________________________________________Nederlandse samenvatting Nederlandse samenvatting Cannabis Sativa wordt door de mensheid al duizenden jaren gebruikt, zowel voor de fabricage van weefmaterialen als voor geneeskundige doeleinden. In de Chinese traditionele geneeskunst werd het toegepast als remedie voor diverse ziekten, waaronder astma. Dit feit en andere anecdotische waarnemingen suggereren dat (endo)cannabinoïden een belangrijke rol zouden kunnen spelen en therapeutische mogelijkheden bieden. De identificatie van de eerste van cannabis afgeleide verbindingen en van de belangrijkste
psychoactieve
component
(Δ9-tetrahydrocannabinol,
Δ9-THC,
dronabinol) in de jaren ’60 hernieuwde de interesse in de effecten en de werking van cannabis, voornamelijk vanwege het gebruik als verslavend middel. Kort daarop breidde de interesse zich uit naar de medische toepassingsmogelijkheden van het middel. De afgelopen jaren leidde de ontdekking van twee cannabisreceptoren (CB1- en CB2-receptor) en de identificatie van endogene B
cannabinoïden, die op deze receptoren aangrijpen, tot de gedachte dat cannabinoïden een veel grotere rol zouden kunnen spelen dan eerder vermoed. Van beide receptoren werd aangetoond dat ze primair aan Gi/o-eiwitten koppelen en dat ze PLC- en MAPK-signaaltransductie routes activeren. Daarnaast bleek dat de CB1-receptor ook aan Gs kan koppelen. De diversiteit van effecten die cannabinoïden op intacte organismen kunnen hebben maakt het onderzoek hiervan complex. Daarom werden in het onderhavige promotieonderzoek de effecten van endocannabinoïden en afgeleide synthetische verbindingen op gekweekte cellen onderzocht. In de luchtwegen zijn gladde spiercellen en epitheelcellen de belangrijke structurele cellen. De diameter van de luchtweg wordt in zeer belangrijke mate door de gladde spiertonus en de dikte van de epitheellaag bepaald. Daarnaast zijn epitheelcellen een belangrijke bron van cytokines en chemokines, alsmede van bronchusverwijdend stikstofmonoxide. Om deze redenen richtte het onderzoek zich op deze celtypen. In verschillende typen cellen typen zijn eerder cannabinoïd-geïnduceerde veranderingen van de intracellulaire Ca2+-concentratie ([Ca2+]i), via CB1receptoren, beschreven. In hoofdstuk 2 werd daarom getracht om de Ca2+-influx mechanismen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de CB1-receptor
129
________________________________________Nederlandse samenvatting geïnduceerde toename in de [Ca2+]i, zoals eerder gerapporteerd in de gladde spiercellijn DDT1 MF2, na stimulatie met het synthetische cannabinoïd CP55,940. Het eerdere onderzoek in deze cellen had al laten zien dat het fytocannabinoïd Δ9-THC een toename in [Ca2+]i veroorzaakte, waarschijnlijk door activatie van CB1-receptoren. Tevens was aangetoond dat het synthetische cannabinoïd CP55,940 een kortstondige naar buiten gerichte ion-stroom veroorzaakte, gemeten middels de patch-clamp-techniek, die niet optrad in een Ca2+-vrije bufferoplossing, wat suggereerde dat deze door Ca2+-influx veroorzaakt werd. De door CP55,940-geinduceerde Ca2+-respons bleek ook gedeeltelijk afhankelijk te zijn van afgifte uit thapsigargine-gevoelige intracellulaire Ca2+-opslagplaatsen, wat wijst op de betrokkenheid van een ‘capacitive calcium entry’ (CCE) mechanisme. Wij vonden dat de door CP55,940 veroorzaakte kortstondige naar buitengerichte stroom zeer vergelijkbaar was met die van histamine, dat Ca2+ vrijzet uit InsP3gevoelige opslagplaatsen en vervolgens CCE induceert. CP55,940 verhoogde concentratie-afhankelijk de [Ca2+]i in DDT1 MF2 cellen, wat werd voorkomen door extracellulair Ca2+ te verwijderen. Toediening van de InsP3- antagonist 2-APB, bij een concentratie die de histamine-afhankelijke stroom remde, had echter geen effect op de CP55,940-afhankelijke celuitwaartsgerichte stroom, wat suggereert dat de door CP55,940-geïnduceerde toename in [Ca2+]i onafhankelijk is van InsP3-gevoelige opslagplaatsen. Ook een andere CCE remmer, SKF 96365, had geen effect op de CP55,940-afhankelijke stroom. Recent is een ‘non capacitive calcium entry’ (NCCE) route beschreven, via welke second messengers als arachidonzuur, Ca2+-influx kunnen veroorzaken. In DDT1 MF2
cellen
verhoogt
arachidonzuur
concentratie-afhankelijk
de
[Ca2+]i.
Voorbehandeling van de cellen met arachidonzuur remde de CP55,940afhankelijke stroom en deze door CP55,940-geïnduceerde stroom was niet afhankelijk van arachidonzuur metabolieten, zoals remmers van cycloxygenase en 5-lipoxygenase routes lieten zien. Aangetoond werd dat arachidonzuur wordt afgegeven als gevolg van CB1-receptor activatie door CP55,940. Deze afgifte was concentratie-afhankelijk en werd volledig geremd door de CB1-antagonist SR141617A, de fosfolipase A2 (PLA2) remmer quinacrine en de MAPK remmer PD98059, wat aangeeft dat arachidonzuur wordt geproduceerd als gevolg van CB1-receptor-, fosfolipase A2- en MAP kinase-activering.
130
________________________________________Nederlandse samenvatting De niet-selectieve Ca2+-antagonisten La3+ en Gd3+ remden de CP55,940afhankelijke celuitwaarts gerichte stroom in concentraties die geen effect hadden op de thapsigargine-afhankelijke CCE. La3+ remde ook de arachidonzuurafhankelijke naar buitengerichte stroom volledig, wat dus betekent dat de arachidonzuur productie het gevolg is van Ca2+-instroom. Quinacrine remde eveneens de CP55,940-geïnduceerde stroom, wat ook PLA2 stroomafwaarts van de Ca2+ instroom plaatst. De conclusie van dit hoofdstuk is dat in DDT1 MF2 gladde spiercellen arachidonzuur een belangrijke second messenger van de CB1-receptor is, die NCCE en op zijn beurt het gevolg is van MAP kinase-geactiveerd cPLA2. In hoofdstuk 3 werd getracht om de Ca2+-signaaltransductie route(s) in humane bronchiale epitheelcellen (16HBE14o-) te identificeren die geactiveerd werd(en) na toediening van het fytocannabinoïd Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), het synthetisch cannabinoïd CP55,940 en het endocannabinoïd virodhamine, leidend tot veranderingen in [Ca2+]i. Gevonden werd dat alle drie cannabinoïden [Ca2+]i deden toenemen in 16HBE14o- cellen. Het fytocannabinoïd Δ9-THC bleek Ca2+ te mobiliseren uit de interne opslagplaatsen en vervolgens Ca2+-instroom uit de extracellulaire ruimte te induceren, wat een CCE-mechanisme suggereert. De niet-selectieve agonist CP55,940 induceerde ook Ca2+-influx uit de extracellulaire ruimte, maar veel minder dan Δ9-THC. Deze Ca2+-influx werd geremd door Ni2+, wat de betrokkenheid van een CCE mechanisme aangeeft, mogelijk via het transient receptor potential (TRP) kanaal TRPC1. Het endocannabinoïd virodhamine induceerde Ca2+-instroom via twee verschillende routes. Bij concentraties beneden 30 µM waren de responsen vergelijkbaar met CP55,940. Bij hogere concentraties virodhamine werd echter een robuuste toename in Ca2+-instroom gevonden. Voor deze responsen waren aanzienlijk hogere virodhamine concentraties nodig dan voor de CB2-receptor gemedieerde remming van de cAMP productie (hoofdstuk 4), wat, in combinatie met de steile Ca2+-respons waargenomen bij 100 µM virodhamine, de opening van een CB-receptoronafhankelijk kanaal suggereert. Dit idee werd ondersteund door de waarneming dat zowel de CB1-receptor antagonist SR141617A als de CB2-receptor antagonist SR144528 de Ca2+-influx eerder lieten toenemen dan afnemen.
131
________________________________________Nederlandse samenvatting Recent is van endogene cannabinoïden aangetoond dat deze hun effecten deels uitoefenen via opening van specifieke en aspecifieke ionkanalen, zoals de kanalen van de TRP familie. We vonden dat de 16HBE14o- cellen inderdaad een verscheidenheid aan TRP kanalen tot expressie brengen. De Ca2+-influx, waargenomen na 30 µM virodhamine, werd gedeeltelijk geremd door de TRPV1 remmer capsazepine, maar bij lagere virodhamine concentraties werden geen effecten van deze remmer gevonden. De TRPV1/TRPV4-remmer ruthenium rood verminderde de Ca2+-influx ook gedeeltelijk, terwijl de CCE-remmer Ni2+ geen effect had. De aanwezigheid van deze kanalen in 16HBE14o- cellen werd aannemelijk gemaakt door de detectie van zowel TRPV1 als TRPV4 mRNA. TRPC6 is waarschijnlijk ook betrokken bij de Ca2+-instroom aangezien dit kanaal NCCE medieert en zeer gevoelig is voor lage concentratie Gd3+ en La3+ - wat overeenkomt met onze resultaten. In overeenstemming hiermee bleek dat ook TRPC6 mRNA in deze cellen tot expressie werd gebracht. Aangezien arachidonzuur de NCCE in DDT1 MF2 cellen induceert (hoofdstuk 2), werden ook de effecten van virodhamine op de arachidonzuur-afgifte in epitheelcellen onderzocht. Virodhamine veroorzaakt inderdaad arachidonzuurafgifte door deze cellen, maar, in tegenstelling tot de gladde spiercellen, werd dit effect niet gemedieerd door de CB1- of de CB2-receptor. De bron van het arachidonzuur bleef ook onduidelijk, aangezien de fosfolipase A2-remmer quinacrine de arachidonzuur-afgifte slechts ten dele remde. Samengevat laten de resultaten in dit hoofdstuk zien dat de cannabinoïden Δ9-THC, CP55,940 en virodhamine verschillende mechanismen gebruiken om de intracellulaire [Ca2+] in bronchiale epitheelcellen te verhogen. Δ9-THC, CP55,940 en lage concentraties virodhamine verhogen [Ca2+]i via mobilisatie, gevolg door CCE, terwijl hogere concentraties virodhamine [Ca2+]i verhogen via een NCCE-afhankelijke route. Een belangrijke door cannabinoïd-receptoren gebruikte signaaltransductie-route is de modulatie van adenylyl cyclase. Zowel de CB1-receptor als de CB2-receptor zijn eerder geclassificeerd als pertussis toxine (PTX) gevoelig en koppelen aan Gi/o-eiwitten. In sommige systemen is echter aangetoond dat cannabinoïden cAMP verhogen door koppeling aan Gs. Om de rol van deze transductieroutes in de epitheelcellen te ontrafelen onderzochten we in hoofdstuk 4 de effecten van het endocannabinoïd virodhamine en het synthetisch cannabinoïd CP55,940 op de forskoline-geïnduceerde cAMP accumulatie in 16HBE14o- cellen.
132
________________________________________Nederlandse samenvatting We vonden dat in deze cellijn beide cannabinoïdreceptoren tot expressie worden gebracht zowel op het niveau van mRNA als van eiwit. Virodhamine en CP55,940 remden de forskoline-geïnduceerde cAMP accumulatie, hoewel, tegen de verwachting in, het effect van CP55,940 minder sterk was dan van virodhamine. De remmende responsen werden gemedieerd door de CB2-receptor aangezien ze geantagoneerd konden worden door de selectieve CB2-receptor antagonist SR144528. Omdat de remming PTX gevoelig was, zijn Gi/o-eiwitten betrokken. Opmerkelijk was dat na behandeling met PTX een stimulerende component tevoorschijn kwam bij hogere concentraties agonist. Dit laatste effect werd verzorgd door CB1-receptoren aangezien het voorkomen kon worden met de selectieve CB1-receptor antagonist SR141617A en verloopt zeer waarschijnlijk via koppeling van de receptor aan Gs. Het pro-inflammatoire cytokine IL-8 is een belangrijke chemoattractant van neutrofielen en is betrokken in de pathofysiologie van chronic obstructive pulmonary disease (COPD) en ernstig astma. Eerder was aangetoond dat, in humane colonepitheel cellen, de specifieke cannabinoïd agonist WIN55212-2 de tumor necrosis factor- α (TNF-α) geïnduceerde afgifte van IL-8 remt. Daarom besloten we de effecten van de cannabinoïden op de TNF-α geïnduceerde IL-8 afgifte door humane bronchiale epitheelcellen 16HBE14o- te onderzoeken. Gevonden werd dat virodhamine en CP55,940 de TNF-α geïnduceerde IL-8 afgifte remden in concentraties vergelijkbaar met de concentraties van de CB2receptor gemedieerde remming van adenylyl cyclase. In overeenstemming hiermee bleek dat de remming van de IL-8 productie niet beïnvloed werd door selectieve blokkade met de CB1-receptor antagonist SR141617A, wat aangeeft dat de remming van de IL-8 afgifte door CB2-receptoren verzorgd werd. De selectieve CB2-receptor antagonist kon niet worden gebruikt aangezien deze verbinding zelf de TNF-α geïnduceerde afgifte van IL-8 uit 16HBE14o_ cellen remde via een tot dusver onbekend mechanisme. De duale effecten van virodhamine en CP55,940, zoals beschreven in dit hoofdstuk, tonen de complexe rol van cannabinoïden en hun receptoren aan in de modulatie van adenylyl cyclase en IL-8 productie. De resultaten suggeren ook dat het endocannabinoïd virodhamine, via stimulatie van CB2-receptoren, antiinflammatoire eigenschappen kan hebben door remming van cytokine afgifte uit het epitheel.
133
________________________________________Nederlandse samenvatting Cannabinoïden lijken duale effecten te hebben op vitaliteit en overleving van cellen. In sommige studies is gerapporteerd dat ze necrose en apoptose induceren en in andere gevallen beschermen ze juist tegen apoptotische stimuli, waaronder oxidatieve stress. Regulatie van cellulair Ca2+, al of niet in samenspel met cAMP, is de belangrijkste factor in de controle van celoverleving. In hoofdstuk 5 hebben we gepoogd de mechanismen te onderzoeken via welke overleving
van
humane
bronchiale
(16HBE14o-)
epitheelcellen
door
(endo)cannnabinoiden kon worden gemoduleerd. De exacte mechanismen zijn verre van duidelijk maar mitogen-activated protein kinases (MAPKs) kunnen betrokken zijn aangezien bekend is dat MAPK routes door cannabinoïden gemoduleerd kunnen worden. We vonden dat hogere concentraties virodhamine (boven 30 µM) de levensvatbaarheid
en
de
overleving
van
de
cellen,
concentratie-
en
tijdsafhankelijk verlaagden; lagere concentratie hadden geen effect. Deze afname van de cellulaire overleving was niet afhankelijk van de koppeling van CB receptoren
aan
Gi/o-eiwitten
aangezien
voorbehandeling
met
PTX
de
virodhamine-afhankelijke afname van de celoverleving niet duidelijk veranderde. De toegepaste concentraties induceerden een Ca2+-overbelading in 16HBE14ocellen op een concentratie- en tijdsafhankelijke wijze, wat aangeeft dat cellulaire overbelading mogelijk verantwoordelijk is voor het effect op cellulaire overleving. Hoewel selectieve antagonisten van de CB1- en de CB2-receptoren geen effect hadden op de virodhamine-geïnduceerde Ca2+-veranderingen (hoofdstuk 3) waren we geïnteresseerd in de rol van de endogene expressie van de CB1receptor en CB2-receptor. Dempen van CB1-receptor of CB2-receptor expressie door gebruik te maken van small interference RNA (siRNA), had geen grote effecten op de virodhamine-geïnduceerde Ca2+ responsen of de remming van het adenylyl cyclase, wat aangeeft dat deze effecten van virodhamine minder belangrijk zijn voor de overleving van 16HBE14o- cellen. Deze resultaten komen overeen met de bevindingen uit hoofdstuk 3, waar aangetoond was dat de sterke intracellulaire
Ca2+
toename,
geïnduceerd
door
hogere
concentraties
virodhamine, gemedieerd wordt door een non-CB1-receptor, non-CB2-receptor afhankelijk mechanisme. Interessant is echter dat vermindering van de expressie van de CB1- en de CB2receptoren tegenovergestelde effecten had op de virodhamine-geïnduceerde afname van de celoverleving. Vermindering van de expressie van de CB1-
134
________________________________________Nederlandse samenvatting receptor verlaagde de overleving van de cellen na virodhamine-incubatie, terwijl verlaging van de expressie van CB2-receptor het tegenovergestelde effect had. Aangezien algemeen wordt aangenomen dat leden van de MAP-kinase familie, zoals ERK1/2, betrokken zijn bij de controle van cellulaire overleving, onderzochten
we
ook
ERK1/2
responsen
in
16HBE14o-
cellen.
In
overeenstemming met eerdere studies die suggeerden dat purinerge receptoren de celoverleving moduleren via ERK1/2, vonden we dat toediening van ATP de fosforylering van ERK1/2 sterk verhoogde. Virodhamine alleen, onder basale condities, induceerde geen ERK1/2 fosforylering. Virodhamine remde echter de ATP-geïnduceerde ERK1/2 fosforylering volledig. Verlaging van de expressie van de twee receptoren had tegengestelde effecten op de ERK1/2 responsen. Verminderde expressie van de CB1-receptor hief ERK1/2 fosforylering door alle stimuli op, terwijl demping van de expressie van de CB2-receptor een lichte stimulatie van de ERK1/2 fosforylering door virodhamine liet zien, die niet echt veranderde in aanwezigheid van ATP. Deze resultaten komen overeen met de effecten van virodhamine op de celoverleving, zoals boven beschreven. Samengevat suggeren de resultaten dat regulatie van de overleving van bronchiale epitheelcellen door virodhamine onafhankelijk is van specifieke, CB1receptor en CB2-receptor geïnduceerde veranderingen in cAMP en [Ca2+]i. De tegengestelde effecten van verlaging van de CB1-receptor en de CB2-receptor expressie laten echter wel zien dat CB1- en CB2-receptoren de virodhamine geïnduceerde vermindering van de cellulaire overleving op reciproke wijze moduleren, effecten die ook gezien worden op het niveau van ERK1/2 activering.
135
________________________________________Nederlandse samenvatting De belangrijkste conclusies van dit proefschrift zijn de volgende: •
Het synthetisch cannabinoïd CP55,940 verhoogt in gladde spiercellen de intracellulaire Ca2+-concentratie ([Ca2+]i) via een CB1-receptor-afhankelijke route, die wordt gemedieerd door arachidonzuur dat ‘non-capacitive calcium entry’ (NCCE) veroorzaakt. Metabolieten van arachidonzuur, gegenereerd door cyclo-oxygenase en 5-lipoxygenase, spelen hierbij geen rol. De CP55,940-geinduceerde arachidonzuur productie wordt verzorgd door fosfolipase A2 (cPLA2) en hangt waarschijnlijk samen met de activatie van MAP kinase.
•
De cannabinoïden Δ9-THC, CP55,940 en (lage concentraties) virodhamine verhogen in humane bronchiale epitheelcellen [Ca2+], via mobilisatie uit interne opslagplaatsen en daaropvolgende ‘capacitive calcium entry’ (CCE).
•
Hogere concentraties virodhamine verhogen [Ca2+]i in deze epitheelcellen via
non-CB1-receptor,
non-CB2-receptor
afhankelijke
NCCE,
waar
waarschijnlijk de ionkanalen TRPV1, TRPV4 en TRPC6 bij betrokken zijn. •
CB1- en CB2-receptoren moduleren op verschillende wijze adenylyl cyclase in deze epitheelcellen. Virodhamine en CP55,940 remmen voornamelijk de cAMP accumulatie via CB2-receptoren gekoppeld aan Gi/o-eiwitten. Na voorbehandeling met pertussis toxine kwam een Gsafhankelijke activatie tevoorschijn, die de cAMP productie verhoogt via activatie van CB1-receptoren.
•
Activatie van de inhiberende CB2-receptoren remde cAMP accumulatie en interleukine-8 (IL-8) afgifte bij dezelfde cannabinoïd-concentraties.
•
Cellulaire overleving van bronchiale epitheelcellen wordt verlaagd door virodhamine, onafhankelijk van CB1-receptor en CB2-receptor afhankelijke veranderingen in cAMP en [Ca2+]i
•
CB1- en CB2-receptoren moduleren de door virodhamine geïnduceerde afname van de overleving van bronchiale epitheelcellen op tegengestelde wijze; deze reciproke effecten worden ook gezien op het niveau van ERK1/2 activatie.
136
