Nastavení metod pro imunofenotypizaci krevních buněk pomocí průtokové cytometrie
Martin Špryngar EXBIO Praha, a.s.
Obsah:
Porovnání vícebarevné vs. dvoubarevné cytometrie Požadavky průtokové cytometrie na vybavení laboratoře Zpracování vzorků Vytváření panelů pro vícebarevnou průtokovou cytometrii Nastavení cytometrů, standartizace
Návaznost kroků vyšetření periferní krve pomocí průtokového cytometru
Preanalytická fáze
Analýza
Postanalytická fáze
Cíl nastavení metod imunofenotypizace krevních buněk
Účel naměřených dat Požadavky množství měřených vzorků a na rychlost zpracování výsledků Požadavky na kvalitu měření a analytickou robustnost metod Požadavky na certifikaci
Cíl nastavení metod imunofenotypizace krevních buněk +
lze sledovat specifické populace definované velkým množstvím parametrů
-
pouze základní populace lymfocytů
+
lze součastně analyzovat několik populací buněk v jedné zkumavce
-
pro podrobnější analýzu je potřeba velké množství zkumavek
Dvoubarevná / tříbarevná průtoková cytometrie
Vícebarevná průtoková cytometrie
-
nároky na nákup průtokového cytometru
+
i na jednoduchých průtokových cytometrech
-
servis průtokového cytometru
+
některé jednoduché typy průtokových cytometrů mají menší nároky na servis
-
nároky na standardizaci měření
+
stačí i základní kontrola kvality měření
-
složitější analýza naměřených dat
+
jednoduchá interpretace naměřených dat
-
větší nároky na použité protilátky (problém získat single reagencie), stabilita konjugátů s tandemovými fluorochromy
+
v FITC a PE je většina protilátek pro FC, konjugáty mají dobrou stabilitu
Vícebarevná průtoková cytometrie
BD Biosciences
Vstupy pro imunofenotypizaci krevních buněk
Materiály pro imunofenotypizaci krevních buněk
Protilátky (vč. izotypových kontrol, sekundární prot.) Lyzační, fixační a permeabilizační činidla Provozní tekutiny pro FC Kalibrační kuličky Zkumavky Laboratorní pomůcky
Ostatní procesy při imunofenotypizaci krevních buněk Doprava a příjem vzorků krve Uchovávání vzorků krve Zpracování a značení vzorků krve Měření Likvidace odpadů
Ostatní procesy při imunofenotypizaci krevních buněk Zpracování naměřených dat Kalibrace cytometrů Pravidelná údržba cytometrů Servis – pravidelný vs. urgentní Interní kontrola kvality Externí kontrola kvality
Prostředí Práce s potencionálně infekčním materiálem - zkumavky, špičky, jehly - aerosol – centrifugace, transfer tekutin Práce s toxickými chemikáliemi Možná kontaminace z dalších testů, které probíhají na jednom průtokovém cytometru Vysoké napětí a laser – u sorterů
Uživatelé
Základní zaškolení uživatelů Průběžné školení uživatelů Pravidla pro použití cytometrů, SOP
Průtokové cytometry Průtokové cytometry - vlastní - cytometr v servisní laboratoři - stroje v reagenčním leasingu Průtokové cytometry - hydrodynamická fokusace - kapilární - ultrasonická fokusace Průtokové cytometry - analogové - digitální Průtokové cytometry - sample loader - HTS
Průtokové cytometry Průtokové cytometry vícelaserové - s oddělenou optikou pro jednotlivé lasery - se společnou optikou pro červený a modrý laser Průtokové cytometry - uzavřené systémy - výzkumné zařízení Další zařízení - lyzační stanice - centrifugy - PC + vyhodnocovací sw
Průtokové cytometry Dvoubarevné značení Čtyřbarevné značení - čtyřbarevný cytometr ≠ ideální nástroj pro čtyřbarevné značení Vícebarevné značení - nároky na standardizaci a stabilitu cytometru
Příprava vzorků
V návaznosti na požadavky certifikace měření a na status protilátek CE IVD / RUO / ASR
Příprava vzorků Povrchové značení buněk - metody Stain-Lyse-Wash Lyze erytrocytů - osmotická lyze - narušení membrán formaldehydem - zvýšení osmotického tlaku přítomností amonných iontů - odstranění erytrocytů fyzikálními metodami (+ další metody: aktivace, proliferace)
Příprava vzorků Intracelulární značení buněk -
cytoplasmatické markery
-
jaderné markery
Blokování transportu proteinů Blokování nespecifických vazebných míst Izotypová kontrola
Fluorescence
BD Biosciences
Fluorescence
Počet lymfocytů CD79b FITC ≠ CD79b PE
Fluorescence -
BD Biosciences
Přesvit fluorochromů na vašem cytometru
Vytváření panelů protilátek
Kompenzace + data spead
Vytváření panelů protilátek
Vytváření panelů protilátek
Vytváření panelů protilátek
Vytváření panelů protilátek
Validace panelů: - FMO kontroly - stabilizované definované vzorky krve (SEKK, ImmunoTrol) - vzorky pozitivních buněk z jiných tkání nebo tkáňových linií - stimulované buňky
Standardizace Poznej svůj cytometr (lasery, filtry,…) Udržuj cytometr v optimální kondici Konfigurace cytometru, baseline (charakterizace cytometru) Definice cílových hodnot MFI – vlastní nebo „standardní“ (EuroFlow) „Standard“ – kuličky (CS&T, FlowSet, 8-peak Rainbow,…) Nastavení cytometru (set up) – optimalizace pro konkrétní aplikace Udržení daného nastavení v čase
Standardizace: baseline = min PMTV pro optimální rozlišení signálu od šumu
Baseline definuje okno pro optimalizaci PMTV pro konkrétní aplikaci (setup)
šum
Standardizace Zajištění reprodukovatelnosti měřených dat změnou PMTV Automaticky - Platformy výrobců (CS&T, FlowCheck+FlowSet) Manuálně – „monitoring“ na jiných kalibračních kuličkách Data změřená dnes stejně jako za týden, měsíc, rok… = porovnatelná data v dlouhodobém horizontu
Standardizace Spherotech Rainbow Beads (8 peaks)
Závěr Při zavádění nových metod je potřeba zohlednit všechny návazné procesy U vícebarevné cytometrie – modelování značení na daném cytometru před zavedením značení Validace značení pomocí dostupných kontrol Bez kalibrace není vícebarevná průtoková cytometrie
Děkuji za pozornost
