Dr Fekete Jenı: A folyadékkromatográfia újabb fejlesztési irányai - HILIC
Mozgófázisok a HILIC-ban
• Módszer specifikus feltétel: • kevésbé poláris, mint az állófázis vagy a
víz • Miért a víz?
Mitı Mitıl polá poláris az álló llófázis felü felülete? A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. A különbözı állófázisoknál a víz a legkevésbé poláris. ezért ennél kell kevésbé polárisnak lenni a mozgófázisnak.
S
AN + H2O H 2O
H2O
K
Általános feltételek • • • • • • • •
kis viszkozitás -nagy tisztaság -szilárdanyag mentesség -gázmentesség -UV detektálásnál kis UV cut-off -kis mértékő kipárolgás -kis toxicitás -gazdaságosság
• Oldószerek:
• víz-metanol-acetonitril-izopropanoltetrahidrofurán
A HILIC-ban használt oldószerek fizikai tulajdonságai
Viszkozitás változás a szerves oldószer-víz összetétel függvényében
• Választás: viszkozitás 1,8 1,6
viszkozitás [cP]
1,4 1,2 1 0,8 Met anol
0,6
T HF
0,4
Acet onit r 0,2 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
szerves oldószer tartalom [v%]
Az elválasztás hatékonyságának függése a mozgófázis viszkozitásától
H
η
2
η
∆H
Hmin
u
1
∆H
1
2
gyakorlati
u
Különbözı binér-elegyek H-u görbéi a lineáris áramlási sebesség függvényében Az acetonitril-víz elegy adja a legkisebb H értékeket, használatakor legnagyobb az elválasztás hatékonysága. Használata a HILIC-ban ajánlatos.
H
víz-2-propanol
víz-EtOH víz-MeOH víz-ACN
u
• Mozgófázis erısség a HILIC-ban • víz>metanol>acetonitril>tetrahidrofurán Mozgófázis erısség a RP-HPLC-ban víz<metanol
• Az elsı szempont, hogy a vegyületek molekuláris formája vagy azok aránya az elválasztás körülményei között állandó legyen. Ha ez a feltétel nem teljesül, akkor a másodlagos egyensúlyok miatt a kromatográfiás csúcs kiszélesedik, és a visszatartás is változhat.
• A HILIC-nál is elsı eldöntendı kérdés,
• hogy kell-e pH kontroll vagy nem, ezt a vegyületek szerkezete dönti el.
• HILIC szempontból a vegyületek négy csoportra oszthatók: • kromatográfiás szempontból semleges vegyületek • savas jellegő funkciós csoportot tartalmazó vegyületek • bázikus funkciós csoportot tartalmazó vegyületek • ionos vegyületek
• Kromatográfiásan semleges vegyületek, amelyek poláris csoportokat tartalmaznak és lgP<-0,5 ekkor • A VEGYÜLET NEM KÖVETELI MEG A pH KONTROLLT • Retenció beállítása: • H2O>MeOH>AN>2-PrOH>THF
A visszatartás egyik lehetséges változata a HILIC folyadékkromatográfiás módszernél. A komponens megoszlik a szorbeált vízréteg és a mozgófázis között. Megoszlás cak akkor várható, ha jelentıs eltérés van a mozgófázis és az állófázis víztartalma között.
S
AN + H2O H2O
H 2O
K
A visszatartás változása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. A vegyületek poláris jellegével a visszatartás nı. Polaritási sorrend: 3>2>1.
k
3
70
2
1
φ (tf%)
A visszatartási tényezı változása a szerves oldószer koncentrációjának függvényében és linearizálás mindenki ismeri RP-HPLC-t ezért ehhez viszonyítunk mindent!!! lgk=A-Bφ
lg k
Linearizálható szakasz
lg k =A’+B’φ
80
100
φ (v/v%)
A visszatartás változása a mozgófázis víztartalmának függvényében a HILIC módszer alkalmazásakor. Minél nagyobb a vízoldhatósága a vegyületnek, annál kisebb az egyenes meredeksége. Linearizálni csak 60 -70 tf.% víztartalom felett lehet.
lg k
φvíz (v/v%)
Mekkora lehet a legnagyobb víztartalom?
• Alap: • -kis víztartalmú szerves oldószereknél az egyensúly beállás hosszú • -az egyensúlyi állapot ismételhetısége bizonytalan
• -3-5 tf.% víz kell a szerves oldószerbe
Savas csoportot tartalmazó vegyületek
• Modell: • R-COOH=RCOO¯+H+ pKa • Ha lehet az elválasztásuk, a ion visszaszorított formában, ennek feltétele:
• lgP<-0,5
Savas csoportot tartalmazó vegyületek Ion visszaszorított: lgP<-0,5, Ionozált: lgD <-0,5
Bázisos csoportot tartalmazó vegyület ionizáltság 1
protonált bázis
I
0,5
-2
+2
pKa
szabad bázis
pH
• Lehetséges módok: • Bázisos csoportot tartalmazó vegyületeknél: • IONIZÁLT!! • Oka: szilanolcsoportok ion visszaszorított formában legyenek.
• pH kontrollt pufferekkel végezzük, de • NAGY A SZERVES OLDÓSZER TARTALOM • CSAK SZERVETLEN KOMPONENSEKET TARTALMAZÓ PUFFEREK NEM OLDÓDNAK!!!!!
• • • • • •
ammónium-acetát/ecetsav ammónium-formát/ hangyasav MS, ELSD, CAD kombabilitás ammónium-citrátok/citomsavak tris/tris HCl trietilamin-foszfát
• pH tompító hatású anyagok: • hangyasav • ecetsav • trifluorecetsav
A pufferkapacitás pH és koncentrációfüggése ammóniumacetát puffer alkalmazásakor
• Víz: skálát 0 és 14 között értelmezzük • Metanolnál ez az érték 16,77 a pH skála ennek megfelelıen 0 és 16,77 között értelmezendı • Acetonitril-víz esetén a pKa érték 34,40 • Tetrahidrofurán-víznél 34,70.
• Kérdés: nagy a szerves oldószer tartalom, akkor Mi a hidrogén-ion aktivitás az oldatban, pKa változás, hova pufferoljunk Mi a hidrogén-ion aktivitás a határfelületen, meddig stabil a kolonna
• Az ajánlott módszer, hogy az
elsıdleges és/vagy másodlagos pufferekbıl tömeg szerint összemérjük az oldatokat, és a nemzetközileg elfogadott értéket használjuk. Ez egyértelmő, mindenhol
reprodukálható. Amennyiben táblázatban az adott összetételt és a hozzá tartozó pH értéket nem találjuk meg, akkor a tiszta komponensekbıl törzsoldatot készítünk, ezek pH-ja adott és a megadott arányokban összemérjük, és mérjük a pH értéket. A tömegmérés az egyik legpontosabb analitikai mérésünk.
• • •
Az analitikai-kémiai számításoknál megismert közelítı képlet alapján számítást végzünk: pH=pKa+log Csó/Csav a képlet alapján kiszámoljuk, hogy 0,01 mól/l savhoz mennyi bázist kell adni, hogy 4-es legyen a pH értéke. Készítsünk ecetsav-ammóniumacetát puffert. pKa=4,76, ekkor bemérünk 0.01 mol ecetsavat egy 1000 ml-es normállombikba, majd a számítás alapján hozzáadunk 0,015 mol ammónium-hidroxidot, és 1 l-re egészítjük ki. A pH csak körülbelül lesz 4-es értékő, mert a bázisnál nem vettük figyelembe az aktivitásfüggést ( lásd Debey-Hückel elmélet vagy Bates-Guenheim közelítés). A hidrogén-ion aktivitás függ a disszociációs állandótól, az egyéb ionoktól, és a mozgó fázisban mért valódi hidrogénion aktivitás, az önprotonálódási állandótól
.
• Módszer: bemérjük az ecetsavat és ammónium-hidroxiddal-dal 4-es pH értékig titráljuk. Ismételten a hidrogénion aktivitás meghatározatlansága okoz bizonytalanságot a retenció reprodukálásában.
• Módszer: a fenti mőveletet a mozgófázisban hajtjuk végre. A mozgófázishoz hozzámérjük az ecetsavat, és NH4OH oldattal titrálva állítjuk be a pH értéket. Ekkor a vízre vonatkoztatott értékhez képest megkapjuk a vízre kalibrált, de a mozgó fázisban mért pH értéket, amely eltér a vízre vonatkoztatottól és a szerves oldószerre vonatkoztatottól is.
• Mérjük a puffer pH-t és ehhez adjuk a szerves oldószert • Kalibráljuk az üvegelektródot az elsıdleges és/vagy másodlagos pufferekre, és utána a kész mozgófázisban mérjük a pH-t • A kalibrációnál az elsıdleges és/vagy másodlagos puffereket a mozgófázisba mérjük be, és a mérést is a mozgófázisban végezzük el.
A pH és a pKa változása a vízben mérthez
Savas csoportot tartalmazó vegyületek elválasztása savas pufferrel. Az 1. görbe a vizes közegben adja meg a vizsgálandó vegyületre a molekuláris formák arányát, a 3. nagy szerves oldószer tartamú közegben. A 2. és 4. görbék a puffer ionizációs viszonyait adják meg vízben és nagy szerves oldószer tartamú közegben
A puffer bázikus összetevıjének és a szerves vegyület bázisos csoportjának pKa értét eltolódása a mozgófázis szerves oldószer tartalmának változtatásával. Jelölések:1. puffer vizes közegben, 2. bázikus csoportot tartalmazó vegyület vízben, 3. puffer 60 v/v% szerves oldószerben, 4. bázikus csoportot tartalmazó vegyület 60 v/v% szerves oldószerben
A szaggatott vonallal jelölt görbék a vízre megadott ionizációs viszonyokat tartalmazzák, a folytonos a szervesoldószer hozzáadása után kialakultakat. A jobb oldalon a savas puffer (formiát vagy acetát) változása, míg a baloldalon a bázisos vegyületé látható.
