Nederlandse samenvatting
Dikkedarmkanker is na longkanker de meest voorkomende doodsoorzaak ten gevolge van kanker in de westerse wereld. Dikkedarmkanker manifesteert zich na een accumulatie van verscheidene genetische veranderingen. Mutaties (veranderingen in individuele genen) kunnen somatisch (opgedaan na de conceptie) of geërfd zijn. Geërfde mutaties bevinden zich in alle cellen van het lichaam, somatische mutaties bevinden zich daarentegen alleen in de cel waarin de mutatie plaastvindt en de afstammelingen daarvan. Mutaties kunnen worden teweeggebracht door omgevingsfactoren zoals straling, chemicaliën en virussen, en doen zich van nature voor bij het ouder worden. Een DNA reparatiesysteem zorgt ervoor dat genen intact blijven. Als dit systeem defect is kunnen mutaties aanwezig blijven en tot kanker leiden. Dikkedarmkanker bestaat uit een solide tumor in de dikke darm en wordt traditioneel onderverdeeld in sporadische en erfelijke gevallen. Bij individuen bij wie geen aanwijzingen van erfelijke genetische veranderingen zijn aangetroffen spreekt men van sporadische kanker. Somatische mutaties veroorzaken gewoonlijk een of een klein aantal poliepen in de karteldarm (colon) die gekenmerkt worden door een abnormale groei van de epitheelcellen in het lumen van de darm. Coloscopie kan deze poliepen ontdekken. Het verwijderen van de poliepen is een effectieve maatregel die voorkomt dat deze verder uitgroeien tot dikkedarmkanker. De symptomen ontwikkelen zich gewoonlijk laat in het verloop van de ziekte, waarbij de meeste sporadische dikkedarmkanker gevallen worden vastgesteld na het 60e levensjaar. Erfelijke dikkedarmkanker syndromen worden veroorzaakt door specifieke geërfde mutaties. Tumoren ontstaan nadat een somatische genetische verandering in het epitheel van de dikke darm het gen met de geërfde mutatie inactiveert (Knudson’s two-hit carcinogenesis model). Deze syndromen worden gewoonlijk gekenmerkt door vele (soms duizenden) poliepen in de dikke darm, alhoewel sommige soorten erfelijke dikkedarmkanker zich direct kunnen ontwikkelen uit de epitheelcellen van de dikke darm zonder dat een poliepontwikkeling detecteerbaar is. De meest voorkomende vormen van erfelijke dikkedarmkanker zijn hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC) en familiaire adenomateuze polyposis (FAP), welke samen ongeveer 5% van alle dikkedarmkanker gevallen voor rekening nemen en gebruikelijk meerdere familieleden raken. FAP wordt veroorzaakt door een geërfde functionele mutatie van een van de kopieën van het adenomatous polyposis coli (APC) gen op chromosoom 5. Inactivatie van het APC gen resulteert in een zichtbaar fenotype tijdens de vroege volwassenheid dat gekenmerkt wordt door een ontwikkeling van honderden poliepen in de dikke darm. Tenzij de conditie vroeg ontdekt en behandeld wordt (gepaard gaande met het verwijderen van de dikke darm) zullen personen met FAP dikkedarmkanker ontwikkelen. Deze personen lopen tevens het risico om andere soorten
153
Nederlandse samenvatting
kanker te ontwikkelen, onder andere van de schildklier, maag en de twaalfvingerige darm. HNPCC is een erfelijke vorm van dikkedarmkanker die voornamelijk aangetroffen wordt in de rechter zijde van de dikke darm. Individuen met een aanleg voor HNPCC lopen een levenstijd risico van 80% om dikkedarmkanker te ontwikkelen, welke zich gewoonlijk voordoet na het 40e levensjaar (op een vroegere leeftijd dan sporadische dikkedarmkanker). De meesten van deze personen blijven asymptomatisch tot aan de ontwikkeling van kanker. Door genetische testen en coloscopie kan een vroege diagnose gesteld worden die kan leiden tot preventie of een goede behandeling. Individuen met een aanleg voor HNPCC lopen ook een verhoogd risico op kanker van de maag, dunne darm, lever, hersenen, huid, endometrium, eierstok en prostaat. HNPCC is geassocieerd met kiemlijn genetische veranderingen in de mismatch repair (MMR) genen. De primaire functie van het MMR systeem is het elimineren van base substituties en insertie-deletie fouten die ontstaan tijdens DNA replicatie. Het systeem omvat verscheidene eiwitten die gecodeerd worden door een aantal genen, waaronder MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 en PMS2, waarvan een aantal geimpliceerd zijn in HNPCC. HNPCC is ook geassocieerd met microsatelliet instabiliteit in tumor DNA. Microsatellieten zijn korte sequenties van repeterende nucleotiden die aanwezig zijn in de coderende en/of niet-coderende sequenties van verscheidene genen. Een verandering in het aantal repetities (‘microsatelliet instabiliteit’) in het coderende gebied kan het gen inactiveren. Microsatelliet instabiliteit is ongebruikelijk omdat het MMR systeem onnauwkeurige inserties of deleties van nucleotide repetities tijdens DNA replicatie (‘slippage’) herkent en herstelt. Als het MMR systeem defect is worden deze fouten echter niet hersteld, wat in oncogenen en tumorsuppressie genen (die de celgroei controlleren) tot kanker kan leiden. Microsatelliet instabiliteit analyse wordt daarom tegenwoordig gebruikt als een methode om HNPCC gevallen te identificeren met mogelijke mutaties in de MMR genen. Het doel van dit proefschrift was om de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de genetische aanleg voor colorectale carcinogenesis in HNPCC te identificeren. Hierbij lag de nadruk op de verscheidene mechanismen die betrokken zijn bij de constitutionele inactivatie van MMR genen, zoals mutaties, methylatie van de promotor gebieden en genetische veranderingen in de regulatie gebieden. In het eerste hoofdstuk van dit proefschrift wordt een overzicht gepresenteerd van de moleculaire en klinische aspecten van dikkedarmkanker (Hoofdstuk 1.1), inclusief de erfelijke syndromen HNPCC (Hoofdstuk 1.2) en FAP (Hoofdstuk 1.3). De genetische technieken die gebruikt worden in dit proefschrift worden kort beschreven in de Appendix.
154
Nederlandse samenvatting
In Hoofdstuk 2 wordt linkage analyse gebruikt als een methode om personen te identificeren die risico lopen om FAP te ontwikkelen, maar bij wie geen APC kiemlijn mutaties zijn gevonden. In deze studie werden 217 personen uit 20 FAP families geanalyseerd met behulp van zeven polymorfe markers. De analyse identificeerde het haplotype dat geassocieerd is met de ziekte in 18 families en de segregatie daarvan in alle familieleden. Een verhoogd risico om FAP te ontwikkelen werd gevonden in 10 van de 53 presymptomatische individuen. Verdere klinische screening testen werden aanbevolen aan deze personen. In Hoofdstuk 3 wordt een microsatelliet instabiliteit analyse gebruikt om dikkedarmkanker gevallen met vermoedelijke genetische veranderingen in de MMR genen te identificeren. Het microsatelliet instabiliteit fenotype wordt volgens internationale richtlijnen in twee verschillende groepen tumoren onderverdeeld afhankelijk van de fractie van gemuteerde microsatelliet sequenties: MSI-L (1 uit 5 geselecteerde microsatellieten is gemuteerd) en MSI-H (≥2 uit 5). Microsatelliet instabiliteit analyse van 45 dikkedarmkanker patienten, waarvan 13 met HNPCC, toonde MSI-H status aan in 85% van de HNPCC patienten en 16% van de niet-HNPCC patienten. Microsatelliet instabiliteit was dus geassocieerd met HNPCC. HNPCC gevallen met MSI-H waren ook gecorreleerd met de aanwezigheid van genetische veranderingen in de MMR genen (Hoofdstuk 4). Een mutatie analyse van 16 HNPCC families, waarin 46% van de individuen MSI-H tumoren hadden, identificeerde acht genetische veranderingen in MLH1 en MSH2. Hoofdstuk 5 rapporteert een eerste geval van promotor methylatie als een epigenetische verandering op een constitutioneel niveau. Methylatie analyse van het MLH1 promotorgebied werd uitgevoerd op 14 HNPCC gevallen met MSI-H maar zonder kiemlijn mutaties in de MMR genen, met behulp van een methylatie-specifieke polymerase (MSP) kettingreactie assay. Een geval was geidentificeerd met een gemethyleerd en een ongemethyleerd MLH1 allel in DNA uit het bloed, en alleen het gemethyleerde allel in tumor weefsel. Analyse van de single nucleotide polymorfismen (SNPs) in het promotorgebied toonde aan dat het bloed DNA heterozygoot was voor het polymorfisme (G/A) terwijl het tumor DNA homozygoot (G) was. Dit duidt op een loss of heterozygosity (LOH) die resulteert in een verlies van het ongemethyleerde allel op het somatische niveau. Immunohistochemie bevestigde dat inactivatie van beide MLH1 allelen resulteerde in de afwezigheid van MLH1 eiwit. Andere onderzoekers hebben de afgelopen jaren deze bevindingen bevestigd. Constitutionele hemi-methylatie is dus een nieuw mechanisme voor monoallelische inactivatie van het MLH1 gen in HNPCC en sporadische early-onset dikkedarmkanker patienten met MSI-H.
155
Nederlandse samenvatting
Hoofdstuk 6 beschrijft een functionele analyse van het 5’-flankerend gebied van het MSH6 gen en de regulatie daarvan door zeven Sp1 transcriptiefactor bindingsplaatsen. De identificatie van twee SNPs in het MSH6 promotor gebied in kanker patienten toonde aan dat twee van de zeven Sp1 transcriptiefactor bindingsplaatsen geinactiveerd waren, wat resulteerde in een verlaagde promotor activiteit. In vitro experimenten toonden bovendien aan dat een MSH6 promotor met twee SNPs sensitiever is voor inactivatie door DNA methylatie. Twee verschillende polymorfe varianten werden geidentificeerd in 16% van een Kaukasische populatie en 3% van een gemengde populatie, wat suggereert dat de menselijke populatie individuen bevat met verschillende niveaus van MSH6 promotor activiteit. We hebben ook aangetoond dat mutaties in het regulerende promotorgebied het binden van transcriptiefactoren zoals Sp1 kan verminderen, wat resulteert in een verlaagde promotor activiteit en mogelijke de novo methylatie. We verschaffen dus een nieuw mechanisme dat een gedeeltelijke inactivatie van een MMR gen kan veroorzaken en een verlaagde constitutionele gen expressie in plaats van veranderingen in de structuur van het eiwit. Tot besluit, in dit proefschrift zijn drie verschillende mechanismen geidentificeerd die kunnen leiden tot de constitutionele inactivatie van MMR genen in HNPCC. Een veelvoorkomend mechanismse betreft verscheidene punt mutaties. Twee nieuwe maar weinig voorkomende mechanismen zijn (i) methylatie van het MLH1 gen en (ii) SNPs in de transcriptiefactor bindingsplaatsen van het MSH6 gen.
156
