Nederlandse samenvatting
Samenvatting
Candida is een opportunistische gistsoort die ernstige infecties kan veroorzaken in patiënten met een verminderde afweer. Candida albicans komt het meest voor, maar andere Candida soorten zoals C. glabrata en C. krusei worden steeds vaker geïsoleerd. Risicogroepen voor Candida infecties zijn neutropene kankerpatiënten, beenmerg- en orgaantransplantatiepatiënten, AIDS-patiënten, diabetici, patiënten die worden behandeld met breedspectrum antibiotica en patiënten die parenterale voeding krijgen. Van alle micro-organismen die bloedbaan infecties veroorzaken komt Candida op de 4e plaats in Noord-Amerika, en op de 8e plaats in Europa. Toch is de standaard detectiemethode voor deze infecties, geautomatiseerde bloedkweek, niet toereikend. Veel infecties blijven ongedetecteerd of worden pas na meerdere dagen aangetoond. Daarna duurt het nog één of soms meerdere dagen voordat duidelijk is om welke soort Candida het gaat. Sommige onderzoekers zijn van mening dat de detectie verbeterd kan worden door de negatieve bloedkweken af te enten. Uit het onderzoek beschreven in hoofdstuk 1, waarin negatieve bloedkweken van patiënten met candidaemie werden afgeënt, blijkt dat dit afenten kan leiden tot extra (klinisch relevante) informatie: na afenten werden positieve bloedkweken gevonden op een moment dat de patiënt werd behandeld met antimycotica. Bloedkweken zonder afenten zou hebben gesuggereerd dat de behandeling aansloeg. Het is daarom aan te bevelen om negatieve bloedkweken van patiënten die verdacht worden van candidaemie of patiënten die behandeld worden voor deze infectie af te enten voor verder onderzoek. Het is belangrijk om te weten welke Candida soort de veroorzaker is van een infectie. C. krusei is bijvoorbeeld resistent tegen één van de meest gebruikte antimycotica, fluconazol, en het is bekend dat C. glabrata deze resistentie snel kan ontwikkelen. Om zo snel mogelijk met de juiste behandeling te kunnen starten is het dus belangrijk om een detectiemethode te hebben die niet alleen snel is, maar ook tot op soortniveau kan aangeven welke gist de infectie veroorzaakt. Door hun snelheid en gevoeligheid zijn nucleïnezuur-amplificatiemethoden belangrijke kandidaten voor het verbeteren van de diagnostiek van infecties. De meest gebruikte techniek is de Polymerase Chain Reaction (PCR), waarin specifieke stukjes DNA worden vermeerderd tot een aantoonbaar niveau. In 1991 werd echter een nieuwe techniek beschreven die een aantal voordelen heeft boven PCR. Deze techniek, Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), is gebaseerd op het vermeerderen van specifieke stukjes RNA in plaats van DNA. In tegenstelling tot PCR vindt dit proces plaats bij een constante temperatuur waardoor er geen dure warmtewisselaar hoeft worden aangeschaft. Daarnaast wordt er per reactie veel meer product gevormd dan bij PCR, waardoor de techniek gevoeliger is. De hoodfstukken 2, 3 en 4 beschrijven de ontwikkeling van een NASBA assay voor het aantonen van Candida RNA in bloed en bloedkweken. Uit hoofdstuk 2 blijkt dat het mogelijk is om de gist direct in bloed aan te tonen. Omdat er bij candidaemie echter vaak sprake is van zeer kleine aantallen gistcellen in het bloed, is er tevens gekeken naar de mogelijkheid om de detectie van bloedkweken te verbeteren door met NASBA gist RNA aan te tonen in negatieve bloedkweken (hoofdstuk 3). Daarnaast is in hoofdstuk 4 onderzocht of een korte voorkweek stap van twee dagen de detectie verbeterde. In beide gevallen waren de resultaten bemoedigend. Door de NASBA assay te gebruiken voor het aantonen van gist RNA in bloedkweken die negatief bleven in de geautomatiseerde monitor werden 62% meer positieve kweken gevonden (een stijging van 21% naar 34%). Daarnaast verbeterde de detectie
120
Samenvatting
substantieel na een korte voorkweek stap: 80% van de monsters die positief waren in de NASBA assay in hoofdstuk 4 waren dat na twee dagen voorkweken. In dezelfde studie werd Candida RNA aangetoond in het bloed van een patiënt waarvan alle bloedkweken negatief waren gebleven. Bij een andere patiënt werd de infectie twee dagen eerder gedetecteerd in vergelijking met de bloedkweken. Hoewel maar een klein aantal patiënten geïncludeerd was in deze studies, blijkt uit de resultaten dat een verbetering van de detectie (zowel in aantal als in snelheid) mogelijk is. Dit kan uiteindelijk leiden tot minder morbiditeit en mortaliteit bij de patiënten. Het belangrijkste voordeel van de NASBA is tevens ook een nadeel. Door de hoge gevoeligheid vergeleken met andere technologiën is er ook een grotere kans op contaminaties. Een duidelijk voorbeeld hiervan wordt beschreven in hoofdstuk 5, waar een poging om de NASBA assay te standaardiseren met behulp van een commerciële kit mislukte doordat bepaalde bestanddelen van de kit gecontamineerd waren met gist- of schimmel RNA. Naar aanleiding van dit onderzoek en een literatuuronderzoek (beschreven in hoofdstuk 6) werd geconcludeerd dat de meeste problemen met contaminaties zich voordoen omdat mensen zich niet bewust zijn van het effect van hun handelen op hun omgeving. Ook niet-moleculair biologen kunnen met grote hoeveelheden DNA werkzaam zijn en zo een onverwacht risico vormen, bijvoorbeeld tijdens onderzoek naar recombinant-eiwitten die door middel van plasmiden tot expressie gebracht worden. Het is daarom aan te raden dat alle onderzoekers die dezelfde laboratoria en benodigdheden gebruiken zich aan dezelfde strenge voorzorgsmaatregelen houden. Het in hoofdstuk 5 beschreven probleem stamde af van de fabrikant. Hoewel het moeilijk is om strenge voorzorgsmaatregelen te nemen in een grootschalig productieproces, zouden fabrikanten zich het belang van zulke maatregelen beter moeten realiseren. Met de in dit proefschrift ontwikkelde NASBA assay kunnen de belangrijkste Candida soorten snel herkend worden. Het is echter hoogst aannemelijk dat er ook gistsoorten gevonden zullen worden die met deze methode niet gespecificeerd kunnen worden. Het is ondoenlijk om voor elke soort een extra probe aan de assay toe te voegen. Men zou daarom naast de NASBA assay ook de beschikking moeten hebben over een universeel toepasbare techniek, hoewel die doorgaans meer tijd in beslag nemen. In hoofdstuk 7 werd onderzocht of zo'n universele techniek, Amplified Fragment Length Polymorphism analysis (AFLP) geschikt is voor de identificatie van verschillende Candida soorten. De onderzochte soorten blijken allemaal een uniek bandenpatroon te hebben, en met behulp van deze methode werd aangetoond dat 6% van een grote collectie C. albicans isolaten in het verleden verkeerd geïdentificeerd was. AFLP patronen zijn gemakkelijk op te slaan in algemeen toegankelijke databestanden, hetgeen de kans op een correcte identificatie vergroot. Naast het verbeteren van de detectie van Candida infecties wilden we in dit onderzoek ook kijken naar de epidemiologie van C. albicans in Europa. Binnen een soort kunnen er bepaalde stammen zijn de geassocieerd zijn met een bepaald type infectie of met een bepaalde geografische locatie. Het aantonen van zulke relaties leidt tot een beter begrip van de epidemiologie van een soort, en kan tevens een aanzet zijn tot bijvoorbeeld het vinden van moleculaire markers voor belangrijke eigenschappen als virulentie. Uiteindelijk kan dit leiden tot verbeterde therapeutische voorschriften. In hoofdstuk 8 werd onderzocht of er een relatie bestaat tussen de productie van twee virulentiefactoren van C. albicans, (fosfo)lipasen en
121
Samenvatting
proteïnasen, en het type infectie of de geografische herkomst van de isolaten. In vergelijking met isolaten afkomstig uit bloed, de urinewegen of wond/huid-infecties bleken significant meer isolaten die betrokken waren bij pneumonieën (fosfo)lipasen te produceren. Tevens produceerde een significant hoger aantal van deze isolaten grote hoeveelheden van dit enzym. Vergelijkbare bevindingen werden gedaan voor proteïnasen: alle pneumonie-isolaten produceerden dit enzym, en 96% van deze isolaten produceerden grote hoeveelheden. Deze resultaten tonen aan dat isolaten betrokken bij pneumonie waarschijnlijk virulenter zijn dan isolaten van andere typen infecties. Mogelijk heeft dit te maken met selectie van virulente isolaten in patiënten met een verminderde afweer. Een andere interessante bevinding werd gedaan on hoofdstuk 9. Een groot aantal Europese C. albicans isolaten werd getypeerd. Hiervoor werd opnieuw gebruikt gemaakt van AFLP, een techniek die naast identificatie van soorten ook geschikt is voor het aantonen van verschillen binnen een soort. De Europese isolaten bleken onderverdeeld te kunnen worden in twee clusters. Opvallend was, dat isolaten afkomstig uit Portugal en Spanje allen tot cluster 1 behoorden, terwijl isolaten uit het Verenigd Koninkrijk en Duitsland vrijwel allemaal tot cluster 2 behoorden. Isolaten uit Frankrijk, Italië, Zwitserland en Turkije waren verdeeld over de twee clusters. Deze resultaten impliceren het bestaan van een Iberische en een NoordEuropese kloon. In conclusie: in dit proefschrift is aangetoond dat een verbetering van de detectie van Candida infecties mogelijk is, zowel in aantal als in snelheid. Daarnaast is ontdekt dat C. albicans isolaten betrokken bij pneumonie virulenter zijn dan isolaten uit andere typen infecties. Tevens lijkt het er op dat er binnen Europa sprake is van een Iberische- en een Noord-Europese C. albicans-kloon. Deze laatste twee bevindingen kunnen het begin zijn van een grootschalig epidemiologisch onderzoek.
122
