Nejčastější úskalí a omyly v imunohistochemické diagnostice HER2

ČLÁNEK

Nejčastější úskalí a omyly v imunohistochemické diagnostice HER2 ¦ Pavel Fabian1, Aleš Ryška2 1 Oddělení onkologické patologie, Masarykův onkologický ústav Brno 2 Fingerlandův ústav patologie a FN Hradec Králové

Úvod Testování exprese HER2 receptoru je zásadním krokem v identifikaci pacientek s karcinomem prsu vhodných k anti-HER2 biologické terapii. Na rozdíl od všech ostatních prediktivních markerů je imunohistochemické stanovení HER2 (a obdobně i steroidních receptorů a proliferačního antigenu Ki-67) v České republice tradičně prováděno v primárních laboratořích patologie, a to bez omezení např. minimálním počtem vyšetřených případů, či použitou metodikou, jako je tomu v případě laboratoří tzv. „referenčních“. Dlouhodobé zkušenosti – v souladu s četnými literárními údaji – ukazují, že konkordance mezi výsledky z lokálních a referenčních laboratoří není vždy uspokojivá.(1,2) Výbor Společnosti českých patologů ČLS JEP této problematice věnuje trvale vysokou pozornost. Dlouhodobě zastává stanovisko, že HER2 prediktivní testování metodou imunohistochemie (IHC) může provádět každá z laboratoří patologie, která prokáže odbornou způsobilost, tj. zejména úspěch v externím hodnocení kvality (EHK). Do nedávné doby byly etablované oficiální programy EHK pro vyšetřování HER2 dostupné pouze v zahraničí (ve Velké Británii – UK NEQAS, ve Skandinávii – NordiQC). Zásadní nevýhodou uvedených programů je vysoký účastnický poplatek, který se pohybuje ve výši desítek tisíc Kč ročně. Programy se tak staly pro menší laboratoře jen velmi obtížně dostupnými. SČP proto iniciovala a ve spolupráci se společností SEKK před několika lety zavedla v ČR program EHK pro HER2 IHC tak, aby byl mj. finančně dostupný i pro malé laboratoře. Výsledky dosažené v těchto cyklech EHK se však v průběhu těchto let – přinejmenším u některých účastníků – výrazněji nezlepšují. Následující text si klade za cíl přispět ke zkvalitnění HER2 IHC testování v ČR.

Breast Cancer

NEWS

Nastavení interních kontrol kvality (IKK) Oproti běžné diagnostické IHC, kterou posuzujeme kvalitativně (výsledek je pozitivní/negativní), HER2 IHC je hodnocena semikvantitativně. Intenzita barvení odráží absolutní množství proteinu, který je přítomen na plazmatické membráně nádorových buněk. Metodika HER2 IHC musí být tedy nastavena tak, aby křivka přímé úměry mezi množstvím proteinu a IHC skóre měla stále stejný sklon. Lapidárně řečeno: to, co má vyjít jako 1+, musí stále vycházet jako 1+. To, co má vyjít jako 2+, musí stále vycházet jako 2+ apod. Jelikož dobře víme, že v metodice IHC dochází vlivem rozličných faktorů k mírné variabilitě výsledků (jež nám v kvalitativním hodnocení nevadí, ale při semikvantitativním hodnocení by byla zavádějící), musíme v každém běhu IHC barvení HER2 provádět barvení interní kontroly, která obsahuje více stupňů očekávané intenzity. Pokud výsledky barvení kontrolních tkání nejsou takové, jaké očekáváme, znamená to, že v daném běhu došlo k „podbarvení“ či „přebarvení“. (Obrázky 1-4) Jako ekonomicky optimální se jeví použití tzv. složeného tkáňového bloku. Všechny kontrolní tkáně jsou tak k dispozici na jednom skle, což krom úspory protilátky umožní i přímé srovnání dosažených intenzit. Složený blok lze snadno vyrobit zalitím několika různých tkáňových vzorků s různým stupněm pozitivity do jednoho kompozitního bloku, ze kterého jsou následně krájeny kontrolní preparáty. Alespoň při sestavování prvního takového testovacího bločku je vhodné použít materiál, jehož pozitivita byla konfirmována v některé referenční laboratoři, neboť ty povinně používají diagnostické kity certifikované pro in vitro diagnostiku (a míra shody je mezi těmito RL

ROČNÍK 4 / ČÍSLO 3 / ŘÍJEN 2014

7

ČLÁNEK Obrázky 1-4: Intenzita IHC reakce v interním kontrolním materiálu koreluje s výsledkem v externím hodnocení kvality (EHK). Ve všech případech byla očekávaná pozitivita 3+, dvojice preparátů byly barveny v jedné laboratoři souběžně v jednom běhu. Laboratoř I: 1) slabá reakce v interní kontrole a 2) slabá reakce v materiálu zaslaném jako vzorek k EHK. Laboratoř II: 3) silná reakce v interní kontrole a 4) silná reakce v materiálu zaslaném jako vzorek k EHK.

Obrázek 1

Obrázek 2

Obrázek 3

Obrázek 4

tak vysoká, že jejich výsledky můžeme považovat a priori za správné). Ke konstrukci složených bločků se ale nehodí každá tkáň – např. zcela nevhodný je materiál z punkčních biopsií (tlakové artefakty často prostupují prakticky celý vzorek a typicky dochází k nadměrnému přibarvování, velmi rychle může dojít k úplnému spotřebování unikátní a cenné nádorové tkáně), dále nelze použít materiál se zjevně nesprávnou fixací (pokud není patrno již v HE barvení, upozorní na to

zónování – slábnutí IHC pozitivity od okraje do středu), ani materiál s nehomogenní pozitivitou. Řezy z kontrolního materiálu je potřeba pořizovat nejpozději den před provedením IHC barvení, neboť tkáň na skle „stárne“ (jde o jev obecný, antigeny se patrně vystavením vzdušnému kyslíku, či vyschnutím řezu mohou měnit a intenzita imunobarvení slábne). Totéž platí pro samotné vyšetřované vzorky – pokud HER2 IHC provádíme např. jednou týdně, shromažďujeme bloky a řezy krájíme až těsně před barvením.

Breast Cancer

NEWS

8


ČLÁNEK Obrázky 5, 6: Intenzita IHC reakce v interním kontrolním materiálu z buněčné linie nekoreluje s výsledkem v externím hodnocení kvality. Byla očekávána pozitivita 3+, dvojice preparátů byla barvena v jedné laboratoři souběžně v jednom běhu. 5) silná pozitivita v interní kontrole, 6) slabá pozitivita v materiálu zaslaném jako vzorek k EHK.

Externí hodnocení kvality (EHK) Vzhledem k tomu, že všechny laboratoře patologie v naší zemi musejí pracovat v souladu s pravidly, která stanovuje norma ISO 15189 určená pro zdravotnické laboratoře, je EHK v ČR povinné pro každou laboratoř, provádějící HER2 IHC. Laboratoř si sama musí stanovit, co považuje za úspěšné absolvování cyklu (např. 95 %). Všechny dostupné cykly (český i zahraniční) pracují se stejným principem (pořadateli se zasílají obarvená testovací skla i výsledky – tedy interpretace barvení vzorků). Laboratoř při neúspěchu v EHK musí neprodleně přijmout účinná nápravná opatření. Tzn. taková opatření, která prokazatelně povedou k nápravě (za průkaz zlepšení lze považovat křížovou validaci s RL, úspěch v dalším cyklu EHK apod). Laboratoř, která není dlouhodobě schopna dosáhnout uspokojivých výsledků v EHK, není zjevně schopna přijmout účinná nápravná opatření, a nesmí tudíž tuto metodu nadále provádět. Tento mechanismus nezávislé kontroly má sloužit k eliminaci případných pracovišť, která by poskytovala nevěrohodné, falešně negativní či falešně pozitivní závěry.

Obrázek 5:

Obrázek 6:

Některé diagnostické soupravy používají jako kontrolní materiál buněčné linie. Jejich použití je samozřejmě součástí certifikovaného diagnostického postupu, nicméně na základě zkušeností z cyklů EHK lze však důrazně doporučit k této kontrole používat souběžně i kontrolu sestavenou z tkání, které pocházejí z rutinního zpracování – prošly formalínovou fixací i zalitím do parafinu. (Obrázky 5,6)

Breast Cancer

NEWS

Verifikace metody Podle materiálu schváleného výborem SČP (viz www.patologie.info v sekci Standardy) je za verifikaci semikvantitativní metody považováno provedení kontrolního barvení s nejméně čtyřmi stupni pozitivity, z nichž jeden má hodnotu 0, zhodnocení preparátu lékařem a provedení písemného záznamu (verifikační protokol). Při zavedení necertifikované metody je nutno provést křížovou validaci – vyšetření stejných vzorků certifikovanou metodou (např. v RL) se stejným výsledkem.

Možné zdroje chyb v preanalytické fázi Nekvalitní fixace je častým zdrojem chybných výsledků IHC. Za doporučený postup (viz ASCO/CAP guidelines(3)) se považuje: fixace 10% pufrovaným formalínem po dobu 6-72 hodin, čas do začátku fixace maximálně 1 hodina. Připomeňme, že fixativa musí být nadbytek – optimálně desetinásobek objemu tkáně – a musí být použita dostatečně velká nádoba. Objemné resekáty je vhodné naříznout tak, aby se fixativum dostalo do centra preparátu, resp. k cílové struktuře, co nejrychleji. Tento postup samozřejmě nesmí nijak negativně ovlivnit možnost zhodnocení vztahu nádoru k resekčním okrajům. Patologie, jako každá jiná klinická laboratoř, má povinnost dbát na dodržování pravidel preanalytické fáze. V praxi to znamená, že musí dát jasně najevo, jakým způsobem se má materiál do laboratoře zasílat (pravidla jsou definována v tzv. Labratorní příručce,


9

ČLÁNEK Obrázek 7, 8: Artefakty způsobené příliš intenzivním postupem k demaskování antigenu. 7) očekávaný výsledek 2+, membránová pozitivita špatně zřetelná, nesouvislá, difuze způsobuje cytoplazmatické zabarvení. 8) očekávaný výsledek 3+, membránová pozitivita špatně zřetelná, místy nesouvislá, difuze způsobuje zabarvení cytoplazmy a stromatu. Materiál špatně adheruje k podložnímu sklu, nelze zaostřit.

Obrázek 7:

Obrázek 8:

resp. Manuálu pro odběr vzorků, tento dokument je volně přístupný zpravidla na webových stránkách pracoviště, případně je na vyžádání zaslán), dále musí při příjmu kontrolovat každý vzorek, každý nesprávně fixovaný materiál musí zasilateli oznámit a také má povinnost provést okamžitou nápravu, tj. například přemístit materiál do vhodné nádoby, dolít formalín, či naříznout objemný resekát.

Do výsledkového protokolu má povinnost uvést, že výsledky mohou být negativně ovlivněny nedodržením preanalytické fáze. Nejen, že je to požadavek vycházející z pravidel správné laboratorní praxe, ale je to také jasná zpětná vazba žadateli o vyšetření a v neposlední řadě i ochrana samotného patologa provádějícího vyšetření (který tímto nepřebírá odpovědnost za případné dopady faktorů, které před příjmem vzorku do laboratoře nemohl sám přímo ovlivnit). Pokud bude patolog vydávat vlivem špatné fixace tkáně falešně negativní výsledky HER2 IHC a ve výsledkovém protokolu nebude uvedena informace o možné limitaci vyšetření vzhledem ke špatné kvalitě vstupního vzorku, může pro něj mít celý případ soudní dohru. Možné zdroje chyb v laboratorní (analytické) fázi Imunohistochemické vyšetření je poměrně sofistikovaným laboratorním postupem sestávajícím z celé řady kroků, kdy kterýkoli z nich – pokud je chybně proveden – může vést k nesprávnému výsledku vyšetření. Jen pro ilustraci lze uvést několik na první pohled banálních faktorů, které jsou často v laboratořích s méně zkušeným personálem opomíjeny, či zanedbány. Během imunohistochemického vyšetření je nutné pečlivě v každém běhu kontrolovat teplotu a pH pufru při demaskování antigenu. Teplota se musí měřit v kyvetě, do níž se vkládají skla, nikoliv v okolní vodní lázni. Čas se měří (dle instrukcí dodavatele protilátky či systému) obvykle od chvíle vložení skel do předehřátého pufru a je potřeba přesně dodržet čas, po který jsou antigeny v pufru demaskovány. Při používání koncentrovaných protilátek je nutné pro semikvantitativní metody pravidelně kalibrovat a čistit mikropipety. Doporučuje se nepoužívat pipety k měření objemů v jejich krajních mezích, kde jsou méně přesné (pro odměření 20 mikrolitrů použít pipetu s rozsahem 10-100, nikoliv 2-20). Je nutné zamezit jakékoli svévolné manipulaci s časem inkubace se substrátem a chromogenem (diaminobenzidin), zkrácení či prodloužení může vést k nižší či vyšší intenzitě barevné reakce, případně k nárůstu nespecifického přibarvení pozadí. Příliš intenzivní demaskování antigenu vede ke ztrátě morfologického detailu a k difuzi antigenu do okolních struktur s nemožností odlišit plazmatické a membránové zbarvení. (Obrázky 7, 8). Silné dobarvení hematoxylinem může znemožnit detekci slabší intenzity pozitivity. Možné zdroje chyb v interpretační fázi Jako první musí patolog vždy hodnotit interní kontrolu –

Breast Cancer

NEWS

10


ČLÁNEK tedy tkáně se známým stupněm exprese (složený tkáňový blok). Pokud není výsledek barvení IKK správný, nelze hodnotit celou vyšetřovanou dávku vzorků. Hodnocení se musí provádět při přehledném zvětšení (3+ intenzita je dobře rozpoznatelné při objektivu 4×, vzorky hodnotit při objektivu 10×, jen výjimečně použít objektiv 20×). Samozřejmostí je hodnocení pouze invazivního karcinomu, in situ léze je doporučeno vůbec nezmiňovat pro možnost omylu v dalším přenosu informace. Hodnotí se pouze membránová pozitivita, cytoplazmatické zbarvení se neuvažuje. Z hodnocení je třeba vyloučit oblasti s okrajovými artefakty i oblasti s nedostatečnou fixací (často centrum nádoru). Kritéria pro hodnocení a pro indikaci in situ hybridizace jsou definována v Doporučeném postupu pro vyšetření nádorů prsu, vydaném SČP ČLS JEP(4) (aktuálně verze z dubna 2014). Je určeno, že pro stanovení určitého skóre je potřeba definované zabarvení nalézt v souvislé kontinuální populaci. Novinkou je zejména definování sice nesouvislé, ale středně silné, či silné pozitivity jako skóre 2+. Často se tento vzor pozitivity vyskytuje u mikropapilárního typu karcinomu. Součástí našeho národního standardu je i požadavek na indikaci in situ hybridizace (retestování) vybrané skupiny IHC negativních (0, 1+) karcinomů prsu (dříve program HERretest).

Závěrem HER2 imunohistochemická diagnostika je komplikovaná a náročná metodika, která vyžaduje trvalou péči, nejlépe jedním určeným lékařem s teoretickými i praktickými zkušenostmi s imunohistochemií, který bude před uvolněním výsledků z laboratoře hodnotit všechna provedená barvení, především interní kontroly, bude kontrolovat výsledky přicházející ze spolupracující referenční laboratoře, povede statistiku výsledků apod. Jen v případě, že se odhodláme k této nikdy nekončící trvalé péči, můžeme dosáhnout trvale kvalitních výsledků. MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.1, prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.2 Oddělení onkologické patologie, Masarykův onkologický ústav Brno 2 Fingerlandův ústav patologie a FN Hradec Králové e-mail: [email protected]

1

Literatura 1.

central, and reference laboratories in specimens from the North Central Cancer Treatment Group N9831 intergroup adjuvant trial. J Clin Oncol 2006 Jul 1;24(19): 3032-8. 2.

Interpretační (postanalytická) fáze Ve výsledkovém protokolu je nutno výslovně uvést, zda karcinom je, nebo není HER2 pozitivní (ve smyslu indikačních kritérií anti-HER2 terapie), v případě pozitivního či nejednoznačného výsledku (3+, 2+, či skupina k retestování) také výslovně uvést, že je vzorek zasílán k dalšímu testování (pro snazší a rychlejší komunikaci je vhodné uvést také do které referenční laboratoře). Součástí správného fungování HER2 diagnostiky je vedení záznamů o výsledcích IHC a jejich statistické zhodnocení. Laboratoř musí mít přehled o tom, zda její výsledky odpovídají obvyklému rozložení HER2 IHC pozitivit (tj. zhruba 10-14 % vzorků 3+ pozitivních, 15-25 % 2+, ostatní 0 a 1+). Je-li to možné, je vhodná i korelace s histologickým gradem (G1 karcinomy nejsou téměř nikdy 3+). Laboratoř je rovněž povinna korelovat své výsledky s vyšetřeními v referenčních laboratořích (nelze akceptovat pouhé přeposlání výsledku onkologovi) – např. pokud bude v IHC negativních vzorcích opakovaně prokázána amplifikace genu HER2, znamená to nízkou citlivost (podbarvování) IHC.

Breast Cancer

NEWS

Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, et al. HER2 testing by local,

Reddy JC, Reimann JD, Anderson SM, et al. Concordance between central and local laboratory HER2 testing from a community-based clinical study. Clin Breast Cancer. 2006 Jun;7(2): 153-7.

3.

Wolff AC, Hammond ME, Hicks DG, et al.: Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol 2013 Nov 1;31(31): 3997-4013.

4.

http://www.patologie.info/standardy.php?zobrazit=24


11

Nejčastější úskalí a omyly v imunohistochemické diagnostice HER2

Recommend Documents