Novinky ve vyšetřování aktivity řasinek sliznice respiračního traktu

PØEHLEDNÉ ÈLÁNKY

Novinky ve vyšetřování aktivity řasinek sliznice respiračního traktu News in the examination of the ciliary activity in the respiratory tract mucosa Papoušek P.1, Koblížek V.2, Dobešová T.2, Tomšová M.3, Salajka F.2 Katedra patofyziologie, Lékaøská fakulta UK v Hradci Králové Plicní klinika, Fakultní nemocnice v Hradci Králové 3 Fingerlandùv ústav patologie, Fakultní nemocnice v Hradci Králové 1 2

SOUHRN Vyšetøování aktivity øasinek vyvolává velký zájem a prošlo dynamickým vývojem v posledních desetiletích. Typicky je funkce øasinek porušená pøi primární ciliární dyskinezi (PCD). Nejèastìji se øasinky vyšetøují in vitro, vzorek se získává odbìrem nosní sliznice. K dispozici k pozorování øasinek in vitro je digitální videomikroskopie pøedstavující zlatý standard. Manuální odeèet tímto zpùsobem je zdlouhavý oproti jiné metodì využívající fotonásobiè. Pøi použití fotonásobièe se svìtlo zachycené na optickém vláknu analyzuje automaticky poèítaèem. S rozvojem technologií se uplatòují další zpùsoby vyšetøení, jako je automatická analýza variace stupòù šedi nebo fotonásobiè propojený se skenujícím konfokálním mikroskopem. K uchovávání funkceschopných øasinek se nejèastìji používá Medium 199. Aby byla zachována frekvence kmitání øasinek (CBF), je nezbytné používat vyhøívaný stolek mikroskopu. Prùmìrná fyziologická hodnota CBF u dospìlé populace je 11,5 Hz a u dìtí 12,8 Hz. Klíèová slova: frekvence kmitání øasinek, digitální videomikroskopie, fotonásobiè SUMMARY Ciliary activity assessment attracts a great interest and has undergone dynamic progress since the last decades. The ciliary function is typically impaired in primary ciliary dyskinesia (PCD). The cilia are mostly examined in vitro, the sample is taken away from the nasal mucosa. Digital videomicroscopy is accessible for the cilia observation in vitro and represents a gold standard. Manual reading using this method is lengthy in comparison with a photomultiplier. Using the photomultiplier, light captured in an optical fibre is analysed automatically by a computer. With technological progress other methods gain ground such as automatical analysis of variance of grey degrees or photomultiplier connected with a scanning confocal microscope. A medium 199 is mostly used for preservation of the functioning cilia. To retain ciliary beat frequency (CBF) it is necessary to use a heated microscope stage. Average physiological CBF value is 11.5 Hz in adult population and 12.8 Hz in children. Key words: ciliary beat frequency, digital videomicroscopy, photomultiplier Petr Papoušek1, Vladimír Koblížek2, Tereza Dobešová2, Markéta Tomšová3, František Salajka2 (1Department of pathological physiology, Medical faculty in Hradec Králové, Charles University, 2Department of pneumology, University Hospital in Hradec Králové, 3Fingerland´s institute for pathology, University Hospital in Hradec Králové): News in the examination of the ciliary activity in the respiratory tract mucosa, Ès. fyziologie 57 (2–3): 91–95, 2008.

Zkratky: CBF – frekvence kmitání řasinek (ciliary beat frequency) PCD – primární ciliární dyskineze HBSS – Hanks buffered salt IDA – vnitřní dyneinové raménko (inner dynein arm)

Československá fyziologie 57/2008 č. 2–3

91

ÚVOD Zjišťování ciliární aktivity se těší velkému zájmu, protože řasinky se relativně snadno získávají a jejich funkce se poměrně jednoduše měří. Vyšetření řasinek je klíčové v diagnostice některých respiračních chorob např. primární ciliární dyskineze (PCD). Z výzkumných důvodů se používá i při vyšetření CHOPN apod. Rozmanité způsoby vyšetření řasinek se liší přesností, náročností na přístrojové vybavení a rychlostí. Za zlatý standard můžeme považovat analýzu zpomaleného videozáznamu kmitání řasinek, i když velké oblibě se těší metody používající fotonásobič. S rozvojem techniky se objevují možnosti sofistikovaného automatizovaného zpracování grafického záznamu. Některé modality umožňuji okamžitě zjistit frekvenci kmitání řasinek (CBF), čehož se dá využít ke sledování účinku farmak nebo intracelulárních faktorů, jako je hladina Ca2+. Náplní tohoto článku není stanovení už výsledné mukociliární clearance. Tab. 1: Rozdìlení metod zjišśování CBF Metody zjišťování CBF: 1. in vivo rozptyl laseru při bronchoskopii 2. in vitro synchronizace se stroboskopem

vzorek respirační sliznice, je použití resekátu při operaci – většinou polypy odebrané v rámci funkční endonasální chirurgie. Vzorky řasinkových buněk získané chirugickou cestou vykazují vyšší CBF než buňky odebrané prostým stěrem kartáčkem (Raphael et al., 1996). Vzorek se uchovává ve fyziologickém roztoku (Pifferi et al., 2001), (Santamaria et al., 1999), nebo se uloží do media 199. Medium 199 obsahuje NaHCO3 a L-glutamát. Do čistící směsi se případně přidá antibiotický roztok (Raphael et al., 1996). Po promytí se vzorek připraví k dalšímu pozorování. Uchovává se při teplotě 37 ˚C, i když jiné týmy používaly zahřívání stolku na 22 ˚C (Piatti et al., 2005). Někteří výzkumníci argumentovali, že ochlazením vzorku se docílí zpomalení CBF nebo se vyvolá ciliární dyskineze. Vliv teploty na CBF bude diskutován níže. Byla též vymyšlena media k delšímu uchovávání aktivních řasinkových buněk. Umožní se tím pozorování kmitání řasinek během 10 dnů konkrétně z chirurgicky odebraných vzorků. Vzorky umístili do kultivačního media vyrobeného z media 199, fetálního telecího séra, antibiotického roztoku a směsi aditiv: inzulin, transferin a hydrokortison. Tkáně byly umístěny do kultivačního media a inkubované při 37 ˚C ve směsi 5% CO2 a vzduchu. Vzorky byly pozorovány ve speciální komůrce, kterou protékal roztok Hanks buffered salt (HBSS). Teplota v komůrce byla udržována na 37 ˚C. U takto kultivovaných buněk se CBF během 10 dnů nemění (Raphael et al., 1996).

videomikroskopie s analýzou zpomaleného videozáznamu fotodioda a fotonásobič automatická analýza variace stupňů šedi z fázově kontrastního mikroskopu fotonásobič propojený se skenujícím konfokálním mikroskopem s diferenciálně interferenčním kontrastem

Vyšetřovat se může sliznice in vivo i in vitro pocházející z horních nebo dolních dýchacích cest. Vzhledem ke snadné dostupnosti se nejčastěji používá in vitro analýza vzorku z nosní sliznice. In vivo byly u prasat testovány způsoby, kdy se používá rozptyl laseru při bronchoskopii (laser light scattering spectroscopy) (Svartgren et al., 1989), ale naprostá většina vyšetření funkce řasinek se provádí in vitro. METODY ZPRACOVÁNÍ VZORKU Jakým způsobem se získává vzorek? Vzorek se odebírá z dolní nosní skořepy kyretkou a kartáčkem, nebo bioptickými instrumenty při bronchoskopii. Kontraindikace provedení nosního stěru jsou málo četné a nejsou absolutní. Zahrnují krvácivou diatézu, přítomnost chlopňové srdeční vady, anamnézu opakovaného nosního krvácení nebo anamnézu předchozího chirurgického výkonu na nose a místní nosní malignitu. Před odběrem se pacient vysmrká. Odběr vzorku může způsobit krátkodobý pocit na kýchání a několikasekundové slzení na straně výkonu. Cytologický kartáček se před odběrem namočí do média 199 nebo do fyziologického roztoku (Tsang et al., 2000). Dalším způsobem, jak získat 92

ODEČET FUNKCE ŘASINEK Preparát k odečtu CBF se umístí do mikroskopu většinou se zahřívaným stolkem na 37 ˚C. Při použití zvětšení 1000x se dosáhne velikosti fyziologických řasinek 3–5 cm na monitoru (Pifferi et al., 2001). K omezení artefaktů se někdy používá antivibrační stolek (Chilvers et al., 2001). Jak se zjišťuje CBF? Historicky první měření CBF dle literatury provedl Martius v roce 1844, kdy s použitím stroboskopu změřil CBF mezi 6–20 Hz (Bleeker, 1971). Principem metody je synchronizovat frekvenci kmitání řasinek s blikáním stroboskopu. K synchronizaci ciliárního pohybu se dnes používá zvukový a vizuální generátor na monitoru. Výsledky získané touto metodou odpovídají analýze videozáznamu se zpomaleným pohybem (Piatti, 2005). Velmi oblíbenou metodou odečtu CBF je použití fotonásobiče (photomultiplier) propojeného s upraveným mikroskopem. Světlo projde vzorkem a objektivem a zachytí se na opticky vodivém vláknu o průměru 50 μm, které sbírá světlo z povrchového ekvivalentu o průměru 1,25 μm. Světlo je fotonásobičem převedeno na signál vzhledu nepravidelné sinusoidy. Vrcholy zvlněné křivky odpovídají jednotlivým kmitům řasinek. Digitalizace probíhá o vzorkovací frekvenci 1024 Hz. Záznam se zpracuje analýzou pomocí Fast Fourierovy transformace. Na výsledné spektrální analýze kmitočtu řasinky odpovídá vrchol křivky (modus daného řasinkového kmitočtu) měřené CBF (Korngreen et al., 1994) (1). Frekvence pod 2 Hz byly odfiltrovány, aby se odstranily artefakty pohybu stolku mikroskopu apod. Československá fyziologie 57/2008 č. 2–3

Obr. 2: Øasinková buòka ve svìtelném mikroskopu v zástinu, zvìtšení 1000krát, digitální záznam pohybu øasinek umožní zpìtnou analýzu CBF a typu pohybu øasinek. Foto spoluautor dr. Tomšová

Obr. 1: Schematický nákres mikroskopu s fotonásobièem na mìøení CBF. Kolísání intenzity svìtla dané kmitáním øasinek je zachycené fotonásobièem a poèítaèem je pøevedeno do nepravidelné sinusoidy. Z ní se automaticky transformací spoèítá CBF. VZ – vzorek s buòkami s øasinkami, PMT – fotonásobiè, PC – poèítaè. Vlastní obrázek

Zlatým standardem odečtu CBF je analýza zpomaleného záznamu z mikroskopu – digitální videomikroskopie. Mikroskop je propojený s videokamerou, záznam se nahrává do počítače se vzorkovací frekvencí nad 50 Hz (Doran et al., 2004), nebo 125 Hz (Fliegauf, 2005) a 400 Hz (Chilvers et al., 2001). Vzorkovací frekvence by měla být alespoň dvojnásobná než maximální předpokládaná CBF v preparátu. Vlastní manuální odečet potom záleží v počítání kmitů vybrané zvětšené řasinky na monitoru. Při znalosti vzorkovací frekvence se jednoduše zkalkuluje CBF ze odečteného počtu dokončených kmitů v daném známém souboru snímků na videozáznamu. Vysokorychlostní digitální videomikroskopie umožňuje pozorovat typ kmitání řasinky (beat pattern). Samotná analýza jen čísla CBF nemusí zachytit úplně všechny pacienty primární ciliární dyskinezí (PCD), když cirkulární pohybový typ způsobený transpozicí mikrotubulů je patrný až videomikroskopicky (Stannard et al., 2004).

Československá fyziologie 57/2008 č. 2–3

Další sofistikovanou metodou odečtu CBF je počítání variace optické denzity v čase. Na digitálním videozáznamu se ve vybrané oblasti vzorku mění intenzita šedi v závislosti na kmitání řasinek. Softwarovým vybavením se dá z periodického kolísání stupňů šedi zjistit CBF. Jeden tým používal videozáznam o frekvenci 25,6 Hz (Clary-Meinesz et al., 1997). Axiální obraz řasinek hodnocený metodou variace optické denzity je na obrázku 3.

Obr. 3: Pohled na bloèek bunìk respiraèního epitelu králíka ze shora ve fázovì kontrastním mikroskopu. Bílými hranicemi jsou oddìleny jednotlivé buòky. Šedé skvrny pøedstavující øasinky se na videozáznamu pohybují. Šipka oznaèuje místo, kde se zjišśuje CBF metodou kolísání intenzity šedi digitalizované sekvence (Zhang et al., 2003). Otištìno se svolením

93

Další novou metodou měření CBF je technika založená na fotonásobiči, který je propojený se skenujícím konfokálním mikroskopem s diferenciálně interferenčním kontrastem. Spočítají se cykly intenzity šedi měnící se v čase díky činnosti řasinek (např. programem Metamorph). Zjistí se časová změna intenzity světla ve vybrané linii na preparátu. Hledané periodické přerušování na vertikální linii odráží cyklické změny řasinkového kmitání. Skenovací mikroskop má vzorkovací frekvenci 198,6 Hz (Doyle et al., 2006). Novou, i když zatím experimentální metodou vyšetření funkce řasinek je rotační frekvence epiteliálních sferoidů. Jedná se o postup, kdy se epiteliální buňky odebrané kartáčkem z dýchacích cest kultivují ve speciálním mediu 3–10 dnů. Narostou do kulovitých agregátů, které rotují kolem vlastní osy rychlostí 0,42 otáčky za sekundu v případě sferoidů z bronchiálního epitelu a 0,21 otáčky za sekundu u vzorku z nosní sliznice (Gamarra et al., 2006). FYZIOLOGICKÉ VÝSLEDKY MĚŘENÍ AKTIVITY ŘASINEK Jaké jsou fyziologické hodnoty CBF u lidí? Fyziologicky je CBF vyšší u dětí. Metodou videomikroskopie vyšla CBF u zdravých dětí 12,8 Hz. Statisticky se lišila od CBF dospělých 11,5 Hz (Chilvers, 2003). Dále bylo potvrzeno, že CBF klesá s věkem i v dospělosti. Jedinci starší než 40 let mají statisticky signifikantně nižší CBF. Nosní mukociliární clearance se s věkem též zhoršuje. Není rozdíl mezi pohlavími ve výši CBF (Ho et al., 2001). Již v 80. letech byla srovnávána CBF u řasinek nosní a bronchiální sliznice. Překvapivě bylo zjištěno, že u pacientů s tumorem dýchacího systému vyšla stroboskopickou metodou v nose CBF 8,89 Hz a v bronších 9,6 Hz. Výsledek mohl být ovlivněn tím, že vyšetření bylo provedeno při pokojové teplotě 18–25 ˚C a nikoliv při tělesné. Soubor obsahoval navíc jen 10 dospělých (Escudier et al., 1987). Jiná skupina došla fotometrickou metodou k těmto výsledkům u 25 pacientů: CBF v nosní sliznici 14,0 Hz, v trachee 14,2 Hz, v lobárním bronchu 14,3 Hz a v subsegmentálním bronchu 10,3 Hz. Výsledky se od sebe statisticky nelišily na hladině alfa 0,05 s výjimkou subsegmentálního bronchu (Rutland et al., 1982). Jeden tým studoval vliv teploty na CBF, mezi 19 a 32 ˚C frekvence kmitání řasinek postupně narůstala. Mezi 32 a 40 ˚C se CBF neměnilo s teplotou. Nad 40 ˚C tato frekvence však už klesala (Green et al., 1995). Metody zjišťující CBF neposkytují bohužel identické výsledky. Srovnáním CBF vyšly statisticky významné rozdíly. CBF digitální videomikroskopií poskytlo frekvenci 13,2 Hz, fotonásobičem (photomultiplier) 12,0 Hz (p = 0,01) a fotodiodou 11,2 Hz (p < 0,001) (Chilvers, O’Callaghan, 2000). U řasinek hodnotíme kromě CBF též pohybový typ řasinky (pattern) – parametr dyskineze. U PCD může být odchylný pohybový typ jedinou patologií na videozáznamu, i když méně často. Tato dyskineze byla skórována jedním týmem 94

následovně: 0 (normální pohyb), 1–3 (abnormální kmitání, když u stupně 3 všechny řasinky kmitaly dyskineticky). Kmitání dyskinetických cilií připomíná tleskání rukou proti sobě (Chilvers et al., 2001). Jeden tým porovnával změnu CBF po ciliogenezi – kultivaci vzorku respiračního epitelu v in vitro buněčné kultuře. Ve vzorku po odběru zjistili CBF 8,4 Hz, po ciliogenezi v suspenzní kultuře bylo CBF přibližně 8 Hz. Po 3 týdnech v suspenzní kultuře se průměrné CBF zvýšilo na 8,6 Hz (Jorissen et al., 1995). Po ciliogenezi přetrvávají vrozené funkční a strukturální abnormality (PCD), kdežto vymizí ty získané během života (sekundární ciliární dyskineze). Buňky se kultivují s proteázou, DMEM-Ham F12 (Life Technologies) s antibiotiky, choleratoxinem a přidá se též Ultroser G (Life Technologies). V suspenzním mediu je NUSerum (Beckton Dickinson). Podrobný popis viz odkaz (Willems et al., 2004). Odečet řasinek provádí pracovník, který neví, od koho pocházejí epiteliální buňky. Měl by se hodnotit podíl buněk s řasinkami ve vzorku, protože jejich počet může být snížen u virových infekcí nebo chronické rhinitidy (Tsang et al., 2000). Na našem pracovišti ve Fakultní nemocnici v Hradci Králové máme zkušenosti s digitálním videomikroskopem. Používáme vyhřívaný stolek mikroskopu. Vzorek po odběru uchováváme ve fyziologickém roztoku. Výzkum je zaměřen zejména na problematiku získaných ciliárních dyskinez. INDIKACE VYŠETŘENÍ CBF Vyšetření řasinek provádíme, abychom mohli určit příčinu bronchiektázií a opakovaných infekcí dýchacích cest (časné infekce bez jiného vysvětlení). Dále k identifikaci pacientů, kteří budou vyžadovat pozornost specialisty. Ještě pro studium patogeneze respiračních chorob a vlivu toxinů a chemikálií na funkci řasinek. DISKUSE A ZÁVĚR Moderní technologie nabízejí rozmanité metody in vitro zjišťování funkce řasinek. Některé metody vyšetření řasinek mají již jen historickou hodnotu, ale jiné dovolují sledování CBF tak, že to umožní časově porovnat aktuální kmitočet s jinými celulárními parametry. S rozvojem technologií se jistě objeví další nové způsoby spolehlivého, levného a rychlého hodnocení aktivity řasinek. Výhodou videomikroskopie je vysoká přesnost, avšak její manuální hodnocení snímek po snímku je zdlouhavější vzhledem k moderním automatizovaným technikám. Úkolem všech metod je hodnotit jen viabilní nepoškozené buňky, což vyžaduje zkušenosti. Je samozřejmé, že samotným odběrem buněk dochází k jejich poškození. Někteří autoři k tomuto rozlišení doporučují vitální barvení tryptanovou modří, pozorováním ustálenosti CBF v čase a reverzibilitou změn CBF vyvolaných alteracemi pH (Clary-Meinezs et al., 1997) (2). Digitální videomikroskopie má klíčové postavení Československá fyziologie 57/2008 č. 2–3

v hodnocení PCD, i když význam ve jejím screeningu má nesporně vyšetření nosem vylučovaného NO (oxid dusnatý), který je u PCD výrazně snížen. Při využití vyšetření řasinek v diagnostice respiračních chorob je známo, že samotná číselná CBF v případě fyziologických hodnot CBF nestačí k definitivnímu vyloučení PCD. Pacienti s defektem IDA (vnitřní dyneinové raménko) měli téměř normální aktivitu řasinek, odchylky pohybového vzoru byly patrné až podrobnou analýzou vysokorychlostní videomikroskopií. Klinik by tedy neměl vyloučit PCD u pacienta s typickým klinickým nálezem odpovídajícím této chorobě, jestliže není schopen dostatečně zhodnotit pohybový typ řasinky (pattern), který se může zjistit pouze vysokorychlostním videomikroskopem. Otázkou je použití média při zpracování epiteliálních buněk. Většina prací používá médium 199, i když někteří včetně nás využívají jen obyčejný fyziologický roztok.

Standardem by měl být vyhřívaný stolek mikroskopu na tělesnou teplotu, což prokazatelně normalizuje CBF. Vyšetření řasinek je sofistikovanou metodou, od níž očekáváme v budoucnu větší klinické použití nad rámec současné experimentální aplikace. Poděkování: Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR 8407-4/2005

MUDr. Petr Papoušek Katedra patofyziologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové Šimkova 870, 500 38 Hradec Králové 1 E-mail: [email protected]

LITERATURA 1. 2.

Bleeker JDJ, Hoeksema PE. Simple method to measure ciliary beat rate

O‘Callaghan C. The effects of coronavirus on human nasal ciliated

of respiratory epithelium. Acta Oto-Laryngologica, 71, 1971, s. 426

respiratory epithelium. Eur Respir J, 18, 2001, s. 965–970.

Clary-Meinesz C, Mouroux J, Huitorel P, Cosson J, Schoevaert D, Blaive

12. Chilvers MA, Rutman A, O‘Callaghan C. Functional analysis of cilia

B. Ciliary Beat Frequency in Human Bronchi and Bronchioles. Chest,

and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young

111, 1997, s. 692–697. 3.

adults. Thorax, 58, 2003, s. 333–338.

Doran SA, Koss R, Tran CH, Christopher KJ, Gallin WJ, Goldberg JI.

13. Jorissen M, Bessems A. Normal ciliary beat frequency after ciliogenesis

Effect of serotonin on ciliary beating and intracellular calcium concen-

in nasal epithelial-cells cultured sequentially as monolayer and in sus-

tration in identified populations of embryonic ciliary cells. J Exp Biol, 207, 2004, s. 1415–1429 4.

pension. Acta Oto-Laryngologica, 115, 1995, s. 66–70. 14. Korngreen A, Priel Z. Simultaneous measurement of ciliary beating

Doyle RT, Moninger T, Debavalya N, Hsu WH. Use of confocal linescan to document ciliary beat frequency. Journal of Microscopy, 223,

and intracellular calcium. Biophys. J., 67, 1994, s. 377–380. 15. Piatti G, Ambrosetti U, Santus P, Allegra L. Effects of salmeterol on

2006, s. 159–164. 5.

6.

7.

cilia and mucus in COPD and pneumonia patients. Pharmacological

Escudier ELV, Boucherat M, Fleury J, Bernaudin JF, Peynegre R. Com-

Research, 51, 2005, s. 165–168.

parative frequencies of the beats of nasal and bronchial ciliary cells.

16. Pifferi M, Cangiotti AM, Ragazzo V, Baldini G, Cinti S, Boner AL.

Study in 10 adults without respiratory pathology. Rev Pneumol Clin.,

Primary ciliary dyskinesia: Diagnosis in children with inconclusi-

43, 1987, s. 65–8.

ve ultrastructural evaluation. Pediatric Allergy and Immunology, 12,

Fliegauf M, Olbrich H, Horvath J, Wildhaber JH, Zariwala MA, Ken-

2001, s. 274–282.

nedy M, et al. Mislocalization of DNAH5 and DNAH9 in Respiratory

17. Raphael JH, Strupish J, Selwyn DA, Hann H, Langton JA. Recovery of

Cells from Patients with Primary Ciliary Dyskinesia. Am. J. Respir.

respiratory ciliary function after depression by inhalation anaesthetic

Crit. Care Med., 171, 2005, s. 1343–1349.

agents: an in vitro study using nasal turbinate explants. Br. J. Anaesth.,

Gamarra F, Bergner A, Stauss E, Stocker I, Grundler S, Huber RM.

76, 1996, s. 854–859.

Rotation frequency of human bronchial and nasal epithelial sphero-

18. Rutland J, Griffin WM, Cole PJ. Human ciliary beat frequency in

ids as an indicator of mucociliary function. Respiration, 73, 2006, s.

epithelium from intra-thoracic and extrathoracic airways. American

664–672. 8.

9.

Review of Respiratory Disease, 125, 1982, s. 100–105.

Green A, Smallman LA, Logan ACM, Drakelee AB. The effect of tem-

19. Santamaria FMS, Grillo G, Sarnelli P, Caterino M, Greco L. Ciliary

perature on nasal ciliary beat frequency. Clinical Otolaryngology, 20,

motility at light microscopy: a screening technique for ciliary defects?

1995, s. 178–180.

Acta Paediatrica, 88, 1999, s. 853–857.

Ho JC, Chan KN, Hu WH, Lam WK, Zheng L, Tipoe GL, et al. The

20. Stannard W, Rutman A, Wallis C, O‘Callaghan C. Central microtubu-

effect of aging on nasal mucociliary clearance, beat frequency, and

lar agenesis causing primary ciliary dyskinesia. American Journal of

ultrastructure of respiratory cilia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 163, 2001, s. 983–988. 10. Chilvers MA, O‘Callaghan C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax, 55, 2000, s. 314–317. 11. Chilvers MA, McKean M, Rutman A, Myint BS, Silverman M,

Československá fyziologie 57/2008 č. 2–3

Respiratory and Critical Care Medicine, 169, 2004, s. 634–637. 21.

Tsang KWT, Zheng L, Tipoe G. Ciliary assessment in bronchiectasis. Respirology, 5, 2000, s. 91–98.

22. Willems T, Jorissen M. Sequential monolayer-suspension culture of human airway epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis 2004; 3(Supplement 2): 53–54.

95