Nederlandse samenvatting
Antibiotica behoren tot de belangrijkste geneesmiddelen die er zijn. Zonder antibiotica zouden een groot aantal infectieziekten, die tegenwoordig alleen maar lastig zijn, nog steeds een groot probleem zijn. Bloedvergiftigingen en longontstekingen zouden vrijwel zeker de dood tot gevolg hebben. Tegenwoordig bestrijden antibiotica de ziekteverwekkende bacteriën, waardoor de infectie kan genezen. De bekendste antibiotica zijn de β-lactam antibiotica, die vanaf de tweede wereldoorlog vele miljoenen levens hebben gered. De twee grootste groepen β-lactam antibiotica zijn de penicillines en de cefalosporines. In Nederland bestaat een antibioticumkuurtje meestal uit het penicilline amoxicilline, soms gecombineerd met clavulaanzuur om ook een aantal resistente bacteriën te bestrijden. Cefalosporines daarentegen hebben in Nederland een status van “reserve geneesmiddel” en worden voornamelijk gebruikt als andere antibiotica niet werken. Deze geneesmiddelen worden daarom in Nederland weinig voorgeschreven, en toediening vindt meestal plaats in het ziekenhuis. In andere landen echter worden cefalosporines wel gebruikt als eerste keus antibiotica, en de wereldwijde omzet van dit geneesmiddel is dan ook hoog. Dit betekent natuurlijk ook dat de wereldwijde productie van cefalosporines erg groot is. De huidige cefalosporines en penicillines zijn afgeleiden van antibacteriële β-lactam verbindingen, die door fermentatie van schimmels worden verkregen. Oorspronkelijk werden deze fermentatieproducten met chemische reacties omgezet tot de gebruikte antibiotica, maar de kosten en de milieubelasting van deze reacties zijn erg hoog. Het zou beter zijn deze omzettingen te laten plaatsvinden door middel van enzymen. Dit zijn biokatalysatoren die met een ongekende specificiteit reacties katalyseren en alleen bepaalde verbindingen omzetten tot een specifiek product. Penicilline derivaten worden gemaakt uit penicilline G, dat wordt geproduceerd door de schimmel Penicillium chrysogenum. Penicilline G bestaat uit de reactieve β-lactam kern met daaraan fenylazijnzuur als zijketen gekoppeld. Deze zijketen wordt door het enzym penicilline acylase verwijderd tijdens de deacylatie reactie. Een andere zijketen kan er dan worden aangezet om een penicilline derivaat te verkrijgen, dat gebruikt kan worden als antibioticum. Ook deze synthesereactie kan gekatalyseerd worden door penicilline acylase. De tweede grote groep β-lactam antibiotica, de cefalosporines, worden op een gelijke manier gemaakt uit cefalosporine C (CPC), dat wordt geproduceerd door de schimmel Cephalosporium acremonium. Ook van CPC moet eerst de zijketen verwijderd worden, maar deze zijketen is anders dan die van penicilline G, en het enzym penicilline acylase kan hiervoor niet gebruikt worden. CPC heeft een zijketen van 6 koolstofatomen met daaraan gekoppeld een zuurgroep en een aminegroep, ook wel aminoadipyl geheten. Er bestaan wel cefalosporine acylases, maar deze katalyseren veel beter de hydrolyse van zijketens bestaande uit vijf koolstofatomen en alleen de zuurgroep, de glutaryl zijketen. De farmaceutische industrie heeft een twee-staps enzymatisch proces ontwikkeld waarin eerst de zijketen van CPC wordt omgezet in een glutaryl zijketen, zodat glutaryl-7-ACA ontstaat, waarvan vervolgens de zijketen wordt verwijderd door cefalosporine acylase. Echter, een één-staps proces zou veel efficiënter zijn. Dan moet een cefalosporine acylase worden gevonden of ontwikkeld dat ook CPC goed kan omzetten. Er is recentelijk een alternatief cefalosporine fermentatieproces ontwikkeld, waarbij het product adipyl-7ADCA wordt gemaakt door een genetisch gemodificeerde schimmel. Dit nieuwe β-lactam heeft een zijketen van zes koolstofatomen en een zuurgroep, adipyl genaamd. Ook de hiervoor benodigde biokatalysator is nog niet in handen. 132
Nederlandse samenvatting Hoofdstuk 1 beschrijft vier verschillende strategieën, die kunnen worden gebruikt om geschikte enzymen te vinden. De eerste is het testen van monsters uit de natuur, zoals grond- en watermonsters. Alle afzonderlijke micro-organismen uit een dergelijk monster kunnen worden geïsoleerd en getest voor het katalyseren van de gewenste reactie, of de actieve micro-organismen kunnen worden verrijkt door toepassing van een specifieke groeiselectie. Vervolgens kan het gen dat het gezochte enzym codeert worden geïsoleerd uit het organisme. In een nieuwe methode wordt al het DNA uit het gehele monster geïsoleerd, zodat eventueel gecodeerde enzymen na expressie in een andere gastheer kunnen worden geproduceerd en getest. Een tweede strategie is het willekeurig muteren van het gen dat een reeds bekend enzym codeert, opdat een mutant enzym met veranderde eigenschappen wordt aangemaakt. Een verzameling mutante genen wordt de mutantenbank genoemd. De grote uitdaging van deze strategie is het creëren van een mutantenbank die aan de ene kant groot genoeg is om de gewenste veranderingen in het enzym te bevatten, maar aan de andere kant niet te groot is om geanalyseerd te kunnen worden. Een derde strategie is gerichte mutagenese. Indien de driedimensionale structuur van het enzym bekend is en er ook voldoende kennis is van de functies van de verschillende aminozuren van het enzym, kan getracht worden een enzym met de gewenste eigenschappen te verkrijgen door doelgericht andere aminozuren in te bouwen. Meestal worden computersimulaties gebruikt om te bepalen welke mutaties gemaakt en getest gaan worden. De vierde en laatste strategie is het zoeken naar homologe genen. Van veel organismen is of wordt het hele genoom in kaart gebracht, zoals ook is gedaan voor de mens. Ook zijn er veel afzonderlijke genen opgenomen in uitgebreide databases. Indien een enzym met vergelijkbare eigenschappen bekend is, kan in deze databases worden gezocht naar homologe genen, die wellicht wel precies de gezochte enzymen coderen. Deze worden vervolgens geproduceerd en getest. Hoofdstuk 1 eindigt met een klein overzicht van het reeds uitgevoerde onderzoek naar enzymen voor de productie van cefalosporine derivaten. In natuurlijke monsters zijn weliswaar een aantal cefalosporine acylases gevonden, maar deze zijn vooral actief op glutaryl-7-ACA. Adipyl-7-ADCA wordt minder goed omgezet en CPC vrijwel niet. Door onderzoekers is de activiteit op CPC van een aantal van deze enzymen is wel verhoogd door mutagenese, maar nog niet zo sterk dat ze industrieel toepasbaar zijn. Hoofdstuk 2 geeft een overzicht van recente ontwikkelingen op het gebied van het βlactam acylase onderzoek. De speurtocht naar een goed adipyl of CPC acylase is één van de belangrijke onderwerpen. Een tweede onderwerp betreft het koppelen van nieuwe zijketens aan de penicilline en cefalosporine antibiotica door middel van nieuwe en verbeterde enzymen. Onderzoek naar de driedimensionale structuur van twee nieuwe enzymen heeft veel informatie opgeleverd over het verloop van deze synthese reactie. De industriële toepasbaarheid van β-lactam acylases is verbeterd door het verhogen van de stabiliteit van het enzym teneinde de levensduur van het enzympreparaat te verlengen, het optimaliseren van reactieomstandigheden en onderzoek naar nieuwe methoden om het enzym te immobiliseren. Tenslotte kunnen β-lactam acylases ook gebruikt worden voor het zuiveren van enantiopure componenten uit racemische mengsels door middel van 133
stereoselectieve acylering/deacylering. Hoofdstuk 2 geeft aan welk onderzoek nog gedaan kan en moet worden nadat een goed adipyl of CPC acylase gevonden is. De daadwerkelijke zoektocht naar betere enzymen begint in hoofdstuk 3. Startpunt hiervoor is het cefalosporine acylase van Pseudomonas SY-77, een bacterie waarvan bekend was dat zij glutaryl-7-ACA kan deacyleren. Het gen dat codeert voor het enzym is geïsoleerd uit het genoom, en de DNA sequentie is bepaald. Het enzym kon geproduceerd worden in een ander bacterie, Escherichia coli. Sequentie analyse toonde aan dat het gen codeert voor een pro-enzym, bestaande uit een signaal peptide, de α subunit, een spacer peptide en de β-subunit. Het actieve enzym bestaat alleen uit de α en β subunit, en er vindt dus een vorm van maturatie plaats waarbij het pro-enzym op meerdere plaatsen geknipt wordt. De activiteit van het gezuiverde enzym op glutaryl-7-ACA was hoog, maar de activiteit op adipyl-7-ADCA bleek veel te laag voor industriële toepassingen. De activiteit op CPC was te laag om te meten. Daarom werd besloten de activiteit op deze laatste twee substraten te verbeteren door mutagenese, en wel willekeurige mutagenese omdat er geen driedimensionale structuur van het enzym voorhanden was. Echter, volledige randomisatie van het hele gen zou een veel te grote mutantenbank opleveren. Daarom werd er gekozen voor een twee-staps strategie. Allereerst werden puntmutaties aangebracht in de α-subunit, zodat een mutantenbank werd gecreëerd waarin alle nucleotiden van dit stuk DNA waren veranderd als enkele mutanten. Deze mutantenbank werd tot expressie gebracht in E. coli cellen die niet zelf het aminozuur serine kunnen aanmaken. Tijdens de groei van de bacteriën werd niet serine aan het medium toegevoegd maar adipyl-serine. Hierdoor konden bacteriën alleen groeien als ze een mutant cefalosporine acylase aanmaakten dat een adipyl zijketen verwijderde. Van de opgekomen kolonies werd de sequentie van het gemuteerde DNA bepaald. Bij de meeste mutanten waren de puntmutaties gelokaliseerd in de nucleotiden die aminozuren 177, 178 en 179 van het enzym coderen. Echter, aminozuren worden bepaald door groepjes van drie DNA nucleotiden, en mutaties in één van de drie basen zal het aminozuur slechts kunnen veranderen in een beperkt aantal andere aminozuren, niet alle 20. Daarom werden vervolgens alle negen nucleotiden die coderen voor deze drie aminozuren volledig gerandomiseerd, en deze mutantenbank werd ook geselecteerd op adipyl-serine. Uit deze selectie kwamen in totaal zeven verschillende mutanten naar voren, waarvan er 3 werden gezuiverd omdat ze een verbeterde relatieve activiteit hadden op adipyl-serine in vergelijking tot glutaryl-serine. Van deze drie werd de hydrolyse van adipyl-7-ADCA uitgebreid gekarakteriseerd. De beste mutant, SY-77Y178H, had een hogere kcat op adipyl-7-ADCA, de maximale activiteit van het enzym, en een hogere katalytische efficiëntie, hetgeen een maat is voor de algemene geschiktheid van het enzym voor de reactie. Bovendien had deze mutant ook een lagere Km op adipyl-7-ADCA, hetgeen een aanduiding is voor een betere affiniteit voor het substraat. De twee andere mutanten, SY77V179G en SY-77L177I+Y178W+V179M, hadden een hogere katalytische efficiëntie en een betere Km, maar geen hogere kcat. Dit eerste experiment toonde aan dat de activiteit van Pseudomonas SY-77 cefalosporine acylase op adipyl-7-ADCA kan worden verhoogd door mutagenese. Uit de driedimensionale structuur van het enzym, dat tegen die tijd was gepubliceerd, bleek dat Tyr178 het enige aminozuur is van de α subunit dat interacties kan hebben met de zijketen van β-lactam substraten. Een histidine op deze plaats creëert extra ruimte voor de langere 134
Nederlandse samenvatting zijketen van het adipyl substraat, en trekt de zijketen dieper de substraat bindingsplaats van het enzym binnen. Hiermee kon de veranderde substraatspecificiteit van het enzym worden verklaard. Na dit succes was de β-subunit van het enzym aan de beurt, zoals beschreven in hoofdstuk 4. Mutagenese en selectie geschiedden op dezelfde manier, al werd nu gebruik gemaakt van een leucine deficiënte E. coli stam en adipyl-leucine als selectiesubstraat. Sequentie analyse van het gemuteerde DNA van de geselecteerde mutanten toonde aan dat aminozuur 266 en aminozuur 375 vaak waren vervangen door andere aminozuren. Dit zijn klaarblijkelijk zeer belangrijke posities om de substraatspecificiteit van het enzym te veranderen. In totaal vijf verschillende mutanten hadden een verhoogde ratio wat betreft activiteit op adipyl-7-ADCA en glutaryl-7-ACA, en deze werden gezuiverd en gekarakteriseerd. Mutant SY-77N266H was de beste met een 8-voudige verhoging van de katalytische efficiëntie en een sterke verlaging van de Km, en mutant SY-77F375L had een verhoogde kcat. In de driedimensionale structuur van het enzym zijn alle geselecteerde mutaties terug te vinden in de directe omgeving van de substraat bindingsplaats. Phe375 is een van de aminozuren die een directe binding vertonen met de zijketen van het substraat, en Asn266 heeft een indirecte interactie met de zijketen. Dit laatste aminozuur was nog niet eerder aangemerkt als een belangrijke positie. Tyr178 uit het vorige hoofdstuk, Asn 266 en Phe375 vormen samen met twee andere aminozuren een piramideachtige structuur, die gesitueerd is rondom de zuurgroep aan het uiteinde van de zijketen van het substraat, zodra dit bindt aan het enzym. Met deze resultaten kon een hypothese worden opgesteld dat verandering van de substraatspecificiteit van het enzym het best kan worden bewerkstelligd door mutagenese van deze 5 aminozuren. Positie 375 wordt uitgebreid geanalyseerd in hoofdstuk 5. Mutante enzymen met alle mogelijke aminozuren op positie 375 werden gemaakt, gezuiverd en gekarakteriseerd. Niet alle enzymen waren correct gematureerd tot de α en β-subunit, klaarblijkelijk is deze positie niet alleen belangrijk voor katalytische activiteit, maar ook voor de maturatie. Vier mutanten hadden een verhoogde kcat, met SY-77F375H als beste met een 2,4-voudige verhoging. Vier mutaties verlaagden de Km, waarvan SY-77F375G het meest met een factor 6. De katalytische efficiëntie van vijf mutanten was verhoogd, waaronder mutant SY77F375C die 6 maal beter was dan het WT enzym. Opvallend was dat indien het erg grote aminozuur tryptophaan of de geladen aminozuren arginine, aspartaat en glutamaat op positie 375 werden ingebouwd er nauwelijks activiteit op glutaryl-7-ACA en adipyl-7ADCA meer was te meten. In de driedimensionale structuur van cefalosporine acylase neemt positie 375 een bijzondere plaats in, op de overgang tussen een hydrofobe ring die interacties vertoont met de koolstofatomen van de zijketen, en een hydrofiele ruimte die waterstofbruggen vormt met de zuurgroep aan het einde van de zijketen. Een klein hydrofoob aminozuur op positie 375 vergroot de hydrofobe ring, zodat de adipyl zijketen, die langer is dan de glutaryl zijketen, meer ruimte heeft. Een hydrofiel aminozuur op deze positie kan de zuurgroep en de rest van de langere zijketen dieper de substraat bindingsplaats in trekken, net zoals mutatie Tyr178His. Een erg groot aminozuur sluit de hydrofobe ring af, en een geladen 135
aminozuur belet de zure groep toegang tot de hydrofiele ruimte. In beide gevallen kan het substraat niet goed opgenomen worden in de substraat bindingsplaats. De informatie die werd verkregen in hoofdstukken 3, 4 en 5 tezamen maakte een gelokaliseerde willekeurige mutagenese van het enzym mogelijk, hetgeen beschreven is in hoofdstuk 6. Vijf residuen werden gerandomiseerd; Tyr178, Asn266 en Phe375 die beschreven zijn in de vorige hoofdstukken, tezamen met Tyr231 en Arg255. De laatste twee aminozuren vormen waterstofbruggen met de zuurgroep van de zijketen van het substraat, en zijn onderdeel van de piramideachtige structuur beschreven in hoofdstuk 4. Van drie posities is bekend dat mutaties de adipyl activiteit verhogen, en van Tyr231 en Asn266 is tevens bekend dat mutaties de CPC activiteit kunnen verhogen. Analyse van de mutantenbank toonde aan dat drie posities, Tyr178, Tyr231 en Phe375, volledig waren gerandomiseerd. Posities 255 en 266 waren veel minder gemuteerd. Aangezien deze twee posities ook nog op één en dezelfde mutagene primer aanwezig waren, en positie 255 een essentieel residu lijkt te zijn voor maturatie en katalytische activiteit, kan over beide posities geen conclusies getrokken worden. De mutantenbank werd gegroeid op aminoadipyl-leucine platen hetgeen activiteit op CPC zou suggereren. Helaas werden geen goede mutante enzymen gevonden. Kennelijk zijn meer veranderingen nodig om een goed CPC acylase te construeren. Op adipyl-leucine daarentegen werden drie verschillende mutanten geselecteerd, die zijn gezuiverd en gekarakteriseerd, SY-77Y178F+F375H, SY-77Y178F+F375L en SY-77Y178F+F375M. Er werden geen mutanten met een veranderd aminozuur op positie 231 geselecteerd, hetgeen een indicatie is dat deze positie niet gebruikt kan worden voor verandering van de substraatspecificiteit. Positie 178 is in alle drie mutanten veranderd in een phenylalanine. Echter, de enkele mutant SY-77Y178F heeft geen verbeterde kcat op adipyl-7-ADCA, en was wel gevonden in hoofdstuk 3 maar niet verder onderzocht omdat de activiteit ratio niet verhoogd was. Deze mutant heeft echter wel een sterk verlaagde Km. De beste van de drie geselecteerde dubbelmutanten, SY-77Y178F+F375H, heeft een hogere katalytische efficiëntie en kcat dan verwacht kon worden op basis van de waarden van de enkele mutanten. De verbetering is dus synergistisch. De katalytische efficiëntie is 36 maal hoger dan die van het WT enzym, door een 6 maal hogere kcat en een 6 maal lagere Km. Dit is de beste mutant die in het gehele onderzoek gevonden is, en de activiteit is al bijna hoog genoeg voor commerciële toepassing. Deze resultaten werden vergeleken met de resultaten van een simpele gerichte mutagenese. Mutanten SY-77Y178H+F375H en SY-77Y178F+F375L waren al eerder gemaakt, deze combineren de mutatie op positie 178 die de beste kcat heeft (hoofdstuk 3) met de geselecteerde Phe375 mutant (hoofdstuk 4) en de Phe375 mutant met de hoogste kcat (hoofdstuk 5). Deze gerichte dubbelmutanten zijn echter slechter dan alle drie geselecteerde mutanten wat betreft katalytische efficiëntie en Km, en slechter dan de beste geselecteerde dubbelmutant wat betreft kcat. Willekeurige mutagenese van specifieke posities gekoppeld aan een goed selectiesysteem geeft in dit geval duidelijk betere resultaten. Tenslotte wordt in hoofdstuk 7 een andere methode gebruikt om een goed adipyl acylase of CPC acylase te ontwikkelen: het onderzoeken van homologe genen. In de opgehelderde DNA sequenties van micro-organismen (>300) zijn tot dusverre meer dan 50 genen ontdekt die homoloog zijn aan β-lactam acylases. Vier werden gevonden in Pseudomonas 136
Nederlandse samenvatting aeruginosa PAO1, waarvan er één kon worden geproduceerd in E. coli. De hydrolyse van een groot aantal β-lactam verbindingen werd getest, maar er werd geen activiteit gevonden. Wel werden een aantal acyl-homoserine lacton (AHL) verbindingen gehydrolyseerd. Dit zijn signaalmoleculen waarmee Pseudomonas soorten de grootte van de bacteriepopulatie kunnen schatten, zodat de populatie op het juiste moment virulent kan worden en ziekte kan veroorzaken in onder andere cystisch fibrose patiënten en mensen met ernstige brandwonden. Ook andere soorten bacteriën gebruiken dit soort quorum sensing systemen. P. aeruginosa PAO1 gebruikt AHL verbindingen die bestaan uit een homoserine ring die gekoppeld is aan een zijketen van vier of twaalf koolstofatomen, zonder zuurgroep op het eind. Wel heeft de keten van twaalf nog een extra zuurstofatoom aan het begin van de keten. Het enzym dat wordt gecodeerd door het onderzochte gen bleek in biochemisch opzicht sterk te lijken op de β-lactam acylases. Alhoewel ook het gezuiverde enzym geen β-lactam verbindingen kon deacyleren, kon het wel de AHL verbindingen hydrolyseren in de erg lage concentraties waarbij quorum sensing plaatsvindt. Bovendien kon de virulentie van P. aeruginosa PAO1 worden verhinderd door het enzym toe te voegen aan cultures, en door het enzym te laten produceren door de bacterie zelf. Op deze manier wordt de bacterie letterlijk onschadelijk gemaakt. Deze resultaten bieden nieuwe aanknopingspunten om infecties met pathogene bacteriën te bestrijden. Geconcludeerd kan worden dat sterk verbeterde enzymen voor de deacylatie van adipyl-7ADCA zijn gevonden, die gebruikt kunnen worden voor een kosteneffectieve, efficiënte en milieuvriendelijke productie van cefalosporine antibiotica. Tevens zijn de interacties tussen het enzym en verschillende β-lactam substraten uitgediept, waardoor de enzymen makkelijk nog verder verbeterd kunnen worden. Tenslotte is er een nieuwe manier gevonden om de zwakke punten van een humaan pathogeen uit te buiten. Hiermee kunnen nieuwe strategieën worden toegepast om infecties bij mensen met een verzwakt immuunsysteem te bestrijden.
137
138
