Nederlandse Samenvatting
139
Nederlandse Samenvatting Staphylococcus aureus is één van de belangrijkste bacteriën verantwoordelijk voor implantaat gerelateerde infecties. Biomateriaal gerelateerde infecties beginnen met reversibele hechting van bacteriën aan een implantaat, waarna de gehechte bacteriën beginnen met de productie van een matrix van extracellulaire polymere substanties (EPS) om over te gaan tot irreversibele hechting, gevolgd door biofilm groei. De EPS matrix beschermd de bacteriën in een biofilm tegen biologische, mechanische en chemische stress, zoals de immuun respons, vloeistof gerelateerde schuifkrachten en behandeling met antibiotica. Al deze grootse veranderingen in S. aureus fysiologie vinden plaats vanwege hechting en biofilm formatie, vandaar dat mechanische waarneming van oppervlakte hechting een belangrijke eigenschap is voor aanpassing en overleving. Echter, er is slechts weinig bekend over de mechanische sensitiviteit van S. aureus gedurende hechting aan oppervlakken. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de verschillen tussen twee belangrijke sensorische strategieën die bacteriën gebruiken om de omgeving waar te nemen, chemische en
mechanisch
sensorische
perceptie.
Bacteriën
worden
aan
verschillende
omgevingscondities blootgesteld tijdens hun groei en hebben verschillende mechanismes ontwikkeld om hun omgeving waar te nemen en overleving te vergemakkelijken. Bacteriën communiceren met hun omgeving door het waarnemen van chemische signalen zoals pH, ionische sterkte of het waarnemen van biologische moleculen, zoals door quorum sensing. Bacteriën reageren echter niet alleen op hun omgeving door chemische waarnemingen, maar ook door fysieke waarnemingsmechanismen. Bij hechting aan een oppervlak bijvoorbeeld, kunnen bacteriën reageren door de excretie van EPS door een mechanisme dat mechanosensing wordt genoemd. Dit stelt ze in staat om te groeien in de door hun geprefereerde matrix beschermde biofilm. Vandaar dat het doel van dit proefschrift was om de rol van hechtingskrachten in de respons van bacteriën op hechting te onderzoeken. We hebben S. aureus gebruikt als model pathogeen dat veelvuldig voorkomt bij biomateriaal gerelateerde infecties en vervolgens deze stam en een aantal isogene mutanten onderzocht met behulp van atomische kracht microscopie (AFM) en oppervlakte versterkte fluorescentie (SEF), om de hechtingskrachten en celwand vervorming te bepalen. De bacteriële respons werd geëvalueerd in termen van gen expressie en getest op verschillende biomaterialen die veelvuldig gebruikt worden in orthopedische implantaten.
140
Nederlandse Samenvatting Bacteriële hechting op oppervlakken wordt beheerst door een combinatie van verschillende korte- en langeafstandskrachten. In Hoofdstuk 2 presenteren we een nieuwe methode gebaseerd op AFM om de bacteriële hechtingskrachten die over lange afstand werken te bepalen, aan de hand van de toegepaste kracht tijden het gebruik van AFM. We hebben twee S. aureus stammen (S. aureus ATCC12600 en S. aureus NCTC 8325-4) en hun isogene Δpbp4 mutanten gebruikt. De lange afstand hechtingskrachten van de S. aureus stammen (0.5 en 0.8 nN) waren slechts een derde van de krachten die gemeten werden voor de meer vervormbare Δpbp4 mutanten (2.7 en 1.6 nN), die niet in staat zijn om peptidoglycan te crosslinken. De gemeten Lifshitz-Van der Waals hechtingskrachten die over lange afstand domineren, gaven de aanleiding om een 40% elliptische vervorming van de bacteriële celwand aan te nemen voor de Δpbp4 mutanten. Directe metingen van hechtende stafylokokken gemaakt met behulp van AFM in de PeakForce-QNM mode bevestigden een hoogte reductie door vervorming in de Δpbp4 mutanten van 100 – 200 nm. Onder natuurlijk voorkomende bacteriële stammen variëren de langeafstandskrachten niet in dezelfde mate als hier is waargenomen voor de Δpbp4 mutanten. Door deze resultaten te extrapoleren kunnen we echter concluderen dat de langeafstandskrachten in bacteriële hechting niet alleen bepaald worden door de samenstelling en de structuur van het bacteriële cel oppervlak, maar ook door tot nu toe genegeerde kleine vervormingen van de bacteriële celwand, die het contactoppervlak vergroten en daarmee ook de hechtingskrachten. Celwand vervorming op de nanoschaal die plaats vindt tijdens de hechting van bacteriën is moeilijk te meten, behalve bij Δpbp4 mutanten die niet in staat zijn om peptidoglycan te cross linken. Hoofdstuk 3 behandelt een meer geavanceerde techniek om celwand vervorming te kwantificeren gebaseerd op oppervlakte versterkte fluorescentie in stafylokokken hechtend op goud oppervlakken. Hechting gerelateerde versterking van fluorescentie hangt af van de afstand van de bacteriën tot het oppervlak en de hechtingstijd. In dit hoofdstuk wordt een model aangedragen gebaseerd op de hechting gerelateerde versterking van fluorescentie van groen-fluorescente microspheres, waarmee de afstand tot het oppervlak en de celwand vervorming van gehechte bacteriën berekend kan worden, gebaseerd op hun hechtingstijd afhankelijke versterking van fluorescentie. De afstanden tussen hechtende bacteriën en een oppervlak, inclusief compressie van de EPS-laag, daalde tot 60 min na hechting, gevolgd door vervorming van de celwand. Vervorming van de celwand is onafhankelijk van de integriteit van de EPS-laag en verloopt het snelst voor een Δpbp4 stam. 141
Nederlandse Samenvatting Gebaseerd op de resultaten van hoofdstuk 2 en 3 kan er geconcludeerd worden dat de celwand vervorming van zowel de moeder stam als de Δpbp4 mutanten optreedt na hechting aan een oppervlak. Echter, wat de vervorming betekent voor de bacteriën in termen van moleculaire respons in het moduleren van het fenotype van vrij bewegend naar het groeien in een biofilm is niet bekend. In Hoofdstuk 4 hebben we onderzocht wat de invloed is van hechtingskrachten met verschillende biomaterialen op icaA (reguleert productie van EPS matrix componenten) en cidA (geassocieerd met cel lyse en extracellulair DNA productie) gen expressie in S. aureus biofilms. Experimenten werden uitgevoerd met S. aureus ATCC12600 en zijn isogene mutant S. aureus ATCC12600Δpbp4, die niet in staat is om peptidoglycan te crosslinken. Het verwijderen van pbp4 leidde tot meer vervorming van de celwand, terwijl groei, biofilm formatie, hydrofobiciteit van het cel oppervlak en zeta potentialen van de stammen onveranderd bleven. De hechtingskrachten van S. aureus ATCC12600 waren het sterkst op polyethyleen (4.9 ± 0.5 nN), het zwakst op roestvrij staal (1.3 ± 0.2 nN) en hechtingskrachten op polymethylmethacrylaat (3.1 ± 0.7 nN) lagen tussen die waarden in. De productie van poly-N-acetylglucosamine, aanwezigheid van eDNA en expressie van icaA genen daalde met toenemende hechtingskrachten. Er werd echter geen relatie gevonden tussen hechtingskrachten en cidA expressie. De hechtingskrachten van de isogene mutant S. aureus ATCC12600Δpbp4 waren veel zwakker dan die van de moederstam en toonden geen correlatie met de productie van poly-N-acetylglucosamine, aanwezigheid van eDNA of expressie van de icaA en cidA genen. Dit suggereert dat hechtingskrachten
de
productie
van
matrix
moleculen,
poly-N-acetylglucosamine,
aanwezigheid van eDNA en icaA gen expressie moduleren door het induceren van vervorming van de celwand, waarbij waarneming van de hechtingskrachten
door
gecrosslinkte peptidoglycan lagen een grote rol speelt. Hechting van bacteriën aan biomaterialen en de daarmee geassocieerde gevoeligheid voor antibiotica is een belangrijke bedreiging voor de medische gemeenschap. Bacteriën vormen niet alleen biofilms, maar ze worden ook tot 1000 keer meer resistent voor antibiotica wanneer ze als biofilm groeien. Om het mechanisme dat deze sterke resistentie veroorzaakt te onthullen, hebben we in Hoofdstuk 5 de regulatie van een recent ontdekt 2componenten systeem bestaande uit een met nisine geassocieerde gevoeligheidsrespons regulator (NsaRS) en de bijbehorende transporter NsaAB in S. aureus onderzocht in de aanwezigheid van chemische en mechanische stress. NsaRS is belangrijk voor hechting, biofilm formatie en resistentie tegen chemische factoren in S. aureus. Het bestaat uit een in
142
Nederlandse Samenvatting het membraam gelegen sensor NasS en een in het cytoplasma voorkomende respons regulator NsaR, welke geactiveerd wordt wanneer het een fosfaat groep ontvangt van de NsaS sensor. De aanwezigheid van de NsaS sensor in het membraam leidt tot onze hypothese die stelt dat het NsaRS systeem niet alleen chemische, maar ook mechanische stress kan waarnemen om zo de antibiotica resistentie via de NsaAB efflux pomp te moduleren. Om deze hypothese te verifiëren vergeleken we de expressie van de NsaS sensor en de NsaA efflux pomp in S. aureus SH1000 in de hechtende (“mechanische stress”) en de planktonische toestand, terwijl de aanwezigheid van nisine werd gebruikt als chemische stress. NsaS en NsaA expressie door S. aureus SH1000 was verhoogd onder mechanische stress, in de gehechte toestand. Chemische stress verhoogde de gen expressie van NsaS en NsaR ook. Gen expressie was het hoogst wanneer de bacteriën een combinatie van chemische stress en een sterke mechanische stress ondergingen, in de huidige studie gekwantificeerd als de hechtingskrachten die ontstaan door een substraat oppervlak en gemeten met behulp van AFM. Dit bevestigd onze hypothese dat het NsaRS systeem zowel chemische als mechanische stress kan waarnemen. In Hoofdstuk 6 hebben we de verschillen besproken tussen het gebruik van AFM en SEF in het kwantificeren van celwand vervorming. Daarnaast bespreken we ook de moleculaire basis voor het waarnemen van oppervlakken in S. aureus in vergelijking met andere bacteriën en eukaryote cellen. Tenslotte, met de resultaten van dit proefschrift, bevelen we toekomstige studies aan om de rol van mechanische sensoren bij antibiotica gevoeligheid te onderzoeken.
143
144
