Nederlandse samenvatting
129
Samenvatting
In de ontwikkelde landen krijgt een op de drie mensen kanker. Ondanks betere screening en behandelingsmogelijkheden is kanker in ontwikkelde landen nog steeds de meest voorkomende doodsoorzaak na hart- en vaatziekten. Bij kanker is er sprake van ongecontroleerde celgroei, waardoor cellen blijven delen en uitgroeien tot een tumor. De tumor drukt weefsel opzij of kan binnendringen in een orgaan en daar schade toebrengen. Cellen kunnen losraken van een tumor en zich via het bloed of lymfevaten verspreiden naar andere organen. Als ze daar uitgroeien tot tumoren is er sprake van uitzaaiingen (metastasen). Kanker kan ondermeer ontstaan door mutaties in een bepaald gen. Een gen bestaat uit een stukje DNA met een specifieke volgorde dat codeert voor een functioneel RNA-product en/of een bepaald eiwit. Eerst wordt het DNA van een gen overgeschreven naar RNA, dit wordt transcriptie genoemd (Figuur 1). Bij het produceren van een eiwit wordt RNA vertaald (translatie) naar een eiwit. Tot voor kort dacht men dat alléén de genen die voor een eiwit coderen verantwoordelijk zijn voor allerlei biologische processen in ons lichaam. Het blijkt echter dat RNA-producten die niet worden vertaald naar een eiwit, ook een belangrijke rol spelen bij genexpressie regulatie. Het aanzetten van het gen om een RNA-product te maken, wordt mede gereguleerd door binding van bepaalde eiwitten (bv. transcriptiefactoren) aan een stuk DNA dat direct voor het gen gelegen is, de zogeheten promoter (Figuur 1). Wanneer er mutaties in de DNA-volgorde hebben plaatsgevonden kan dit leiden tot een niet functioneel RNA-product of eiwit, of er wordt te veel of te weinig, of in zijn geheel geen product aangemaakt.
promoter
gen start overschrijving
regulerende eiwitten
DNA transcriptie
RNA translatie
eiwit Figuur 1. Het proces van genexpressie. In de kern bevindt zich het DNA dat codeert voor een RNA-product dat vervolgens vertaald kan worden naar een eiwit. De DNA-volgorde van het gen wordt voorafgegaan door de promoter, waaraan regulerende eiwitten kunnen binden die de transcriptie in gang zetten. Tevens bestaan er RNA-produkten die niet naar een eiwit worden vertaald, maar direct het transcriptieproces kunnen beïnvloeden.
130
Samenvatting
Epigenetica Het laatste decennium is steeds duidelijker geworden dat naast genetische mutaties, epigenetische mutaties eveneens een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van kanker. Epigenetica is de studie van overdraagbare veranderingen in genexpressie die niet verklaard kunnen worden door veranderingen in de DNA-volgorde zelf. Epigenetische factoren die genexpressie reguleren zijn o.a. DNA-methylatie, histonmodificaties, RNA-produkten en de dichtheid van de nucleosomen. Het onderzoek beschreven in dit proefschrift concentreert zich op DNA-methylatie en histonmodificaties. Het DNA is opgerold om verpakkingseiwitten (histonen) die samen met andere eiwitten het chromatine vormen waar de chromosomen uit bestaan (Figuur 2). Factoren die de chromatinestructuur bepalen zijn nauw verbonden met genexpressie. Wanneer het chromatine ”open” staat kunnen er allerlei regulerende eiwitten, waaronder transcriptiefactoren, aan de promoter binden waardoor het gen tot expressie komt. Wanneer het chromatine ”gesloten” is, is de promoter als het ware afgeschermd voor deze eiwitten, en staat het gen uit. Factoren die de chromatinestructuur bepalen zijn o.a. DNA-methylatie en de zogeheten histoncode (Figuur 2). Binding van een methylgroep aan een bouwsteen van DNA (cytosine voorafgaand door de bouwsteen guanine) veroorzaakt een gesloten chromatinestructuur. Aan histonstaarten kunnen op verschillende plaatsen chemische groepen (methyl, acetyl, fosfaat, ubiquitine) gekoppeld worden. Dit patroon vormt een histoncode die bepaalt of het chromatine een open of gesloten structuur aanneemt. Acetylering van histonen is bijvoorbeeld geassocieerd met een open chromatinestructuur.
DNA methylatie
histonstaart
nucleosoom chromosoom Qiu, Nature 2006
Figuur 2.Twee belangrijke componenten van de epigenetische code. Chromosomen bestaan uit chromatine: DNA opgerold rondom histonen. Zowel het methyleren van het DNA als de verschillende moleculen die aan de staarten van de histonen worden gekoppeld bepalen mede of er transcriptie van het DNA plaatsvindt.
131
Samenvatting
Een verstoring van de normale genexpressie door epigenetische mutaties speelt een belangrijke rol bij kanker. Veranderingen in de methylatiestatus van het DNA en/of in modificaties van de histonen kunnen leiden tot een veranderde genexpressie. Het belangrijkste verschil met genetische mutaties is dat epigenetische mutaties omkeerbaar zijn en dus mogelijk met medicijnen zijn te herstellen. Epigenetische medicijnen zoals remmers van DNA-methylatie en histon-modificerende eiwitten worden al in de kliniek gebruikt. Ondanks dat de resultaten veelbelovend zijn, is een groot nadeel dat deze medicijnen werkzaam zijn op het DNA van het gehele genoom. Dit betekent dat zij ook effect hebben op de genen met een correcte expressie. Om te bereiken dat alléén een defecte genexpressie wordt gecorrigeerd dient het epigenetische medicijn doelgericht naar dat specifieke ”foute” gen gedirigeerd te worden. EpCAM en kanker Een gen dat codeert voor een eiwit dat geassocieerd is met kanker is het Epitheliale Cel Adhesie Molecuul (EpCAM). Dit eiwit is oorspronkelijk geïdentificeerd als een marker voor carcinomen, toe te schrijven aan de hoge expressie op snel woekerende tumoren van epitheliale oorsprong. Bijna alle normale epitheelcellen brengen ook EpCAM tot expressie, maar veel minder dan carcinoomcellen. Aanvankelijk werd EpCAM voorgesteld als een celadhesie molecuul. Recente inzichten laten echter een meer veelzijdige rol voor EpCAM zien, die niet uitsluitend is beperkt tot celadhesie, maar diverse processen omvat zoals celmigratie, proliferatie, differentiatie en mogelijk kankerinitiatie. Voor sommige carcinoomtypen zoals borstkanker is gebleken dat remming in de aanmaak van het EpCAM-eiwit tot minder proliferatie, migratie en invasie van tumorcellen leidt. Tot op heden kan men de eiwitaanmaak echter alleen maar tijdelijk verlagen. Doel van het onderzoek Het onderzoek in dit proefschrift beschreven richt zich op een blijvende verlaagde aanmaak van het EpCAM-eiwit om tumorgroei en metastasering te voorkomen. Het blijkt dat de overexpressie van EpCAM op carcinomen niet wordt veroorzaakt door onderliggende genetische defecten. In dit proefschrift wordt de epigenetische regulatie van het gen dat codeert voor het EpCAM-eiwit onderzocht. Vervolgens wordt door te interfereren met de epigenetische code van het EpCAMgen beoogd de expressie van het EpCAM-gen uit te schakelen. Door een gerichte verandering aan te brengen in de epigenetische code van alléén het EpCAM-gen, wordt het gen uitgeschakeld waardoor er geen EpCAM-eiwit meer wordt aangemaakt. De nadruk ligt hierbij op genspecificiteit. In hoofdstuk 1 wordt het eiwit EpCAM geïntroduceerd en kort uitgelegd wat epigenetica inhoudt. Tevens worden verschillende methoden om het EpCAM-gen uit te schakelen uitgelegd. Hoofdstuk 2 geeft een gedetailleerd overzicht van de schijnbaar tegenstrijdige biologische rol van EpCAM in het ontstaan van kanker, het voortschrijden van de tumor en de metastasering in een breed spectrum aan carcinoomtypen. In dit hoofdstuk wordt tevens de (epi)genetische regulatie van het
132
Samenvatting
gen dat codeert voor EpCAM beschreven en worden de mogelijkheden om hierop in te grijpen besproken. Tot op heden wordt de overexpressie van EpCAM op carcinomen gebruikt als doelwit voor klinische studies waarin getest wordt of antilichamen gericht tegen het EpCAM-eiwit in staat zijn om de tumorcellen te doden met behulp van de afweercellen in het lichaam. In sommige tumortypen laat remming in de aanmaak van EpCAM-eiwit een verminderd oncogeen fenotype zien. Dit opent de mogelijkheid om EpCAM op gen-niveau uit te schakelen zodat de tumorcellen minder snel delen, migreren en invaseren. Bovendien is aangetoond dat bepaalde kankercellen in de tumor, de zogeheten kankerstamcellen, sneller een tumor initiëren wanneer deze cellen EpCAM tot expressie brengen dan kankerstamcellen die géén EpCAM tot expressie brengen. Ingrijpen in de epigenetische regulatie van het EpCAM-gen, waardoor tumorcellen minder EpCAM-eiwit maken kan mogelijk leiden tot een nieuwe therapie tegen kanker. In hoofdstuk 3 is de epigenetische regulatie van het EpCAM-gen specifiek in ovariumkanker onderzocht. Het bleek dat in cellijnen van ovariumcarcinomen, hypermethylatie van de EpCAMpromoter correleert met de afwezigheid van EpCAM-expressie, en omgekeerd, dat hypomethylatie een hoge EpCAM-expressie laat zien. Tevens bleken de histonmodificaties die kenmerkend zijn voor een open chromatinestructuur geassocieerd te zijn met een EpCAM-promoter die aanstaat, terwijl de histonmodificaties karakteristiek voor een gesloten chromatinestructuur correleerden met een EpCAM-promoter die uitstaat. Bovendien is onderzocht of transcriptiefactoren die een bewezen rol spelen bij ovariumkanker, mogelijk betrokken zijn bij de regulatie van het EpCAM-gen. In cellijnen die EpCAM tot expressie brengen bleken tien van de zestien geteste transcriptiefactoren aan de EpCAM promoter te binden. De transcriptiefactor Sp1 bleek op een specifieke plaats in de promoter moeilijker te kunnen binden indien het DNA hier gemethyleerd was. Het koppelen van een methylgroep aan de cytosine in het DNA wordt uitgevoerd door het enzym DNA-methyltransferase. Om het EpCAM-gen te kunnen uitschakelen dienen we dit enzym in de tumorcel te kunnen afleveren. In hoofdstuk 4 laten we zien dat het cationische liposoom SAINT in staat is eiwitten af te leveren in de cel. De in verschillende type cellen gebrachte eiwitten waren functioneel actief. Bovendien bleek SAINT als enige transportmiddel in staat om functioneel actieve eiwitten in de cel af te leveren in de aanwezigheid van serum dat een essentiële voorwaarde is voor een toekomstige toepassing in de kliniek. Om te verifiëren of het DNA-methyltransferase in de kern van de cel kan komen en functioneel is, hebben we gebruik gemaakt van het E-cadheringen waarvan bekend is dat wanneer het wordt gemethyleerd, het niet meer tot expressie komt. Nucleaire activiteit van het door SAINT afgeleverde DNA-methyltransferase werd bevestigd door een verhoogde DNA-methylatie van het E-cadherin-gen en een verlaagde E-cadherin eiwitexpressie. De resultaten beschreven in hoofdstuk 5 laten zien dat actief interfereren met de DNA methylatiestatus van de EpCAM-promoter inderdaad resulteert in een verandering van EpCAM-expressie. Behandeling van EpCAM-negatieve cellen met een DNA methylatieremmer induceerde EpCAM-expressie en veroorzaakte verhoogde EpCAM-expressie in een EpCAM-
133
Samenvatting
positieve ovariumcarcinoom cellijn. Afleveren van het DNA-methyltransferase door SAINT liet een toegenomen DNA-methylatie van de EpCAM-promoter zien, wat correleerde met een efficiënte verlaagde EpCAM-expressie. Eiwitexpressie kan ook worden geremd door zogenaamde RNA-interferentie. Door het afleveren van korte stukken dubbelstrengs RNA (siRNA) specifiek voor het EpCAM-RNA, wordt alléén het RNA afgebroken dat codeert voor het EpCAM-eiwit. Het nadeel van deze methode is dat er voortdurend siRNA in de cel afgeleverd moet worden omdat de cel EpCAM-RNA moleculen blijft aanmaken. Om te illustreren dat DNA-methylatie in tegenstelling tot RNA-interferentie een blijvend effect heeft zijn beide methoden met elkaar vergeleken. Terwijl de verlaagde EpCAM-expressie na aflevering van EpCAM-specifiek RNA vier dagen aanbleef en daarna weer toenam, bleef de door het DNAmethyltransferase verlaagde EpCAM-expressie voor maar liefst zeventien dagen constant. Deze bevinding illustreert dat DNA-methylatie wordt doorgegeven aan de dochtercellen. Het inbrengen van het DNA-methyltransferase in de cel heeft als gevolg dat het DNA van het gehele genoom wordt gemethyleerd. Om genspecifiek te methyleren maken we in hoofdstuk 6 gebruik van een DNA-bindend domein dat ontwikkeld is om slechts aan één positie in het genoom te binden. Dit DNA-bindend domein, het zogenoemde Triple helix vormend Oligonucleotide (TFO), is een enkelstrengs stuk DNA dat specifiek bindt aan het dubbelstrengs DNA in de EpCAM-promoter. Aan de TFO is een DNA-methyltransferase gekoppeld: de TFO bindt aan de EpCAM promoter, alwaar alléén op die positie in het genoom DNA-methylatie plaatsvindt. Hoofdstuk 7 beschrijft dat siRNA, ontworpen om EpCAM-RNA af te breken zoals genoemd in hoofdstuk 5, ook in staat is een blijvende verlaging van EpCAM-expressie te bewerkstelligen in een klein deel van de celpopulatie die behandeld is met dit siRNA. De verlaagde EpCAM expressie correleerde met een toename in DNA-methylatie van de EpCAM- promoter. Tenslotte wordt in hoofdstuk 8 het onderzoek zoals beschreven in dit proefschrift bediscussieerd en worden de perspectieven voor de verdere ontwikkeling van EpCAM-gen specifieke therapieën besproken. Samenvattend heeft dit onderzoek naar de regulatie van het gen dat codeert voor het EpCAMeiwit, geleid tot drie verschillende methoden waarop de expressie van dit gen langdurig kan worden verlaagd. Deze methoden zijn allen gebaseerd op methylatie van het DNA waardoor een gen uitgeschakeld wordt met als gevolg dat er geen RNA, en dus geen eiwit, meer door de cel wordt aangemaakt. Om een DNA-methylerend enzym in de cellen te brengen is onderzocht of het transportmiddel SAINT functionele eiwitten in de cel(kern) kan afleveren. Het inbrengen van het DNA-methylerend enzym in de cellen resulteerde in methylatie van het DNA en een verminderde EpCAM-eiwit aanmaak. Om DNA-methylatie van andere genen te voorkomen, werd bij de tweede methode het DNA-methylerende enzym gekoppeld aan een DNA-bindend domein, specifiek voor het EpCAM-gen. De geïnduceerde DNA-methylatie bleef inderdaad beperkt tot het gebied waar het DNA-bindend domein bindt. Bij de derde methode werden korte stukken RNA ingebracht om
134
Samenvatting
specifiek het EpCAM-RNA af te breken. In een subpopulatie van de cellen bleek echter ook het EpCAM-DNA gemethyleerd dat resulteerde in een langdurig verlaagde aanmaak van het EpCAMeiwit. Genspecifieke DNA-methylatie is breed toepasbaar: in principe kan op deze manier ieder willekeurig ”ziek gen” uitgeschakeld worden.
135
136
