Monitorování hladin jednotlivých antimykotik pomocí HPLC E. Klapková, R. Průša ÚKBP, 2. LF UK a FN Motol
20.9.2010
Invazivní mykotické infekce (IFI) bakteriální infekce
X
IFI ↓ výskyt ↑morbidita a mortalita
příčiny: pokroky v lék. péči agresivní terapeutické přístupy transplantace solidních orgánů nádorová onemocnění (hematologické malignity) Spektrum invazivních mykóz
6% 3% 8% 9%
Aspergillus 44%
Candida jiné plísně nespecifikované plísně Zygomycetes Fusarium
(Pappas PG. Transnet database FOFI 2005)
30%
Antimykotika Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B) místo působení - buněčná membrána Azolová antimykotika (itrakonazol, flukonazol, vorikonazol, posakonazol) místo působení – buněčná membrána Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin) místo působení – buněčná stěna Ostatní (flucytosin) místo působení – mykotická RNA
Polyenová antibiotika (nystatin, amfotericin B) • chemicky podobné látky (streptomycety) • účinek: fungicidní zabudování do biol. membrány vznik hydrofilních pórů
nystatin – lokální aplikace amfotericin B – široké spektrum lokálně – kandidózy intravenózně – poškození ledvin
Azolová antimykotika (ketokonazol, itrakonazol, flukonazol, vorikonazol, posakonazol) Imidazolové deriváty (ketokonazol, mikonazol…)
Triazolové deriváty (itrakonazol, posakonazol, vorikonazol)
itrakonazol
flukonazoll
účinek fungistatický především na kvasinky (Candida), vláknité houby (Aspergillus) (Scedosporium, Fusarium), ale i mikromycety Antimykotický efekt inhibice cytochromu P450 – 14 – α – demethylasy hromadění nefunkčních sterolů (defektní mem.) schopnost inhibice konidiace v pořadí účinnosti: vorikonazol >> posakonazol > itrakonazol
pacienti s vysokým rizikem – preventivní antimykotická léčba (itrakonazol) pacienti s prokázanou systémovou infekcí – cílená dlouhodobá léčba (vorikonazol, posakonazol)
Vorikonazol – inhibice syntézy ergosterolu kandid 10 x účinněji než flukonazol (C. krusei) fungistatické působení oproti amfotericinu B lék 1. volby invazivní aspergilózy, kandidózy
Itrakonazol – metabolizován v játrech na aktivní metabolit hydroxyitrakonazol ve steady state jsou přítomny itrakonazol a hydroxyitrakonazol v poměru 1:1 – 1:2 nutné stanovovat oba analyty
Echinokandiny (kaspofungin, anidulafungin, mikafungin)
• nová skupina antimykotik, vysoká tolerance • lipopeptidy ~1200 kD • odlišný mechanismus účinku – buněčná stěna • kandidy – fungicidní; aspergily – fungistatický • odlišná biotransformace, mimo cytochrom P-450 • pouze nitrožilní podání lineární farmakokinetika
výhodné
Buněčná stěna Candida albicans
Bennett JE. Echinocandins for candidemia in adults without neutropenia. N Engl J Med 2006; 355: 1154–1159
Je nutné monitorovat antimykotika? • nutnost monitorování hladin při perorální léčbě – porucha vstřebávání ze zažívacího traktu • azolová antimykotika – ovlivnění enz. procesů na cyt. P-450 klíčový enz. systém hepatocytů v biodegradaci léčiv • inter a intraindividuální variabilita
Lékové interakce závažné lékové interakce: barbituráty, karbamazepin, sirolimus, rifampin,… léky snižující koncentraci: fenytoin, nevirapin, rifabutin léky zvyšující koncentraci: ritonavir, omeprazol, delaviridin léky, jejichž koncentraci zvyšují: warfarin, cyklosporin, takrolimus, statiny, benzodiazepiny
Terapeutické rozmezí itrakonazol Prevence: 0,5 – 1 mg/l Terapie: 1 – 3 mg/l
posakonazol a vorikonazol Účinné: 0,5-2,5 mg/l Tolerované z hlediska nežádoucích účinků: 2-4 mg/l Toxická koncentrace: > 4 mg/l Stabilita vzorku 1 týden laboratorní teplota 2 týdny 2 – 8°C 2 měsíce -20 °C
Kapalinový chromatograf Agilent 1200
degasser kvartérní pumpa autosampler termostat kolon DAD detektor
příprava vzorku na stanovení itrakonazolu a metabolitu: 1 ml séra + 100 μl I.S. (ketokonazol) protřepat přidat 5 ml extrakční směsi (heptan:isoamylalkohol; 9:1) 5 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 4 ml org. vrstvy sušení při 50 °C rozpuštění odparku ve 150 μl MF
Chromatografické podmínky DAD detektor, 255 nm MF: ACN:metanol:fosfátový pufr 50mM (45:20:35) průtok MF: 2,0 ml/min kolona: Agilent Zorbax SB C18, 5 μm t: 40 °C
Kalibrační standard: Chromsystems Itrakonazol – 0,70 mg/l Hydroxyitrakonazol – 0,91 mg/l Sérové kontroly: Chromsystems Level I Itrakonazol – 0,153 – 0,225 mg/l Hydroxyitrakonazol – 0,23 – 0,351 mg/l Level II Itrakonazol – 0,288 - 0,432 mg/l Hydroxyitrakonazol – 0,44 – 0,67 mg/l Level III Itrakonazol – 1,08 – 1,62 mg/l Hydroxyitrakonazol – 1,89 – 2,79 mg/l
Kalibrátor
I.S.
OH itrakonazol
itrakonazol
Khoschsoru, Freuhwirth, Zelzer: Antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, 3569-3571
Analýza pacientského vzorku
I.S. OH itrakonazol Itrakonazol
Možnost společného stanovení itrakonazolu a vorikonazolu
příprava vzorku na stanovení posakonazolu a vorikonazolu: 100 μl plazmy + 100 μl I.S. (ketokonazol) protřepat přidat 3 ml extrakční směsi (hexan:dichlormetan; 7:3) 20 min třepat centrifugace (5 min, 3000 ot/min) odpipetovat 2,5 ml org. vrstvy sušení při 30 °C rozpuštění odparku ve 150 μl MF
Chromatografické podmínky DAD detektor, 255 nm MF: ACN:voda:fosfátový pufr 50mM (52.5:0,25:45) průtok MF: 0,5 ml/min kolona: Agilent Eclipse C8, 5 μm, 250 mm t: 25 °C
Kalibrace
vorikonazol
posakonazol I.S.
Chhun S., Rey E., Tran A.: Simultaneous quantification of voriconazole and posakonazole in human plazma by HPLC with UV detection, J. of chromatography
Standard vorikonazol a posakonazol – komerčně nedostupné Interní kontrola kvality – 2 hladiny Externí kontrola kvality
Kontrola Chromsystems
I.S.
posakonazol
Validace metody Opakovatelnost Analyt
CV (%)
koncentrace (mg/ml) (průměr ± SD)
CV (%)
Výtěž nost (%)
0,38 ± 0,01
3,92
0,73 ± 0,04
5,5
96,2
1,45 ± 0,07
4,16
1,01 ± 0,06
5,9
Hydroxyitrakonazol
0,54 ± 0,01
0,96
1,1 ± 0,02
1,8
2,21 ± 0,04
1,83
1,43 ± 0,03
2,1
Vorikonazol
0,52 ± 0,02
3,50
0,51 ± 0,03
6,7
1,17 ± 0,05
4,19
1,22 ± 0,07
5,7
0,46 ±0,02
4,34
0,48 ± 0,03
6,5
1,18 ± 0,04
4,77
1,22 ± 0,07
5,6
Itrakonazol
Posakonazol
koncentrace (mg/ml) (průměr ± SD)
Reprodukovatelnost
95,7 103,1 98,1
Závěr •
vyvinuta metoda umožňující stanovení itrakonazolu a hydroxyitrakonazolu v séru
•
vyvinuta metoda umožňující stanovení posakonazolu a vorikonazolu v plazmě
•
jednoduchá příprava vzorku, vysokou stabilitou
•
nevýhody – žádný kontrolní materiál, nedostupnost analytických standardů pro kalibraci
•
zkušený personál
Děkuji Vám za pozornost
