NEDERLANDSE SAMENVATTING
220
§ Dutch summary
Nederlandse samenvatting
§ 221
De Algemene Vergadering van de Verenigde Naties heeft het jaar 1999 uitgeroepen tot het Internationale Jaar van de Ouderen. Hiermee erkent zij dat de wereldbevolking in snel tempo veroudert: het percentage oudere mensen groeit en bovendien worden de oudere mensen steeds ouder. De vergrijzing van de wereldbevolking heeft verreikende gevolgen, met name voor de gezondheidszorg. Tijdens het ouder worden verandert er veel in ons lichaam: we worden gevoeliger voor hartziekten, osteoporose, diabetes, arthritis, kanker, en ziekte in algemene zin. Ook de hersenen worden tijdens het verouderingsproces aangetast. Over het algemeen nemen onze cognitieve vaardigheden af. Bovendien is veroudering een risicofactor voor bijvoorbeeld herseninfarct, de ziekten van Alzheimer en Parkinson, dementie, en depressie. Door wetenschappelijk onderzoek wordt steeds meer bekend over dergelijke ziekten, maar we weten nog steeds onvoldoende over de verouderingsprocessen die aan deze ziekten ten grondslag liggen. Dit proefschrift draagt bij aan het begrijpen van structurele veranderingen in de hersenen tijdens normale veroudering. In dit proefschrift worden rhesus apen en toepaja’s (boomspitsmuizen of spitseekhoorns, orde Scandentia, familie Tupaiidae) als diermodellen voor veroudering van de mens gebruikt (Figuur 1). Rhesus apen en toepaja’s hebben voor onderzoek naar verouderingseffecten op de hersenen verschillende voordelen boven onderzoek met knaagdieren: evolutionair staan ze veel dichter bij de mens. Rhesus apen worden onder laboratorium omstandigheden 35 tot 40 jaar oud, toepaja’s ongeveer 10 jaar. Om juiste conclusies te kunnen trekken in verouderingsonderzoek is het van groot belang om resultaten van proeven met verschillende diersoorten te vergelijken. Dit proefschrift is daarom opgedeeld in twee secties: DEEL 1 beschrijft de studies van rhesus apen, DEEL 2 omvat de onderzoeken van toepaja’s.
Figuur 1 A Rhesus apen en B een volwassen toepaja uit de kolonies van het Duitse Primatencentrum. (Bron: Duits Primatencentrum, Göttingen, Duitsland)
Nederlandse samenvatting
§ 223
Figuur 3 A Algemeen schema van een doorsnede van de hippocampus formatie. De lagen met neuronen zijn zwart ingetekend. B Weergave van de belangrijkste intrinsieke verbindingen van de hippocampus formatie (1) t/m (5): zie tekst. Afkortingen: sub: subiculum; CA1, CA2, CA3: CA1, CA2, en CA3 subgebieden van de hippocampus; DG: dentate gyrus
De functie van de hippocampus formatie en veroudering Om informatie te krijgen over de hippocampus-gerelateerde cognitieve vaardigheden tijdens veroudering hebben we een geheugentest uitgevoerd met jonge en oude toepaja’s. Bij deze ruimtelijke geheugentest wordt een plank gebruikt met afsluitbare openingen, waarin stukjes amandel als beloning geplaatst kunnen worden. In deze zogenaamde holeboard test moeten de toepaja’s, na een gewenningsfase, met zo weinig mogelijk fouten de openingen met beloning vinden. Bij deze opdracht worden twee verschillende geheugensoorten onderscheiden: het referentiegeheugen, waarbij de hippocampus een dominante rol speelt, en het werkgeheugen, waarbij zowel de hippocampus als de prefrontale cortex betrokken zijn. Het werkgeheugen, of korte termijn geheugen, heeft betrekking op het verwerken van informatie van het ogenblik (in de holeboard test de informatie van één sessie). Het referentiegeheugen heeft betrekking op lange termijn geheugen (in de holeboard test de informatie over verschillende sessies). Het referentiegeheugen van de oude toepaja’s was in deze holeboard taak even goed als dat van de jonge dieren, maar de oude toepaja’s hadden een slechter werkgeheugen (HOOFDSTUK 7). De neuronen van de hippocampus formatie en veroudering In ratten, rhesus apen en mensen is aangetoond dat de functie van de hippocampus tijdens veroudering afneemt. Bovendien is met behulp van magnetische resonantie imaging (MRI) bij mensen aangetoond dat de hippocampus kleiner wordt naarmate de leeftijd vordert. Deze resultaten deden o.a. vermoeden dat het aantal zenuwcellen in de hippocampus afneemt tijdens veroudering. Sommige onderzoeken hebben inderdaad
224
§ Dutch summary
een reductie van het aantal hippocampale neuronen aan kunnen tonen. Voor deze studies werden kwantificeringsmethoden toegepast die zich beperkten tot twee dimensies en die gebruik maakten van verschillende veronderstellingen. Bij zulke veronderstellingen wordt er bijvoorbeeld van uitgegaan dat neuronen bolvormig zijn of altijd dezelfde grootte hebben. Het is echter gebleken dat hersenmateriaal van oudere individu’s tijdens de histologische behandeling minder krimpt dan dat van jonge individu’s. Dit kan tot gevolg hebben gehad dat de resultaten, verkregen met tweedimensionele telmethoden, tot onjuiste conclusies hebben geleid. Sinds het begin van de jaren 90 worden in verouderingsonderzoeken zogenaamde stereologische kwantificeringsmethoden gebruikt om aantallen neuronen in de hippocampus te schatten. Stereologische methoden zijn vrij van veronderstellingen. De optical fractionator is één van de stereologische methoden, die in wetenschappelijke artikelen vaak gebruikt wordt om totale aantallen van neuronen te schatten. Algemeen bij stereologie geldt dat rekening gehouden wordt met alle drie dimensies. Bij de optical fractionator wordt de complete hippocampus in coupes gesneden. In een toevallige maar systematische selectie van alle coupes worden tellokaties wederom toevallig en systematisch uitgekozen, waarbij ook aan de diepte van de coupes aandacht wordt gegeven. Hierdoor krijgen alle neuronen een gelijke kans om geteld te worden. De in de (voor de onderzoeker bekende) fractie van de hippocampus getelde neuronen worden omgerekend op de complete hippocampus. Het resultaat van deze stereologische methode is een zuivere schatting van totale neuronenaantallen. De theorie van stereologische methoden wordt in verschillende artikelen uitgebreid uitgelegd, maar dergelijke artikelen zijn veelal te theoretisch om de methoden in de praktijk te kunnen brengen. Wetenschappelijke artikelen die de optical fractionator gebruiken verstrekken welliswaar voldoende gegevens over de methode zodat een ’insider’ een experiment kan herhalen, maar ze verschaffen te weinig informatie voor een ’outsider’ om deze methode toe te kunnen passen. Daarom wordt in HOOFDSTUK 2 de optical fractionator uitvoerig beschreven. Hierbij wordt voldoende theorie gepresenteerd om de techniek te kunnen begrijpen terwijl de methode stap voor stap uitgelegd wordt, zodat ook een niet-ingewijde de optical fractionator kan toepassen. Eerder verouderingsonderzoek naar het aantal neuronen in de menselijke hippocampus heeft aangetoond dat neuronen slechts in specifieke onderdelen afsterven. Het is belangrijk om deze effecten te vergelijken met resultaten uit diermodellen voor veroudering. Om stereologie op de verschillende onderdelen van de hippocampus toe te kunnen passen is het dus van groot belang dat de exacte grenzen van de hippocampale onderdelen bekend zijn. Hiertoe beschrijven we in HOOFDSTUK 3 van de hippocampus van de rhesus aap anatomische kenmerken die de precieze grenzen van de hippocampus en zijn onderdelen aangeven. De anatomie van de hippocampus van de toepaja is nog niet eerder beschreven. Daarom hebben we in HOOFDSTUK 6 verschillende immunocytochemische kleuringen en een kernkleuring gebruikt om een uitgebreide anatomische beschrijving te geven van de hippocampus van de toepaja.
Nederlandse samenvatting
§ 225
De kennis over de anatomie van de hippocampus formatie en over de stereologische methode wordt vervolgens gebruikt om te onderzoeken of veroudering een negatief effect heeft op de aantallen van hippocampale neuronen in rhesus apen en toepaja’s. We konden aantonen dat zowel bij oude rhesus apen (HOOFDSTUK 4) als bij oude toepaja’s (HOOFDSTUK 7 ) de aantallen neuronen in de hippocampus niet afnemen ten opzichte van jonge dieren. De bloedvaatjes van de hippocampus en veroudering De hersenen maken ongeveer 2% van ons lichaamsgewicht uit, maar ze betrekken 15% van de totale bloedstroom en gebruiken 25% van de hoeveelheid beschikbare zuurstof. De hersenen zijn dus een hoog actief orgaan, maar hebben zelf geen mogelijkheid om zuurstof of glucose op te slaan. Daardoor zijn de hersenen sterk afhankelijk van een grote en stabiele bloedtoevoer. De grote arteriën en venen zorgen respectievelijk voor de bloedtoe- en afvoer. De zenuwen die op de grote arteriën eindigen regelen de algemene bloeddruk. De kleinere arteriolen kunnen door hun innervatie de lokale bloeddruk regelen. In de kleinste bloedvaatjes, de haarvaten (capillairen), verlaten zuurstof en glucose de bloedstroom en bereiken het hersenweefsel. De structuur van de haarvaatjes kan met behulp van de electronen microscoop in het kleinste detail worden onderzocht. Eerdere studies naar haarvaten bij oude ratten en oudere mensen hebben afzettingen aangetoond in de buitenste wand, de basaal membraan. Deze afzettingen kunnen plaatsvinden in de vorm van lokale verdikkingen van de basaal membraan of in de vorm van collageen fibrillen. In HOOFDSTUK 5 hebben wij met behulp van de electronen microscoop de haarvaten met structurele veranderingen gekwantificeerd in de hippocampus van rhesus apen van verschillende leeftijden. In de CA1 en CA3 subgebieden van de hippocampus neemt het percentage haarvaatjes met afzettingen in de basaal membraan tijdens veroudering toe, met name door collageen fibrillen. Collageen fibrillen in en plaatstelijke verdikkingen van de basaal membraan kunnen een adequate verzorging van het omliggende hersenweefsel beletten en zouden zo een negatieve invloed kunnen uitoefenen op het functioneren van de hippocampus. De serotonerge innervatie van de hippocampus formatie en veroudering
Het functioneren van de hippocampus is afhankelijk van intacte verbindingen. Het intrinsieke connectie systeem van de hippocampus, dat glutamaat gebruikt als neurotransmitter, wordt gemoduleerd door verschillende andere neurotransmitter systemen. Modulatie vindt ten eerste plaats door lokale activiteit van GABAerge interneuronen, en ten tweede door neurotransmitter systemen van buiten de hippocampus. De hippocampus ontvangt o.a. cholinerge input van de basale ganglia en het septum, noradrenerge input van de locus coeruleus, en serotonerge input van de raphe kernen. De rol van het cholinerge systeem in de functie van de hippocampus en de verouderingseffecten op de cholinerge verbindingen naar de hippocampus is veelvuldig onderzocht. Relatief weinig is bekend over het effect van veroudering op de serotonerge en noradrenerge verbindingen naar de hippocampus.
226
§ Dutch summary
Serotonine moduleert verschillende fysiologische en gedragsprocessen die tijdens veroudering verslechteren, waaronder processen van slaap en dag-nacht ritme, en neuroendocriene processen. Serotonine zelf levert waarschijnlijk slechts een kleine bijdrage aan cognitieve processen. Er is echter een sterke interactie met acetylcholine, die waarschijnlijk wordt aangetast tijdens veroudering. In HOOFDSTUK 8 hebben we ons onderzoek beschreven naar de serotonerge vezels in de hippocampus van jonge en oude toepaja’s. Serotonerge vezels werden immunocytochemisch gekleurd met een antilichaam tegen serotonine. Van de gekleurde vezels werden vervolgens in de verschillende onderdelen van de hippocampus de vezeldichtheid (een maat voor de innervatie) en de optische dichtheid (een maat voor de hoeveelheid serotonine) in de vezels bepaald. Het was opvallend dat de interindividuele verschillen tussen de jonge toepaja’s aanmerkelijk groter was dan die tussen oude dieren. De resultaten laten zien dat in bijna alle onderdelen van de hippocampus de vezeldichtheid en de optische dichtheid tijdens veroudering afnemen. Dit betekent enerzijds dat serotonerge vezels tijdens veroudering degenereren, en anderzijds dat het serotonine metabolisme aangetast is. Het is nog niet bekend of serotonerge neuronen tijdens veroudering alleen in functie achteruit gaan of afsterven. Conclusie Eerder onderzoek heeft geleid tot de hypothese dat structurele veranderingen in de kleinste bloedvaten kunnen resulteren in een vermindering van cognitieve vaardigheden (Farkas en Luiten, 2001). Een verstoorde balans van vasculaire innervatie systemen zou volgens deze theorie een vernauwing van de bloedvaten tot gevolg kunnen hebben. Tot een bepaalde leeftijd worden deze effecten waarschijnlijk gecompenseerd. Op een gegeven moment echter daalt de hersendoorbloeding gestaag, waardoor de bloedtoevoer in de kleinste bloedvaatjes niet meer voldoende is. Er kunnen dan structurele veranderingen optreden die de passieve afgifte van noodzakelijke voedingsstoffen bemoeilijken of een storing veroorzaken in het actieve transport van voedingsstoffen. Uiteindelijk leidt een verminderde toevoer van nutriënten ertoe dat de energiehuishouding van neuronen ontregelt raakt en de metabolische activiteit van neuronen afneemt. Neuronen kunnen waarschijnlijk zulke situaties tot een bepaald moment compenseren, waarna ze uitgeput raken. Ten slotte zullen de effecten hiervan merkbaar worden in de cognitieve vaardigheden. De resultaten beschreven in dit proefschrift passen goed in deze theorie. We hebben in oude toepaja’s een degeneratie van het serotonerge systeem in de hippocampus aangetoond. Een afname van serotonine alleen zou een vaatverwijding tot gevolg hebben. Waarschijnlijk worden tijdens veroudering dus ook andere neurotransmitter systemen die bloedvaten innerveren (zoals acetylcholine en noradrenaline) nadelig beïnvloed. In de hippocampus van oude rhesus apen hebben we structurele veranderingen in de kleinste bloedvaten waargenomen. Hoewel neuronen volgens de bovengenoemde theorie uitgeput raken, hebben we in toepaja’s en rhesus apen
222
§ Dutch summary
Cognitie is een begrip waarmee verschillende vaardigheden worden aangeduid, zoals perceptie, aandacht, planning, evaluatie, denken, creativiteit, spraak en lezen, en leren en geheugen. In dit proefschrift wordt ingegaan op leren en geheugen. Deze vaardigheden kunnen goed getest worden zowel in diermodellen als bij de mens. De functie en anatomie van de hippocampus formatie De belangrijkste hersenstructuur voor het leren en het geheugen is de hippocampus. De hippocampus wordt zo genoemd omdat deze structuur op een zeepaardje lijkt. De hippocampus speelt een rol in het ruimtelijke en het “declaratieve” geheugen. Declaratieve herinneringen zijn bewust oproepbare herinneringen, bijvoorbeeld van feiten, gebeurtenissen en activiteiten, die we aan anderen kunnen verwoorden. Alle zoogdieren hebben een hippocampus. De hippocampus is een langwerpige, licht gekromde structuur in de grote hersenen, die bij verschillende zoogdieren een afwijkende ligging heeft (zie Figuur 2). Tijdens de evolutionaire ontwikkeling van insectivoren naar primaten heeft de ruimtelijke ligging van de hippocampus aanzienlijke veranderingen ondergaan en je zou kunnen zeggen dat de hippocampus relatief steeds minder omvangrijk is geworden tijdens de evolutie. Hij neemt steeds minder volume in, voornamelijk doordat de hersenschors aan volume toeneemt.
Figuur 2 Illustratie van de positie van de hippocampus formatie (grijs) in de hersenen van een rat, toepaja, rhesus aap en mens. Maatstreep (rat, toepaja en rhesus aap): 1 cm, maatstreep (mens): 5 cm
De hippocampus formatie is onderverdeeld in het subiculum, de hippocampus, en de dentate gyrus (zie Figuur 3A). De pyramidevormige neuronen in het subiculum en de hippocampus vormen één continue cellaag. De hippocampus wordt verder verdeeld in de CA1, CA2 en CA3. Opvallend voor de connecties in de hippocampus formatie is dat de signaaloverdracht hoofdzakelijk in één richting verloopt (zie Figuur 3B). De dentate gyrus ontvangt informatie van de entorhinale cortex (1) en innerveert de CA3 van de hippocampus (2). De informatie stroom gaat dan verder van CA3 naar CA1 (3) en vervolgens naar de neuronen van het subiculum (4), die de entorhinale cortex weer innerveren (5). De neurotransmitter die wordt gebruikt voor deze signaaloverdrachten is glutamaat. Andere neurotransmitters, waaronder acetylcholine, serotonine en noradrenaline, moduleren de glutamaterge signaaloverdrachten.
Nederlandse samenvatting
§ 227
aangetoond dat er geen aanzienlijke sterfte van hippocampale neuronen plaatsvindt. Het feit dat oude toepaja’s een slechter ruimtelijk werkgeheugen (waar zowel de hippocampus als de frontale cortex bij betrokken zijn) hadden dan jonge dieren wijst op een verslechtering van o.a. de energiehuishouding van de neuronen in de hippocampus. Verder onderzoek is nodig om de bovengenoemde theorie te ondersteunen. Om de volgorde van gebeurtenissen goed vast te kunnen leggen is het belangrijk dat dieren van verschillende leeftijden onderzocht worden, dus niet alleen jonge en oude dieren. Vervolgens moeten we weten of de cholinerge en noradrenerge innervatie van het boedvatstelsel tijdens veroudering al in een vroeg stadium aangetast is. Verder moeten we duidelijkheid krijgen over wanneer en hoe neuronen in een slechtere energie status vervallen en of deze processen gepaard gaan met veranderingen in de neuronale structuur. Bovendien zou meer onderzoek uitgevoerd moeten worden naar de verouderingseffecten op de astrocyten, omdat astrocyten zowel een structurele als metabolisch verbinding tussen bloedvaatjes en neuronen vormen. Uit onze resultaten bij oude toepaja’s blijkt dat ook de prefrontale cortex tijdens veroudering nadelig beïnvloed wordt. Het is daarom raadzaam om in de toekomst de structurele en functionele veranderingen van de prefrontale cortex tijdens veroudering nader te onderzoeken. Sommige studies naar de effecten van veroudering op de mens en in diermodellen geven verschillende resultaten. Zo kan tot nu toe in geen enkel onderzocht diermodel voor veroudering een aanzienlijke sterfte van hippocampale neuronen aangetoond worden. Bij mensen is een neuronensterfte in de hippocampus evenwel zeer waarschijnlijk. Het is daarom belangrijk om uitkomsten van onderzoek bij mensen in diermodellen te verifiëren en vice versa.
