Mutasi DNA Mitokondria yang Berkaitan Dengan Penyakit Diabetes Mellitus
Skripsi
RR. Bellinda Lucky SS 10504070
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
Mutasi DNA Mitokondria yang Berkaitan Dengan Penyakit Diabetes Mellitus Mitochondrial DNA Mutation Related to Diabetes Mellitus
Skripsi
RR. Bellinda Lucky SS 10504070
PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2008
Abstract Maternally inherited mitochondrial DNA has been applied for medical purpose, such as for diagnose Diabetes Mellitus (DM). It has been reported that Maternallu Inherited Diabetes and Deafness has a correlation with mitochondrial DNA mutation, which is a A3243G mutation on tRNALeu gene. However, there is no information whether mitochondrial DNA sample in Biochemistry Laboratorium at the Division of Biochemistry, ITB posses its mutation. Samples were obtained from mouth epithelial cell, then DNA fragment were amplified using Polymerase Chain Reaction method, followed by an agarose gel electrophoresis, and sequencing mtDNA of samples, finally the results were analyzed by using SeqmanTM program. Visualization of the amplified mtDNA showed one band of 1,8 kb in size. The results indicate that samples has A3606G mutation, instead of A3243G. Based on these results, it can be conclude that the mtDNA of this diabetes patient has no correlation with A3243G mutation. However, as has been reported recently, this A3606G mutation might be associated to certain diabetes patient, including the one in this research. Keyword: Mitochondrial DNA, mutation, diabetes
ii
Abstrak DNA mitokondria yang diturunkan secara maternal dapat digunakan untuk keperluan medis, salah satunya adalah diagnosis penyakit Diabetes Mellitus (DM). Telah dilaporkan bahwa Maternally Inherited Diabetes and Deafness merupakan penyakit diabetes yang diturunkan secara maternal dan berkaitan dengan DNA mitokondria, yaitu mutasi A3243G pada gen tRNALeu. Namun belum ada informasi, apakah sampel DNA mitokondria penderita DM yang ada di laboratorium Biokimia ITB juga mengalami mutasi tersebut. Metode yang dilakukan adalah pengambilan sampel menggunakan kertas saring, amplifikasi fragmen DNA mitokondria dengan Polymerase Chain Reaction, elektroforesis gel agarosa, sekuensing, dan analisisnya menggunakan program SeqmanTM. Visualisasi hasil amplifikasi dengan elektroforesis menunjukkan satu pita berukuran 1,8 kB. Analisis hasil sekuensing menunjukkan adanya mutasi A3606G namun tidak ada mutasi A3243G. Atas dasar hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa untuk sampel yang dianalisis, penyakit DM yang diderita tidak ada kaitan dengan mutasi A3243G namun diduga berkaitan dengan mutasi A3606G sebagaimana telah dilaporkan oleh peneliti lain. Kata kunci: DNA mitokondria, mutasi, diabetes
iii
Program Studi Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung
Menerangkan bahwa skripsi yang disusun oleh:
Nama : RR. Bellinda Lucky SS NIM : 10504070
telah disetujui sebagai persyaratan untuk mendapatkan gelar Sarjana Kimia
Bandung,
Juni 2008
Pembimbing
Achmad Saifuddin Noer, M.Sc, Ph.D. NIP. 130875577
iv
Bukankah Kami telah melapangkan untukmu dadamu?, dan Kami telah menghilangkan daripadamu bebanmu, yang memberatkan punggungmu? Dan Kami tinggikan bagimu sebutan (nama)mu, Karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan. Maka apabila kamu telah selesai (dari sesuatu urusan), kerjakanlah dengan sungguh-sungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap. (QS. 94:1-8)
… it's better to try and fail, than fail to try. B’coz there are people out there fighting to make things better, and at least I did something…
I want to live in the center of a circle,, I want to live on the side of a square,, I look around at a beautiful life,, Been the upperside of down and been the inside of out…
Dedicated for my luvely mom… patiently mom… heavenly mom… Daddy for all u’ve done… Also all my BIG family for their supports… Last but not least, all my best friends for their supports… This is the beginning of my true journey…!!!
Jovial_Sylph
v
Ucapan Terima Kasih Bismillahirrahmaanirrahiim… Alhamdulillah… Puji dan syukur penulis haturkan kepada Allah SWT karena dengan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tugas akhir dan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada: 1. My luvely mom. Thank you for all your support and your patience, your kindness, your love, ALL your prayer, and everything you’ve done. Tanpa restu dan doa dari mamah, anakmu takkan mampu menjadi seperti sekarang, takkan mampu menjadi seseorang yang tegar dan tabah, dan takkan mampu menjadi seseorang yang beranjak dewasa. Doakan Linda biar sukses di pendidikan dan karier Linda, untuk membalas semuanya walaupun sangat sedikit. Thank you so much for always being there for me, Ma. I’m sorry that your daughter didn’t make you happy as I should since then. But I try harder to make you happy. 2. Papah. Buat semua kerja keras, doa, dan usahanya hingga Linda bisa lulus tepat waktu. Mungkin baru ini yang bisa Linda kasih buat papah, baru ini tanda bakti Linda sama papah. This year is just the beginning of my journey. Doakan Linda semoga bisa sukses di tahun-tahun ke depan. Thank you so much for always staying there for me, Pa. I know I couldn’t be just like now without you and your supports. So let me try harder to make it better for you and this family. I hope I can help both of you fulfill “the fifth of Rukun Islam”. Amin! 3. Om Yuddy sekeluarga dan Om Eddy sekeluarga yang telah memberikan dukungan dan bantuan untuk Linda selama kuliah. Linda yakin Allah pasti membalas kebaikan Om Eddy dan Om Yuddy, dan Linda doakan semoga sukses terus dan lancar. Linda pasti berusaha terus jadi orang yang sukses dan bisa berguna juga untuk saudarasaudara dan lingkungan Linda nanti. Amin! 4. Pembimbing penulis, Bapak Achmad S. Noer atas segala arahan dan bimbingannya selama saya melakukan tugas akhir. Atas segala saran dan kritikan, dan kesediaan waktunya untuk berkonsultasi. Thank you so much, Sir! Untuk Ibu Ati, terima kasih banyak karena sudah mau direpotkan oleh Linda, dan masukan-masukannya juga, terima kasih banyak Ibu. Semoga silaturrahmi kita tetap dijaga ya Pak.
vi
5. Pak Aminudin dan Pak Saepudin atas waktu dan kesediannya dengan penulis. Terima kasih banyak Pak. 6. Tidak akan bisa Linda pungkiri kalau “BRTZ fam” yang jadi kawan terdekat buat Linda. Mulai dari awal kuliah sampai Linda lulus (akhirnya), thank you so much for all your support girls, all time that we’ve spent together for almost four years, and everything that we shared together. Thanks too, for the sorrow and happiness we’ve felt together. I’m sorry if I’m not the good friend of yours. This is me. Especially to Anti for your time, your patience handling me, and every single story that we’ve shared. Thanks Anti for being my best friend. Hope this friendship will last forever. Tidak lupa, sukses buat kalian semua! Ditunggu undangan nikahnya ya! ☺ 7. Penghuni Lab. Biokimia. Terima kasih banyak atas semua kesenangan dan kesedihan yang pernah melanda kita bersama. Ka Benki atas kesediaan waktu dan pengalamannya, Teh Neneng dan Teh Rina atas waktu mendengarkan keluh kesahnya Linda, Edo, Ka Fris, Edu, Septin, Ogi, Rian, Teh Fera, dan Dini. Thank you guys! 8. Akhirnya teman-teman angkatan 2004 yang juga telah membuat “coretan-coretan” dalam hidup Linda. Iim, thank you for all your support! Go get your girl, haha! Dan cepat lulus ya Ka! Yudis, thanks buat waktunya mendengarkan curahan hati Linda. Opik, cepat lulus ya! Thanks for everything we’ve shared. Anak-anak mantan pengurus AMISCA, I miss you all! Agus, orang terakhir yang percaya sama Linda, thanks buat “pembelaan”nya tentang Linda. Bagaimanapun juga kebenaran yang akan menang, bukan isu semata☺. Teman-teman angkatan 2003 yang pernah memberikan “tinta hitam dan biru” buat Linda☺. Teman-teman angkatan 2005, Nyun-nyun dan Neng, nuhun pisan buat doanya ya! Sukses Tugas Akhirnya. 9. “Fajri”, thank you so much for being the inspiration for me. “I've been trying to believe and confident different people i've found. When some more then got closer than others and some wouldn't even bother, but then you came around. I didn’t really know what to call you, you didn’t know me at all but I was happy to explain. If this is communication, then I disconnect. I've seen you, I know you, but I hope we’ll meet someday at the right time and at the right place.” ☺ Dan terima kasih banyak untuk semua orang yang membantu Linda yang tidak bisa Linda sebutkan satu persatu. Sekali lagi terima kasih banyak.
vii
Daftar Isi ABSTRACT ..............................................................................................................................ii ABSTRAK ............................................................................................................................... iii UCAPAN TERIMA KASIH ....................................................................................................vi DAFTAR ISI ......................................................................................................................... viii DAFTAR TABEL...................................................................................................................... x DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................ xi DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................................xii 1 PENDAHULUAN ................................................................................................................ 13 2 TINJAUAN PUSTAKA ....................................................................................................... 15 2.1 Mitokondria ....................................................................................................................... 15 2.2 Fungsi Mitokondria............................................................................................................ 16 2.3 DNA Mitokondria .............................................................................................................. 18 2.4 Sifat DNA Mitokondria ..................................................................................................... 19 2.4.1 Pola pewarisan secara maternal ...................................................................................... 19 2.4.2 Laju Mutasi mtDNA ....................................................................................................... 20 2.5 Mitochondrial Disease ....................................................................................................... 21 2.5.1 MIDD (Maternally Inherited Diabetes and Deafness) ................................................... 23 2.6 Teknologi PCR .................................................................................................................. 23 2.7 Rujukan Analisis MtDNA ................................................................................................. 25 2.7.1 Cambridge Reference Sequence ..................................................................................... 26 2.7.2 Mitomap ......................................................................................................................... 27 2.8 Diabetes Mellitus ............................................................................................................... 28 2.8.1 Jenis Diabetes Mellitus ................................................................................................... 29 2.8.2 Gejala Diabetes ............................................................................................................... 30 3 METODOLOGI PENELITIAN ........................................................................................... 31 3.1 Alat ................................................................................................................................. 31 3.2 Bahan ................................................................................................................................. 31 3.3 Pengumpulan Sampel ........................................................................................................ 32 3.4 Penyiapan Templat DNA ................................................................................................... 32 3.5 Amplifikasi DNA ............................................................................................................... 33
viii
3.6 Analisis Hasil PCR ............................................................................................................ 33 3.7 Penentuan Urutan Nukleotida ............................................................................................ 34 3.8 Analisis Hasil Sequencing ................................................................................................. 35 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................................................ 36 4.1 Pengambilan sampel .......................................................................................................... 36 4.2 Hasil Lisis Sel .................................................................................................................... 37 4.3 Fragmen 1,8 kb Hasil Amplifikasi PCR ............................................................................ 37 4.4 Analisis Hasil PCR ............................................................................................................ 39 4.5 Hasil Sequencing dan Urutan Nukleotida Sampel ............................................................. 41 4.6 Mutasi pada Sampel ........................................................................................................... 43 4.7 Perbandingan Mutasi Sampel dengan Data Mitomap ........................................................ 46 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................................................ 48 5.1 Kesimpulan ........................................................................................................................ 48 5.2 Saran ................................................................................................................................. 48 6 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................... 49 Lampiran A .............................................................................................................................. 52 Lampiran B .............................................................................................................................. 57 Lampiran C .............................................................................................................................. 59 Lampiran D .............................................................................................................................. 60
ix
Daftar Tabel Tabel 2. 1
Perbedaan karakteristik DNA inti dan DNA mitokondria manusia ............. 20
Tabel 2. 2
Klasifikasi genetik dari Mitochondrial Disorder yang disebabkan adanya kecacatan DNA mitokondria ....................................................................... 22
Tabel 3. 1
Urutan nukleotida primer Bfor dan Brev ..................................................... 32
x
Daftar Gambar Gambar 2. 1
Struktur mitokondria .................................................................................... 15
Gambar 2. 2
Tiga tahap respirasi sel dalam mitokondria ................................................. 16
Gambar 2. 3
Proses pembentukan ATP menurut teori chemiosmotic coupling pada matriks mitokondria .................................................................................................. 17
Gambar 2. 4
Struktur DNA mitokondria .......................................................................... 18
Gambar 2. 5
Skema pewarisan DNA mitokondria ........................................................... 20
Gambar 2. 6
Skema PCR .................................................................................................. 25
Gambar 2. 7
Fragmen yang akan dianalisis dan diamplifikasi, yaitu posisi 2900-3800 .. 27
Gambar 2. 8
Tampilan Mitomap untuk mutasi yang terkait dengan penyakit .................. 28
Gambar 3. 1
Siklus PCR ................................................................................................... 33
Gambar 4. 1
Elektroforesis gel agarosa hasil amplifikasi fragmen-B mtDNA ................ 39
Gambar 4. 2
Skema amplifikasi fragmen-B DNA mitokondria ....................................... 40
Gambar 4. 3
Elektroforesis hasil amplifikasi fragmen-B mtDNA pada sampel diabetes 41
Gambar 4. 4
Elektroforegram hasil sequencing sampel diabetes ..................................... 42
Gambar 4. 5
Urutan nukleotida sampel positif-Diabetes (sampel DM) ........................... 43
Gambar 4. 6
Hasil elektroforegram sampel DM .............................................................. 44
Gambar 4. 7
Hasil elektroforegram sampel DM .............................................................. 45
Gambar 4. 8
Contoh tampilan Mitomap ........................................................................... 46
Gambar 4. 9
Contoh tampilan Mitomap ........................................................................... 47
xi
Daftar Lampiran Lampiran A
Elektroforegram sampel............................................................................... 52
Lampiran B
Urutan nukleotida sampel ............................................................................ 57
Lampiran C
Mutasi pada sampel ..................................................................................... 59
Lampiran D
Tampilan Mitomap tentang mutasi yang berkaitan dengan penyakit .......... 60
xii
