Molekuláris genetikai vizsgáló
módszerek az immundefektusok diagnosztikájában
Primer immundefektusok A primer immundeficiencia ritka, veleszületett, monogénes öröklődésű immunhiányos állapot. Családi halmozódást mutathatnak.
A génhiba következménye: az immunsejtek számbeli és/vagy funkcionális csökkenése
Vizsgált gének száma 100
2004-2015 között
80
69
69
62 60
47
49
42 40
34
34
2008
2009
26 20
19
0 2004-2006
2007
2010
2011
2012
2013
2014
2015
Vizsgált gének száma BETEGSÉG GÉNEK SZÁMA __________________________________________________
PID
59
LSD
4
Egyéb
6
Összeses
69
Elvégzett genetikai vizsgálatok száma 2004-2015 között 1400 1208
1200
1132
PID genes
1046
Other genes
1000
1232
992
960
Total
761
733 649
926 845
816
800
1012
630 556
600 489 482 347 357
400 272 184 184
200 61 61
0 2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
2015
Elvégzett genetikai vizsgálatok száma 2004-2015 között BETEGSÉGEK VIZSGÁLATOK SZÁMA ___________________________________________________________________ PID
1012
Egyéb
220
Összesen
1232
Prenatalis vizsgálat
35
GENETIKA = ÖRÖKLÉSTAN - a gének, - az öröklődés, - az élőlények variációjának tudománya 1819 Festetics Imre az öröklődés számos szabályszerűségét megfogalmazása 1865
Gregor Mendel – genetikai törvények, kersztezés
1903
Kromoszóma felfedezése
1913
A kromoszómák lineárisan rendezett gének sorát tartalmazzák
1927
A génekben lejátszódó fizikai változásokat mutációnak nevezik
1941
A gének kódolják a fehérjét.
1944
Elősször izolálják a genetikai anyagot, a DNS-t
1953
James D. Watson és Francis Crick DNS szerkezetének a megismerése
1983
Kary Banks Mullis polimeráz láncreakciót (PCR-t) DNS sokszorosítása
1989
Francis Collins és Lap-Chee Tsui Az első gén szekvenálása (CFTR fehérje, cisztikus fibrózis)
2003 . 04.01. GÉNTERÁPIA
A Humán Genom Projekt sikeres befejezése a genom 99%-nak szekvenálása
Örökítő anyag
23 pár kromoszóma
A kromoszómák génekből épülnek fel
A gének DNS-ből állnak A DNS nukleotidokból épül fel
A
T
C A
G T
A C
T G
DNS Exon 2
Exon 1 Intron 1
Exon 4
Exon 3 Intron 2
Intron 3
Éretlen RNS Exon 2
Exon 1 Intron 1
Exon 4
Exon 3
Intron 2
Intron 3
Érett RNS 5”CAP
Fehérje
Exon 1 Exon 2
Exon 3
Exon 4
3”PolyA
MUTÁCIÓ Örökítő anyag megváltozása Kromoszóma számbeli és méretbeli megváltozása Gén bázissorendjének a megváltozás Funkció vesztés Funkció nyerés Káros Hasznos (Leiden-mutáció, véralvadás zavara)
Öröklődés típusai X-kromoszómához kötött
XX XY XX XX XY XY
Autoszómális domináns
Autoszómális recesszív
DE NOVO
MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLAT JELENTŐSÉGE Klinikai diagnózis megerősítése Korai diagnózis felállítása Időben elkezdett, megfelelő terápia a beteg életminősége javul, jobb prognosztika Családtagok vizsgálata Családfa készítése Öröklődés menetének megismerése Hordozó állapot felderítése
Családtervezés segítése
MÓDSZEREK DNS izolálás Amplifikációs PCR Szekvenálási PCR
DNS szekvenálás Kiértékelés adatbázis segítségével
3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
Btk Gén elhelyezkedése: X -kromoszóma; Xq21,3-Xq22 Mérete: 37,5 kb Exonok száma: 19 (18 kódoló)
Gene Cards GC0XM100491
BTK, 16 exon I.
c.1573 C>T
p.R525X
II.
I/1
II/1
G C T C G A A G C T T G A A
G C T C G A A G C T T G A A
Kontroll
II/2
1
PH
TH
SH3
SH2
1
PH
TH
SH3
SH2
G C T T G A A
G C T
659
SH1
SH1
C G A A
525
Azonosított genetikai eltérések Csendes mutáció
(C>A TCCTCA
szerinszerin)
Polimorfizmus (SNP) Ismert mutáció (irodalom, adatbázisok alapján) Új mutáció
patogenitást igazolni kell
Patogenitás igazolása Nonsense mutáció, deléció, inszerció
önmagában elegendő
Splicing mutáció, missense mutáció
további vizsgálatokat igényel
Geneteikai eltérés jelenléte az egészséges populációban Mutáció helyzete Fehérje jelenléte Fehérje funkciója
Sejtes vizsgálatok
MUTÁCIÓ HELYE PH
1
TH
SH3
SH2
SH1
Lindvall et al., 2005.
10 AMINÓSAVAK TULAJDONSÁGA
Fenilalanin
Tirozin
apoláros hidrofób
poláros hidrofil 10
AMINÓSAV KONZERVÁLTSÁGA
Lindvall et al., 2005.
patkány egér human csimpánz csirke
659
Gén kifejeződése
Relative SH2D1A expression
1
1 Kontroll Anya
0,8
Beteg
0,62 0,6 0,4 0,2 0 0
Western-blot C
WT
G245D
C
WT
F570L
70 kDa
ά-FLAG
ACTIN
41,7 kDa
40 µg 40 µg
40 µg 150 µg
40 µg 40 µg
40 µg 150 µg
Relatív enzimaktivitás (%)
SMPD1 enzimaktivitása és fehérje fél-életidő vizsgálat
Szubsztrát:
2-N-Hexadecanoylamin-4-nitrophenolphosphorylcholine 15 mM / reakció
IL-17+ and IL-22+ T sejtek 4,5
Percentage of cells (%)
4 3,5
Kontroll Beteg
3 2,5 2
1,5 1 0,5 0 CD3+/IL-17+
CD3+/IL-22+
CD4+/IL-17+
CD4+/IL-22+
Kontroll
APS1 (AIRE)
257
I. m/vt
AIRE, 6. exon c.769C>T p.R257X
m/vt
C T
C T
257
257
II. m/vt C T
257
m/vt
m/m
C T
257
257
p.Arg257Stop
Mark Saltis et al.,2008
SÚLYOS KOMBINÁLT IMMUNDEFICIENCIA I.
IL2RG gene
c.295insA II.
V99fsX11 Kontroll
Beteg1 (II/1)
insA
Beteg 2 (II/2)
Anya (I/1)
insA insA
prenatal
Molekuláris genetikai vizsgálat fontossága A mutáció analízise elengedhetetlen a pontos diagnózishoz Családtagok szűrése
hordozó állapot felderítése korai diagnózis a tünetek megjelenése előtt prenatalis vizsgálat Időben elkezdett, megfelelő terápia Betegek állapota, életminősége és a betegség prognosztikája javul
