Možnosti využití elektromigračních technik při studiu vlastností mikroorganismů
Anna Kubesová
Osnova • Candida Kapilární elektromigrační techniky • •
Výsledky Závěr
Planární elektromigrační techniky • •
Výsledky Závěr
• Pseudomonas syringae • Výsledky • Závěr
Candida ‘‘Psilosis’’ • Candida “psilosis”– fenotypově nerozlišitelné: C. orthopsilosis C. metapsilosis C. parapsilosis • Candida parapsilosis – patogen pro pacienty se sníženým imunitním systémem.
• Candida “psilosis” - Kapilární elektromigrační techniky - Planární elektromigrační techniky
Candida ‘‘Psilosis’’ biofilm
Výsledky A pH gradient 3,6-4,0 Katolyt: 4 x 10-2 molL-1 Na OH 0,3% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Anolyt: 0,1 molL-1 H3PO4 Vzorek: 8 x 107 buněk v 1 ml 15 x 10-3 molL-1NaCl 1% (w/v) PEG 10 000 B pH gradient 3,6-4,0 Katolyt: 0,6% (w/v) PEG 4000
Kapilární izoelektrická fokusace
Výsledky A pH gradient 3,8-4,0
Kapilární izoelektrická fokusace
Katolyt: 2 x 10-2 molL-1 Na OH 0,1% (w/v) PEG 10 000 1% EtOH Anolyt: 0,1 molL-1 H3PO4 Vzorek: krevní sérum B pH gradient 3,8-4,0 Katolyt a anolyt stejný jako u A Vzorek:
3x 107 buněk v 1 ml krevního sera 3% EtOH 2% (w/v) PEG 10 000
Výsledky A: fosfátových pufr 1×10−2 molL−1 (pH 8,4) 0.6% (w/v) PEG 4000 3% (v/v) EtOH Vzorek: 8×107 buněk mL−1 PSS B: fosfátový pufr 1×10−2 molL−1 (pH 8,4) 0.3% (w/v) PEG 10,000 3% (v/v) EtOH Vzorek: 8×107 buněk mL−1 PSS s 1% (w/v) PEG 10,000
Kapilární zónová elektroforéza
Závěr • V této studii byly pomocí cIEF a CZE analyzovány vždy tři zástupci každého ze studovaných biofilm-pozitivních a biofilm-negativních druhů C. “psilosis” • Navrhované kapilární elektromigrační metody dokáží rychle, spolehlivě separovat a identifikovat jednotlivé druhy C. „psilosis” včetně jejich biofilmových forem.
Výsledky Vzorky: Vysráženo vždy 100 μg proteinu a rozpuštěno v 100 μl pufru. Dávkováno 15 μl vzorku na gel. Gel: Separační gel 4-20% T. Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250.
SDS-PAGE C. orthopsilosis (FS 72, PH 94 – biofilm-negativní), C. metapsilosis (PH 86, FS 58 – biofilm-positivní; PH 87, PH 88 – biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16, BC 11 – biofilm-positivní; BC 8, BK 75 – biofilm-negativní)
Výsledky Vzorky: Dávkováno 15 μl vzorku lyzátu na gel. pH gradient: 3-10 Separační gel 5% T. Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250.
IEF C. orthopsilosis (FS 72, PH 94 – biofilm-negativní), C. metapsilosis (PH 86, FS 58 – biofilm-positivní; PH 87, PH 88 – biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16, BC 11 – biofilm-positivní; BC 8, BK 75 – biofilm-negativní)
Výsledky Vzorky: Vysráženo vždy 100 μg proteinu a rozpuštěno v 200 μl rehydratačním pufru. Dávkováno 125 μl vzorku na IEF strip. IEF: ReadyStrip IPG Strip, lineární pH gradient 3–10, délka 7 cm od firmy Bio-Rad. Napětí:150 V (50 V h, li near),600 V (600 V h, linear), 1500 V (1500 V h, linear) and 4000 V (15000 V h, rapid) SDS-PAGE Gel: Separační gel 4-20% T. Napětí 180V Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250.
C. orthopsilosis
C. metapsilosis (+)
C. metapsilosis (-)
C. parapsilosis (-)
C. parapsilosis (+)
Výsledky
MALDI TOF MS C. orthopsilosis (FS 72 biofilm-negativní), C. metapsilosis (FS 58 biofilm-positivní; PH 88 biofilm-negativní) and C. parapsilosis (BC 16 biofilm-positivní; BK 75 biofilm-negativní)
Závěr • Pomocí planárních elektromigračních technik a MALDI TOF MS vybrané kmeny studovaných biofilmpozitivních a biofilm-negativních kmenů C. "psilosis". • Naše výsledky ukazují, že všechny použité techniky jsou schopny identifikovat jednotlivé druhy C. "psilosis" a především 2-DE a MALDI TOF MS dokáží identifikovat i jejich biofilmové formy.
Patovary Pseudomonas syringae • Patovary Pseudomonas syringae – rostlinné patogeny • Plynová chromatografie – nedostatečná databáze • CZE, cIEF, IEF a MALDI TOF MS.
Výsledky Kapilární izoelektrická fokusace A pH gradient 2,0-4,7 Katolyt: 4 x 10-2 molL-1 Na OH 0,1% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Anolyt: 0,1 molL-1 H3PO4 0,1% (w/v) PEG 4000 1% EtOH Vzorek: 1x 107 buněk v 1 ml 15 x 10-3 molL-1NaCl 3% EtOH 2% (w/v) PEG 10 000
Výsledky Identifikace plynovou chromatografií methyl esterů mastných kyselin.
strain
source
percentage of probability by GC identification
Pseudomonas corrugata
IVIA 614.5.344 CFBP 5324 CFBP 490144 CFBP 546544 CFBP 666344
Pseudomonas syringae pv. Syringae43
CCM 2870 CCM 2114 CCM 2868 Isol. PPBOL 1048 Isol. PPBOL 1049 Isol. PPBOL 1050 Isol. PPBOL 1054 Isol. PPBOL 1055 Isol. B, PPBOL 31/08 Isol. B, PPBOL 32/08
Pseudomonas syringae pv. persicae
LMG 5184 LMG 5078 LMG 5566 LMG 5568 LMG 5569
Pseudomonas syringae pv. maculicola Pseudomonas syringae pv. tomato
LMG 5071
P. syringae 86.3 % 2.4 P. putida 82.0 % 2.4 P. putida 78.0 %, P. corrugata 40.3 % 2.4 P. corrugata 66.4 % 2.4 P. corrugata 63.1 %, 61.8 % 2.4 pI = 2.4, RSD = 1.1 % P. s. syringae 71.7 % 3.1 P. s. 94,5 % 3.1 P. s. syringae 73.0 %, 73.7 % 3.1 P. s. syringae 84.0 % 4.8 no results 3.1 P. s. syringae 84.0 % 3.1 not identified 3.1 not identified 3.1 P. viridiflava 90.7 %. P. s. syringae 84.9 % 3.1 P. s. syringae 92.0 % 3.1 pI = 3.1, RSD = 0.9 % P. viridiflava 93.1 %, P. syringae 90.3 % 3.4 P. syringae 35.9 % 3.4 P. syringae 34.2 % 3.4 P. syringae 41.0 % 3.4 P. syringae 37.0 % 3.4 pI = 3.4, RSD = 0.7 % P. s. maculicola 63.9 % 3.7 pI = 3.7, RSD = 1.4 % P. s. tomato 74.7 % 4.0 P. s. syringae 92.9 %, P. viridiflava 84.3 % 4.0 P. viridiflava 91.2 %, P. syringae 91.1 % 4.0 P. viridiflava 93.6 %, P. syringae 92.5 % 4.0 P. s. tomato 86.1 % 4.0 P. syringe 93.2 % 4.0 P. syringae 90.1 %, P. s. tomato 66,2 % 4.0 P. syringae 92.9 %, P. s. syringae 92.9 % 4.0 pI = 4.0, RSD = 1.2 % P. s. mori 94.6 % 4.1 P. s. morsprunorum 96.3 %, 96.9% 4.1 P. syringae 95.7 %, P. s. mori 95.7 % 4.1 pI = 4.1, RSD = 1.5 % P. viridiflava 80.3 %, P. s. syringae 74.6 % 4.5 P. viridiflava 94.1 %, P. s. syringae 88.7 % 4.5 P. viridiflava 92.8 %, P. s. syringae 92.7 % 4.5 P. syringae 95.5 %, P. s. morsprunorum 95.5 % 4.5 P. s. syringae 92.9 % 4.5 pI = 4.5, RSD = 0.8 % P. syringae 94.2 % 4.8 P. s. syringae 75.0 % 4.8 P. s. syringae 93.9 % 4.8 no results 4.8 no results 4.8 pI = 4.8, RSD = 1.0 %
IVIA 1733.344 CFBP 1326 CFBP 221244 CFBP 542244 CFBP 2546 CCM 7018 CCM 7019 Isol. B, PPBOL 106/08
Pseudomonas syringae pv. morsprunorum
CCM 2859 CCM 2534 CCM 2860
Pseudomonas syringae pv. mori
IVIA 1003.1a CFBP 1642 Isol. B, PPBOL 141/08 Isol. B, PPBOL 104/08 Isol. B, PPBOL 46/04
Pseudomonas syringae pv. lachrymans
CFBP 1644 CFBP 6465 CFBP 6462 CCM 2857 Isol. VURV 601743
pI
Výsledky Kapilární zónová elektroforéza Taurine-Tris pufr 1,5×10−3 molL−1 (pH 8,4) 0.1% (w/v) PEG 4000 1% (v/v) EtOH Vzorek: 8×107 buněk mL−1 PSS 1% (w/v) PEG 10 000
Výsledky Vzorky Dávkovány 4 μl vzorku lyzátu na gel
pH gradient Separační gel 5% T
3-10Barvení: Coomassie Brilliant Blue G-250
Výsledky MALDI-TOF MS spektra MALDI-TOF MS spektra proteinů Pseudomonas siringae. Jako matrice byla použita kyselina sinapová.
Závěr •
Všechny použité techniky jsou schopny identifikovat jednotlivé patovary Pseudomonas syringae.
•
Zvláště doplnění výsledků plynové chromatografie o výsledky kapilární isoelektrické fokusace, může být pro analýzu patovarů bakterií velice přínosné.
Děkuji za pozornost a přeji krásné vánoční svátky.
