Nanomedicina Szimpózium, 2008
Nanomechanika: Egyedi Biomolekulák Manipulálása Kellermayer Miklós
Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet
ÉLŐ SEJTBEN: BONYOLULT FEHÉRJE NANOGÉPEZETEK
QuickTime™ and a None decompressor are needed to see this picture.
QuickTime™ and a H.264 decompressor are needed to see this picture.
Mikrotubulus dinamikus instabilitás
Tovacsúszó keratinocita
QuickTime™ and a H.264 decompressor are needed to see this picture.
Vevikulum transzport kInesinnel
QuickTime™ and a H.264 decompressor are needed to see this picture.
Fehérjeszintézis riboszómán http://multimedia.mcb.harvard.edu
MIÉRT EGYEDI MOLEKULÁK? Kitekeredett állapot Konformációs tér
2. Időbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik Sztochasztikus folyamatok, pl. fluorofór pislogás
párhuzamos G útvonalakon haladó folyamatok, pl. fehérjegombolyodás
GFP Jel (a.u.)
1. Térbeli kiátlagolódás kiküszöbölődik
Idő (s) Natív állapot GFP pislogás (Moerner)
3. Biomolekuláris mechanika Molekuláris rugalmasság, motorfehérje funkció
QuickTime™ and a Photo - JPEG decompressor are needed to see this picture.
Kinesin motorfehérje
Bakteriofágból kiszabadult DNS
4. Egyedek azonosítása, követése sokaságban Térbeli és időbeli transzport útvonalak (pl. víruspartikulumok celluláris mozgása, citoszkeletális filamentumok dinamikája)
Aktin "speckle" mikroszkópia (Small)
Egyedi mikroTubulusok (Borisy)
QuickTime™ and a Video decompressor are needed to see this picture.
EGYEDI MOLEKULÁK MECHANIKAI MANIPULÁLÁSA
"Rugólapka alapú" módszer: atomerő-mikroszkóp (AFM) Lézernyaláb kitérés
"Mező alapú" módszer: lézercsipesz
Lézer fókusz
Lézer molekula QuickTime™ and a Video decompressor are needed to see this picture.
Latex gyöngy
Rugólapka elhajlás = F/k molekula ∆z
Mozgatható mikropipetta Kettős szálú DNS molekula megnyújtása
Kellermayer, Physiol. Meas. 26, R119, 2005
BIOMOLEKULÁRIS RENDSZEREK
1.
Titin óriás izomfehérje
2.
Rekombináns titin fragmentumok
3.
Miozin vastag filamentum
4.
Amiloid fibrillumok
TITIN: MOLEKULÁRIS RUGÓ AZ IZOMSZARKOMERBEN Izomköteg Izomrost Miofibrillum
Szarkomer
Z
Vékony filamentum
M
Vastag filamentum
Z
Ig-domén (7-szálú ß-hordó)
Titin
I-szakaszbeli szegmens tandem Ig-régió
PEVKdomén
tandem Ig-régió
DOMÉNSZERKEZET A TITINBEN
Ig domén
PEVK szegmens
egyedi szekvenciák
szívizom N2-B I1
I15
N2-B I27
I84
I105 COOH
NH2
vázizom (soleus) I1
I15 I27
I79 N2-A
PEVK
I84
I105 COOH
NH2
I55-62 konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió
differenciálisan expresszálódó tandem Ig régió
I
II
Klónozott és mechanikailag manipulált titin fragmentumok
III konstitutívan expresszálódó tandem Ig régió
TITIN NANOMECHANIKA LÉZERCSIPESSZEL Nem-lineáris rugalmas erőválaszra szuperponált átmenetek
Erővezérelt szerkezeti változások A-B
160
D
"Wormlike chain" (WLC) modellgörbe
140
C
120
Erő (pN)
100
C
80
D
60
Domén kitekeredés
40
Nemlineáris rugalmasság
20 0
B
Nemlineáris rugalmasság
A 0
E
E
F 1
2
3
4
5
6
F
Molekulahossz (µm) Kellermayer et al. Science 276, 112, 1997
Perzisztencia hossz Erő
Nemlineáris WLC rugalmasság Vég-vég távolság
QuickTime™ and a Graphics decompressor are needed to see this picture.
TITIN NANOMECHANIKA ATOMERŐ-MIKROSZKÓPPAL Egyedi molekula erőspektroszkópia
Erő-fűrészfogak: mechanikailag stabil domének nem-kooperatív kitekeredése
500
300
Erő (pN)
Erő (pN)
400
140 120 100 80 60 0.22
0.24
0.26
0.28
0.3
0.32
0.34
QuickTime™ and a Video decompressor are needed to see this picture.
Megnyúlás (µm)
200
100
0 200
400
600
800
1000
1200
Megnyúlás (nm) Kellermayer et al. BBA 1604, 105, 2003
Molekuladinamika szimuláció, K. Schulten
REKOMBINÁNS TANDEM-IG FRAGMENTUM MECHANIKÁJA Az I55-62 fragmentum kitekeredési görbéje
k0off E
Tranziciós állapot
Fxß
Kitekert állapot
3 Natív állapot
2
xß
∆L
1
Reakció koordináta
20 Gyakoriság
200 pN
15 10 5 50 nm
∆L = 29,8 3,5 nm
0 0
Grama et al. Croat. Chem. Acta 78, 405, 2005.
100
200
300
400
Kitekeredési erő (pN)
REKOMBINÁNS PEVK FRAGMENTUMOK MECHANIKÁJA
AFM rugólapka Au S
His6 Glymo-NTA-Ni
PEVKI
Reverzíbilis nemlineáris erőválasz
Erő (pN) Force (pN)
100 80
Effective persistence length (nm)
2.5
PEVK szegmens
120
Effektív perziszenciahossz (nm)
A PEVK domén elektrosztatikusan hangolható molekula-teleszkóp
2
1.5
1
0.5
Lp PEVKI Lp PEVKII Lp PEVKIII
0 0
60
50
100 150 200 250 Ionic strength (mM)
300
Ionerősség (mM)
40
-
20 0 0
50 100 150 200 250 Extension (nm) Megnyúlás (nm)
Nagy et al. Biophys. J. 89, 329, 2005.
-
- - - - - - - -
+ + + + + + + + - + + + + + - - -+ + + + + + ++ + + + + + + + + +
350
TITIN NANOMECHANIKA KONSTANS ERŐVEL
Erővisszacsatolt lézercsipesz
Titin feltekeredés konstans erő alatt Erő (pN) 100
Referencia
0
Kitekert állapot
2000
Mért jel (erő)
Kitekeredés
Megnyúlás (nm) Gyors összeesés
1500
Szerkezeti fluktuációk
titin Feedback
Végső kontrakció
1000
500
Mozgatható mikropipetta
Feltekert állapot Szabályzás (piezo mozgás)
30
40
50
60
Idő (s)
70
80
90
x10
3
MIOZIN VASTAG FILAMENTUM NANOMECHANIKÁJA Szintetikus miozin filamentum vizualizálása és manipulálása AFM-mel
A repetitív erőcsúcsok periodicitása korrelál a miozin gerinc menti, elektrosztatikusan töltött régiók periodicitásával Húzás - Relaxáció
-100pN
#
#
#
#
4.15 nm
0 11.8
20.1
28.4
36.7
45.0
53.3nm
-100pN
8.3 nm
Erő
200 nm
Kitérés
0 29.9
54.8
79.7
104.6
129.5nm
14.3 nm
-200pN
Lézer
0 59.2
87.8
116.4nm
43 nm
-100pN
Rugólapka
0 Vastag filamentum
23
csillám
66
Megnyúlás
109
152nm
A reverzíbilis átmenetek (# #) spontán össyezippzározódási folyamatra utalnak. Decker and Kellermayer, J.Mol.Biol. 322, 307, 2008.
AMILOID FIBRILLUMOK NANOMECHANIKÁJA
Amiloid ß1-40 peptid
Amiloid protofilamentum
400
Gyakoriság Count
50
1
Aβ1-40 33 pN
Erő (pN)
300
∆F
40 200
30
100
20
2
3
4
5 6
10 0 0
20
40
60
80
100
Megnyúlás (nm)
Kellermayer et al. JBC 280, 8464, 2005
120
140
0
0
40
80
120 120
160
Plató erő (pN)
200
240
AZ AMILOID SZÉTZIPPZÁROZÁS REVERZÍBILIS R
120 80
300
Erő (pN)
Erő ő (pN)
40 0
20
200
100
0 0
-20 0
20
300
40 60 Extension (nm) (nm) Megnyúlás
80
7600
100
7800
8000
8200
8400
8600
Megnyúlás (nm) 160 140
600
250
120
200
400
Erő (pN)
Plató erő (pN)
100
150 100 50 0
80 60 24
26
28
30
32
200 0 -200
0.1
1
10
Nyújtási sebesség (µm/s) Kellermayer et al. JBC 280, 8464, 2005; Karsai et al. J. Chem. Inf. Mod. 45, 1641, 2005
-400 20
40
60
80
Megnyúlás (nm)
100
8800
KÖSZÖNET László Grama
Tamás Huber
Ünige Murvai
Attila Nagy
Árpád Karsai
Brennan Decker
Pasquale Bianco
Balázs Kiss
Paola Cacciafesta
Zsolt Mártonfalvi
András Kengyel
Margit Benke
Együttműködések: Penke Botond (Szeged) Henk L. Granzier (WSU) Carlos Bustamante (U.C. Berkeley)
QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
QuickTime™ and a TIFF (Uncompressed) decompressor are needed to see this picture.
Dávid Szatmári
Jusztina Kungl
Károly Zieber
Howard Hughes Medical Institute European Union OTKA, ETT, NKTH
