NEDERLANDSE SAMENVATTING Inleiding Dit project betrof een onderzoek naar de gevoeligheid van de hersenen voor neurodegeneratieve processen, en met name hoe dit beinvloed wordt door factoren tijdens de vroege postnatale periode direct na de geboorte en hormonale factoren later in het leven. In het bijzonder werden bij ratten experimenten gedaan betreffende de lange termijn effecten van postnatale hantering en postnatale behandeling met het neuropeptide ACTH-(4-9) (ORG 2766) op stress reactiviteit, leren en geheugen en gevoeligheid van de acetylcholine neuronen in de hersenen voor neurodegeneratie op volwassen leeftijd. Verder heb ik de invloed van het vrouwelijk geslachtshormoon estradiol bestudeerd in volwassen vrouwelijke proefdieren en daarbij specifiek gekeken naar leervermogen en mogelijke beschermende effecten van dit hormoon tegen acute hersenbeschadiging. In de meeste experimenten hebben we ons geconcentreerd op het acetylcholine systeem, en met name de plasticiteit en gevoeligheid van de cholinerge neuronen van de nucleus basalis in de basale voorhersenen. Cholinerge neuronen en leren en geheugen Het cholinerge systeem speelt een belangrijke rol in allerlei cognitieve functies en vooral bij leer- en geheugenprocessen waarbij attentie een belangrijke rol speelt, dus de aandacht die nodig is om iets te leren of te herinneren. Bovendien lijkt schade aan cholinerge neuronen een belangrijke rol te spelen bij afnemende cognitieve vermogens als gevolg van een acute hersenschade - zoals bij een hersenbloeding - en bij langzaam optredende verminderde hersenfunctie tijdens veroudering en in het bijzonder bij neurodegeneratieve ziektes zoals ziekte van Alzheimer. Veroudering en neurodegeneratieve ziekteverschijnselen zijn een toenemend probleem in onze maatschappij en om die reden is het van groot belang om inzicht te krijgen in omgevingsprocessen en manipulaties die neuronale schade veroorzaken of beinvloeden, dan wel kunnen voorkomen. Tijdens de vroege ontwikkeling zijn de hersenen nog erg gevoelig voor invloeden van buitenaf. Dit betreft niet alleen stimuli uit de externe omgeving maar ook de aard en mate van moederzorg en hormonale factoren die van de moeder afkomstig zijn. Wetenschappelijke onderzoek bij dieren heeft aangetoond, dat veranderingen in de interactie tussen moeder en pup, of specifieke behandelingen kort na de geboorte met bepaalde medicijnen lange termijn veranderingen in de hersenen teweeg kunnen brengen. Het bestaan van deze gevoelige periode na de geboorte heeft waarschijnlijk een belangrijke biologische functie. Het biedt de nakomelingen de mogelijkheid om zich aan te passen aan de omgeving waarin ze zijn geboren en
200
Samenvatting
waarin ze opgroeien. Dit aanpassingsproces zou onder bepaalde condities en bij bepaalde invloeden echter ook kunnen leiden tot ontwikkelingsveranderingen die niet gunstig zijn en het individu kwetsbaar maken voor risico’s in het latere leven. Studies aan de hersenen en van het gedrag hebben aangetoond dat estrogenen, naast hun rol als vrouwelijk geslachtshormoon, een sterke invloed hebben op hersenfuncties en met name op bepaalde signaalstoffen in de hersenen: de zg. neurotransmitters waaronder de eerder genoemde neurotransmitter acetylcholine in de basale voorhersenen. Klinisch onderzoek suggereert een hersenbeschermend effect van estrogenen na behandeling met het vrouwelijk geslachtshormoon na de menopauze. Hierbij verminderde de kans op het krijgen van neurodegeneratieve ziektes zoals de ziekte van Alzheimer en werd een positief effect gevonden op het herstel na een hersenbloeding.
Experimenten Onze proefdieren waren witte albino Wistar ratten. De ratten werden behandeld tijdens de ontwikkelingsfase (postnatale hantering of postnatale behandeling met ORG 2766) of op volwassen leeftijd (estradiol behandeling). In alle experimenten werd vervolgens het gedragsmatig functioneren van de dieren getest op volwassen leeftijd, alsmede de gevoeligheid van het cholinerge systeem voor neurodegeneratie. De gedragstoetsen richten zich vooral op leervermogen en geheugen, maar in een aantal experimenten werd tevens gekeken naar gedragsmatige en endocriene stress reactiviteit. Dit omdat eventuele veranderingen in stress systemen en stressgevoeligheid een sterke invloed zouden kunnen hebben op, enerzijds, het leervermogen, en anderzijds, de gevoeligheid voor neurodegeneratieve processen. Om de gevoeligheid voor neurodegeneratieve processen te meten werd gebruik gemaakt van een model waarbij hersenschade werd geinduceerd door een injectie van de stof N-methyl-D-aspartaat (NMDA), welke aangrijpt op een bepaald type receptoren voor de neurotransmitter glutamaat en daardoor een sterk exciterende werking heeft. Door de hoge dosis van NMDA (40 of 60 nmol) treedt overexcitatie op, hetgeen leidt tot schade of dood van de betreffende neuronen. Ook onder natuurlijke omstandigheden speelt overaktivering van zenuwcellen door excitatoire neurotransmitters een belangrijke rol bij neurodegeneratieve processen. In onze experimenten werd NMDA selectief geinjecteerd in de cholinerge nucleus basalis magnocellularis (NBM). Vervolgens werd de sterfte van cholinerge cellen in de NBM en degeneratie van vezelprojecties in de hersenschors gemeten, en met name hoe dit werd beinvloed door de verschillene postnatale manipulaties en de estradiol behandeling op volwassen leeftijd.
Samenvatting
201
Postnatale hantering Een eerste serie experimenten in dit project betrof de lange-termijn effecten van postnatale hantering. Deze experimenten vloeiden voort uit eerdere studies, waaruit bleek dat hanteren van jonge ratte pups in de eerste weken na de geboorte veranderingen teweeg brengt in de interactie tussen de pups en hun moeder, waarbij vooral de toename in moederzorg in de vorm van likken en poetsen van wezenlijk belang lijkt te zijn. Deze toename in moederzorg kan op zijn beurt leiden tot blijvende fysiologische en gedragsmatige veranderingen in de nakomelingen. In onze experimenten werden de pups van enkele nesten blootgesteld aan postnatale hantering, terwijl pups van andere nesten ongemoeid werden gelaten. De jongen van de hanteer-groep werden gedurende de 3-weekse zoogperiode dagelijks voor korte tijd van hun moeders gescheiden (slechts 15 minuten). Deze scheiding vindt telkens op hetzelfde tijdstip van de dag plaats. Tijdens de scheiding werden de pups korte tijd gehanteerd en vervolgens in een verwarmde beker geplaatst om mogelijke effecten van afkoeling te voorkomen. Na 15 minuten werden de pups en moeder herenigd in hun thuiskooi. Ruim 3 weken na de geboorte werden zowel de dieren van de gehanteerde groep als de jongen van de controle groep gespeend en gescheiden van hun moeder. De dieren groeiden verder op onder standaard condities tot de volwassen leeftijd van minimaal 3 maanden waarop verdere experimenten werden uitgevoerd. Uit het eerste experimenten bleek dat postnatale hantering blijvende veranderingen veroorzaakt in neuroendocriene en gedragsmatige stress reaktiviteit (Hoofdstuk 2). De resultaten van de gedragstesten wijzen op een verminderde angst bij de dieren die postnataal gehanteerd werden. De resultaten van de endocriene metingen waren in overeenstemming met de gedragsresponsen. De minder angstige postnataal gehanteerde dieren vertoonden in reaktie op een bedreigende omgeving ook een veel minder sterke stijging van de stresshormonen corticosteron en prolactine, en in mindere mate ook van adrenaline. De postnataal gehanteerde dieren lijken dus minder stress gevoelig en angstig te zijn dan de niet gehanteerde controle dieren. Op grond van deze resultaten, en studies uit andere laboratoria die in dezelfde richting wijzen, zou men kunnen denken, dat postnatale hantering in het algemeen een positieve invloed heeft. Echter, in een daaropvolgend experiment waarin werd gekeken naar de invloed van postnatale hantering op de gevoeligheid voor hersenschade bleek dit niet zo simpel te zijn (Hoofdstuk 3). In tegenstelling tot de ‘positive effecten’ op stress gevoeligheid, suggereren de resultaten van het hersenschade model dat postnatale hantering de dieren op volwassen leeftijd gevoeliger maakt voor acute neurotoxiciteit. Na injectie van NMDA in de NBM was er een significant sterker verlies van projecterende cholinerge vezels in de cortex in de postnataal gehanteerde dieren.
202
Samenvatting
Het precieze mechanisme achter deze verhoogde gevoeligheid moet nog opgehelderd worden. Postnatale behandeling met ACTH-(4-9) analogon ORG 2766 In een tweede serie experimenten werd onderzocht wat de lange termijn invloeden zijn van postnatale behandeling met het ACTH-(4-9) analogon ORG 2766. ACTH is vooral bekend als een hormoon dat onder condities van stress de bijnieren stimuleert tot afgifte van corticosteron. Echter, ACTH heeft ook effecten op het centrale zenuwstelsel, beinvloedt het gedrag en is mogelijk van invloed op neuronale plasticiteit. Het ACTH-(4-9) analogon werd gesynthethiseerd door biochemische modificaties van het ACTH (4-10) molecuul waardoor het ACTH-(49) analogon sterkere effecten op het centrale zenuwstelsel heeft maar het veroorzaakt, net als het ACTH-(4-10) molecuul, geen perifere aktivatie van de bijnieren. Bekend was dat ACTH-(4-9) analogon op volwassen leeftijd niet alleen een sterke invloed heeft op gedrag maar dat het ook een positief effect heeft op neuronale plasticiteit, en herstel na een letsel van het zenuwstelsel bevordert. Met andere woorden, ACTH-(4-9) analogon lijkt een stimulerende of ‘voedende’ werking te hebben op het zenuwstelsel. Het leek dan ook belangrijk om te kijken wat het effect is van het ACTH(4-9) analogon tijdens de vroege postnatale fase wanneer het zenuwstelsel nog volop in ontwikkeling is. Onze postnatale experimenten met ACTH-(4-9) analogon kwamen voort uit een eerdere studie in ons lab welke liet zien dat postnatale toediening van ORG 2766 resulteerde in lange termijn veranderingen in de hersenstrukturen die een belangrijke rol spelen bij de regulatie van stress responsen. In ons vervolgonderzoek kregen jonge ratten op dag 1, 3 en 5 na de geboorte een subcutane injectie met ORG 2766 (1 en 3 µg/g lichaamsgewicht), terwijl controle dieren uit hetzelfde nest injecties kregen met een fysiologisch zout oplossing. De experimentele dieren en controle dieren groeiden verder op onder standaard condities. De gedragstudies op volwassen leeftijd toonden aan dat postnatale behandeling met ORG 2766 geen duidelijk effect heeft op de gedragsmatige stress reactiviteit van de dieren, maar wel een stimulerend effect heeft op het leervermogen in een ruimtelijke leertak, de Morris water maze (Hoofdstuk 4). Daarnaast werd op hogere leeftijd een verhoogd exploratief gedrag waargenomen (Hoofdstuk 6). Onze resultaten suggereren dat postnatale behandeling met ORG 2766 leidt tot een verhoogde alertheid en omgeving-gerichte attentie op volwassen leeftijd. Voor wat betreft de gevoeligheid voor schade geinduceerd door een injectie van NMDA in de cholinerge NBM leken de postnataal met ACTH-(4-9) analogon behandelde dieren op volwassen leeftijd minder gevoelig te zijn dan de control dieren (Hoofdstuk 5), dit in tegen stelling tot de postnataal gehanteerde dieren in de eerdere experimenten. Na een NMDA injectie bleken de postnataal met ACTH-(4-9) behandelde dieren een minder sterk verlies te hebben van cholinerge cellen in de NBM en van cholinerge vezels in de
Samenvatting
203
cortex. Onze resultaten duiden er mogelijk op dat de postnatale behandeling met ORG 2766 van invloed is op de ontwikkeling van intrinsieke neuroprotectieve mechanismen bij excitatoire overstimulatie, mogelijk door specifieke aktivatie van neuronen en glia cellen. Ten slotte, dieren die postnataal met ORG 2766 waren behandeld bleken niet alleen minder gevoelig te zijn voor acute neuronale schade maar ze vertoonden op hogere leeftijd ook een hogere dichtheid van cholinerge vezels in het algemeen, specifiek in het CA3 gebied van de hippocampus (Hoofdstuk 6). Dit zou er op kunnen wijzen dat de postnatale behandeling de dieren niet alleen minder gevoelig maakt voor acute schade maar ook voor geleidelijk optredende schade tijdens veroudering. 17β−Estradiol behandeling op volwassen leeftijd Naast de lange termijn effecten van postnatale manipulaties, werd ook studies verricht naar de effecten van estradiol behandeling in vrouwelijk ratten op volwassen leeftijd. In deze experimenten werden bij de ratten de ovaria verwijderd om de endogene bron van estrogenen weg te nemen. Vervolgens werd de helft van de dieren behandeld met 17β-estradiol-3-benzoate (10 µg/250 g lichaamsgewicht, subcutane injecties, eenmal per 2 dagen), terwijl controle dieren injecties kregen met alleen het niet werkzame olie-achtige oplosmiddel. De resultaten laten zien dat 17β-estradiol behandeling op volwassen leeftijd een faciliterende effect heeft op het leervermogen van de vrouwelijke ratten. In een associatieve leertak, de ‘two-way active shock avoidance’, leerden de estradiol-behandelde dieren sneller dan de olie-behandelde controle dieren (Hoofdstuk 7). Omdat bekend was dat estradiol behandeling vaak leidt tot een verhoging van de productie van corticosteron, hetgeen een rol zou kunnen spelen in de effecten op leervermogen, werd een vervolgexperiment uitgevoerd waarin deze mogelijke interactie werd onderzocht (Hoofdstuk 8). Dieren waarvan de bijnieren waren verwijderd werden door middel van subcutaan aangebrachte pellets met verschillende concentraties van corticosteron gesubstitueerd. Daarnaast werden ook de ovaria verwijderd en werd de helft van de dieren behandeld met estradiol. In dit experiment bleken de glucocorticoiden geen rol te spelen in het positieve effect van estradiol op associatief leren. Dat estradiol niet effectief is in elke leertaak bleek uit het feit dat er geen verschil werd gevonden in de ‘passive shock avoidance’ test ook niet in combinatie met verschillende concentraties corticosteron (Hoofdstuk 7, 8). Naast het effect van estradiol op gedragsmatig functioneren, bleek het ook een stimulerend effect te hebben op het cholinerge systeem, hetgeen resulteerde in een hogere cholinerge vezeldichtheid in de somatosensorische hersenschors (Hoofdstuk 7). Echter, bij acute excitatoire schade geinduceerd door NMDA in de NBM bleek estradiol geen beschermend effect te hebben en was het verlies aan cholinerge cellen en projecterende vezels even groot als bij de controle dieren. Daar staat tegenover dat een merker voor synaptische connecties, het presynaptische
204
Samenvatting
eiwit synaptophysine, in de cortex van estradiol behandelde dieren niet verminderd was na de NMDA injectie, terwijl dit bij de controle dieren wel het geval was. Dit suggereert dat in de estradiol behandelde dieren het verlies van cholinerge projecties naar de cortex wordt opgevangen door andere systemen waardoor de totale synaptische dichtheid gehandhaafd blijft.
Conclusies De resultaten van dit proefschrift bevestigen dat subtiele manipulaties en gebruik van farmaca tijdens de vroege postnatale periode een sterke invloed kunnen hebben op de ontwikkeling van de jongen, kunnen leiden tot ogenschijnlijk permanente veranderingen in gedrag en fysiologie, en zelfs van de gevoeligheid voor neurodegeneratie op volwassen leeftijd. De studies naar postnatale hantering laten zien dat interventie met de normale moeder-pup interactie kort na de geboorte, waarschijnlijk door opwekking van een verhoogde moederzorg, resulteert in een verminderde neuroendocriene stressgevoeligheid en angst, terwijl de gevoeligheid voor acute hersenschade in ons model juist vergroot werd. De postnatale behandeling met het ACTH-(4-9) analogon daarentegen leek geen effect te hebben op de stress reactiviteit maar had wel een specifieke invloed op neurale circuits leidend tot een verbetering in ruimtelijke leervermogen. Bovendien was de gevoeligheid voor excitatoire neuronal schade juist minder. Deze resultaten tonen duidelijk aan, dat het moeilijk is om de mogelijke gevolgen van postnatale hantering of andere postnatale gebeurtenissen te generaliseren in termen van gezondheid en ziekte. De veranderingen geinduceerd door infantiele stimulatie kunnen leiden tot een verminderde gevoeligheid voor een bepaald soort aandoeningen (bijvoorbeeld stress-gerelateerde aandoeningen zoals depressie), terwijl dezelfde behandeling aanleiding kan geven tot een verhoogde gevoeligheid voor andere aandoeningen (bijvoorbeeld acute schade na een hersenbloeding). Alhoewel de plasticiteit van het brein op volwassen leeftijd aanmerkelijk minder is dan rond de geboorte, blijkt ook tijdens het latere leven een zekere mate van plasticiteit te bestaan die, zoals onze resultaten laten zien, beinvloed kan worden door hormonen als estradiol. Estradiol heeft een positieve invloed op de cholinerge vezelstrukturen in de cortex en ook op de prestaties in sommige leertaken. Daarnaast, alhoewel estradiol niet in staat bleek acute excitatoire schade van cholinerge cellen te verminderen, leek het wel compensatoire reakties te stimuleren en andere neuronale systemen. Het is niet uitgesloten dat postmenopausale estradiol behandeling langs deze weg ook gunstige effecten heeft op hersenfuncties en cognitieve functies tijdens veroudering, dementie en de ziekte van Alzheimer.
Samenvatting
205
Concluderend kan worden gesteld dat de uitkomst van acute neurologische aandoeningen zoals een hersenbloeding of langzame neurodegeneratieve ziektes zoals de ziekte van Alzheimer niet het gevolg van enkel proces of causaal mechanism maar een complex resultaat is van diverse interacterende processen en systemen. Een verdere exploratie van dit concept door dierexperimentele onderzoek kan van fundamenteel belang zijn om een beter inzicht te krijgen in pediatrische en volwassen neurologische aandoeningen en de manier waarop die ziekten voorkomen of behandeld kunnen worden.
