Nederlandse samenvatting
Jonatan R. Catai
De afgelopen tien jaar is de belangstelling voor de levenswetenschappen sterk toegenomen en zijn de onderzoeksactiviteiten in dit veelomvattende gebied enorm gegroeid. Deze ontwikkelingen leiden tot een grotere kennis en beter begrip van biologische processen en biochemische mechanismen, en kunnen uiteindelijk aanknopingspunten voor nieuwe en/of verbeterde therapieën voor ziekten opleveren. Adequate analytisch-chemische technieken zijn onmisbaar in de biowetenschappen om karakterisering en kwantificering van biologisch en farmaceutisch relevante verbindingen mogelijk te maken. Om tegemoet te komen aan de steeds stringentere eisen die gesteld worden aan selectiviteit en gevoeligheid in de biomedische en farmaceutische analyse, is de ontwikkeling van verbeterde en nieuwe analytische procedures van groot belang. Capillaire electroforese (CE) is een zeer efficiënte micro-scheidingstechniek die met name geschikt kan zijn voor biomoleculaire analyse. CE-scheiding van verbindingen is gebaseerd op verschillen in electroforetische mobiliteit die in essentie een functie is van de lading-massa verhouding van het geanalyseerde molecuul. CE wordt meestal uitgevoerd in fused-silica capillairen gevuld met een waterige buffer (het achtergrond-electroliet of BGE) waarover een hoge spanning wordt aangelegd. Veel biomoleculen zijn wateroplosbaar en ionogeen (doordat ze zure en/of basische groepen bevatten) en kunnen worden gescheiden met CE. Dit betekent ook dat, in tegenstelling tot veel andere scheidingstechnieken, CE in principe de mogelijkheid biedt om eiwitten en peptiden onder niet-denaturerende condities te analyseren. Andere voordelen van CE zijn de relatief korte analysetijden, de zeer kleine monstervolumina die nodig zijn en het lage verbruik van oplosmiddelen en chemicaliën. Het hoofddoel van de studies beschreven in dit proefschrift was de ontwikkeling van CE-systemen voor de efficiënte, snelle en reproduceerbare scheiding van peptiden en eiwitten. Deze karakteristieken zijn ontegenzeggelijk van belang om betrouwbare CEanalyses van biomoleculaire verbindingen te bereiken. Zo dienen bijvoorbeeld voor de karakterisering van farmaceutische eiwitten reproduceerbare scheidingsprofielen te worden verkregen om consistente piektoewijzing en valide vergelijkingen mogelijk te maken. Echter, conventionele CE-systemen worden vaak gekenmerkt door een slechte reproduceerbaarheid van migratietijden en/of verminderde scheidingsefficiëntie, met name wanneer het de analyse van eiwitten betreft. Deze problemen hangen doorgaans samen met ongewenste interacties van de polypeptide moleculen met de binnenwand van het scheidingscapillair. In principe is het mogelijk om deze interacties te verminderen of te elimineren door de capillairwand te voorzien van een geschikte coating. In dit proefschrift worden de mogelijkheden bestudeerd om met geladen polymeren op eenvoudige en snelle wijze een geadsorbeerde bilaag-coating te produceren die geschikt is voor de CE-analyse van peptiden en eiwitten. Efficient capillary electrophoresis of peptides and proteins with bilayer-coated capillaries
151
Jonatan R. Catai
Bij aanvang van dit project waren de basiskarakteristieken van polymere bilaagcoatings bekend, maar de geschiktheid voor peptide- en eiwitanalyse was nauwelijks onderzocht. In de onderhavige studie zijn de polymeren polybrene (PB) en poly(vinylsulfonzuur) (PVS) gebruikt om een permanent geadsorbeerde bilaag-capillair coating te vormen. De eerste laag wordt gemaakt door het positief geladen PB electrostatisch te adsorberen op het negatief geladen oppervlak van het fused-silica capillair. Vervolgens wordt het negatief geladen PVS, ook door electrostatische interactie, op de PB-laag aangebracht, waardoor een bilaag met een sterk negatief en uniform oppervlak ontstaat. Met deze coating zijn zowel peptide-scheidingen (gebruikmakend van BGEs van lage pH) als eiwitscheidingen (met BGEs met neutrale pH) bestudeerd. Op voorhand bood de bilaagcoating goede perspectieven voor het gebruik van massaspectrometrische (MS) detectie, omdat geen van de coatingspolymeren aanwezig is in de BGE gedurende de CE-analyse. Daarom was een belangrijk deel van het onderzoek gewijd aan het gebruik van vluchtige buffers in combinatie met de coating om een efficiënte CE–MS koppeling te realiseren, en dus identificatie en karakterisering van peptiden en eiwitten te bereiken. De toepasbaarheid van de op de PB-PVS-coating gebaseerde CE-methoden zijn geëvalueerd met neuropeptiden (enkephalines), eiwitdigesten, mengsels van intacte eiwitten, en farmaceutische eiwitten in intacte en gedegradeerde toestand. De prestaties van de ontwikkelde CE-systemen zijn primair geëvalueerd door de schotelgetallen (N) en reproduceerbaarheid van migratietijd van de geanalyseerde peptiden en eiwitten in kaart te brengen. Deze parameters bieden niet alleen belangrijke informatie over de scheidingskwaliteit, maar ook over het functioneren en de toestand van de coating. Lage schotelgetallen en verschuiving van migratietijden indiceren adsorptie van analieten aan het capillair-oppervlak en/of beschadiging van de coating. Schotelgetallen zijn ook indicatief voor het vermogen van het systeem om smalle pieken te produceren en daarmee een maat voor de te bereiken scheidingsefficiëntie. In Hoofdstuk 1 van dit proefschrift worden het uitgangspunt en het doel van het uitgevoerde onderzoek beschreven. Een overzicht van het gebruik van CE voor de analyse van farmaceutische eiwitten wordt gepresenteerd in Hoofdstuk 2. Allereerst worden de basisprincipes en experimentele opstelling van CE, en de mogelijkheden die CE biedt voor eiwitscheidingen behandeld. Vervolgens worden de verschillende CE modi (nl. zone electroforese, isoëlectrische focusing, gel electroforese en affiniteitselectroforese) die gebruikt zijn voor de analyse van biofarmaceutica beschreven. Voor elke modus wordt een overzicht gepresenteerd en relevante voorbeelden worden bediscussieerd. CE–MS van farmaceutische eiwitten wordt ook kort geïntroduceerd. 152
Efficient capillary electrophoresis of peptides and proteins with bilayer-coated capillaries
Jonatan R. Catai
In Hoofdstuk 3 worden de mogelijkheden van de PB-PVS-coating voor de analyse van peptiden met CE met UV-absorptie detectie onderzocht. In tegenstelling tot niet-gecoate (‘kale’) fused-silica, produceert de bilaag-coating een sterke electroösmotische vloeistofstroom (EOF) bij pH 2.5 als gevolg van de aanwezigheid van de volledig gedeprotoneerde sulfonaatgroepen in de PVS-laag (pKa < 1.0). Door geen PVS aan de BGE toe te voegen, konden sterk verbeterde scheidingsefficiënties (schotelgetallen tot 600.000) worden verkregen voor peptiden. Vergeleken met kale fused-silica capillairen levert de bilaag-coating zeer gunstige reproduceerbaarheden van de migratietijden (RSD < 0.3%) en veel kortere analysetijden, en tevens een goede stabiliteit in de tijd. Met het CE systeem met de bilaag-coating konden zeer efficiënte scheidingen van sterk gerelateerde enkephalines en van een mengsel van een isomere peptide en peptoïde worden verkregen in minder dan 7 min. De geschiktheid van bilaag-gecoate capillairen in combinatie met vluchtige buffers voor CE–MS analyse van peptiden wordt onderzocht in Hoofdstuk 4. De bilaag-coating bleek volledig compatibel met MS-detectie en veroorzaakte geen ionisatie-suppressie of achtergrondsignalen. De coating was zeer stabiel met mierenzuur als BGE en leverde reproduceerbare CE–MS-profielen van peptidemengsels met RSDs van de migratietijden kleiner dan 1%. Onder CE–MS-omstandigheden werden schotelgetallen tussen de 300.000 en 500.000 verkregen. Om deze hoge efficiënties te bereiken bleek minimalisering van de hydrodynamische vloeistofstroom in het capillair, die veroorzaakt wordt door het vernevelingsgas van het CE–MS-interface, van essentieel belang. Het belang van een voldoende hoge snelheid van data-acquisitie van de MS om op adequate wijze de zeer smalle CE-pieken te detecteren wordt benadrukt. De toepasbaarheid van het ontwikkelde CE–MS systeem wordt gedemonstreerd aan de hand van de snelle en efficiënte scheiding en identificatie van peptiden uit een eiwitdigest met behulp van MS/MS-detectie. In Hoofdstuk 5 wordt de geschiktheid van de PB-PVS-coating voor de analyse van intacte eiwitten gedemonstreerd. CE–UV van test eiwitten werd bestudeerd gebruikmakend van BGEs van medium pH (7.0-8.5). Met een BGE van 300 mM Trisfosfaat werden goede schotelgetallen (150.000-300.000), symmetrische pieken en gunstige migratietijd-reproduceerbaarheden (RSD < 0.8%) verkregen. Met kale fused-silica capillairen waren de eiwitpieken sterk verbreed en de RSDs van de migratietijden waren vaak groter dan 5%. De PB-PVS-coating bleek effectief in staat om eiwit-adsorptie te minimaliseren en een zeer stabiele EOF te produceren. De bruikbaarheid van de coating wordt geïllustreerd door de scheiding van eiwitten als interferon-α 2b, myoglobine en carbonic anhydrase, door het volgen van de ontleding van insuline in de tijd, en door Efficient capillary electrophoresis of peptides and proteins with bilayer-coated capillaries
153
Jonatan R. Catai
profilering van het glycoproteïne ovalbumine. Ook wordt getoond dat de PB-PVS-coating compatibel is met alkalische spoelstappen en met injecties van grote concentraties humaan serum albumine (HSA). In Hoofdstuk 6 wordt een CE–MS-methode voor de analyse van intacte eiwitten ontwikkeld gebruikmakend van vluchtige BGEs van neutrale pH. BGEs met voldoende buffercapaciteit bleken nodig om gunstige migratietijd-reproduceerbaarheden en schotelgetallen te verkrijgen. Een BGE van ammoniumformaat voldeed voor pH 8.5, maar methylmorfoline diende te worden toegevoegd om reproduceerbare analyses bij pH 7.5 mogelijk te maken. Verhoging van de BGE-concentratie verbeterde de schotelgetallen van de geanalyseerde eiwitten, maar veroorzaakte ook een afname van de intensiteit van de MS-respons. Succesvolle CE–MS-analyses van standaard eiwitmengsels en van een farmaceutische eiwit worden gedemonstreerd waardoor bepaling van de molecuulmassa van de analieten en hun degradatieproducten mogelijk wordt. In Hoofdstuk 7 wordt de ontwikkelde CE-methode met de PB-PVS-coating gebruikt voor de karakterisering van recombinant humaan groeihormoon (rhHG), een therapeutisch eiwit. Vergeleken met een standaard CE-methode die gebruik maakt van kale fused-silica capillairen, worden met de nieuwe methode hogere scheidingsefficiënties en aanzienlijk snellere analyses verkregen. De stabiele migratietijden die door de coating gegenereerd worden, bieden de mogelijkheid om betrouwbaar de thermische ontleding van rhHG in de tijd te volgen en degradatieproducten te kwantificeren. CE–MS-analyses van de rhHG-monsters suggereren dat de voornaamste ontledingsproducten samenhangen met enkelvoudige en tweevoudige deamidering van het eiwit. Geëxpireerde rhHGformuleringen bleken ook oxidatieproducten te bevatten. Hoofdstuk 8 geeft algemene conclusies en opmerkingen over de bruikbaarheid van de bilaag-coating voor de analyse van eiwitten en peptiden, en enkele toekomstperspectieven worden bediscussieerd.
154
Efficient capillary electrophoresis of peptides and proteins with bilayer-coated capillaries
