült élelmiszerek és takarmányok vizsgálatáért és engedélyezéséért. A GM szabályozás az USA-ban rendkívül szigorú előírásokkal indult, de a kilencvenes évek elejére nyilvánvalóvá vált, hogy az rendkívül költséges és lassú, továbbá a rizikótényezők veszélyessége sem igényli. Az áttörést és az igazi könnyítést a szabályozásban az FDA 1992-es döntése jelentette. Ennek lényege, hogy azok az élelmiszerek, melyeket génjeikben megváltoztatott növényi alapanyagokból készítenek, nem igényelnek külön szabályozást és vizsgálatot a hagyományos nemesítéssel előállított fajták termékeihez képest. Tehát az addig érvényben lévő élelmiszer és takarmány engedélyezési eljárást és vizsgálatot alkalmasnak tartották arra, hogy a GM termékek veszélyességét is megállapítsák. A döntést az USA Tudományos Akadémiája (National Science Academy, NSA), valamint a FAO és a WHO is támogatta. Ezt követően 1994-ben jelent meg az USAban a ,,Flavr-Savr” (későn puhuló) paradicsom a piacon, melyet azóta 20 GM fajta követett. A GMO szabályozás szigorúsága tovább enyhült 1997-ben. Az USDA döntése értelmében a szántóföldi kísérletekhez már nincs szükség előzetes engedélyezésre és környezethatás vizsgálatra, csak bejelentési kötelezettség van. Az APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service), azonban továbbra is igényli a kísérletek terveit, végzi az ellenőrzést és a beszámoltatást. Európában a GMO-kal kapcsolatos első átfogó szabályozást az EU (European Union) 90/219/EEC és a 90/220/EEC (European Economic Community) direktíváinak elfogadása és bevezetése jelentette. A 90/219/EEC ajánlás a géntechnológiai laboratóriumokkal, tenyésztő helységekkel és üvegházakkal kapcsolatos munkákra irányul. A 90/220/EEC ajánlás a GMO-k környezetbe való kibocsátásának és kereskedelmének feltételit szabályozza. A GM élelmiszerekre vonatkozó ajánlásokat a Novel Food Regulation (257/EEC) tartalmazza. Jelenleg ezek az ajánlások vannak érvényben Európában, de átdolgozásuk, melynek célja a szabályozás egyszerűsítése, folyamatban van. A GM növények vonatkozásában a szabályozást – az USA-hoz képest – bonyolultabbá teszi Európában és hazánkban is, hogy a köztermesztésbe csak államilag elismert fajták kerülhetnek. A fajtaelismerés 1–3 éves engedélyezési eljárása a GM fajtajelöltekre is vonatkozik. További specialitása az EU szabályozásnak, hogy mindegyik tagország parlamentje saját GMO törvényt fogad el, tehát e vonatkozásban a direktívák valójában csak ajánlásokat jelentenek. Eltérés mutatkozik még a GMO-k veszélyességének megítélésében, az engedélyezési eljáráshoz szükséges adatszolgáltatásban és az eljárás időtartamában. Az EU-ban a jelenleg érvényben lévő szabályozás (90/220/EEC) alapján az elmúlt években egy-egy engedélyezési eljárás ideje átlagosan 9–25 hónap között változott (pl. hímsteril és herbicidrezisztens kukorica 24 hónap, herbicidrezisztens szója 17 hónap, rovarrezisztens kukorica 25 hónap, herbicidrezisztens dohány 9 hónap). Az USA-ban ez az időtartam 22 engedélyezett GM fajta átlagában 6 hónap volt. Ezek az eltérések az EU és az USA között az elmúlt években a növényfajták és a növényi termékek, valamint az élelmiszerek kereskedelmében konfliktusokhoz vezettek. Ezért a megoldást a GMO-k és termékeik nemzetközileg egységes szabályozása jelentené. Ezt azonban különböző régiók és fejlettségű országok eltérő gazdasági érdekei jelenleg még nem teszik lehetővé.

1.7. 15.3. Törvényi szabályozás Magyarországon Magyarország a 90-es években több nemzetközi egyezmény aláírásakor (pl. Biológiai Sokféleség Egyezmény, Rio De Janeiro, 1992) vállalta, hogy a GM szervezetek hazánkban csak a GMO-törvény parlamenti elfogadását és hatálybalépését követően kerülhetnek kipróbálásra. Az 1995. évi LXXXI. törvénnyel a Parlament ratifikálta és kihirdette a biológiai sokféleségről szóló nemzetközi (ENSZ) egyezményt (Biodiversity Strategy and Action Plan), röviden a Biodiverzitás Egyezményt, melynek megvalósítását az egyes tagországokban az UNEP (United Nations Environmental Program) támogatja. Többéves előkészítő munka után a Parlament 1998. március 16-án fogadta el a géntechnológiai tevékenységről szóló XXVII/1998. sz. törvényt. A törvény ,,a genetikailag módosított mikroorganizmosok zártrendszerű felhasználásáról, illetve a genetikailag módosított élőlények korlátozott szabadföldi kibocsátásáról” szóló 90/219/EEC és a 90/220/EEC sz. irányelvek alapján készült.


V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái A XXVII./1998. sz. GMO törvény 1999. január 1-én lépett hatályba. A hatálybalépés előtt a Mezőgazdasági és Vidékfejlesztési Minisztérium – az (1)1999. FVM rendeletben – kidolgozta a törvénynek a mezőgazdaság és az élelmiszeripar területén történő végrehajtásáról szóló utasítását. A törvény I. fejezete szerint annak hatálya kiterjed a géntechnológiai módosításra, a GMO-k zárt rendszerben történő felhasználására, a környezetbe való kibocsátására, forgalomba hozatalára, exportjára, importjára és szállítására. A törvény II. fejezete, mely a legnagyobb, ismerteti azokat a tevékenységeket, melyeket géntechnológiai engedélyekhez köt. Kijelöli az engedélyezési eljárásban résztvevő Géntechnológiai Hatóságokat (GH) és meghatározza felügyeleti területeiket és feladataikat. A törvény a géntechnológiai laboratóriumok létrehozását, a géntechnológiai tevékenység végzését, a GMO-k (GM növények és GM állatok, valamint GM termékek) felhasználását, kibocsátását, forgalmazását, exportjárt és importját engedélyhez köti. Az engedélyeket a Géntechnológiai Hatóságok adják meg, ahová a kérelmeket be kell nyújtani. A kérelmek elbírálására a törvény létrehozza a Géntechnológiai Bizottság (Géntechnológiai Eljárásokat Véleményező Bizottság) intézményét, meghatározza összetételét, feladatait és működési elveit. A Géntechnológiai Bizottság (GB) minden kérvénnyel kapcsolatban – meghatározott időn belül – állást foglal, melyet a GH-nak megküld. A GB-nek 16 tagja van, melyből 5 főt a Magyar Tudományos Akadémia (MTA), 1–1 főt az érintett Minisztériumok (Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium, FVM; Oktatási Minisztérium, OM; Környezetvédelmi Minisztérium, KVM; és Egészségügyi Minisztérium EM), valamint a Gazdasági Minisztérium (GM) képviseletében az Országos Műszaki Fejlesztési Bizottság (OMFB) jelöl, továbbá képviseltetik magukat a környezetvédő szervezetek (4 fő) és egészségvédő szervezetek (2 fő) is. A kérelemről a GB véleménye alapján a GH dönt. Amennyiben az engedélyt megadja, azt a Magyar Közlönyben, illetve napilapokban 30 nappal korábban közzé kell tenni és azzal kapcsolatban észrevétel tehető. Az eljárás időtartama a kérelem jellegétől függően 3–6 hónap. A GM növények és fajták hazánkban csak úgy kerülhetnek köztermesztésbe, ha előtte kérvényezik azok kísérleti kibocsátását, mely során a kérelmező által javasolt, illetve a GB által értékelt helyszíneken – mely nem lehet fajtakísérleti állomás – az EU ajánlások legteljesebb figyelembevételével, a GM növényfajtákat egy vagy több évig kell vizsgálni. Az FVM, mint GH az Országos Mezőgazdasági Minősítő Intézetet (OMMI) bízta meg a szabadföldi kísérletek ellenőrzésével, beszámoltatásával és értékelésével. A kérvényhez mellékelni kell továbbá minden olyan dokumentumot, mely bizonyítja, hogy a GM fajta és a belőle készült takarmány vagy élelmiszer veszélytelen a környezetre és az emberre. Amennyiben a bizottságban kételyek merülnek fel e vonatkozásban, úgy további információkat kérhet vagy speciális vizsgálatokat igényelhet. A Géntechnológiai Bizottság az így összegyűjtött adatok és a szabadföldi kísérletes kibocsátás eredményei alapján állást foglal abban, hogy a szóban forgó GM fajta veszélyes lehet-e a környezetre és az emberre, vagy nem. Ezt követően a GH kiadja vagy megtagadja az engedélyt. Az engedély 5 évre adható és meghosszabbítható. A kiadott engedély alapján lehet elkezdeni a GM fajta fajtakísérletekben történő vizsgálatát állami elismerés (minősítés) céljából, melyet az OMMI végez. A GMO-kal kapcsolatos nyilvántartást a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ (MBK) az Internetes honlapján végzi. A GM szervezetek és termékeik GMO eredetének bizonyítása és azonosítása az e célra akkreditált intézetek laboratóriumaiban történik. A Mezőgazdasági Biotechnológiai Központ (MBK), a mikroorganizmusok, vetőmagvak, szaporítóanyagok és nyerstakarmányok, az Országos Állategészségügyi Intézet a húsipari termékek és állatok, az Országos Közegészségügyi Központ Élelmezés és Táplálkozástudományi Intézete az állati és növényi eredetű élelmiszerek vizsgálatát végzi. Ezek a vizsgálatok különösen a kibocsátással, behozatallal és kivitellel, szállítással és hulladék kezeléssel kapcsolatos paragrafusokban foglaltak teljesítését szolgálják.


V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái A törvény III. fejezete az engedély kiadását követő visszavonás eseteivel, a géntechnológiai tevékenység korlátozásával vagy tiltásával, az oktatási, képzési és tájékoztatási feladatokkal, valamint ezek pénzügyi fedezetével foglalkozik. A törvény IV. fejezete a vegyes záró rendelkezéseket tartalmazza. Összefoglalva megállapítható, hogy a törvényi szabályozás szükségességében a világ országai egyetértenek. Eltérések vannak azonban a konkrét szabályozás szigorúságában. Ebből a szempontból a legliberálisabb a szabályozás az USA-ban és legszigorúbb az EU-ban. Természetesen a világ számos országában e kérdés még nincs törvényileg rendezve. A GMO szabályozás nemzetközi tapasztalataiból az alábbi következtetések vonhatók le: • Ha a világon valahol egy GM fajta termesztését már engedélyezték, az többé a környezetből nem vagy csak nehezen vonható vissza. • Az engedélyezett GM fajta génje előbb vagy utóbb meg fog szökni, illetve a gén megszökése gyakorlatilag nem akadályozható meg. • Abban az esetben, ha a génről utólag derül ki, hogy terméke mégis veszélyes és káros a környezetre, nagyon kicsi az esélye annak, hogy a veszélyes géntől és termékétől – globális viszonylatban – egyszer és mindenkorra megszabaduljunk. A fentiek miatt nagyon fontos a nemzetközileg egységes szabályozás mielőbbi és gyors bevezetése. Felhasznált és ajánlott irodalom Dale, P.J. (1995): R and D regulation and field trialing of transgenic crops. Trends in Biotehnology, 13, 398– 403. Dudits D. és Dohy J. (szerk.) (1998): Biotechnológia: Lépéstartás Európával. MTA, Bp. 9–68. FVM-rendelet (1998): A Földművelésügyi és Vidékfejlesztési Minisztérium rendelete a géntechnológiai tevékenységről szóló 1998. évi XXVII. törvénynek a mezőgazdaság és az élelmiszeripar területén történő végrehajtásáról. Magyar Közlöny, 1999, 2. szám (1999 I. 14). GMO-törvény (1998): A géntechnológiai tevékenységről szóló 1998. évi XXVII. törvény. Magyar Közlöny, 1998, 28. szám (1998 IV. 01). Heszky L. (1999): A növényi géntechnológia elmélete és gyakorlata. Vetőmag, 3, 3–6. Koening, A. (1999): Genetically modified crops in the European Union the regulatory frame-work and public acceptance. In: Altman, A., M.Ziv., S.Izhar (eds.) Plant Biotechnology and in vivo Biology in the 21st. Century. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht–Boston–London, 751–756. ORAVECZ S. (1999): A géntechnológiai tevékenység szabályozása. Vetőmag, 3, 6–8. Robinson, C. (1998): Understanding the commercial and regulatory stress for genetically modified and novel foods and food ingredients. Trends in Food Sci. and Technol, 9, 83–86.

2. 16. A növényi-biotechnlógia növekvő szerepvállalása a fenntartható fejlődés feltételeinek megteremtésében: hazai lehetőségek és feladatok A fenntartható fejlődés koncepciója, amely 1987-ben a ,,Közös jövőnk” című dokumentumban fogalmazódott meg, tudomásul veszi, hogy ,,visszatérni a természetbe” megvalósíthatatlan utópia. Ugyanakkor megfogalmazódik: mindent meg kell tenni az ember által használt természeti környezettel való jó és takarékos gazdálkodás érdekében úgy, mint ahogy az a vállalati vezető cselekszik, aki cégét gyermekeire akarja hagyományozni. Ez nagyon nagy kihívás és feladat az emberiség számára, különösen, ha ki akarjuk elégíteni a növekvő népesség (előrejelzések szerint 2050-ben 11 milliárd ember) élelmiszerigényét. Már az elkövetkező


V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái 20–30 évben szükség lesz az élelmiszertermelés megduplázására úgy, hogy a hasznosítható terület folyamatosan csökken, a klímaváltozások (extrém időjárási viszonyok) korlátozzák a növénytermesztés lehetőségeit. Különösen nagy hangsúllyal megfogalmazódó igény a környezet szennyezésének mérséklése a környezetbarát mezőgazdasági technológiák kiterjedt bevezetésével. Az élelmiszerigények mennyiségi és minőségi kielégítésében, a környezeti terhelés mérséklésében a növény-biotechnológia szerepe meghatározó jelentőségű. Tekintettel a termesztett növények teljesítőképességének biológiai és fizikai korlátaira, a közel 40%-os terméskiesésre, amit a gyomok, betegségek és kártevők okoznak, nyilván szükség van új technológiákra, amelyek alapját a molekuláris és sejtbiológiai megközelítések adhatják elsősorban a fajta-előállító növénynemesítés metodikai hátterének kiszélesítésével. A növénynemesítés évszázadok óta folyamatosan javítja a termesztett növények termőképességét új, kedvező génállományú tenyészanyagok előállításával, kiszelektálásával és ellenőrzött felszaporításával. A növénynemesítő keresztezéssel változtatja meg a növények génösszetételét, és a fenotípus értékelésével szelektálja ki a kívánt tulajdonságú egyedeket. Mint az előző fejezetekben láthattuk, a rekombináns DNSmódszerek lehetővé teszik agronómiailag fontos gének izolálását és visszaépítését a növények genomjába. Ez a növénynemesítés folyamatával egybeépülő tevékenység új eszköz a kívánt célok elérésében. Míg keresztezés alkalmával a nagyszámú gént érintő, előre nem irányítható rekombinációs folyamatok sora játszódik le, addig a transzformáció egy vagy néhány jól ismert gént épít be. Természetesen egyetlen gén is igen sokirányú hatást fejthet ki. Ezért van szükség a transzgénikus genotípusok nagy számban történő előállítására, a tenyészanyagok éveken át történő értékelésére. Lehetséges, hogy újabb keresztezések révén kell továbbjavítani az elsődleges transzgénikus anyagokat. A növénynemesítők gyakran nyúlnak a rokon vadfajokhoz mint génforrásokhoz. Egy bizonyos rokonsági körön belül ivaros keresztezéssel megvalósítható a génátvitel. Ezt a kört bővítheti a szomatikus hibridizáció, bár ezek a módszerek egyidejűleg nagyszámú gén átvitelét biztosítják. A géntechnológia ezzel szemben lehetővé teszi tetszőleges élő szervezet (vírus, baktérium, gomba, állat) génjének felhasználását, ezért láthattuk, hogy milyen sokféle géntechnológiai megközelítéssel próbálkoznak a kutatók. Nyilvánvaló, hogy a többféle elképzelés közül csak bizonyos megoldások vezetnek növénynemesítési felhasználásra érdemes tenyészanyaghoz. A génforrások körének bővülésével a növényekben elő nem forduló fehérjék, anyagcsereutak jelennek meg, ezért különös alapossággal kell értékelni a lehetséges kockázatokat akár a fogyasztás szemszögéből, akár a természetes növénypopulációkra kifejtett hatás oldaláról. Az utóbbi szempont csak akkor kerül előtérbe, ha a termesztett növény kereszteződik vadon élő rokon fajokkal. Így a búza, kukorica és burgonya teljesen biztonságos, a beépített gén nem szabadulhat ki. A repcében vagy lucernában lévő transzgén spontán kereszteződéssel átépülhet gyompopulációk génállományába. Ezt a tényt figyelembe kell venni a kibocsátást megelőző hatásvizsgálatok során. Természetesen a beépített transzgén és a repce, lucerna többi génjei azonos eséllyel kerülhetnek át a gyomok génállományába. Eddig nem lehetett megfigyelni a gyomok nemesítődését, ami a kultúrnövények és gyomok közötti génátvitel biológiai jelentőségét nem erősíti meg. A biotechnológiai módszerekkel nemesített fajták termesztése világszerte gyors ütemben növekszik. A transzgénikus tenyészanyagok szabadföldi kipróbálása engedélyhez kötött, így a rendelkezésre álló adatok igen szemléletesen mutatják a növekedés ütemét. A 16/1. ábra az OECD országokban engedélyezett kísérletek számát mutatja. Érdemes megemlíteni, hogy a legtöbb kísérlet (37%) kukoricával folyik. Ezt követi a burgonya, a repce és a szója. A kísérletek 85%-át Észak-Amerikában végezték. A növekedés szintén igen gyors a transzgénikus fajták termesztési területét tekintve.

1996.

2,0 millió ha

1997.

12,8 millió ha

1998.

27,8 millió ha (Kína nélkül)

1999.

40,1 millió ha

Igazán pontos adatok a világban folyó termesztésről nincsenek. Becslések szerint 1998-ban csak Kínában 9 millió hektáron termesztettek rovarrezisztens gyapotot. Bármennyire hiányosak az adatok, az biztosan megállapítható, hogy a növekedés üteme figyelemre méltó, különösen, ha értékeljük a földrajzi megoszlást. Míg Észak-Amerikában és Dél-Amerika egyes országaiban (Argentína, Brazília) kiterjedten termesztenek 335 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái géntechnológiával nemesített (GN) fajtákat, addig Európában lényegében kísérleti stádiumban van az anyagok értékelése. Ennek a technológiai szakadéknak komoly gazdasági kihatásai vannak. Nehéz pontosan előre jelezni a fejlődés várható irányait és ütemét. A kialakult különbség részben észrevehető a közvélemény eltérő nyitottságában a géntechnológiai termékek fogyasztását illetően. Míg az amerikai vásárlók igen jelentős arányban (70–80%) készek genetikailag módosított (GMO) termékeket vásárolni, addig az európaiak elzárkóznak. Különösen Németország és Ausztria közvéleménye ellenzi a GMO termékek forgalmazását. Igen indulatos, sokszor reális valóságtartalmat nélkülöző viták tanúi lehetünk. Bonyolítja a tisztánlátást, hogy a sajtó szenzációt hajszolva felnagyítja a vélt vagy valós problémákat. Mint a korábbi fejezetekben láthattuk, a transzgénikus fajták előállítása bonyolult folyamat, a részletek megértése bizonyos felkészültséget igényel. A használt módszerek az elmúlt években kerültek kidolgozásra, így még nem szerepelhettek a tananyagban. Komoly energiákat igényel a népszerűsítés és a felvilágosítás. Mindezeket alapul véve, differenciált ütemű, a világ különböző részein eltérő mértékű fejlődésre számíthatunk a biotechnológiai termékek elterjedését illetően. Meghatározó tényező az, hogy az Európai Unió milyen politika mellett dönt. Az elzárkózás mögött valószínűsíthető a gazdaságvédelmi törekvés is, hiszen ezen a területen az amerikai technológiai fölény elvitathatatlan. Látva az eddig elért eredményeket, a jelentős gazdasági kihatásokat, nagyon nehezen képzelhető el, hogy a jelenlegi európai elszakadás hosszabb ideig fennmarad. Még a fejlett, túltermelő európai mezőgazdaság is rákényszerül a rezisztens fajták használatára, ami egyben a kémiai növényvédelem környezetkárosító hatásainak a mérséklését is jelenti. Elkerülhetetlen a súlyosan szennyezett talajok, a vízek terhelésének csökkentése. Láthattuk, hogy számos géntechnológiai megközelítés a minőségi paramétereket javítja. Ipari alapanyagokat előállító növények is génbeépítéssel szolgáltathatnak optimális termékeket. Ha figyelembe vesszük azt, hogy a géntechnológiával kiegészített növénynemesítés a hatékonyság növelése révén jobb terméket jelentő fajták előállításával tudja csak versenyképességét biztosítani, akkor nem merész előrejelzés, az hogy a nem is olyan távoli jövőben a fajták túlnyomó többségének előállításánál használni fogják a géntechnológia nyújtotta előnyöket. Így a géntechnológia integráns része lesz a nemesítésnek, mint ahogy az ma a keresztezés, a szelekció, és a poliploidizáció. A technológia elterjedésének ütemét sok tényező befolyásolja, mint a kutatás előrehaladása, a módszerek tökéletesedése. A vásárlói szokásokat meghatározza majd a termék ára, minősége és az egészséget kímélő sajátosságai. A biotermesztés alapját a rezisztens tenyészanyagok termesztése jelenti, mert csak így lehet a kémiai védekezést mellőzni. Mint a korábbi fejezetekben láthattuk, a rezisztenciagének ma már izolálhatók és a gazdasági növények széles körébe beépíthetők. A valódi biotermesztés jövője csak úgy biztosítható, ha a gazdák élnek a géntechnológiával nemesített fajták által nyújtott előnyökkel.

16/1. ábra: A transzgénikus növényekkel végzett szabadföldi kísérletek számának ugrásszerű növekedése az elmúlt években (Forrás: OECD adatbázis; http://www-pecd-prg/ehs/service.htm) A hazai biotechnológia jövőbeni fejlődésének irányait több tényező is jelentősen befolyásolja. Néhány kertészeti mikroszaporító laboratóriumtól eltekintve, idehaza is a fajta-előállító növénynemesítés az elsődleges 336 Created by XMLmind XSL-FO Converter.

V. A növényi géntechnológia társadalmi jelentősége és problémái hasznosítója a sejt- és molekuláris módszerekre épülő technológiáknak. A jelenlegi tevékenység és a jövőbeni fejlődés meghatározója az a tény, hogy Magyarország talaj- és klimatikus viszonyai kiváltságos feltételeket biztosítanak a vetőmagtermesztés számára. Ehhez társul még az ország nemzetközileg is elismert tradíciója a fajta-előállításban. Mind a nemesítés, mind a vetőmagtermesztés nagy szaktudást igényel, és jelentős az a hozzáadott szellemi tőke, amely a termékben, a jó minőségű vetőmagban megtestesül. Mindezek indokolják a mezőgazdaság ezen húzó ágazatának kiemelt fejlesztését. A biotechnológiai és génsebészeti módszerek bevezetése hazánkban viszonylag korán megtörtént. Párhuzamosan az alapkutatási eredmények megszületésével, jelentős erőfeszítések történtek, amelyre támaszkodva ma már szinte minden hazai nemesítő intézetben működik növény-szövettenyésztő laboratórium és rendelkezésre áll a génbeépítéshez szükséges metodikai háttér. A Szegedi Biológiai Központból 13 éve közölték az első idehaza előállított transzgénikus növényről szóló közleményt. A szegedi kukorica- és búzanemesítők már publikáltak cikkeket transzgénikus növények előállításáról. Martonvásáron az MTA Mezőgazdasági Kutatóintézetében és Gödöllőn a Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban génpuskát használnak a gén-beépítéshez. Az utóbbi intézetben előállított vírusrezisztens dohány és burgonya tenyészanyagok agronómiai értékelése folyamatban van. A keszthelyi és nyíregyházi burgonyanemesítők rendelkeznek transzgénikus tenyészanyagokkal. A GATE Genetikai és Növénynemesítési Tanszék által előállított transzgénikus szegfűvonalakat üvegházi körülmények között értékelik. Tehát minden alap adott ahhoz, hogy nemesítőink támaszkodjanak a meglévő lehetőségekre. Jelenleg az agronómiai gének korlátozott száma gátolja a szélesebb körű transzformációs programok kivitelezését. Ezért a jövőbeni fejlesztések kiemelt célja új, originális elgondolásra épülő géntechnológiai stratégiák kidolgozása és növénynemesítési felhasználása. A kapacitások szűkösek, ezért összehangolt, országos projektekre van szükség, amelyek biztosítják a molekuláris biológusok és növénynemesítők együttműködését. Természetesen körültekintő mérlegelés szükséges a növényfaj és a javítandó tulajdonság megválasztásához. Az ilyen döntések már gazdasági és piaci szempontokat is figyelembe vesznek. Mivel a magyar mezőgazdaság legfontosabb piacát az Európai Unió országai jelentik és ebben a régióban van a legerősebb konkurencia, fejlesztéseinket az EU-politikához célszerű igazítani, bár más piacok szintén fontos szerepet játszanak. Láttuk, hogy Európa jelentős hátrányban van az USA-hoz, Kanadához viszonyítva. Késik a géntechnológiai termékek piaci bevezetése, ugyanakkor nagyon jelentős erőforrásokat mozgósítanak a kutatásra, fejlesztésre. Magyarország számára kedvező stratégia lehet az, hogy kihasználjuk az EU-csatlakozásig hátralévő éveket és előnyös helyzetet próbálunk termékeink számára biztosítani. Ehhez a fejlesztéseket már most meg kell kezdeni. A tömegáruk helyett egyedi, specifikum értékű termékek felé kell tevékenységünket irányítani. A kiemelkedő minőségű búza (lisztminőség és sütőipari érték, fuzáriumrezisztencia) mellett a kertészeti növények (dinnye, uborka) vagy a gyógynövények nyújthatnak kedvező piaci lehetőségeket. A hazai növénynemesítési és biotechnológiai tevékenység lehetőségeit ma már lényegesen befolyásolja az a tény, hogy nagy számban és jelentős kapacitással működnek az országban nemesítési és agrokémiai világcégek. Így jelen van több amerikai cég is, akik vezető szerepet játszanak a géntechnológiai fejlesztésekben. A világcégekkel kialakítandó kapcsolat több szempontból is kínál kiaknázható lehetőségeket. Megfelelő feltételrendszer kidolgozása alapot adhat a kölcsönös előnyökre épülő együttműködésekhez, és így lehetővé válhat, hogy a hazai nemesítők felhasználhassák a csúcstechnológiát jelentő géneket. Ezek jelenléte az új, korszerű fajtákban alapfeltétel lehet a jövőbeni fajtaminősítések során. Másik oldalról támogatandó lenne, hogy a világcégek építsenek a hazai kutatási, fejlesztési kapacitásokra, a magyar nemesítők tevékenységére. A kölcsönös előnyökre alapozott együttműködések kedvező helyzetet jelenthetnek nemcsak az európai versenyben, hanem a piac megszerzésében világszerte. E könyv anyagának összeállításakor megdöbbentő tapasztalatot jelentett, hogy milyen nagyszámú tudományos közlemény használja a géntechnológiai módszereket mind új tudományos felismerések, mind nemesítési célú gyakorlati eredmények elérése érdekében. Nem lehet nem észrevenni, hogy egy igen jelentős technológiai forradalom tanúi, részesei vagyunk, amely minden bizonnyal hatást gyakorol a következő évezred emberének mindennapjaira. Mint minden emberi próbálkozás, ez a technológia is hordozhat magában kockázatot, de ez nem jelenti azt, hogy ne éljünk az előnyök adta lehetőségekkel, és természetesen minden lehetséges eszközzel a problémák elkerülésére kell törekednünk. Csak kiterjedt alapkutatással, a növények életfolymatainak megismerésével lehet biztonságossá tenni a géntechnológia felhasználásával előállított termékeket. Egy fejlődési spirál kezdetén vagyunk, és állandó erőfeszítést igényel mindenegyes újabb fok megtétele. Ma még nehezen jósolható meg, hogy miként érvényesül a géntechnológia szerepvállalása az élelemiszert túltermelő fejlett világ, illetve az éhínség súlytotta fejlődő világ országainak mezőgazdaságában. Mindenesetre súlyos mulasztás lenne, ha a magyar mezőgazdaság és fejlesztéspolitika nem készülne fel az új technológiák bevezetésével összefüggő kihívásokra. A kutatói közösség eddig is törekedett a módszerek bevezetésével újdonságértékű eredményekkel ezt a felkészülést segíteni és a versenyképességet biztosítani.


Növényi biotechnológia és géntechnológia Dudits, Dénes Heszky, László

Recommend Documents