NEDERLANDSE SAMENVATTING
6DPHQYDWWLQJ
6DPHQYDWWLQJ
Samenvatting Om transplantatie van een donor orgaan in een immunologisch niet-identieke ontvanger mogelijk te maken, dient de ontvanger een hoge dosis medicijnen in te nemen om het immuunsysteem te remmen. Wanneer deze immunosuppressie niet gegeven zou worden, wordt het getransplanteerde orgaan onmiddellijk herkend als vreemd en zal een heftige immunologische reactie op gang komen om het orgaan te vernietigen. Een complicatie is dat de herkenning en eliminatie van ziekteverwekkers, zoals bacteriën en virussen, ook geremd wordt. Eén van de ziekteverwekkers die de meeste transplantaat ontvangers plaagt is het cytomegalovirus (CMV). CMV behoort tot de familie van de herpesvirussen, die als eigenschap heeft dat het na een infectie latent (slapend) of laag actief in het lichaam aanwezig blijft. CMV negatieve transplantaat ontvangers kunnen voor het eerst geïnfecteerd raken met CMV door bijvoorbeeld transplantatie van een CMV positief orgaan in een CMV negatieve ontvanger. Dit zijn de primaire infecties. In perioden van verzwakte afweer, bijvoorbeeld na een orgaantransplantatie, kan CMV weer opspelen in de vorm van een zogenaamde secundaire infectie. CMV kan een systemische infectie veroorzaken met symptomen als piekende koorts, gewrichtsklachten en malaise. Diverse organen kunnen betrokken zijn bij deze infectie. Zelfs wanneer geen klinische symptomen waarneembaar zijn tijdens actieve infectie, kan toch functieverlies worden aangetoond in een aantal organen. Dit geeft aan dat ook tijdens de minder ernstige infecties het virus op meerdere plaatsen in het lichaam actief is. Een van de celtypen dat geïnfecteerd kan worden met CMV is het endotheel. Gezien de centrale ligging (binnenbekleding van bloedvaten) en de specifieke functie van endotheelcellen (reguleren van ontsteking, in- en uitstroom van voedingsstoffen, reguleren van bloedstolling) kan infectie van endotheel met CMV van cruciaal belang zijn bij de verspreiding van het virus door het lichaam. Tevens zou de hoeveelheid geïnfecteerd endotheel een afspiegeling kunnen vormen van de betrokkenheid van de diverse organen bij de infectie. Daarom zijn we in deze studie geïnteresseerd in de rol van het endotheel tijdens CMV infectie. In een aantal patiënten met actieve CMV infectie kunnen in het bloed laat-stadium geïnfecteerde endotheelcellen aangetroffen worden die cytomegaal zijn veranderd (sterk vergroot). We hebben de aanwezigheid van deze cytomegale endotheelcellen (CEC) en andere endotheelcellen in het bloed bestudeerd in relatie tot de ernst en het verloop van de infectie. Een andere maat voor betrokkenheid van endotheel tijdens CMV infectie die we bestudeerd hebben, is de hoeveelheid stoffen die tijdens endotheelactivatie of schade aan het bloed werden afgegeven. Een aantal CMV patiënten hebben een longfunctie meting ondergaan om te kijken of er een verband was tussen de hoeveelheid schade aan het endotheel en de afname van longfunctie. Met behulp van in vitro gekweekte endotheelcellen is verspreiding van het virus van endotheel naar witte bloedcellen bestudeerd. Verder hebben we enkele enzymen op het celoppervlak van CMV geïnfecteerde endotheelcellen onderzocht die betrokken zijn bij regulatie van ontsteking en stolling.
130
6DPHQYDWWLQJ
Hoofdstuk 1 bevat de inleiding van dit proefschrift en geeft een overzicht van de relatie tussen CMV en endotheel. In hoofdstuk 1.2 zijn de onderzoeksvragen beschreven die aan deze studie ten grondslag liggen. De inleiding begint met de biologie van het virus, gevolgd door de klinische aspecten van een CMV infectie na transplantatie. Het laatste gedeelte handelt over de relatie van CMV met endotheel en bloedvaten. Hierin komt de kinetiek van CMV infectie in endotheelcellen aan de orde. We bespreken diverse aspecten van de infecteerbaarheid van het endotheel met CMV en behandelen de gevolgen van infectie met CMV op de functie en het uiterlijk van de endotheelcel. Ook beschrijven we de effecten van CMV infectie op endotheel op het ontstaan van atherosclerose (dichtslibben van vaten) en transplantaat disfunctie op lange termijn. Hoofdstuk 2 beschrijft de methode die ontwikkeld is om cytomegale endotheelcellen uit bloed te isoleren en te tellen. Dit werd gedaan door uit bloed geïsoleerde mononucleaire cellen te kleuren met endotheel specifieke fluorescerende labels. De gemarkeerde cellen werden met behulp van de fluorescence activated cell sorter (FACS) gesorteerd op een adhesieglaasje. Deze nieuwe methode werd vergeleken met de bestaande methode waarbij mononucleaire cellen uit bloed werden geïsoleerd en op glaasjes werden gecentrifugeerd. Deze glaasjes werden vervolgens gekleurd met zowel een CMV merker als een endotheelmerker. Hoewel de opbrengst van endotheelcellen uit het bloed vergelijkbaar was bij beide methodes, bleek de FACS methode meer dan tien keer zo gevoelig. Dit komt doordat er veel grotere hoeveelheden bloed geanalyseerd kunnen worden. In hoofdstuk 3 is in kaart gebracht wanneer en in welke hoeveelheden endotheelcellen worden aangetroffen in bloed van niertransplantaat ontvangers met een CMV infectie. Twee soorten endotheelcellen werden aangetoond, namelijk de laat-stadium CMV geïnfecteerde cellen met een cytomegaal uiterlijk en niet-geïnfecteerde endotheelcellen (EC). De CEC werden uitsluitend gevonden in de niertransplantaat ontvangers met een matige tot ernstige CMV infectie, terwijl de EC ook werden waargenomen in patiënten met een milde CMV infectie en buiten de infectie om. Het voorkomen van CEC, EC of beide was geassocieerd met de aanwezigheid van klinische symptomen tijdens de infectie. Een opvallende bevinding was dat de meeste patiënten met CEC, EC of beide in het bloed tijdens CMV infectie, voorafgaand aan deze infectie een periode van acute afstoting hadden doorgemaakt. Blijkbaar leidt het na elkaar voorkomen van acute afstoting en CMV infectie tot meer endotheelschade tijdens CMV infectie. In hoofdstuk 4 zijn de bloedplasma spiegels bestudeerd van een aantal merkers die een parameter zijn voor endotheelschade en -activatie. Gedurende de CMV infectie werd wekelijks bloed afgenomen waarin de hoeveelheid von Willebrand Factor (vWF), oplosbaar ICAM-1 (sICAM-1), oplosbaar VCAM-1 (sVCAM-1) en oplosbaar E-selectine (sE-sel) werd gemeten. De concentratieveranderingen van deze moleculen werden bestudeerd in relatie tot de ernst van de infectie, het voorkomen van endotheelcellen in bloed en het optreden van acute afstoting voorafgaand aan de CMV infectie. De concentratie van vWF en van sVCAM-1 verdubbelde tijdens ernstige CMV infectie. De stijging van vWF in bloed correleerde met de aanwezigheid van CEC en EC in bloed. De kinetiek van de stijging van vWF en de aanwezigheid van endotheelcellen (CEC en EC) in bloed gaven dus de relatie met CMV geïnduceerde endotheelschade weer. In overeenstemming met de bevindingen van 131
6DPHQYDWWLQJ
hoofdstuk 3 was de toename in de plasmaconcentratie van zowel vWF als sVCAM-1 het sterkst in patiënten die eerder acute afstoting hadden doorgemaakt. Hoofdstuk 5.1 behandelt de longfunctie van niertransplantaat ontvangers tijdens CMV infectie. De longfunctie werd bepaald door middel van het meten van de CO diffusie capaciteit, waarbij tevens parameters voor de capillaire bloedstroom (Vcap) en diffusie over de alveolaire membraan (Dm) in kaart gebracht werden. Het meten van de Vcap en de Dm kan informatie verschaffen over de mate van ontsteking of afname van de doorbloeding. Aangezien CEC, zoals bestudeerd in hoofdstuk 3, erg groot zijn, zouden deze cellen de kleinste bloedvaatjes in de long kunnen verstoppen en dus op deze manier verantwoordelijk zijn voor de afname in longfunctie tijdens CMV infectie. Echter, zowel de diffusie als de doorbloeding waren verminderd tijdens CMV infectie. Daarom is geconcludeerd dat ontsteking veroorzaakt door CMV de belangrijkste veroorzaker is van de afname in longfunctie, in plaats van verstopping door CEC. In hoofdstuk 5.2 is dieper ingegaan op de relatie tussen CEC, de ernst van de infectie en de CO diffusie capaciteit van de longen. Vijf patiënten waarbij CEC werden aangetoond in het bloed in de periode dat de longfunctie testen werden afgenomen, zijn vergeleken met vier patiënten die geen CEC in het bloed hadden tijdens de testen. Alle patiënten hadden een verminderde longfunctie met verminderde Vcap en verminderde Dm, terwijl tussen beide groepen geen verschillen zichtbaar waren. Analyse van een groep met 15 CMV patiënten, waarbij patiënten werden ingedeeld aan de hand van de ernst van infectie, liet zelfs zien dat patiënten met een ernstigere infectie wel een grotere afname van de diffusie capaciteit over de membraan (Dm) vertoonden, maar niet van de Vcap. Uit deze groep patiënten bleek dus dat de afname van de longfunctie niet gerelateerd was aan het verstoppen van bloedvaatjes door CEC, maar wel aan de ernst van de CMV infectie. In een in vitro model voor CMV antigenemie werd de rol van CMV specifieke antistoffen bestudeerd (hoofdstuk 6). Het model is gebaseerd op contact tussen polymorfonucleaire granulocyten (PMNs) en in vitro gekweekte endotheelcellen geïnfecteerd met een endotheel geadapteerde CMV stam. Reeds na 5 minuten konden de eerste PMNs geoogst worden die na kleuring met een merker voor het CMV eiwit pp65 positief waren (CMV positieve antigenemie). In dit hoofdstuk beschrijven we de remming van de opname van CMV pp65 door PMNs na toevoeging van sera van CMV seropositieve patiënten. Deze remming kon aangetoond worden na toevoeging van patiëntensera, gezuiverd IgG uit deze sera of CMV hyperimmune globuline. In hoofdstuk 7 hebben we het mechanisme van de opname van pp65 door PMNs onderzocht. Alhoewel fagocytose door PMNs de meest voor de hand liggende route is waardoor PMNs het CMV (eiwit) opnemen, geeft deze route geen verklaring voor de bevindingen dat pp65 snel in de kern aangetoond kan worden. De verwachting zou zijn dat pp65 in de lysozomale blaasjes afgebroken wordt. Wij zagen remming door CMV specifieke antistoffen, remming door lactoferrine en betrokkenheid van microtubuli-geassocieerd transport in de opname van CMV pp65. Zowel CMV antistoffen als lactoferrine remden de aanhechting van het virus aan de gastheercel, waarna de fusie bemoeilijkt wordt. In een aantal elektronenmicroscopische opnames van PMNs in aanwezigheid van CMV geïnfecteerd endotheel troffen we PMNs betrokken bij de fagocytose van virusdeeltjes. 132
6DPHQYDWWLQJ
Fagocytose lijkt dus ook een rol te spelen in opname van pp65. Het is echter niet bekend of het gefagocyteerde eiwit ook daadwerkelijk in de kern terechtkomt. Naar aanleiding van de resultaten van deze experimenten postuleren we dat, naast fagocytose, fusie van virale partikeltjes met de celmembraan van PMNs verantwoordelijk is voor de opname van pp65 door de PMNs. De virale partikels komen vrij in het cytoplasma en kunnen via cytoskeletgemedieerd transport naar de kern gebracht worden. In het laatste hoofdstuk gaan wij in op de pathofysiologie van CMV infectie op de functie van endotheelcellen. We beschrijven dat de expressie van ecto-ATPase en ecto-5’ nucleotidase is toegenomen op in vitro gekweekt endotheel geïnfecteerd met CMV (hoofdstuk 8). Deze enzymen hebben een remmende werking op het stollingsproces. Tevens heeft het door ecto-5’ nucleotidase gevormde eindproduct, adenosine, een remmend effect op ontsteking. We lieten zien dat deze enzymen verhoogd aanwezig en sterker actief zijn. Coculture experimenten van geactiveerde PMNs met CMV geïnfecteerd endotheel lieten zien dat er minder zuurstof metabolieten geproduceerd werden. We denken dus dat infectie met CMV resulteert in een verhoogde expressie van ecto-ATPase en ecto-5’ nucleotidase en dit kan dienen als een ontsnappingsroute of compensatietactiek van het virus om ontsteking en bloedstolling op het endotheel tegen te gaan. Tot slot worden in hoofdstuk 9 alle resultaten samengevat en bediscussieerd. De betekenis van CEC in de pathofysiologie van de infectie wordt besproken en de conclusie is dat ze een belangrijke maat zijn voor de ernst van de infectie. Tevens kunnen de CEC betrokken zijn bij de verspreiding van het virus, maar mogelijk gebeurt dit reeds als de geïnfecteerde endotheelcellen nog niet losgelaten hebben. De in vitro experimenten gaven aan dat de geïnfecteerde endotheelcellen het virus doorgeven aan PMNs en monocyten. Er wordt bediscussieerd waar de niet-geïnfecteerde endotheelcellen vandaan komen, waarbij het beenmerg als bron voor aanvoer van nieuwe endotheelcellen vermeld wordt. Een onderwerp van discussie is de relatie tussen acute afstoting en CMV infectie met betrekking tot de versterkte endotheelschade. Verder worden suggesties aangereikt voor nader onderzoek in de richting van endotheelschade en CMV infectie na transplantatie.
133
