Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Antwerpen
Coördinaten van het Referentielaboratorium Dr. F. PORTAELS Tel. : 03/247.63.17
I.T.G. - Mycobacteriologie Fax : 03/247.63.33
Nationalestraat, 155 2000 Antwerpen E-mail :
[email protected]
Onderstaande gegevens tonen het activiteitenverslag van het referentielaboratorium in Antwerpen (I.T.G - Antwerpen).
Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : ¾ op klinische monsters : • • • • • ¾
microscopisch onderzoek kweek op vaste voedingsbodems (Löwenstein-Jensen, Ogawa en Stonebrink) identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rRNA gen) PCR-analyses : deze analyses laten toe de aanwezigheid van mycobacteriën vast te stellen, en het Mycobacterium tuberculosis complex te identificeren op basis van het 16S rRNA gen eventueel gevoeligheidsbepaling aan rifampicine van de gedetecteerde mycobacteriën met behulp van PCR en sequencing van het rpoB gen.
op positieve kweken : • •
identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rRNA gen) eventueel gevoeligheidsbepaling van de gedetecteerde mycobacteriën. Dit gebeurde • via de MGIT-SIRE kit in het BACTEC-MGIT960 toestel voor de eerstelijns middelen (streptomycine, isoniazide, rifampicine en ethambutol). • via de proportiemethode op 7H11 agar voor volgende tweedelijns middelen (enkel voor MDR-TB) : ofloxacine (4 µg/ml), kanamycine (6 µg/ml), ethionamide (10 µg/ml) en capreomycine (10 µg/ml).
Totaal aantal monsters ontvangen voor analyse Tabel 1 : Mycobacteriën : totaal aantal monsters ontvangen voor analyse (N; 2002-2005, 2007) 2002
2003
2004
2005
2007
klinische monsters kweken
217 122
454 891
466 103
382 187
326 81
Totaal
339
1345
569
569
407 myco_a_t1
Geografische oorsprong: Het merendeel van de klinisch monsters was afkomstig van consultaties binnen het Instituut voor Tropische Geneeskunde, terwijl de positieve culturen voornamelijk werden toegestuurd vanuit 21 verschillende laboratoria verspreid over Vlaanderen. Ongeveer de helft hiervan was afkomstig van 4 laboratoria (AZ Zottegem; Damiaan Oostende; H. Hart Eeklo; UZA). Een aantal monsters werden gestuurd voor DNA typering, terwijl de meerderheid gestuurd werd voor een eerste analyse (diagnose of gevoeligheidsbepaling en identificatie). Voor sommige patiënten werd meer dan één monster ontvangen. In tabellen 2-6 wordt een verdeling weergegeven van het totaal aantal monsters volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat. Tabel 2 : Mycobacteriën : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2002 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 2002
Totaal
Kweken
Klinische monsters
M. tuberculosis NTM Negatief Uitgezonderd Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting
43 29 206 10 46 5
38 25 0 8 46 5
5 4 206 2 0 0
Totaal
339
122
217 myco_a_t2
Mycobacteriën
1
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Antwerpen
Tabel 3 : Mycobacteriën : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2003 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 2003 Eerste analyse
Confirmatie
Totaal
Kweken
Klinische monsters
M. tuberculosis NTM Negatief Uitgezonderd
43 15 289 23
39 12 0 7
4 3 289 16
Subtotaal
370
58
312
56 4
56 4
0 0
430
118
312
Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting
Totaal
myco_a_t3
Tabel 4 : Mycobacteriën : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2004 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 2004 Eerste analyse
Confirmatie
Totaal
Kweken
Klinische monsters
M. tuberculosis NTM Negatief Uitgezonderd
51 31 444 15
39 25 5 6
12 6 439 9
Subtotaal
541
75
466
28 0
28 0
0 0
569
103
466
Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting
Totaal
myco_a_t4
Tabel 5 : Mycobacteriën : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2005 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Totaal 2005 Eerste analyse
Confirmatie
Kweken Totaal Verschillende patiënten
Klinische monsters Totaal Verschillende patiënten
M. tuberculosis NTM Negatief Uitgezonderd
58 44 375 48
55 41 19 28
52 37 16 27
3 3 356 20
3 3 0 0
Subtotaal
525
143
132
382
315
44 0
44 0
0 0
569
187
382
Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting
Totaal
myco_a_t5
Tabel 6 : Mycobacteriën : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2007 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Totaal 2007 Eerste analyse
Confirmatie Totaal
Kweken Totaal Verschillende patiënten
Klinische monsters Totaal Verschillende patiënten
M. tuberculosis NTM Negatief Uitgezonderd
53 30 320 25
50 24 23 5
37 20 21 3
3 6 297 20
3 6 270 18
Subtotaal
428
102
81
326
297
0 3
0 3
0 0
431
105
326
Kwaliteitscontrole DNA-fingerprinting
myco_a_t6
•
•
2
De 326 klinische monsters waren afkomstig van 297 verschillende patiënten; 9 monsters (van 9 verschillende patiënten) werden positief in cultuur (3 M. tuberculsos-complex of MTBc en 3 M. marinum, 2 M. intracellulare en 1 M. chelonae) Van de 102 toegestuurde isolaten waren er 93 bedoeld voor een eerste diagnose. Deze laatste waren afkomstig van 81 verschillende patiënten. Van deze laatste werden 57 isolaten geïdentificeerd als mycobacteriën (37 MTBc en 20 niet-tuberculeuze mycobacteriën of NTM). Het aandeel gecontamineerde kweken of kweken waarin geen
Mycobacteriën
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Antwerpen
mycobacteriën werden teruggevonden, die werden toegestuurd nam toe tegenover de voorbije jaren: 5,8% (6/103) in 2004, 14,9% (28/187) in 2005, 15 % (14/93) in 2006 en 20% in 2007 (20/102).
Identificatie van de positieve monsters in 2007 In tabel 7 wordt een overzicht gegeven van de geïdentificeerde monsters. Het gaat hier enkel om Mycobacterium species isolaten voor een eerste identificatie die werden toegestuurd uit perifere laboratoria of geïsoleerd werden uit klinische monsters in het referentielaboratorium. Isolaten toegestuurd voor kwaliteitscontrole van de identificatie werden niet meegerekend. Per patiënt werd slechts 1 isolaat in meegeteld. Het merendeel (61%) van de gekarakteriseerde isolaten behoren tot het MTBc, gevolgd door M. avium (8/81 of 9,8%) en M. marinum (4/81 of 4,9%). Tabel 7 : Mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en toegestuurde kweken in 2007, gerangschikt per oorsprong en identificatie. Monsters voor kwaliteitscontrole en DNA-fingerprinting werden niet ingesloten. Per patiënt werd slechts één monster meegerekend.
37
8
40
8
2
1 165 1 32 2 2 36 54 7
2 12 180 2 35 2 40 6 60 7
3 297
20 326
1 3 1 2
1
1 1
Totaal aantal patiënten
Subtotaal
1
Niet-mycobacterien
2
1
Negatief
2 3 16
1
M marinum
1
Bronchiale aspiratie Expectoratie Huidbiopt Orgaanbiopt Pleuravocht Urine Andere Onbepaalde oorsrong
1
M. kansasii
3 12
M. intracellulare
3
M. gordonae
Subtotaal
M. fortuitum
Totaal
1 2
M. chelonae
Kweken
Bronchiale aspiratie Expectoratie Etter Faeces Huidbiopt Urine Andere
M. avium
M. tuberculosis
Klinische monsters
1
1 11
2
1
1
3 3 2 1
1
5 30 1 3 3 7 7 25
21
3
81
1 1 2
1
2
3
3
1
2
1
3
3
3
3
2
4 318
23 407 myco_a_t7
Mycobacteriën
3
4
Mycobacteriën
3
M. chimerae
1
3
3
5
1
200
2001
1
Totaal
Totaal
M. xenopi
M. tuberculosis
M. terrae
M. szulgai
2000
Totaal
50 M. xenopi
NTM
M. tuberculosis
M. terrae
M. species
M. smegmatis 4
M. xenopi
M. species
M. tuberculosis-complex
M. tuberculosis
6
M. terrae
2 M. szulgai
6
M. szulgai
2
M. smegmatis
M. simiae
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
M. palastre
M. nonchromogenicum
M. necaurum
M. nebraski
M. mucogenicum
1
M. species
M. simiae
M. scrofulaceum 2
M. smegmatis
M. simiae
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
M. palastre
M. nonchromogenicum
M. necaurum 1
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
M. palastre
M. nonchromogenicum
100
M. necaurum
43% M. nebraski
28%
M. nebraski
57% 4
M. mucogenicum
72% 7
M. kansasii
0 M. marinum
7
M. mucogenicum
3
M. marinum
M. interjectum M. intracellulare
59%
M. marinum
3
M. kansasii
M. gordonae M. hassiacum
41%
M. kansasii
1
M. intracellulare
M. interjectum
5
M. intracellulare
150
M. interjectum
2
M. hassiacum
150
M. gordonae
M. fortuitum M. frederiksbergense
3
M. hassiacum
M. fortuitum M. frederiksbergense
M. chimerae M. engbaekii
150
M. gordonae
2
M. frederiksbergense
M. chimerae M. engbaekii
M. celatum M. chelonae 9
M. fortuitum
M. engbaekii
4
M. celatum
1
M. chelonae
0
M. chelonae
100 M. bovis
M. avium complex
50
M. bovis
M. avium complex
100
M. celatum
5
M. bovis
0
M. avium complex
Mycobacteriën Referentielaboratorium - Antwerpen
In figuren 1-8 wordt een evolutie weergegeven van het totaal aantal geïdentificeerde mycobacteriën van Belgische oorsprong in het referentielaboratorium over de laatste 8 jaar. Daarbij zien we dat de verhouding van NTM tegenover M. tuberculosiscomplex vrij constant blijft.
Figuur 1 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2000 N
200 155
NTM 92
25 3
Figuur 2 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2001
N
182
131
M. tuberculosis-complex
50 19
2
Figuur 3 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2002
N
200
2002
NTM
M. tuberculosis-complex
79
45
2
12
2
1
4
6
6
1
M. tuberculosis-complex Totaal
M. xenopi
50 M. szulgai M. terrae
Totaal
M. xenopi
M. tuberculosis
M. species
M. smegmatis
M. simiae
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
M. palastre
M. nonchromogenicum
M. tuberculosis-complex
Totaal
M. nebraski M. necaurum
1
M. tuberculosis
M. marinum
1
M. xenopi
M. terrae
M. szulgai
M. species
M. smegmatis
M. simiae
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
M. palastre
M. kansasii
7
M. tuberculosis
M. terrae
2
M. szulgai
1
M. species
M. smegmatis
3
M. simiae
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. nebraski M. necaurum M. nonchromogenicum
1
M. parascrofulaceum
100 1
M. palastre
43% 1
M. nonchromogenicum
57% 2
M. necaurum
33%
M. mucogenicum
1 M. mucogenicum
1
M. nebraski
67%
M. marinum
1
M. intracellulare
100
M. kansasii
M. hassiacum M. interjectum
27%
M. mucogenicum
2
M. interjectum
1
M. intracellulare
M. fortuitum M. frederiksbergense
73%
M. marinum
2
M. kansasii
150
M. intracellulare
0 M. hassiacum
1
M. hassiacum
150
M. interjectum
1
M. gordonae
5
M. gordonae
M. chimerae M. engbaekii
150
M. gordonae
M. fortuitum M. frederiksbergense
5
M. frederiksbergense
M. chimerae M. engbaekii
M. celatum M. chelonae 1
M. fortuitum
M. engbaekii
M. celatum
6
M. chelonae
1
M. chimerae
1
M. celatum
0
M. chelonae
100 M. bovis
M. avium complex 9
M. bovis
M. avium complex
0
M. bovis
M. avium complex
Referentielaboratorium - Antwerpen
Mycobacteriën
Figuur 4 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2003
200 N
2003
NTM 77 106
50
Figuur 5 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2004
N
200
2004
NTM
M. tuberculosis-complex 42 63
1
Figuur 6 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2005
N
200
2005
NTM
96
50
55
Mycobacteriën
5
6
Mycobacteriën
M. celatum
3
M. hassiacum
3 2
Totaal
50
M. xenopi
M. nebraski
Totaal
M. xenopi
M. tuberculosis
M. terrae
M. szulgai
M. species
M. smegmatis
M. simiae
M. scrofulaceum
M. peregrinum
M. palastre M. parascrofulaceum
M. nonchromogenicum
M. necaurum
50
M. tuberculosis
M. terrae
M. szulgai
M. species
M. smegmatis
M. simiae
M. marinum M. mucogenicum
1
M. scrofulaceum
M. kansasii
1
M. peregrinum
M. parascrofulaceum
61%
M. palastre
39%
M. nonchromogenicum
1
M. nebraski
3
M. intracellulare
100
M. necaurum
2
M. interjectum
44%
M. mucogenicum
1
M. hassiacum
5
M. gordonae
56%
M. marinum
3
M. kansasii
0 M. intracellulare
150
M. interjectum
M. fortuitum M. frederiksbergense
2
M. chimerae
150
M. gordonae
3
M. fortuitum
1
M. frederiksbergense
1
M. engbaekii
3
M. chimerae
0
M. engbaekii
8 M. chelonae
M. celatum
M. bovis
M. avium complex 10
M. chelonae
100
M. bovis
M. avium complex
Mycobacteriën Referentielaboratorium - Antwerpen
Figuur 7 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2006
200 N
2006
NTM
M. tuberculosis-complex 79
44
4
Figuur 8 : Mycobacteriën geïdentificeerd in 2007
N
200
2007
NTM
M. tuberculosis-complex 40 66
4
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Antwerpen
Gevoeligheidstest 1.
M. tuberculosis
In 2007 werd M. tuberculosis-complex geïdentificeerd bij 37 verschillende patiënten. Een volledige gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 36 isolaten, terwijl voor 1 cultuur enkel de snelle moleculaire test voor de detectie van resistentie aan rifampicine werd uitgevoerd. Aantal patiënten • gevoelig voor H (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) en S (streptomycine) : 24 • mono-resistent tegen H : 1 • mono-resistent tegen S: 6 • resistant tegen H en S : 3 • Multi-resistent (MDRTB, tegen minstens R en H) : 2 Eén MDRTB patiënt bleek gevoelig aan alle geteste tweedelijns middelen, terwijl de andere resistentie vertoonde aan kanamycine en capreomycine. Tabel 8 : Mycobacteriën : evolutie van de gevoeligheid (N; 2002-2007)
gevoelig voor H, R, E en S H, R en E mono-resistent tegen E H S resistant tegen H en S H, E en S multi-resistent HR HS HRE HRES MDRTB, tegen minstens R en H Totaal isolaten
2002
2003
35
34
1
1
1
1
2
3
2004
2005
2007
39
44
24
1
1 2 3 1 2
1 1 1 2 39
39
42
54
36 myco_a_t8
H (isoniazide), R (rifampicine), E (ethambutol), S (streptomycine)
2.
1 6 3
Atypische of niet-tuberculeuze mycobacteriën (NTM)
Er werden geen gevoeligheidsbepalingen voor NTM uitgevoerd in 2007.
Diagnose per moleculaire biologie op klinische monsters In 2007 zagen we een stabilisatie van de aanvragen voor opsporing van mycobacteriën of M. tuberculosis-complex door PCR in klinische monsters. Vijfendertig procent (6/17) van de onderzochte monsters was positief. Details staan weergegeven in tabel 9. Tabel 9 : Mycobacteriën : detectie van mycobacterieel DNA in klinische monsters ontvangen (N; 2007) PCR (16S rDNA gen)1 Monster
1
Aantal
Negatief
MTBc
Rifampicine resistentie bepaling (rpoB gen) met sequencing NTM
Sputum Biopsie Etter Pleuraocht Andere
6 6 2 2 1
4 4 0 2 1
1 1
1 2 1
Totaal
17
11
2
4
Niet-gecommercialiseerde testen vervaardigd in het Laboratorium van Mycobacteriologie van het ITG
0 myco_a_t8
Mycobacteriën
7
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Gegevens van het referentielaboratorium Dr. Ap. M. DUFAUX Tel. : 02/373.32.10
WIV - Dpt Pasteur – Mycobacteriën Fax : 02/373.32.81
Engelandstraat 642 1180 Brussel E-mail :
[email protected]
Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en Mycobacteriën.
Inleiding De volgende analysen werden uitgevoerd : op DNA-extract identificatie opsporing van genmutaties geassocieerd met antibioticaresistentie op positieve culturen
identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rRNA of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-LipaMycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het M. tuberculosiscomplex kan worden ontleed)
gevoeligheidstest voor M. tuberculosis -
in Bactec MGIT 960 of in Bactec 460TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-PZA
-
door de methode Bactec 460TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica
-
door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpoB om de resistentie tegen rifampicine na te gaan
-
door PCR om de mutatie S315T in het gen katG en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inhA om de resistentie tegen isoniazide na te gaan
gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem)
genotypering van M. tuberculosis, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken : spoligotyping, MIRU-VNTR op 12 of 22 loci en RFLP op IS6110)
Stalen ontvangen voor analyse in 2007 Aantal : 1502
1265 31 28 135 30 13
culturen voor identificatie culturen voor kwaliteitscontrole culturen voor genotypering DNA-extracten van klinische stalen DNA-extracten van runderen (CERVA) voor genotypering door MIRU-VNTR klinische stalen, per vergissing (worden niet meer voor analyse aanvaard sinds maart 2006)
Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 110 verschillende laboratoria, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen Tabel 1 : Mycobacteriën : stalen ontvangen voor analyse (N; 2000-2007) 2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
klinische monsters kweken
409 1084
350 934
352 1001
454 891
682 1002
778 1148
276 * 148 1319 1354
Totaal
1493
1284
1353
1345
1684
1926
1595
* niet meer aangevaard voor analyse sinds maart 2006
2007
1502 myco_b_t1
Mycobacteriën
1
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong Aantal : 1025 [427 (41,7%) M. tuberculosiscomplexen en 598 (58,3%) atypische mycobacteriën of NTM].
De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in tabel 3 vermeld. Het detail van de identificaties per type klinisch staal wordt in de tabellen 4 en 5 weergegeven. In tabel 6 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. Opmerkelijk is het feit dat 240 (19%) van de 1265 culturen opgestuurd ter identificatie geen mycobacteriën bevatten.
Gevoeligheidstests 1. M. tuberculosis In 2007 werd M. tuberculosis (M. tuberculosiscomplex) geïdentificeerd in 427 klinische stalen van 412 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest is uitgevoerd voor 376 patiënten (op 1 klinisch isolaat voor 332 patiënten en op 2 of 3 isolaten voor 44 van hen). Het antibiogram is niet uitgevoerd op de stammen verstuurd voor genotypering, noch op besmette culturen, noch wanneer de stam was geïsoleerd in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoerde (tabel 2). Tabel 2 : Mycobacteriën : gevoeligheidstests (N, %; 2001-2007) 2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
N
%
gevoelig voor I, R en E alleen resistent tegen E alleen resistent tegen I alleen resistent tegen R resistent tegen I + E multiresistent (I+R) multiresistent (I+R+E)
284 1 9 1
93,1 0,3 3,0 0,3
275 1 35
84,4 0,3 10,7
219
86,9
285
87,4
311
90,7
280
82,8
323
85,9
22 2
8,7 0,8
26 1
8,0 0,3
21 0
6,1 0,0
1 9
0,3 3,0
3 12
0,9 3,7
2 7
0,8 2,8
14
4,3
11
3,2
32 2 4 7 13
9,5 0,6 1,2 2,1 3,8
23 1 7 4 18
6,1 0,3 1,9 1,1 4,8
Totaal
305
100,0
326
100,0
252
100,0
326
100,0
343
100,0
338
100,0
376
I : isoniazide, R : rifampicine, E : ethambutol
100,0 myco_b_t2
Onder de multiresistente stammen stellen we 1 M. bovis vast (patiënt in 2006 al bekend als monoresistent tegen isoniazide) en 12 stammen (55%) behorend tot de familie Beijing. Een mutatie in rpoB is aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine (mutatie S531L in 73% van de gevallen). Een mutatie in katG of inhA is aangetroffen in 91% van de MDRisolaten (katG in 73%; katG + inhA in 18%; alleen inhA in 4,5% = 1 stam). Onder de isolaten monoresistent tegen isoniazide (of resistent tegen isoniazide en ethambutol) is de mutatie S315T in katG aangetroffen in 67% van de isolaten, de mutatie -C15T in inhA in 7% van de isolaten. De resterende 27% isolaten hadden de gezochte mutatie in deze 2 genen niet.
2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 165 patiënten (171 isolaten) besmet met de volgende mycobacteriën : 87 M. avium-intracellulare, 30 M. xenopi, 24 M. kansasii, 7 M. malmoense, 5 M. marinum, 3 M. interjectum, 2 M. szulgai en 7 andere atypische mycobacteriën.
Analyse van DNA geëxtraheerd uit klinische stalen Wij hebben 135 DNA (geëxtraheerd in het laboratorium dat het staal had gekregen) ontvangen ter identificatie en/of opsporing van mutatie in het gen rpoB. De opsporing van een mutatie in het gen rpoB van DNA van het M. tuberculosiscomplex is een sneltest voor de opsporing van de resistentie van de stam tegen rifampicine, wat multiresistentie (resistentie tegen rifampicine + isoniazide) suggereert. Van de 135 DNA zijn er 118 afkomstig van een laboratorium voor anatoompathologie, 123 waren geëxtraheerd uit een biopsie of klieren en 12 uit respiratoire stalen (tabel 5). Van de 12 extracten van respiratoire oorsprong bevatten er 3 DNA van M. tuberculosis (met mutatie in rpoB) en 6 bevatten DNA van een atypische mycobacterie. Onder de extracten van extrarespiratoire stalen bevatte 94% geen mycobacterieel DNA en slechts 1 is geïdentificeerd als M. tuberculosiscomplex (tabel 5).
2
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Mycobacteriën
Genotypering van de tuberculosebacillen In ons laboratorium worden drie genotyperingstechnieken op basis van verschillende merkers gebruikt om de genetische afdruk van de tuberculosebacillen te bepalen : spoligotyping, MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit Variable Number Tandem Repeat) en zo nodig IS6110-RFLP om clusters van stammen met een identiek profiel bij de twee andere technieken te kunnen onderscheiden. Genotypering biedt de gelegenheid om de overdrachtswegen van de tuberculose na te gaan (bevestiging van intrafamiliale besmetting of besmetting onder buren, micro-epidemies, opsporing van kruisbesmettingen in laboratoria tussen twee stalen die tezelfdertijd worden behandeld). Dankzij de techniek kan ook humane tuberculose ten gevolge van M. bovis worden onderscheiden van klassieke tuberculose ten gevolge van M. tuberculosis. Genotypering wordt toegepast op alle klinische isolaten resistent tegen isoniazide, op alle multiresistente isolaten en op verzoek ook in geval van een vermoeden van een epidemie of besmetting. Genotypering heeft ons onder meer in de gelegenheid gesteld om personen die aanvankelijk werden beschouwd als patiënten lijdend aan multiresistente tuberculose uit te sluiten van de behandeling omdat het eigenlijk om een kruisbesmetting in een laboratorium ging. In 2007 heeft Caroline Allix, die de techniek MIRU-VNTR in ons laboratorium heeft ontwikkeld, haar doctoraalscriptie ‘Génotypage et phylogénie du complexe M. tuberculosis’ verdedigd en verschillende wetenschappelijke artikelen gepubliceerd over de techniek en de moleculaire epidemiologie van tuberculose in Brussel.
Opmerkingen ¾
De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT.
¾
Het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide en van multiresistente tuberculose geregistreerd in ons laboratorium is vergelijkbaar met de percentages vastgesteld in 2006.
¾
Van de 1265 kweken verstuurd voor identificatie bevatten er 240 (19%) geen mycobacteriën (besmette culturen of vals positieven), 199 (83%) ervan waren afkomstig van de MB/BacT kweekautomaat gebruikt door bepaalde laboratoria. Net zoals in 2006 heeft het toestel heel wat vals positieven afgeleverd. Deze situatie heeft tot veel nodeloos werk geleid omdat de identificatie van een negatieve cultuur meer werk vergt (om er zeker van te zijn dat zij echt geen mycobacteriën bevat) dan de identificatie van een zuiver mycobacteriële kweek.
¾
De meest geïsoleerde species van NTM waren net zoals voorgaande jaren M. xenopi en M. gordonae (niet pathogeen). Wij stellen een aanzienlijke toename vast van het aantal M.avium en M. intracellulare (32% van de atypische mycobacteriën geïdentificeerd in 2007, 22% in 2006) (tabel 6).
¾
Wat de NTM betreft weten wij niet hoeveel onder hen werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over klinische gegevens van de patiënten beschikken.
Mycobacteriën
3
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Tabel 3 : Mycobacteriën : identificatie van culturen uit klinische monsters (N; 2007) TUBCPX
Pathogeen
NTM
M. tuberculosis BK
5
M. bovis
3
M. BCG
3
Totaal TUBCPX
427
M. avium
117
M. bohemicum
2
M. celatum
3
Cpx M. chelonae-abscessus
21
Cpx M. fortuitum- peregrinum
17
M. genavense M. gordonae
Potentieel pathogeen
Niet pathogeen
416
2 121
M. haemophilum
2
M. heckeshornense
2
M. interjectum
5
M. intermedium
2
M. intracellulare
74
M. kansasii
32
M. lentiflavum
11
M. malmoense
9
M. marinum
8
M. paraffinicum (scrofulacium)
8
M. simiae
4
M. szulgai
6
M. xenopi
126
M. agri
1
M. holsaticum
1
M. nonchromogenicum
6
Cpx terrae Andere mycobacteriën Totaal NTM Totaal Mycobacteriën Negatieve
7 11 598 1025 240
Culturen voor kwaliteitscontrole
31
Culturen voor genotypering
28
DNA-extracten van klinische stalen
135
DNA-extracten van runderen (CERVA) voor genotypering door RFLP
30
Klinische monsters
13
Totaal
1502 myco_b_t3
4
Mycobacteriën
1265
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Totaal
9 3 1
53 40 16 2
1 1 39 10 1 1 15 13 1 1 6 3
3
5 3 2 1 1 1 1
2 1 2 6 1 1
74 1 1 3 4 29 1 1 10 1 1
7 113 2 26 18 1 3 10
1 3 5 4 2 1 3 11
3 1 1 1
3 2 1 2
1
3 2
1 1
3 3
2 1 3 1 1 5 1
1 4 1
3 2 5
1
5 1
5
1
1 2
1
1 2
5
1
Cultures négatives (faux positifs) ou contaminées
Autres bactéries
M. agri M. holsaticum M. nonchromogenicum Cpx terrae
M. xenopi
M. malmoense M. marinum M. paraffinicum (scrofulacium) M. scrofulaceum M. simiae M. szulgai
M. lentiflavum
M. kansasii
M. intracellulare
M. haemophilum M. heckeshornense M. interjectum M. intermedium
M. gordonae
M. genavense
9 2 2
Cpx M. fortuitum-peregrinum
Cpx M. chelonae-abscessus
59 2 2 17 9
M. avium
BK BCG M. bovis
587 179 1 217 59 2 111 42 1 18 10 24 9 2 2 7 3 4 2 25 14 11 2 35 23 30 10 13 4 1 52 10 3 43 9 1 86 38 2
M. bohemicum M. celatum
Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën of pees Klierbiopsieën Etter Abces Urine Anderen Onbepaald
Cpx Tuberculosis
Totaal
Kweken
Tabel 4 : Mycobacteriën : species geïdentificeerd vertrekkende van kweekbodems (N; 2007)
4 1 2 2 4 5 4 23 19 6
1265 416 5 3 3 117 2 3 21 17 2 121 2 2 5 2 74 32 11 9 8 4 4 4 6 126 1 1 6 7 11 240 myco_b_t4
Tabel 5 : Mycobacteriën : DNA voor analyse verstuurd : 135 waarvan 118 afkomstig van een laboratorium voor anatoompathologie (N, %; 2007) Aanwezigheid van DNA van het M. tuberculosiscomplex N % Respiratoire Biopsie/klier
3 * 1
25,0 0,8
Aanwezigheid van DNA van mycobacteriën N % 6 6
50,0 4,9
Negatief
Totaal
N
%
N
3 116
25,0 94,3
12 123
* De 3 DNA vertoonden een mutatie in het gen rpoB, wat resistentie tegen rifampicine suggereert. Uit de cultuur van deze stalen bleek achteraf dat het multiresistente stalen waren.
% 100,0 100,0 myco_b_t5
Mycobacteriën
5
Mycobacteriën
Referentielaboratorium - Brussel
Tabel 6 : Mycobacteriën : mycobacteriële species van klinische oorsprong (N; 1998-2007)
Cpx M. tuberculosis
Opportunistische atypische Mycobacteriën
Niet of zeer zelden pathogeen
Andere bacteriën Totaal
2007
2006
2005
2004
2003
2002
2001
2000
1999
1998
Cpx M. tuberculosis M. tuberculosis Mengeling M. tub. M. avium Mengeling M. tub. M. fort. Mengeling M. tub. M. gordonae Mengeling M. tub. M. intracellulare Mengeling M. tub. M. kansasii Mengeling M. tub. M. lentiflavum Mengeling M. tub. M. xenopi Mengeling M. tub. + atypique M. africanum M. bovis M. bovis BCG Mengeling M. bovis BCG + M. gordonae
415 5
451 12
462 1
437
421
422
438
521
492
413
3 1
2
M. avium M. Intracellulare M. bohemicum M. celatum Cpx abscessus-chelonae-fortuitum Cpx M. chelonae-abscessus Cpx M. fortuitum-peregrinum M. genavense M. haemophilum M. heckeshornense M. immunogen M. interjectum M. intermedium M. kansasii Mengeling M. kans. M. avium Mengeling M. kans. M. gord. M. lentiflavum M. malmoense M. marinum M. mucogenicum M. novocastrense M. paraffinicum M. peregrinum M. scrofulaceum Mengeling M. scrof. M. gord. M. senegalense M. shimoidei M. simiae M. smegmatis M. szulgaï M. xenopi Mengeling M. xen. M. gord. M. species
117 74 2 3
M. agri M. alvei M. anthracenicum M. branderi M. duvalli M. elephantis M. gadium M. gilvum M. gordonae M. hiberniae M. holsaticum M. negraskense M. neoaurum M. nonchromogenicum M. phlei M. ratisbonense M. sphagni M. terrae Cpx terrae-mucogenicum-ratisbonense M. triplex M. triviale
2
6 1
1 2
1
1 1
1 3 3
1 6 79 55 2
1 1 3 2 1 93 49 2
1 4 77 47 2 37
21 17 2 2 2
23 17
32 21
1
2
5 2 32
7
2 2 1 56 32 1 1 42
4
1
3 1
5 3
1
57 65 1 1 56
71 25 1 2 15
1 2
2 5
2
36 1
32
29
17
1 7 8 15
20 2
2
3 2 70 30 1 38
62 29 2 36
41 11
3
1 1 2
31
1 5 1 25
20
11 9 8
5 11 11 3
7 4 8 2
4 4 4 2
4
5
4
2
4
1
6 126
3
3 115
6 2 4 149
4
6
1 4
23 2
1
2
14
1
1 1 18
1 2 1 35
14 3 3
4 6 7
5 3 1
7 1
4
5 4 16 2 8 4 2 1
6 123
1 1 1 111
2 108
6 2 3 94
3
6
13
10
1 1 3
1 4
2
2
7 1 1 4
100 2 10
1
4 3 1 4 3 83
49
6
1
1 1 121
145
143
1
161
142 1
1 1 201
166 1
198 4
133 1
4 2 3
4
2
1 1 2
4
82
1 1
6
1 3 1
3 1
1 3 1
1
1
1
3 1 1
5 2 7
2
4
3 1
1
11
15
2
1025
1025
5
1
1068
967
886
973
953
5
3
7
1122
922
627 myco_b_t6
6
Mycobacteriën