Nederlandse samenvatting
Onderzoek heeft aangetoond dat er een omgekeerde relatie is tussen het voorkomen van autoimmuunziekten en de incidentie van infecties met parasitaire wormen, ook wel helminthen genoemd. Op basis hiervan is de hypothese opgesteld dat infectie met helminthen ons afweersysteem beïnvloedt, en daardoor een belangrijke rol speelt in het verhinderen van autoimmuun ziekten zoals inflammatoire darmziekten (IBD) en multiple sclerose (MS). Helminthen hebben zich miljoenen jaren ontwikkeld om optimaal in hun gastheer te kunnen overleven. Om goed te kunnen koloniseren moet de helminth het immuunsysteem van zijn gastheer onderdrukken. Het lijkt erop dat de miljoenen jaren van co-evolutie van helminth en gastheer ervoor heeft gezorgd dat het immuunsysteem van de gastheer zich heeft aangepast aan de aanwezigheid van de parasitaire wormen. Het ontbreken van helminthen in de gastheer kan daardoor leiden tot een overactieve immuunreactie. Deze “hygiëne-hypothese” vormt de basis voor klinische studies, waarbij onderzocht wordt of toediening van eieren van de parasitaire varkensworm Trichuris suis aan IBD en MS patiënten een therapeutisch effect heeft. 1.1 Inflammatoire darmziekten (IBD) Inflammatoire darmziekten, ook wel “inflammatory bowel disease” (IBD) genoemd, zijn een groep chronische ziekten van het maag-darm stelsel. De meest voorkomende ziektes binnen IBD zijn de ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC), die aparte ziektebeelden hebben. Bij CD zijn er losse plekken met ontsteking door het hele maag-darmkanaal, waarbij de ontstekingen tot diep in het omliggende weefsel kunnen doordringen. Bij UC tast de ontsteking alleen de oppervlakkige darmlagen aan, en vormt één grote zweer onderaan de dikke darm. Ook is de onderliggende immuunreactie in de twee ziektes zeer verschillend. Bij UC treedt een zogenoemde T helper 2 (Th2) cel reactie op, die zorgt voor een minder destructieve immuunreactie dan de T helper 1 (Th1) cel reactie die optreedt bij CD. Het ontstaan van een sterke Th1 reactie gaat vaak samen met hoge productie van ontstekingsstoffen, cytokines genoemd, waaronder interleukine 12 (IL-12), interferon gamma (IFN-γ) en tumor necrose factor alfa (TNFα). De oorzaak van het ontstaan van IBD is nog niet helemaal duidelijk. Er zijn zo’n 160 genvarianten bekend binnen het menselijk genoom die zorgen voor een hogere kans op het ontwikkelen van IBD. Veel van deze genen hebben betrekking op het immuunsysteem en de herkenning van normale darmbacteriën. Echter, niet alle mensen met deze genvarianten ontwikkelen IBD, wat betekent dat ook omgevingsfactoren een belangrijke rol spelen in de ontwikkeling van IBD. Er zijn studies gedaan die aanduiden dat een overactieve immuunreactie op de normaal aanwezige darmbacteriën een van de hoofdredenen zou kunnen zijn voor het ontstaan van ontstekingen in IBD. 1.2 Multiple sclerose (MS) MS is een chronische ontstekingsziekte van het centraal zenuwstelsel, waarbij het myeline rond de zenuwen wordt aangevallen door overactieve immuuncellen wat leidt tot verminderde hoeveelheden myeline en de vorming van littekenweefsel. Hierdoor gaat de functie van de axonen (zenuwuitlopers) achteruit, wat uiteindelijk ziekte tot resultaat heeft. Hoewel de precieze oorzaak van MS nog onbekend is, is het wel duidelijk dat verschillende typen imuunccellen van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem een rol spelen in de ziekte. Zo lijken Th1 en Th17 celtypen een belangrijke rol te spelen in de opgewekte immuunreactie. De T cellen worden aangestuurd door cellen die antigeen presenteren, voornamelijk dendritische
cellen (DCs) en macrofagen. Voor beide celtypen is een rol beschreven in het ontstaan van MS en vooral het type macrofagen dat aanwezig is in de hersenen is doorslaggevend. Het is aangetoond dat M1 macrofagen een rol kunnen spelen in de afbraak van myeline, terwijl M2 macrofagen kunnen zorgen voor neuronale regeneratie. 2. Helminthen Helminthen zijn parasitaire wormen die onderverdeeld worden in twee groepen: nematoden, ook wel rondwormen genoemd, en platyhelminthes, ofwel platwormen. Helminthen kunnen, afhankelijk van de soort, mensen en dieren infecteren na contact met worm-geïnfecteerde grond, voeding of water. Verhoogde hygiëne heeft ervoor gezorgd dat mensen tegenwoordig minder blootgesteld worden aan helminthen. Wormen scheiden stoffen uit die erg lijken op factoren binnen het immuunsysteem van de gastheer en er wordt gedacht dat ze een belangrijke rol spelen in het reguleren van de darmflora. Het missen van helminth infecties kan in mensen daardoor leiden tot het ontwikkelen van ziektes zoals IBD. Het is bekend dat helminthen Th2 en regulatoire T cel (Treg) immuunreacties opwekken, terwijl veel autoimmuun ziektes, waaronder CD en MS geassocieerd zijn met Th1 reacties. Schistosoma mansoni is een platworm en is een menselijke parasiet die gevonden wordt in de bloedvaten (Figuur 1). De levenscyclus van de worm bestaat uit twee gastheren. Eieren met daarin ontwikkelende miracidia worden uitgescheiden in de feces en komen in het water terecht. Daar komen de miracidia vrij en infecteren slakken (tijdelijke gastheer). In de slak worden cercariae geproduceerd, welke in het water terecht komen. Wanneer mensen in aanraking komen met geïnfecteerd water doorboren cercariae snel de huid, worden schistosomulae en migreren naar de bloedvaten waar ze zich voeden met bloed. In de mens produceren de wormen nieuwe eieren die via de darm worden uitgescheiden. Trichuris suis is een rondworm, met het varken als natuurlijke gastheer. Geïnfecteerde varkens scheiden niet-infectieuze eieren uit. In ongeveer een maand groeien deze uit tot infectieuze L1 larven, die als ze ingeslikt worden in de slijmlaag (mucosa) van de darm uitgroeien via L2, L3 en L4 naar volwassen L5 wormen die eieren produceren. In mensen zorgt infectie met T. suis niet voor ziekte, maar overleven de wormen slechts enkele weken voor ze verdwijnen uit het lichaam. Deze eigenschap maakt T. suis eieren zeer geschikt voor gebruik in helminth therapieën. Trichinella spiralis is een rondworm die een aantal gastheren kan infecteren, waaronder rat, varken en mens met een complete levenscyclus die binnen één gastheer plaatsvindt. Infecties bij mensen worden bijna altijd veroorzaakt door het eten van geïnfecteerd vlees van varkens of andere dieren. Wanneer het vlees wordt gegeten dan komen de larven uit hun capsules in het vlees en migreren naar de darm van de nieuwe gastheer. Daar verblijven zij in de mucosa, waar ze uitgroeien en reproduceren. 3. Helminthen in de behandeling van auto-immuun ziekten Er is onderzoek gedaan naar de effecten van helminth infectie op het immuunsysteem met diverse worm soorten in verschillende diermodellen en in een aantal klinische studies. In verschillende diermodellen voor colitis in zowel ratten als muizen is aangetoond dat infectie met S. mansoni zorgt voor de inductie van Th2 en Treg immuunreacties, en vermindering van colitis in deze dieren. Infectie met T. spiralis in muismodellen voor colitis leidde tot vergelijkbare resultaten. In muizen met experimentele auto-immuun encephalomyelitis (EAE), het meest gebruikte modelsysteem voor MS, werd aangetoond dat infectie met S. mansoni leidt tot significante vermindering van de ontsteking in het centraal zenuwstelsel, het ruggenmerg en de hersenen. EAE inductie in ratten die geïnfecteerd waren met T. spiralis zorgde voor een significante verlaging van de ernst in het gehele ziekteverloop van EAE op een dosis afhankelijke manier.
Humane klinische studies met helminthen zijn grotendeels gedaan met eieren van de varkensworm T. suis (TSO). In een eerste kleine studie werd aangetoond dat behandeling met 2.500 TSO elke twee weken gedurende 12 weken ervoor zorgde dat 3 van de 4 patiënten met CD in remissie kwamen. Een tweede studie met 29 CD patiënten, die gedurende 24 weken elke 3 weken met 2.500 TSO behandeld werden, liet zien dat 72% van de patiënten in remissie ging, wat aantoont dat TSO veel CD patiënten minder ziek maakt. In de eerste studie met TSO voor MS werden vier patiënten met secundaire progressieve MS behandeld gedurende 6 maanden (2.500 TSO elke 2 weken). Deze studie liet zien dat er een verandering was in de immuunbalans van de behandelde patiënten. In een andere studie werden nieuw gediagnosticeerde patiënten met relapsing-remitting MS behandeld met TSO gedurende 3 maanden, wat resulteerde in een verlaging van de nieuw gedetecteerde MRI laesies in de hersenen van gemiddeld 6.6 voor de start, tot 2.0 aan het eind van de TSO behandeling. Twee maanden na afloop van de TSO behandeling was het gemiddelde aantal nieuwe laesies gestegen naar 5.8. Dit toont aan dat TSO het verloop van de ziekte significant kon vertragen in de MS patiënten. 4.1 Het intestinale immuunsysteem Wanneer een patiënt behandeld wordt met TSO dan komen de oraal ingenomen eieren in de darm van de patiënt en zal het immuunsysteem hierop reageren. Tussen de darmholte, die voedsel en micro-organismen bevat, en het onderliggende weefsel is een intestinale barrière aanwezig. Deze barrière bestaat uit een enkele laag epitheel cellen (de IECs) en een dikke slijmlaag die voorkomt dat bacteriën en toxines het onderliggende weefsel kunnen binnendringen. Communicatie tussen de IECs en de onderliggende immuun cellen is essentieel voor de regulatie van immuunreacties. Een aantal soorten immuuncellen zijn aanwezig in de onderliggende weefsels, waaronder monocyten, macrofagen en DCs, welke lichaamsvreemde stoffen kunnen presenteren aan T cellen, die vervolgens de immuunreactie op gang brengen. DCs zijn heel belangrijk in het bepalen van het soort immuunreactie dat door T cellen wordt geïnduceerd. Th1 en Th17 immuunreacties induceren ontstekingen, terwijl Th2 cellen een humorale immuunreactie veroorzaken en Treg cellen immuunreacties juist onderdrukken. DCs kunnen veel verschillende immuunreacties induceren doordat ze pathogeen-specifieke moleculen kunnen herkennen via receptoren op hun oppervlak, waaronder de Toll-like receptoren (TLRs, Figuur 2) en C-type lectine receptoren (CLRs, Figuur 3). Afhankelijk van de receptor(en) op de DC die worden geactiveerd, kunnen verschillende immuunreacties geïnduceerd worden door onder andere cytokines uit te scheiden, en de expressie van specifieke moleculen aan het celoppervlak. 4.2 Helminth producten en het immuunsysteem Niet alleen worm infectie, maar ook behandeling met bepaalde worm producten blijken ontstekingreacties te kunnen onderdrukken. Het feit dat helminth producten auto-immuun ziekten kunnen onderdrukken maakt het waarschijnlijk dat deze producten de functie van één of meerdere typen immuuncel kunnen veranderen. Bij helminth therapie komen de wormen in de darmholte in contact met de IECs. Hoofdstuk 2 laat zien dat behandeling van dunne darm IECs met T. suis producten (TsSP) zorgt voor een verlaging van de immuunreactie die opgewekt wordt met het bacterieproduct lipopolysaccharide (LPS), wat bindt aan TLR4. Behandeling met TsSP zorgt ook voor een verlaging van de barrière functie van de cellen, waardoor helminth producten naar het onderliggende weefsel kunnen migreren (Figuur 4). In dit onderliggende weefsel zijn veel immuuncellen te vinden, waaronder DCs en macrofagen. In hoofdstuk 3 en hoofdstuk 5 hebben we laten zien dat de LPS-geïnduceerde immuunreacties van DCs enorm verlaagd worden door toevoeging van TsSP. Dit zorgt voor
lagere niveaus van verschillende cytokines (TNF-α, IL-6, IL-12) en chemokines (CCL2,3 en CXCL9,10). Daarnaast wordt het oppervlakte molecuul OX40 ligand (OX40L) verhoogd op TsSP-behandelde DCs, wat T cellen aanstuurt om richting Th2 of Treg cellen te differentiëren. Experimenten waarbij de behandelde DCs in contact kwamen met T cellen lieten zien dat deze veranderingen er inderdaad voor zorgden dat er meer Th2 cellen kwamen, terwijl er minder Th1 en Th17 cellen waren. Macrofagen kunnen zich vanuit hun voorloper cellen ontwikkelen tot verschillende soorten macrofagen. De klassiek geactiveerde macrofagen (CAM) veroorzaken ontsteking, terwijl de alternatief geactiveerde macrofagen (AAM) zorgen voor meer regulerende eigenschappen. In hoofdstuk 7 hebben we laten zien dat in zowel LPS-gestimuleerde CAM als AAM macrofagen de immuunreactie kon worden onderdrukt door het geven van TsSP. Verder werd de expressie van P2X purinoreceptor in beide typen M2 macrofagen verlaagd na behandeling met TsSP. Verlaging van P2RX7 zorgt voor een verlaging van IL-1β, een cytokine dat ontsteking bevordert. Deze data laten zien dat TsSP ontstekingsreacties kunnen onderdrukken in meerdere immuuncel typen. 4.3 Helminth producten onderdrukken door TLR4 veroorzaakte ontstekingsreacties TLR4, de receptor waar LPS aan bindt, kan zorgen voor sterke immuunreacties en TLR4 blijkt een negatieve rol te spelen in de ontstekingsreacties in UC en MS. De resultaten uit hoofdstuk 3 en hoofdstuk 7 laten zien dat helminth producten sterke onderdrukkende effecten hebben op TLR4-geïnduceerde ontstekingen. Daarnaast laten we in hoofdstuk 4 zien dat DCs gestimuleerd met producten afkomstig van S. mansoni eieren (SEA) TLR4-geïnduceerde ontstekingsreacties kunnen verlagen door de vermindering van cytokine productie en T cel activatie. De negatieve regulatoren Suppressor of Cytokine Signaling 1 (SOCS1) en SH2-containing protein tyrosine phosphatase 1 (SHP1) worden geïnduceerd in SEA-behandelde DCs. Het aanzetten van deze negatieve regulatoren, die TLR4 reacties kunnen onderdrukken, kan een mechanisme zijn die S. mansoni wormen gebruiken om ontstekingsreacties te onderdrukken. Hoofdstuk 6 laat zien hoe TLR4-afhankelijke ontsteking wordt onderdrukt door TsSP. Na interactie van LPS met TLR4 volgt er een lange signaleringsroute die resulteert in onder andere de productie van cytokines en verandering van de expressie van oppervlakte moleculen. Toevoeging van TsSP zorgt voor verlaagde aanwezigheid van vele moleculen in de TLR4 signaleringsroute, ook al in het begin van de signaleringsroute, wat aantoont dat TsSP direct invloed zouden kunnen hebben op TLR4. Als er minder TLR4 op het oppervlak aanwezig is dat signaleert zullen er ook minder moleculen van de signaleringsroute aanwezig zijn. We tonen aan dat TsSP zorgen voor een verhoging van Rab7b in DCs, terwijl de hoeveelheid TLR4 op het oppervlak verminderde. Mogelijk leidt het verhogen van Rab7b tot een verlaging van TLR4 op het oppervlak, en de daarop volgende signalering. Dit zou een belangrijk mechanisme kunnen zijn waarmee T. suis wormen ontstekingen remmen. 5. Helminth glycanen De uitgescheiden producten van wormen, welke ontstekingsreacties kunnen onderdrukken bestaan voornamelijk uit (glyco)proteïnen en (glyco)lipiden. Er wordt gedacht dat vooral de glycanen (suikerketens) op deze moleculen, die in alle stadia van helminth ontwikkeling aanwezig zijn, een belangrijke rol spelen in het onderdrukken van het immuunsysteem van de gastheer. Glycanen vormen een belangrijke groep macromoleculen die in alle levende organismen voorkomen. Het zijn suikerketens (oligosacchariden), welke verbonden zijn aan eiwit via bv. een N-glycoside of een O-glycoside binding, of aan lipiden. Zowel N- als O-gebonden glyanen en glycolipiden zijn in alle helminthen te vinden en lijken een cruciale rol te spelen in
het bepalen van het type immuunreactie dat wordt geïnduceerd na contact met helminthen of hun producten. Helminthen brengen glycanen tot expressie die lijken op die van de mens, maar daarnaast hebben ze ook typische glycanen die niet in de mens voorkomen. In S. mansoni eieren zijn onder anderen de glycoproteïnen omega-1, IPSE/α-1 en kappa-5 aanwezig waarvan de aanwezige glycanen verschillen. Omega-1 en IPSE/α-1, die beiden een rol spelen in het ontstaan van Th2 immuunreacties, bevatten allebei Lewis X (LeX) glycaan structuren, terwijl kappa-5, die geen bekende rol heeft in het moduleren van immuunreacties van de gastheer, deze glycaanstructuur niet bevat. Over glycaan structuren in T. suis was nog weinig bekend, maar in hoofdstuk 5 van dit proefschrift staat beschreven dat TsSP vooral de glycaan eindstructuren α-gebonden Nacetylgalactosamine (α-GalNAc) en oligomannose bevat, die kunnen binden aan verschillende receptoren binnen het menselijk immuunsysteem. 5.3 Helminth producten/componenten in de behandeling van auto-immuun ziekten Hoewel er nog geen klinische studies zijn gedaan die de effecten van helminth producten in auto-immuun ziekten beschrijven zijn er wel een heel aantal proeven gedaan in verschillende diermodellen. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat de oplosbare producten van S. mansoni wormen de ontsteking in TNBS colitis verminderen. Daarentegen onderdrukte S. mansoni SEA geen DSS colitis, terwijl S. mansoni cercariae dat wel deden. Behandeling met recombinant T. spiralis glycoproteïne (rTsP53), een product dat veel aanwezig is in de uitgescheiden producten van T. spiralis, vermindert de hevigheid van TNBS colitis. Hoofdstuk 3 van dit proefschrift laat zien dat ziekteverschijnselen in EAE, het meest voorkomende diermodel voor MS, significant verminderd worden in muizen die blootgesteld zijn aan oplosbare wormproducten van ofwel T. suis, ofwel T. spiralis. Deze data impliceren dat infectie met levende wormen wellicht niet altijd nodig is in de behandeling van autoimmuun ziekten. 5.4 Rol van helminth glycanen in immuunreacties De rol die helminth glycanen spelen in het menselijk immuunsysteem is nog niet geheel bekend. Het is beschreven dat meta-perjodaat behandeling, waardoor glycanen worden beschadigd, ervoor zorgt dat S. mansoni producten vrijwel geen Th2 immuunreacties meer kunnen veroorzaken. In hoofdstuk 4 laten wij zien dat S. mansoni SEA, behandeld met perjodaat geen cytokine productie kan onderdrukken in DCs, en dat OX40L niet verhoogd wordt. Hoofdstuk 5 laat vergelijkbare resultaten zien voor perjodaat behandeld TsSP. Daarnaast laten we in hoofdstuk 2 zien dat perjodaat behandeld TsSP ook in IECs de productie van cytokines en chemokines niet kunnen onderdrukken en geen invloed hebben op de barrière functie van IECs. Hieruit blijkt dat glycanen een belangrijke rol spelen bij de onderdrukking van ontstekingsreacties, mogelijk via interactie met glycaan-bindende receptoren zoals CLRs. CLRs zijn receptoren die glycaan-bevattende producten kunnen opnemen in de cel. Van een aantal CLRs is ook bekend dat zij intracellulaire signaleringsroutes aan kunnen zetten waardoor de TLR signaleringsroutes gestimuleerd dan wel geremd kunnen worden. Zo is bijvoorbeeld van de CLRs DC-specific ICAM3-grabbing non-integrin (DC-SIGN) en macrofaag galactose lectine (MGL) bekend dat zij kunnen signaleren. Voor de mannose receptor (MR) is geen direct bewijs dat de receptor kan signaleren, maar ligatie van de receptor kan wel leiden tot intracellulaire signalering. In hoofdstuk 4 staat beschreven dat S. mansoni SEA de negatieve regulatoren SOCS1 en SHP1 op een glycaan-afhankelijke manier aanzet. Wanneer binding van SEA aan de MR wordt geblokkeerd dan worden deze negatieve regulatoren ook niet gesynthetiseerd, wat
aanduidt dat de MR een rol speelt in het “aanzetten” van SOCS1 en SHP1. De MR zou dit effect kunnen hebben ofwel door directe signalering, ofwel door opname van de producten, waarna de S. mansoni producten in contact komen met een intracellulaire receptor die zorgt voor inductie van SOCS1 en SHP1. 6. Tot slot Hoewel er nog meer klinische studies zullen moeten worden gedaan zijn de tot nu toe behaalde resultaten in de behandeling van inflammatoire ziekten met helminth therapie veelbelovend. Er is onderzoek gedaan met meerdere soorten helminthen, maar tot nu toe zijn de beste resultaten behaald met T. suis ova (TSO). Naast onderzoek naar infectie met levende wormen wordt ook onderzoek gedaan naar de effecten van helminth producten op het immuunsysteem. Echter, voordat deze therapieën in gebruik genomen zouden kunnen worden als immuun therapie zal er nog veel extra onderzoek gedaan moeten worden. Dit extra onderzoek zou onder andere een directe vergelijking van helminth (product) therapie met de conventionele therapie moeten zijn. Ook is het zinnig om verder te bekijken welke helminth producten belangrijk zijn voor de onderdrukking van het menselijk immuunsysteem en hoe deze onderdrukking tot stand komt. Als deze producten geïsoleerd zou het niet meer nodig zijn om patiënten te infecteren met helminthen, maar zouden in plaats daarvan behandeld kunnen worden met alleen het werkzame product. De resultaten in dit proefschrift laten zien dat één enkele helminth soort het immuunsysteem van zijn gastheer op meerdere manieren kan beïnvloeden. Ook verhogen de hier gepresenteerde data ons begrip van de mechanismen die helminthen en hun producten gebruiken in de onderdrukking van het immuunsysteem. Daarnaast geven de beschreven resultaten een aantal aanwijzingen die verder uitgewerkt kunnen worden voor het gebruik van helminth producten in de behandeling van inflammatoire ziekten in de mens.
