Moderní elektrochemické metody

BEST Servis, Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Katedra analytické chemie, UNESCO Laboratoř elektrochemie životního prostředí, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze

Moderní elektrochemické metody

Květen 2009 ISBN 978-80-254-3997-5

1

Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.

Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé xerox kopie).

2

Elektrochemická a chemická redukce guaninu a 8-azaguaninu Libuše Trnková a, Kamila Neplechová a, Zdenka Balcarová a, Luděk Havran b, Miroslav Fojta b Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Universita, Kotlářská 2, 611 37 Brno [email protected] Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno Úvod Pochopení redukce nebo oxidace bází nukleových kyselin v různých prostředích může pomoci objasnit mechanismus procesů DNA spojených s přenosem elektronů, včetně jejího poškození. Je známo, že ve vícestupňovém transportu náboje v DNA je hlavním aktérem guanin (G) jako nukleobáze s nejnižší hodnotou oxidačního potenciálu1. Jak je tomu v případě 8-azaguaninu (8-azaG) se snaží naznačit naše práce. O

O N

HN NH

2

N

N

HN

NH

NH 2

N

N NH

8-azaG

G

8-azaguanin (2-amino-6-oxo-8-azapurin) je syntetický analog guaninu a má široké uplatnění v moderní biologii, biochemii a medicíně. Snadno se inkorporuje do DNA, čímž zasahuje do metabolismu buněk. Má cytostatické účinky. V oblasti molekulární biologie se využívá analog GTP 8-azaguanosin-5’-trifosfát (8-azaGTP), který slouží ke sledování genových mutací. Fluorescenční vlastnosti 8-azaG jsou často využívány ke studiu ionizačních stavů aktivních míst RNA enzymů. Proto zkoumání přenosu elektronu v roztoku i na nabitém fázovém rozhraní je u G a jeho analogů stále aktuální a dalšímu výzkumu v této oblasti prospěšné. Elektrochemická redukce G a 8-azaG byla zkoumána na rtuťové elektrodě v prostředí fosfátového-acetátového pufru pomocí cyklické a eliminační voltametrie. Chemická redukce byla studována v roztoku s tetrahydridoboritanem sodným (NaBH4) pomocí UV-Vis spekter. Je známo, že elektrochemická redukce guaninu v sobě zahrnuje komplexní proces v závislosti na katalytické redukci protonu. Redukce probíhá na imidazolovém kruhu fixací 2 elektronů a jednoho nebo dvou protonů. Elektroredukce guaninu (G) na rtuťové kapkové elektrodě probíhá při velmi negativních potenciálech (v závislosti na pH a složení roztoku) zápornějších než –1.6 V. Jeho redukční signál není běžnými elektrochemickými metodami detekovatelný z důvodu redukčních procesů vodíku, vody nebo komponent základního elektrolytu2-4. S použitím potenciostatické makroelektrolýzy společně s analýzou pomocí NMR spekter bylo prokázáno, že redukčním produktem je 7,8-dihydrogenguanin3. Mikroelektrolýza na rtuťové kapce detekovaná rychlou rychlostí polarizace ukázala, že redukční produkt G může být v závislosti na experimentálních podmínkách oxidován zpět na původní G. Odezvou je anodický signál kolem potenciálu -0.2 V (vs. Ag/AgCl/KCl), který má značné analytické využití, jelikož poloha N7 imidazolového kruhu reprezentuje klíčové vazebné místo antitumorových agens, kovů a mutagenních látek. Proto je anodický pík G často považován za indikátor (a) změn struktury oligo- a polynukleotidů, (b) jejich interakcí s komponenty v roztoku a (c) různých typů kovalentních aduktů5-7. Náš výzkum ukázal, že vylučování vodíku (hydrogen evolution reaction - HER) v redoxním procesu guaninu hraje podstatnou roli.

3

Navíc je situace komplikována katalytickým vylučováním vodíku v přítomnosti neredukované i redukované nukleobáze. K vysvětlení úzké souvislosti HER s redukčním procesem G může pomoci eliminační voltametrie (EVLS - Elimination Voltammetry with Linear Scan)8-12 s využitím přímé a zpětné, neboli reverzní, polarizace elektrody. Z hlediska aplikace EVLS na voltametrické signály jsou pro studium redukčních i oxidačních procesů nejčastěji používány dvě eliminační funkce eliminující kinetickou složku proudu I k a zachovávající složku difúzní I d , přičemž kapacitní složka I c je buď zkreslena (E1) nebo také eliminována (E4). Potom tyto EVLS funkce mají tvar: E1. : f ( I ) = − 3.4142 I 1 2 + 3.4142 I a E4. : f ( I ) = −11.657 I 1 2 + 17.485 I − 5.8284 I 2 , kde f ( I ) je označení pro eliminační funkci,

I 1 2 a I 2 jsou celkové voltametrické proudy měřené při poloviční nebo dvojnásobné rychlosti polarizace než je rychlost polarizace pro referenční proud I . Materiály a metody Použité chemikálie G, 8-azaG, NaBH4, Na2SO3, stejně jako složky FA pufru byly zakoupeny od Sigma Aldrich Chemical Corp. USA s čistotou p.a. nebo ACS. Všechny roztoky byly připravovány v třikrát destilované vodě z křemenné aparatury. Voltametrické křivky byly zaznamenány na elektrochemickém analyzátoru AUTOLAB 20 (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) ve spojení se stojanem VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). V použitém tříelektrodovém zapojení byla pracovní elektroda rtuťová visící kapka (HMDE), pomocná elektroda platinový drátek a referenční elektroda Ag/AgCl/3M KCl. Rychlosti polarizace 0,625 až 5 V/s byly registrovány s potenciálovým krokem 2 nebo 5 mV. Elektrochemické experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. Výpočty pro EVLS byly provedeny v Excelu (Microsoft, USA). Absorpční UV spektra byla měřena na Unicam UV/Vis spektrofotometru UV4 (Cambridge, UK) v 0.5 cm kyvetě. pH bylo měřeno pHmetrem CyberScan PC 5500 (Eutech Instruments, Nijkerk, Netherlands) pomocí elektrody Single pore glass. Roztoky ve spektrálním experimentu byly po dobu 20 minut probublávány dusíkem a uchovávány v ledové lázni před každým záznamem spektra. Výsledky a diskuse Elektrochemická redukce G, která vede ke vzniku 7,8–dihydrogenguaninu, je spřažena s procesem vylučování vodíku. Reakce není doprovázena destrukcí skeletu purinové baze a ke zpětné oxidaci na původní molekulu G může dojít kromě elektrodového procesu i vlivem vzdušného kyslíku. Totéž bylo zjištěno v případě jeho derivátu 8-azaG, jehož redukční produkt je oxidován zpět na původní bázi při pozitivnějším potenciálu, než je tomu u G (Obr. 1). Nejvyšší odezva anodického píku G i 8-azaG byla potvrzena při aplikaci zpětné polarizace rtuťové elektrody, kdy potenciálový bod obratu odpovídal počátečnímu potenciálu normální polarizace. Byla sledována závislost výšky a polohy píku na pH a na rychlosti polarizace elektrody. Na základě průběhu jednotlivých eliminačních funkcí, zejména E1 a E4, byl diskutován mechanismus celkového redoxního procesu G a 8-azaG a jejich provázanost s redukcí vodíku. Průběh chemické redukce G a 8-azaG pomocí NaBH4 ve vodném prostředí byl sledován pomocí absorpčních spekter. Vzhledem k tomu, že při laboratorní teplotě je průběh reakce velmi rychlý, vzorky probublané dusíkem se udržovaly v ledové lázni. Tetrahydridoboritan sodný (NaBH4) slouží jako redukční činidlo a použití Na2SO3 bylo zamýšleno k zabránění zpětné oxidace redukčního produktu během měření spekter. V průběhu reakce vzniká v absorpčním spektru nové maximum kolem 315 nm (Obr.2).

4

1.50

8-azaG

I (uA) 0.50

G

-0.50 1.50 I (uA)

-1.50

8-azaG

1.10 0.70

G

0.30

-2.50

-0.10 -0.50 -350

-3.50 -1800

-1300

-250

-150

-800

-50

-300

E (mV)

50

E (mV)

200

Obr. 1. Cyklický voltamogram G a 8-azaG (5.10-4M) v FA pufru pH 6,0. Rychlost polarizace 2,5 V/s, potenciálový krok 10 mV. Zpětná polarizace elektrody (od -1,75 V do +0,1 V vs Ag/AgCl/3M KCl ). 0.50

G+NaBH4+Na2SO3

A 0.40

0.30

0.20

G+NaBH4 0 min 5 min 10 min 12 min

0.10

15 min 17.5 min 20 min 25 min

0.00 220

240

260

280

300

320

λ (nm) 340

Obr. 2. Absorpční UV spektra G s tetrahydridoboritanem sodným ve fosfátovém pufru pH 7,1 a s Na2SO3 při teplotě 5o C v inertní atmosféře (N2). Kontrola: G ve fosfátovém pufru s NaBH4 bez přídavku Na2SO3. G + redukční směs: G s NaBH4 s přídavkem Na2SO3.

5

Z obrázku je patrný vznik, nárůst i pokles absorpčního maxima okolo 315 nm v časovém intervalu 0 – 25 min. Již podle dřívějších publikací jsme testovali toto maximum jako produkt redukce purinového skeletu. S tímto předpokladem byly zkoumány další deriváty včetně samotného purinu, pyrimidinu a imidazolu. U všech studovaných derivátů byl pozorován vznik absorpčního pásu okolo 315 nm, který byl časově omezený i při nízké teplotě. Na základě tohoto jevu jsme přistoupili k podrobnému studiu spektrálního chování jednotlivých složek reakční směsi a zjistili jsme, že za toto nově vzniklé absorpční maximum je zodpovědná souhra všech použitých složek redukčního prostředí. Závěr Cílem práce bylo porovnání chemické a elektrochemické redukce G a jeho derivátů. Výsledky byly prezentovány na příkladu G a 8-azaG. Za elektrochemickou redukci u obou sledovaných purinů je zodpovědný redukční proces protonů za vývoje vodíku. V obou případech elektrochemická redukce za vzniku 7,8-dihydrogenderivátu není doprovázena destrukcí skeletu purinové báze a k jeho oxidaci může dojít i vlivem vzdušného kyslíku. Abychom zabránili vlivu kyslíku na tuto zpětnou oxidaci při experimentu chemické redukce NaBH4, navrhli jsme přidat do redukční směsi siřičitan. Bylo zjištěno, že absorpční pás okolo 315 nm, v minulosti označován jako absorpční maximum redukčního produktu, byl: (a) ovlivněn přítomností siřičitanu a fosfátového pufru, (b) závislý na poměru složek roztoku a (c) časově omezený i při nízké teplotě. Poděkování Práce byla finančně podporována projekty: INCHEMBIOL (MSM 0021622412), BIO-ANALMED (LC06035) od MŠMT ČR. Literatura 1. Bixon M., Jortner J.: Chemical Physics 326, 252 (2006). 2. Palecek E., Jelen F., Trnkova L.: General Physiology and Biophysics 5, 315 (1986). 3. Studnickova M., Trnkova L., Zetek J., Glatz, Z.: Bioelectrochem. and Bioenerg. 21, 83 (1989). 4. Trnkova L., Studnickova M., Palecek E.: Bioelectrochem. and Bioenerg. 7, 643 (1980). 5. Palecek E., Talanta 56, 807 (2002). 6. Palecek E., Fojta M., F. Jelen, V. Vetterl: The Encyclopedia of Electrochemistry , A.J. Bard, M. Stratsmann (Editors), p. 365, Wiley-VCH, Weinheim, 2002. 7. Palecek E., Jelen F.: Perspectives in Bioanalysis. Vol. 1: Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics, p. 74, E. Palecek, F. Scheller, J. Wang (Editors), Elsevier, New York, 2005. 8. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 9. Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001). 10. Trnkova L.: J. Electroanal Chem 582, 258 (2005). 11. Trnkova L.: in K.R. Adam V. (Editor), Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research, p. 51 Research Signpost, Kerala, India, 2007.

6

Možnosti implementace eliminační voltametrie do elektrochemických analyzátorů Peter Barath a,b, Kateřina Klosová c, Libuše Trnková c a Ústav elektrotechnologie FEKT VUT v Brně, Údolní 53, 602 00 Brno b Ústav anorganické chemie AV ČR, v. v. i., 250 68 Řež c Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova Universita, Kotlářská 2, 611 37 Brno. Email:[email protected] Úvod Potenciálem kontrolované elektrochemické metody poskytují celkový proud, který lze vyjádřit jako sumu dílčích proudů. Některé dílčí proudy lze eliminovat běžnými voltametrickými metodami, jako jsou např. pulzní techniky, které snižují kapacitní složku proudu na zanedbatelnou hodnotu. Eliminační metody, navržené a matematicky zpracované, experimentálně ověřené a rozvíjené, nám umožňují eliminovat nejen kapacitní proudy, ale i jiné vybrané proudy. Podstata eliminace dílčích proudů spočívá v matematické transformaci celkového proudu na proudovou eliminační funkci, která jedny proudy zachová, druhé eliminuje. Zpočátku byla navržena eliminační polarografie (EP), jejíž eliminační procedura spočívá na rozdílných časových závislostech dílčích polarografických proudů. Později byla navržena eliminační voltametrie (EVLS – Elimination Voltammetry with Linear Scan), využívající rozdílných závislostí voltmetrických proudů na rychlosti polarizace. Oproti EP EVLS pracuje na jednodušším základě, nepoužívá časových integrálů a derivací, je rychlejší a lze ji aplikovat i na pevné elektrody 1-5. Bylo zjištěno, že EVLS: a) dává možnost získat dodatečné informace o probíhajících procesech na povrchu elektrody, zejména porovnáním různých eliminačních funkcí, b) poskytuje informaci o nejpomalejším (řídícím) kroku v daném elektrodovém ději, c) umožňuje v případě difúzně řízeného procesu výpočet koeficientu přenosu náboje, b) prostřednictvím eliminace kinetických proudů odkrývá procesy skryté za procesem (např. vylučování vodíku), c) upozorňuje na systém vzájemně se ovlivňujících procesů (katalýza, provázanost, synergie) elektrodových procesů, d) rychle odhalí elektrodový proces v adsorbovaném stavu zkoumaného analytu, e) odráží drsnost elektrodových povrchů, f) zvyšuje citlivost voltametrických metod (LSV, CV) a g) snižuje detekční limit, zejména v případě adsorbující se částice, která v EVLS poskytuje speciální signál (pík-protipík) a tak může do značné míry pomoci bez opravy na základní proudovou línii (baseline correction) může být užitečná pro citlivé analytické stanovení anorganických i organických látek. EVLS jako matematická transformace celkového voltametrického proudu na tzv. eliminační funkci, pomocí které lze eliminovat dílčí proudy z naměřených proudo-napěťových křivek. Tato transformace je založena na dvou předpokladech. Prvním předpokladem je, že se celkový voltmetrický proud I skládá z dílčích (partikulárních) proudů a je roven jejich součtu:

n

I = ∑ I j = I d + I c + I k + .......

(1)

j =1

kde Id značí difúzní proud, Ic kapacitní (nabíjecí) proud a Ik kinetický proud. Druhým předpokladem je, že eliminovaný proud lze vyjádřit jako součin dvou na sobě nezávislých funkcí – funkce rychlosti polarizace Wj(ν) a funkce potenciálu Yj(E): neboli (2) I j = Y j ( E ) ⋅ W j (ν ) I j = Y j ( E ) ⋅ν x konkrétně pro jednotlivé dílčí proudy (difúzní, kapacitní, kinetický): I d = Yd ( E ) ⋅ν 1 / 2 I c = Yc ( E ) ⋅ν 1 I k = Yk ( E ) ⋅ν 0 (3) Pro studium redukčních i oxidačních procesů je nejvíce používaná EVLS funkce eliminující kinetickou složku proudu I k a zachovávající složku difúzní I d , přičemž kapacitní složka I c je buď zkreslena (E1) nebo také eliminována (E4). Potom v případě volby násobku 2: 7

E1. Eliminace I k se zachováním I d ( I c zkreslen): E4. Eliminace kde

Ik a

f ( I ) = − 3.4142 I 1 2 + 3.4142 I

I c se zachováním I d : f ( I ) = − 11.657 I 1 2 + 17.485 I − 5.8284 I 2 ,

f ( I ) je označení pro eliminační funkci, I 1 2 a I 2 jsou celkové voltametrické proudy

měřené při poloviční nebo dvojnásobné rychlosti polarizace než je měřen referenční proud I . V poslední době se naše úsilí zaměřuje na možnost implementace eliminační procedury do elektrochemických analyzátorů. Pokud to prostřednictvím softwarového balíku GPES pro elektrochemické analyzátory EcoChemie nebylo možné, předpokládáme, že v případě softwaru NOVA to bude reálné. Jako representativní experiment byl zvolen redukční proces vodíku na parafinem impregnované grafitové elektrodě (PIGE). Materiály a metody Použité chemikálie byly zakoupeny od Sigma Aldrich Chemical Corp. USA a byly čistoty p.a. Všechny roztoky byly připravovány v deionizované vodě. Voltametrické křivky byly registrovány na elektrochemickém analyzátoru AUTOLAB 302N (EcoChemie, Utrecht, Holandsko) ve spojení se stojanem VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko). V použitém tříelektrodovém zapojení byla pracovní elektroda rtuťová visící kapka (HMDE) nebo PIGE ( pomocná elektroda platinový drátek a referenční elektroda Ag/AgCl/3M KCl. NOVA je nový softwarový balíček firmy EcoChemie určený pro všechny elektrochemické analyzátory Autolab s USB rozhraním 6. Je rozdílná od ostatních voltametrických softwarových balíků. Přináší pro daný potenciostat/galvanostat více flexibility, která spočívá v možnosti sestavení procedur, které na sebe mohou navazovat, mohou se opakovat s volitelným inkrementem, mohou být různě obměňovány tak, aby procedura byla časově méně náročná a byla jednodušší v obsluze. Procedury mohou být použity jako templáty. Vhodným prostředkem jsou i opakované smyčky pro vzájemné napojení parametrů, pak volba inkrementů v různých parametrech, předdefinování souboru dat k rutinní analýze. Jinými slovy můžeme vytvořit velmi dynamickou proceduru, kdy některé parametry se mění během elektrochemického experimentu. Pro představu nastavení LSV parametrů pomocí nového softwarového balíčku NOVA je ukázán Obr. 1.

Obr.1. Nastavení dynamické procedury pomocí softwaru NOVA 1.4.

8

Výsledky a diskuse Pro testování softwaru NOVA jsme si vybrali experiment redukce kadmia na rtuťové a grafitové elektrodě v 0.1M KCl. Další obrázek ilustruje analýzu LSV dat v 3D prostoru pro 0.1M KCl.

Obr. 2. Zpracování dat pomocí softwaru NOVA 1.4. LSV křivka (horní obrázek) a Nyquist graf (dolní obrázek) pro 0.1M KCl na PIGE.

9

Předpokládáme, že implementace EVLS do nového softwarového balíčku NOVA bude součástí Data presentation – Analysis. Každý algoritmus programu obsahuje několik kroků, které jsou pojmenovány nejprve pomocí diagramu a pak implementovány pomocí programového jazyku (práce softwarového inženýra EcoChemie). I algoritmus EVLS může spočívat v posloupnosti dílčích kroků. Prvním krokem může být výběr rychlostí polarizace, druhým krokem výběr typu eliminace, rozhodující o tom, který dílčí proud bude zachován a který eliminován. Podle obou výběrů nastává třetí krok – výpočet koeficientů v lineární kombinaci celkových voltametrických proudů naměřených při různých rychlostech polarizace (libovolné), při nichž musíme označit stupeň vyhlazení. Teprve hlazené voltametrické křivky budou zpracovávány do tvaru žádané eliminační funkce. Další krok odpovídá zobrazení eliminační funkce v závislosti na potenciálu. Podle průběhů jednotlivých EVLS funkcí můžeme usuzovat na adsorbovanou částici (pík-protipík), elektrodové procesy řízené difúzí, kinetikou a adsorpcí, na předřazenou chemickou reakci a na procesy silně ovlivněné i povrchem elektrody. Doposud byly všechny výše popsané dílčí kroky prováděny s voltametrickými daty pomocí Excelu nebo pomocí maker v Excelu. Závěr V práci byla diskutována implementace eliminační voltametrie (EVLS) jako matematické úpravy voltametrických dat do elektrochemických analyzátorů. Doposud používaný excelovský soubor (makra) počítá najednou všech šest EVLS funkcí a též sestrojuje grafy těchto funkcí. Naším cílem je zavést EVLS jako součást softwaru NOVA, který je nejen aktuálním produktem firmy EcoChemie s novým rozhraním a s novou variabilitou, ale i s možností vlastní úpravy analýzy dat v podobě dalších matematických funkcí. Poděkování Práce byla finančně podporována projekty od MŠMT ČR: BIO-ANAL-MED (LC06035) a výzkumné záměry MSM 0021622412 (INCHEMBIOL) a MSM 0021630516. Literatura 1. 2. 3. 4. 5.

6.

Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). Trnková L., Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996). Trnková L.: Chemické Listy 95, 518 (2001). Trnkova L.: J. Electroanal Chem 582, 258 (2005). Trnková L.: Application of Elimination Voltammetry with Linear Scan in Bioelectrochemistry, in Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research (Eds.: Adam V., Kizek R.), p. 51. Research Signpost, Kerala, India, 2007. http://www.ecochemie.nl/?pag=69&PHPSESSID=4d086fbfa8a937751367ad0d1e02dd7d

10

Izotachoforetické stanovení biogenních aminokyselin Martin Bartoš, Dana Hloušková a Blanka Hyhlíková Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, E-mail: [email protected] Izotachoforeticky lze stanovit pouze takové látky, které mají dostatečnou pohyblivost v elektrickém poli (mobilitu) a to v roztocích o nepříliš vysokém či nízkém pH. Funkční skupiny aminokyselin jsou sice ve vodných roztocích ionizovány, ale celá molekula je téměř elektroneutrální a její mobilita je příliš nízká. Z biogenních aminokyselin tvoří výjimku pouze kyseliny asparagová a glutamová, nesoucí dvě karboxylové skupiny, a bazické aminokyseliny histidin, lysin a arginin (obr. 1), které lze izotachoforeticky stanovit přímo 1,2. Převahu záporného náboje lze zajistit zablokováním nebo zrušením aminoskupiny. K tomu se nabízí dvě reakce, které jsou již desítky let využívané při stanovení sumy aminokyselin. Především jde o reakci primárního aminu s formaldehydem (skupina -NH3+ přejde na -N=CH2), která je podstatou alkalimetrické tzv. formolové titrace 3 a byla použita i pro izotachoforetické stanovení aminokyselin 4. Druhou možností je reakce s kyselinou dusitou, při které vzniká z aminokyseliny příslušná hydroxykyselina a uvolňuje se plynný dusík: HOOC-CHR-NH2 + HNO2 =

HOOC-CHR-OH + N2 + H2O

Na této reakci je založena van Slykeova metoda stanovení primárních alifatických aminů 5. V izotachoforéze dosud nebyla, pokud známo, použita. Celé stanovení lze rozdělit na dvě až tři základní části: převedení (konverzi) aminokyseliny na hydroxykyselinu, snížení obsahu nežádoucích iontů v roztoku (prodlužují analýzu a snižují separační kapacitu systému) a vlastní izotachoforetickou separaci. Rychlost a účinnost konverze jsou ovlivňovány řadou podmínek, především vlastnostmi konkrétní aminokyseliny, teplotou a intenzitou míchání, koncentrací dusitanu a koncentrací a charakterem kyseliny použité k převedení dusitanu na kyselinu dusitou. Ukázalo se, že reakce probíhá rychleji za zvýšené teploty a intenzivního míchání. Zatímco s rostoucí koncentrací dusitanu roste i účinnost konverze, v případě kyseliny je závislost složitější - s rostoucí koncentrací silné kyseliny (H2SO4) po počátečním nárůstu signálu následuje jeho pokles, zatímco při okyselení slabou kyselinou (octovou, valerovou) lze dosáhnout téměř 100% konverze. K okyselení reakční směsi lze použít i slabě kyselý katex - výhodou je nižší koncentrace nežádoucích iontů ve směsi. Silně kyselý katex poskytl podobné výsledky jako silná kyselina, není proto vhodný pro konverzi aminokyseliny na hydroxykyselinu, ale lze jej použít k částečnému převedení dusitanu na dusičnan, což příznivě ovlivňuje separační kapacitu při nižších hodnotách pH vedoucího elektrolytu. K izotachoforetické separaci lze použít i poměrně kyselý systém: vedoucí elektrolyt: HCl + β-alanin, pH 3,6; koncový elektrolyt: kyselina octová případně valerová. Nejlépe probíhá konverze u alifatifatických aminokyselin (glycin, alanin, valin, leucin, izoleucin) za vzniku příslušné hydroxykyseliny. Leucin nelze odlišit od izoleucinu. Výrazné zóny poskytují hydroxyaminokyseliny serin a threonin, dále fenylalanin, glutamin, asparagin a kyseliny glutamová a asparagová. Tyrosin a sirné aminokyseliny (cystein, methionin) dávají složitější signál. Bazické aminokyseliny lysin a histidin je vhodnější analyzovat za pomoci téměř neutrálního vedoucího elektrolytu, arginin neposkytuje žádný signál. Prolin při reakci s

11

dusitanem neuvolňuje dusík, při separaci dává dvě zóny. Tryptofan povařením s dusitanem dává sraženinu. Metoda byla použita ke stanovení alifatických aminokyselin v potravinových doplňcích. 0

2

4

6

8

10

12

14

Glycin Alanin Valin Leucin Isoleucin Serin Threonin Tyrosin Fenylalanin Cystein Methionin Asparagin Glutamin Asparagová Glutamová Prolin Tryptofan Histidin Lysin Arginin

Obr. 1. Vliv pH na převažující formu biogenních aminokyselin. Svislé čárkování - kladný iont, vodorovné čárkování - záporný iont, bez výplně - neutrální molekula (svislá čára uprostřed - izoelektrický bod). Rozhraní mezi oblastmi odpovídají pKA funkčních skupin (použity konstanty z 6). Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky projektu MSM0021627502 a Výzkumného centra LC06035. Literatura 1. Tesková K.: Diplomová práce. Univerzita Pardubice, Pardubice 2001. 2. Trnková L.: Diplomová práce. Univerzita Pardubice, Pardubice 2005. 3. Davídek J. a kol.: Laboratorní příručka analýzy potravin. SNTL. Praha 1977. 4. Everaerts F.M., van den Put J.M.: J. Chromatogr. 52, 415 (1970). 5. Jureček M.: Organická analysa II. Nakladatelství Československé akademie věd. Praha 1957. 6. Kortlý S., Šůcha L.: Chemické rovnováhy v analytické chemii. SNTL. Praha 1988.

12

Stanovení perorálních antidiabetik pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí Zdenka Bartošová, David Jirovský, Vítězslav Maier a Jana Skopalová Katedra analytické chemie, Univerzita Palackého, Tř. Svobody 8, Olomouc 771 46

Diabetes mellitus 2. typu je závažné onemocnění, jež v poslední době postihuje stále více lidí – hovoří se dokonce o epidemii. Tuto metabolickou poruchu doprovází snížená schopnost tvorby inzulinu spojená s rezistencí cílových buněk na tento hormon. Terapeutická léčba se snaží tyto defekty potlačit a často k tomuto účelu využívá perorální antidiabetika. K vývoji nových, účinnějších léčiv či jejich kombinací a inovací je věnováno nemalé úsilí, a společně se snižujícími se dávkami efektivnějších perorálních antidiabetik rostou požadavky na dostatečně citlivé analytické metody, které by byly schopné tyto látky sledovat na terapeutických hladinách v tělních tekutinách. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ve spojení s elektrochemickou detekcí (HPLC/ECD) představuje velmi efektivní analytický nástroj k řešení této problematiky. Jednou z hlavních předností HPLC/ECD je její vysoká selektivita. Díky ní se značně snižují požadavky na procesy spojené s předběžnými úpravami vzorku, při kterých může docházet ke ztrátám či dokonce rozkladu analytu. Je prezentována jednoduchá, rychlá a vysoce citlivá HPLC metoda s coulometrickou detekcí ke stanovení vybraných elektroaktivních perorálních antidiabetik v krevní plazmě, vhodná k farmakokinetickým studiím či terapeutickému monitoringu těchto léčiv u pacientů trpících diabetes mellitus 2. typu. Poděkování Autoři děkují za finanční podporu práce výzkumnému záměru MSM 6198959216.

13

Electrochemical Characterization of Water Soluble Fullerenes Jana Bulíčková, Miroslav Gál, Magdaléna Hromadová and Lubomír Pospíšil Academy of Sciences of the Czech Republic J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Fullerene (C60) is a highly hydrophobic compound and it is considered to be insoluble in water. Different approaches were described for preparing aqueous solutions of C60. One of the possibilities is to create an inclusion complex of the C60 inside a cavity of gammacyclodextrin (γCD). Recently, we have shown that such complexes are capable of the electrochemical conversion of N2 to ammonium ions 1. Several attempts have been made to dissolve C60 in aqueous medium directly without the need of inclusion chemistry or chemical modification of the C60 moiety. One possibility is to use an ultrasonic treatment of a two-phase mixture of water and toluene containing C60. Total evaporation of toluene from the mixture results in a brownish-yellow aqueous solution containing C60 2. The state of C60 in aqueous solutions is still being discussed. Some authors speculate about the modification of fullerene core by variable number of OH groups leading to the formation of fullerenols. The measurements of Raman spectra of our aqueous solution containing C60 suggest that the symmetry of C60 in water remains unchanged and further attempts to characterize „water soluble C60“ are being made. The most suitable techniques for the electrochemical characterization of the aqueous solution of C60 is the low-frequency phase-sensitive AC polarography and the steady-state voltammetry. The redox potential of fullerene in water is not known so far and our measurements could fill this gap. The estimation of the formal redox potential of free C60/C60.- couple will be compared in different solvents. This enables further application of the electrochemical methods for study of the host-guest interactions with cyclodextrins. Acknowledgement A Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (IAA400400505 and KJB400400603) and the Ministry of Education (LC510 and COST OC140) are greatly acknowledgement for financial support. Reference 1. Pospíšil L., Bulíčková J., Hromadová M., Gál M., Civiš S., Cihelka J., Tarábek J.: Chem Commun (Camb). , 2270, (2007). 2. Andrievsky G.V., Kosevich M.V., Vovk O.M., Shelkovsky V.S., Vashchenko L.A., J. Chem. Soc., Chem.Commun. (Camb)., 12, 1281, (1995).

14

Crystallic Silver Amalgam Electrode Ales Danhel a, Bogdan Yosypchuk b and Jiri Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 8, CZ-12843 Prague 2, Czech Republic E-mail: [email protected] b J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry AV CR, v.v.i., Dolejskova 3, CZ-182 23 Praha 8, Czech Republic The preparation and possibilities of electrochemical behavior and application of the crystallic silver amalgam electrode are briefly discussed in this work. The crystallic silver amalgam can be prepared by stepwise addition of silver nitrate solution into deionized water containing metallic mercury drop. The silver amalgam crystals growing on the mercury surface (Fig. A) have variable composition (AgxHgy, 50-75 % of Hg) such as already found in silver amalgam minerals 1. A thin silver wire stucked in to a mercury drop provides more and better shaped needle crystals 2. Amalgam must be cleaned from nitrate salts of mercury (colorless crystals of mercury(I) nitrate dihydrate (Hg2(NO3)2·2H2O and yellow mercury(II) nitrate monohydrate (Hg(NO3)2·H2O)) by decanting of mother liquor and repeated dissolving by perchloric acid solution and finally cleaning by deionized water 3. Otherwise it would contaminate supporting electrolytes during voltammetric measurements and block the usage of silver amalgam. Small and branched amalgam crystals can be powdered and used for the preparation of modern electrode materials such as: amalgam paste (amalgam powder mixed with pasting liquids) or composite material (amalgam mixed with polymeric binder) 4-5.

Fig. (A) Silver amalgam crystals at mercury drop, (B) single needle crystal of silver amalgam (magnification 200x) and (C) working electrode based on single crystal silver amalgam (magnification 50x) Well shaped needle crystals of silver amalgam (Fig. B) can be used for the construction of “single crystal silver amalgam microelectrodes” (SCAgAE, Fig. C). Contact between the crystal and silver wire was mediated by silver amalgam paste (Ag(s) in Hg(l) ~15 % Ag w/w) sucked into 10 μL pipette tip. Crystal sticks out from narrowed part of tip and it is isolated by film of polystyrene (~ 30 mg of polystyrene dissolved in 1 ml of dichlorethane). Potential windows measured by DC voltammetry in supporting electrolytes (0.1M HClO4, 0.01M HCl, 0.2M acetate buffer pH 4.8, 0.05M Na2B4O7 pH 9.2, 0.01M NaOH) are compared with potential windows of hanging mercury drop electrode (HMDE) and polished silver solid amalgam electrode (p-AgSAE, see Table I). Variable sizes of single amalgam crystals should provide possibilities of application such as: voltammetric determinations in microvolumes, amperometric detection in flow systems (capillary and/or microcolumn FIA, SIA, HPLC, CZE) and detectors for “Lab-on–chip”.

15

Table I. Potential ranges of selected electrodes obtained by DC voltammetry (scan rate 20 mV·s-1, l is length and d is diameter; the potential limits correspond to 1, 5 or 20 µA current level; reference electrodes: Ag|AgCl 3M KCl for SCAgAE and saturated calomel electrode for HMDE and p-AgSAE) Electrodes´ potential ranges , V 0.2M Electrode (current 0.05M 0.1M 0.01M Acetate [μA], proportions ) 0.01M HCl Na2B4O7 HClO4 NaOH buffer, pH pH 9.2 4.8 -1.30 ... -1.42 ... -1.60 ... -1.89 ... -2.20 ... SCAgAE (20 μA, +0.50 +0.40 +0.38 +0.30 +0.12 l = 1 mm, d = 50 μm) -1.20 ... -1.29 ... -1.47 ... -1.72 ... -2.00 ... SCAgAE (5 μA, +0.43 +0.20 +0.34 +0.19 +0.05 l = 1 mm, d = 50 μm) 0.2M 0.05M 0.1M Acetate 0.1M HCl Na2B4O7 0.1M NaOH HClO4 buffer, pH pH 9.2 4.8 -1.19 ... -1.27 ... -1.70 ... -1.98 ... -1.97 ... 5 +0.44 +0.11 +0.31 +0.15 0.07 HMDE (1 μA) p-AgSAE -1.12 ... -1.12 ... -1.51 ... -1.88 ... -1.96 ... +0.45 +0.11 +0.31 +0.16 0.06 (1 μA, d = 0.70 mm)5 Still it is necessary to find optimal conditions: how to grow crystal without surface defects and how to construct working electrodes obtaining less signal noise caused by the defects. Testing of this electrode material for voltammetric and amperometric methods is main aim of next research, but suitability of this electrode material is obvious. Acknowledgment Financial support from MSMT CR (LC 06035 and MSM 0021620857), GACR (203/07/1195) and GAUK (6107/2007/B-Ch/PrF) is gratefully acknowledged. References 1. Zakrzewski M.A., Burke E.A.J.: Mineral. Mag. 51, 360 (1987). 2. Nirmala K.A., Gowda D.S.S.: J. Appl. Cryst. 8, 6 (1975). 3. Greenwood N.N., Earnshaw A.: Chemie prvku. Svazek II. Praha: Informatorium, 1993. 4. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 5. Yosypchuk B.: PhD Thesis. Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Pardubice 2003.

16

Carbon Paste Electrodes Modified by Room-Temperature Ionic Liquid Hana Dejmková, Marie Švecová, Jiří Zima and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic, [email protected] Room temperature ionic liquids (RTILs) are compounds that have recieved great attention recently. From the chemical point of view, they are salts, composed of bulky organic cations (usually based on substituted imidazole, pyridine or phosphonium) and smaller anions. Disproportion in shape and size cause low lattice energy and consecutive liquid state under the room temperature, while other properties remain those of melted salts. Among them, we can mention stability both thermal and chemical and low volatility. They are good solvents of many compounds, mainly of polar or ionic character. They are valued in electrochemistry for their conductivity, and in biochemistry for maintaining, if not enhancing, the biological activity of compounds. Their utilization is widespread, reaching from solvents for organic synthesis to fuel cell electrolytes. They are employed in analytical chemistry as well, in the role of mobile phase in separation techniques, solvents for spectrometry and in electrochemistry for preparation of supporting electrolytes or sensors 1, 2. The first carbon paste electrode modified by ionic liquids (IL-CPE) was prepared in 2005 by Liu et al. 3 They report higher response of the electrode and fast charge transfer kinetics together with serious drawback in high background current. Similar results were reported by Zheng et al. 4 Slight decrease in background current was achieved by Maleki et al. 5 and Sun et al. 6 by using ionic liquid with higher melting point. On the other hand, the preparation and handling of the electrode is more difficult. Kachoosangi et al. 7 was trying to reduce the background current by employing rotating disc electrode. Shul et al 8 and Wang et al 9 present another advantage of IL-CPE: possibility of analyte accumulation on the electrode, or creating the conditions for the accumulation, respectively. The most recent works concern on the comodification by ionic liquid and carbon nanotubes. The presence of both modificators seems to compensate some disadvantages of electrodes modified by any single of them 10, 11. In our work, we have tested carbon paste electrode composed of graphite powder and pasting liquid consisting of mineral oil and 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate (BMIMPF6) in proportion of 0 %, 25 %, 50 % and 100 %, for the determination of model systems, namely K3[Fe(CN)6], FeSO4, hydroquinone and an pharmaceutical Ambroxol. As expected, the increasing content of RTIL caused the rapid increase of the background current (Fig. 1). Peak potentials, however, were not influenced and remained stable for all the electrodes used. The response of the analyte reached its maxima for RTIL content of 25 %. Although certain degree of accumulation was observed for the simple analytes, accumulation of ambroxol was not noticeable, which indicates limited possibilities of the IL-CPE properties. Acknowledgement Financial support of the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects MSM 0021620857, RP14/63 and LC06035) is gratefully acknowledged.

17

25

200

40 B

A

I [μA]

I [μA]

0

0

I [μA]

400

C

I [μA]

100

200

0

-40

-25

-50

0

300

600 E [mV]

-80

D

0

-100

-200

-200 0

0

300 600 E [mV]

300 600 E [mV]

0

300 600 E [mV]

Fig. 1. Cyclic voltammograms of K3[Fe(CN)6] (c =5·10−3 mol·L-1) obtained using carbon paste electrode with pasting liquid containing 0 % (A), 25 % (B), 50 % (C), 100 % (D) of BMIMPF6. Supporting electrolyte 0.5 mol·L-1 KCl, scan rate 100 mV·s-1. References 1. Koel M.: Crit. Rew. Anal. Chem. 35, 177 (2005). 2. Wei D., Ivaska A.: Anal. Chim. Acta 607, 126 (2008) 3. Liu H., He P., Li Z., Sun C., Shi L., Liu Y., Zhu G., Li J.: Electrochem. Comm. 7, 1357 (2005). 4. Zheng J., Zhang Y., Yang P.: Talanta 73, 920 (2007). 5. Maleki N., Safavi A., Tajabadi F.: Anal. Chem 78, 3820 (2006). 6. Sun W., Yang M., Gao R., Jiao K.: Electroanalysis 19, 1597 (2007). 7. Kachoosangi R.T., Wildgoose G.G., Compton R.G.: Electroanalysis 19, 1483 (2007). 8. Shul G., Sirieix-Plenet J., Gaillon L., Opallo M.: Electrochem. Comm. 8, 1111 (2006). 9. Wang S.F., Xiong H.Y., Zeng Q.X.: Electrochem. Comm. 9, 807 (2007).

18

Voltammetric Determination of 4-Nitrophenol and 5-Nitrobenzimidazole on Different Amalgam Electrodes a Dana Deýlová , Jiří Barek a and Bogdan Yosypchuk b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 8, 128 43 Prague 2, Czech Republic b Institute of Physical Chemistry J. Heyrovsky of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic Introduction Nitrophenols coming from pesticide degradation products, car exhausts, and industrial wastes are listed as priority pollutants by the US Environmental Protection Agency 1,2. Pesticides based on simple nitrophenols are generally not allowed today but some of than are still used as growth stimulators in agriculture 3. They are potential carcinogens, terratogens, and mutagens 4. Because of their toxicity and vast scale distribution in the environment, their determinations have become one of the important goals of environmental analysis. 5-Nitrobenzimidazole (5-NBIA) belongs to the group of genotoxic nitrated heterocyclic aromatic compounds. It can damage natural biological functions of living organisms. The occurrence of 5-NBIA in environment is expected in connection with fossil fuels combustion 5. 5-NBIA was polarographically determined as a part of photographic processing solutions 6 and its properties have been studied in the area of metal corrosion protection 7. 5-NBIA is proven carcinogen and mutagen 8. Both substances were determined using practically non-toxic polished mercury silver solid amalgam electrode (p-AgSAE), meniscus-modified silver solid amalgam electrode (mAgSAE) and mercury film silver solid amalgam electrode (MF-AgSAE). All electrodes have a good mechanical stability, simple handling and regeneration including an electrochemical pre-treatment of their surface. Materials and methods 5-NBIA and 4-nitrophenol (4-NF) were determined by differential pulse voltammetry (DPV) and DC voltammetry (DCV) in Britton-Robinson buffer (5-NBIA at pH 8 and 4-NF at pH 6). Mercury film on a large area p-AgSAE was deposited in a special vessel with mercury bottom containing mercuric chloride solution. Into this solution we placed p-AgSAE and deposited mercury film as long as we need. Before starting the work, as well as after electrode passivation, the electrochemical activation of electrodes was carried out in 0.2 M KCl at -2200 mV under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. The regeneration was carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials 100 mV more negative than the potential of amalgam dissolution (Ereg,1) and 100 mV more positive than the potential of hydrogen evolution (Ereg,2) in the given base electrolyte, for optimal values see Table I. Regeneration always ended at more negative potential.

19

Table I. Experimentally found optimal values of regeneration potentials of p-AgSAE, m-AgSAE and MF-AgSAE in Britton-Robinson buffer. p-AgSAE m-AgSAE mf-AgSAE pH Ereg,1 (mV) Ereg,2 (mV) Ereg,1 (mV) Ereg,2 (mV) Ereg,1 (mV) Ereg,2 (mV) 6 0 -1200 -100 -900 -100 -600 8

-100

-600

-100

-600

-100

-600

Results and discussion Optimal pH for 4-NF was pH 6 for all electrodes 9 and pH 8 for 5-NBIA. Repeatability of determination of 4-NF on MF-AgSAE was very good on film deposited for 300 s to 3600 s (Fig. 1). Optimal regeneration potentials are listed in Table I. Linear calibration curves were obtained in the concentration range 2-1000 μmol/l. Their parameters for the lowest concentration range are summarized in Table II. The determination limit was calculated as ten times the standard deviation for ten determinations of the analyte at a concentration corresponding to the lowest point of the appropriate calibration graph. It can be seen than MF-AgSAE gives the highest pike (slopes of calibration curves). However, the repeatability is worse than for p-AgSAE or m-AgSAE. -300 Ip (nA) -250 -200

film 3600s RSD = 2,0 % film 1800s RSD = 1,4% film 900s RSD = 2,5%

-150

film 300s RSD = 0,3 %

-100 -50 0 0

1

2

3

4

5

6

7

8 9 10 repetetion rate

Fig. 1. Repeatability of DPV determination of 4-NF (c = 1·10-5 mol/l) in BR-buffer pH 6 on MF-AgSAE with different deposition times. Conclusions It has been shown that DPV at m-AgSAE gives reliable results for 4-NF. For 5-NBIA the results are less reliable probably because of complex formation of 5-NBIA with mercury ions. Lowest calibration range DCV and DPV for bothe substances and all electrodes were (210)·10-7 mol/l.

20

Table II. Parameters of the calibration straight lines for the determination of 4-NF and 5-NBIA in the concentration range (2-10)·10-7 mol/l using DCV and DPV at m-AgSAE p-AgSAE and MF-AgSAE (deposit time 3600 s) in a Britton-Robinson buffer (for 4-NF pH 6 and for 5-NBIA pH 8). Slope Intercept LQ Electrode Substance Methods R (10-7 mol/l) (nA.mol/l) (nA) DCV -1.17·10+6 1.1 0.9987 3.69 4-NF DPV -2.19·10+6 1.7 0.9990 3.15 p-AgSAE +6 DCV -1.95·10 0.5 0.9904 7.68 5-NBIA DPV -2.09·10+6 1.2 0.9969 4.74 +6 DCV -1.25·10 -1.3 0.9636 1.36 4-NF -1.3 0.9997 8.14 DPV -2.68·10+6 m-AgSAE +6 DCV -4.94·10 5.6 0.9993 3.17 5-NBIA -0.8 0.9930 6.04 DPV -4.91·10+6 3.6 0.9899 8.76 DCV -3.02·10-6 4-NF 3.1 0.9986 3.68 DPV -3.47·10+6 MF-AgSAE 9.3 0.9897 9.73 DCV -4.48·10+6 5-NBIA DPV -4.71·10+6 9.3 0.9954 7.06 Acknowledgement This research was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035 and MSM 0021620857) and Grant Agency of the Czech Republic (No. 203/07/1195). References 1. U.S. Environmental Protection Agency, Federal Register 52, 131 (1989). 2. Luttke J., Scheer V., Levsen K., Wunsch G., Cape J.N., Hargreaves K.J., StoretonWest R.L., Acker K., Wieprecht W., Jones B.: Atmos. Environ. 31, 2637 (1997). 3. SRS, List of the Registered Plant Protection Products. 3, The state phytosanitary administration, Brno, Czech Republic 2006. 4. ATSDR, Toxicological profile for nitrophenols, Agency for Toxic Substances and Disease Registry, Atlanta 1992. 5. Barek J., Cvacka J., Muck A., Quaiserova V., Zima J., Electroanalysis 13, 779 (2001). 6. Canterford D.R.: J. Photogr. Sci. 26, 65 (1978). 7. Popova A., Christov M., Raicheva S., Sokolova E.: Corros. Sci. 46, 1333 (2004). 8. Rosenkranz H.S., Karol M.H.: Mutat. Res. 431, 81 (1999). 9. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Navratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007).

21

Voltammetric Determination of Picric Acid Using Silver Amalgam Paste Electrode and Carbon Paste Electrode a b Jan Fischer , Abdul Niaz , Jiří Barek a, Bogdan Yosypchuk c, Sirajuddin b and Muhammad Iqbal Bhanger b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, 12843 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b National Centre of Excellence in Analytical Chemistry, University of Sindh, Jamshoro 76080, Pakistan c J. Heyrovsky Institute of Physical Chemistry of ASCR, v. v. i., Dolejškova 3, 182 23 Praha 8, Czech Republic Introduction Picric acid (2,4,6-trinitrophenol) is an important organic compound which is used in wide number of products such as basic chemicals for paints, agrochemicals, plastics, it has also numerous applications in pharmaceuticals and others industry. It is also used as a booster for other explosives and rocket fuel. Besides its importance it has hazardous potential to humans and the environment 1. The presence of this compound in water causes pollution problems 2. Therefore, the monitoring of this compound is essential for environmental control. Similarly, there is an ever increasing demand for electrochemical determination of trace amounts of nitrated explosives for which new types of electrodes are actively sought. Due to easy instrumentation and low equipments costs, voltammetric techniques are particularly useful for the analysis of a wide variety of organic compounds 3. Most of polarographic and voltammetric methods for the determination of picric acid use mercury electrode 4, 5. So far there are no direct methods available in the literature for the determination of picric acid using solid or paste electrodes, excluded sonogel-carbon electrode 6. Recently, a silver amalgam paste electrode (AgA-PE) for the reduction processes has been developed by our research group 7,8. Due to easily mechanically or electrochemically renewable surface, good mechanical stability, broad potential window and high rate of electrode processes, the AgA-PE is suitable for electrochemical measurements. Therefore, the present study aimed to investigate a differential pulse voltammetric (DPV) method for the determination of trace amounts of toxic picric acid in drinking and river water using a nontoxic silver amalgam paste electrode and to compare the results at this electrode to that at carbon paste electrode. Experimental All reagents were of analytical grade. A stock solutions of 1.10-3 mol.l-1 picric acid was prepared by dissolving 0.02291 g of the substance (C. A. S. Registry Number: [88-89-1]; 99%, Sigma-Aldrich, Germany) in 100 ml of deionized water. Britton–Robinson buffer was used as a supporting electrolyte. De-ionized water was produced by a Milli-Q plus system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic) in p. a. purity. All the chemicals were used without any further purification. DPV experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph. The working electrode was silver amalgam paste electrode (AgA-PE) with 10% silver and carbon paste electrode (CPE). The way of preparation of AgA-PE was described in previous paper 8. A small amount of electrode material was put inside the small pipette tip (hole size 600±25 µm), an electrical connection with the steel wire was made and then the surface was

22

smoothed on a glass surface. The silver amalgam was made by mixing of mercury and 10 % of fine silver powder (particle size 2 – 3.5 μm, Aldrich). The glassy carbon paste was prepared by mixing 250 mg of glassy carbon micro particles (Alfa Aesar, Germany) and 100 uL of mineral oil (Fluka). After mixing, a small amount of the amalgam paste or carbon paste was put inside the pipette tip and an electrical connection with the steel wire was made and then the surface of AgA-PE was smoothed on a glass surface and of CPE on a filter paper. Before starting the experiment for each new surface of AgA-PE the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol.L-1 KCl at –2200 mV under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with AgA-PE or CPE was carried out at a scan rate of 20 mV.s-1, pulse amplitude of –50 mV, pulse duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and interval between pulses of 100 ms. Results and discussion The influence of pH on the differential pulse voltammograms of picric acid on AgA-PE and CPE is represented by Fig. 1 and Fig. 2. It can be seen from the Fig. 1 that at pH 2 the highest, best developed and therefore most easily evaluated peak at AgA-PE was obtained. At CPE optimal pH 3 was selected because at this pH signal was more stable than at pH 2 where the peak was highest. The calibration curves were measured for picric acid in the concentration ranges of (2 – 10).10-5, (2 – 10).10-6 and (2 – 10).10-7 mol.l-1 for AgA-PE and (2 – 10).10-5 and (2 – 10).10-6 mol.l-1 for CPE. The peak currents were linearly proportional to the concentrations of picric acid over the entire ranges. The proposed method was tested for model samples of picric acid in drinking and river water at both AgA-PE and CPE. Highly linear calibration curves were obtained for drinking and river water at AgA-PE and CPE, these results show the applicability of presented methods. The parameters of thus obtained calibration curves at both electrodes are summarized in Table I. Table I. Parameters of calibration straight lines for the determination of picric acid in the concentration range of 2.10-7 – 1.10-4 mol.l-1 using DPV at both AgA-PE and CPE in a Britton-Robinson buffer. Slope Intercept R LOQ Matrix Conc. range -1 -1 [nA.mol l] [nA] [mol.l-1] Electrode pH [mol.l ] AgA-PE

2.0

Buffer

AgA-PE AgA-PE CPE

2.0 2.0 3.0

Drinking w. River water Buffer

CPE CPE

3.0 3.0

Drinking w. River water

(2-10)·10-5 (2-10)·10-6 (2-10)·10-7 (2-10)·10-7 (2-10)·10-7 (2-10)·10-5 (2-10)·10-6 (2-10)·10-6 (2-10)·10-6

23

-4.20·106 -7.36·106 -3.60·107 -2.1·107 -1.7·107 -1.16·106 -1.20 106 -0.66·106 -0.42·106

-77.75 -26.65 -3.90 -1.05 -1.50 -5.68 -0.16 -0.38 -0.27

0.9970 0.9976 0.9976 0.9999 0.9991 0.9999 0.9998 0.9998 0.9975

–– –– 5.6·10-8 9.5·10-8 1.2·10-7 –– 4.7·10-7 8.2·10-7 1.3·10-6

pH=2 -400 I, nA

3 4 5

-200

6

12

7 8

9

11 10

0 0

-300

-600 E, mV

-900

Fig. 1. Differential pulse voltammograms of picric acid at AgA-PE in Britton-Robinson buffer pH 2 to 12 (numbers above curves correspond to given pH), c(picric acid) = 1.10-4 mol.l-1.

pH=2 -160

3 4

I, nA 10 11

-80

5

12

6 78 0

0

9

-600

E, mV

-1200

Fig. 2. Differential pulse voltammograms of picric acid at CPE in Britton-Robinson buffer pH 2 - 12 (numbers above curves correspond to given pH), c(picric acid) = 1.10-4 mol.l-1. Conclusions The AgA-PE showed good electrochemical response towards picric acid with good reproducible results without any surface passivation. This indicated that AgA-PE is a suitable sensor for the determination of micromolar and submicromolar concentrations of picric acid. Picric acid could also be reduced at CPE with RSD 1.1%. The limit of determination of picric acid using DPV at AgA-PE is lower than that for CPE. The easy renovation of electrode surface makes the method easier than the use of other solid electrodes and thus it represents an effective and simple alternative to the HMDE. It can be expected that AgA-PE will be useful for determination of trace amounts of nitrated pollutants.

24

Acknowledgment This work was financially supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects RP 14/63, LC06035 and MSM 0021620857), and by the Grant Agency of the Czech Republic (project 203/07/1195). A. N. thanks for the financial support of the Higher Education Commission Pakistan. References 1. Health Council of the Netherlands: Committee on Updating of Occupational Exposure Limits. Picric acid; Health-based Reassessment of Administrative, Occupational Exposure Limits. Health Council of the Netherlands, The Hague 2002. 2. Windholz, M., ed.: The Merck Index, Tenth edition. Merck & Co.Inc., Rahway 1989. 3. Barek J., Cvacka J., Muck A., Quaiserova V., Zima J.: Fresenius J. Anal. Chem. 369, 556 (2001). 4. Morales A., Toral M. I.: Bol. Soc. Chil. Quim. 27, 274 (1982). 5. Zimmermann Y., Broekaert J. A. C.: Anal. Bioanal. Chem. 383, 998 (2005). 6. Cordero-Rando M. D., Naranjo-Rodriguez I., Palacios-Santander J. M., CubillanaAguilera L. M., Hidalgo-Hidalgo-de-Cisneros J.L.: Electroanalysis 17, 806 (2005). 7. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 8. Niaz A., Fischer J., Barek J., Yosypchuk B., Sirajuddin, Bhanger M. I.: Electroanalysis, In press.

25

Electrochemical and Capillary Zone Electrophoresis Study of Pyrimidine Residues Modification by Osmium Tetroxide, 2,2’-Bipyridine. Detection of Unpaired and Mispaired Thymines in DNA Heteroduplexes Miroslav Fojta a, Pavel Kostečka a, Miroslava Bittová b, Martin Bartošík a, Luděk Havran a, Tibor Hianik c, Libuše Trnková b and Emil Paleček a a Institute of Biophysics AS CR, v.v.i., Královopolská 135, CZ-612 65 Brno; e-mail: [email protected] b Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2,CZ-611 37 Brno c Faculty of Mathematics, Physics and Informatics, Comenius University, Mlynska dolina F1, SK-842 48 Bratislava Osmium tetroxide complexes (Os,L) have been used as chemical probes of DNA structure due to their preferential reactivity towards thymine residues in single-stranded or conformationally distorted regions in DNA 1. The DNA-Os,L adducts are electrochemically active and owing to this feature they have been utilized for facile DNA labeling, electrochemical detection of DNA hybridization 2 as well as for monitoring DNA damage1. Recently a complex of osmium tetroxide with 2,2’-bipyridine (Os,bipy) was used for covalent modification of tryptophan residues in proteins and for monitoring of interactions of avidin or streptavidin with biotin 3. In this work we used capillary zone electrophoresis (CZE) in combination with square-wave voltammetry (SWV) at a pyrolytic graphite electrode (PGE) to study reactivity of different pyrimidine residues, thymine (T), uracil (U), cytosine (C) and 5-methyl-cytosine (meC), within a pentanucleotide AAAAY (where Y stands for the pyrimidine residue), towards Os,bipy. Since adenine practically does not react with Os,L, Y residues represent the only reactive centre within the pentamers and their reactivity can thus be easily compared. Both techniques revealed the order of the Y reactivities as follows: T>>MeC~U>C. Hence, our results confirmed (a) highly preferential modification of T among all Ys and (b) increased reactivity of MeC, compared to C that was reported by other authors4. However, despite recent papers presenting Os,L modification as useful tool for MeC detection in DNA4, the strong modification of T within natural DNA (where T is much more abundant than MeC) makes this approach hardly applicable for real analyses of DNA methylation. Further, we applied Os,bipy as a probe for the detection of unpaired or mispaired T residues in DNA heteroduplexes. Using SWV at PGE we observed increased reactivity of thymines within abasic sites5, single-base insertions as well as T•T or G•T mispairs, compared to thymines forming the canonical A•T pairs. Conditions for reliable discrimination between perfectly matched duplexes and heteroduplexes involving the reactive T residues were optimized. Our results suggest that a single mispaired thymine can easily be recognized among at least 25 base pairs, making Os,bipy modification, followed by electrochemical analysis, in principle useful for the detection of abasic sites (representing a kind of DNA damage), as well as detection of sequence polymorphisms involving T residues within short DNA fragments. Acknowledgements This work was supported by MEYS CR (LC06035, MSM0021622415), Czech Science Foundation (203/07/1195, 203/08/P598) and to Slovak Grant Agency (VEGA 1/4016/07).

26

References 1. Havran L., Vacek J., Cahova K., Fojta M.: Anal. Bioanal. Chem. 391, 1751 (2008). 2. Fojta M., Kostecka P., Trefulka M., Havran L., Palecek E.: Anal. Chem. 79, (2007). 3. Fojta M., Billova S., Havran L., Pivonkova H., Cernocka H., Horakova P., Palecek E.: Anal. Chem. 80, 4598 (2008). 4. Tanaka K., Tainaka K., Kamei T., Okamoto T.: J. Am. Chem. Soc. 129, 5612 (2007). 5. Bartosik M., Gajdos V., Kostecka P., Fojta M., Palecek E., Volkov E., Oretskaya T., Hianik T.: Electroanalysis 21, 295 (2009).

27

Monitoring of In Vvitro DNA Synthesis and PCR Amplification Using 7-Deaza-Purines as Electroactive Markers a,b Miloslava Fojtová , Petra Horáková b,c, Hana Pivoňková b, Eva Šimková a,b, Zdenka Vychodilová a,b, Luděk Havran b and Miroslav Fojta b a Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2,CZ-611 37 Brno b Institute of Biophysics AS CR, v.v.i., Královopolská 135, CZ-612 65 Brno c Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Nám. Čs. Legií 565, CZ-532 10 Pardubice

In vitro DNA synthesis by primer extension (PEX) or polymerase chain reaction (PCR) belongs to the current methodological arsenal of molecular biology, being used for DNA cloning, sequencing, SNP genotyping as well as monitoring of gene expression. Detection techniques applied in connection with the PEX or PCR approaches encompass gel or capillary electrophoresis, fluorescence techniques including those applied in the quantitative real-time PCR, as well as various types of biosensors and microarrays. Electrochemical approaches have also been applied to analyze products of PEX or PCR. These electrochemical techniques include both label-free (utilizing intrinsic electrochemical properties of nucleic acids or their constituents)1 and label-based ones. Various types of DNA labels have been introduced into the PEX or PCR product by polymerases, including biotin (for subsequent attachment of streptavidin-enzyme conjugates applied in enzyme-linked electrochemical detection systems)2 or different electrochemically active groups such as ferrocene3, nitro- or aminophenyl4, and [M3+/2+(bpy)3] complexes of osmium or ruthenium5. Specific electrochemical signals related to the labels are produced by the synthesized DNA but not by primers or the starting DNA templates, which helps one to monitor reliably the PEX or PCR reactions. Besides the above mentioned external DNA tags, also some nucleobase analogues differ remarkably from the natural nucleobases by their redox potentials, making thus possible to distinguish between DNA containing only the natural bases and PEX or PCR products with the analogues incorporated. For example, 7-deaza-guanine and 7-deaza-adenine have been shown to be electrochemically oxidized at considerably less negative potentials than guanine and adenine, respectively5. These bases, which are known to be unable of Hoogsteen pairing due to the absence of nitrogen atom at the 7-position, are used in PCR analysis of some specific sequences (such as G-rich repeats) to prevent formation of alternative secondary structures (e.g., G-tetraplexes) during amplification. We utilized the 7-deaza-purines as electroactive markers (incorporated into DNA by polymerases) for monitoring of PEX using synthetic oligonucleotides, as well as of PCR of natural genomic sequences, including some repetitive elements. Using biotinylated primers, separation of synthesized DNA strands at magnetic beads and ex situ voltammetric analysis, a simple technique for the DNA in vitro synthesis was proposed. Acknowledgements This work was supported by MEYS CR (LC06035, MSM0021622415), Czech Science Foundation (203/07/1195) and GA ASCR (IAA400040901). References 1. Hason S., Pivonkova H., Vetterl V., Fojta M.: Anal. Chem. 80, 2391 (2008). 2. Horakova-Brazdilova P., Fojtova M., Vytras K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008). 3. Brazdilova P., Vrabel M., Pohl R., Pivonkova H., Havran L., Hocek M., Fojta M.: ChemEur. J. 13, 9527 (2007).

28

4. Cahova H., Havran L., Brazdilova P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Edit. 47, 2059 (2008). 5. Vrabel M., Horakova P., Pivonkova H., Kalachova L., Cernocka H., Cahova H., Pohl R., Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009).

29

Modern Thermoelectrochemistry Peter Gründler a, Andreas Kirbs b and Lothar Dunsch a a Institut f. Festkörper- u. Werkstoffforschung Dresden, Elektrochemie u. Leitfäh. Polymere, Helmholtzstr. 20, D-01069 Dresden, Germany. E-Mail: [email protected] b Atotech Deutschland GmbH, Erasmusstr. 20, Berlin, D-10553, Germany, E-mail: [email protected] Introduction The term „thermoelectrochemistry“ exists since the fifties of the last century, but unlike other combined branches of electrochemistry like photoelectrochemistry or spectroelectrochemistry there did not exist an independent scientific subject of this name. The temperature dependence of electrochemical quantities has been traditionally considered more or less like a tedious duty or factum. The situation changed when, within the last decades, new techniques appeared which allowed to vary the quantity „temperature“ as an independent variable, i.e. arbitrarily and fast. Temperature modulation as well as fast temperature jumps generated by Joule heating, by laser irradiation, and by related techniques allowed the access to kinetic information. Acceleration of kinetic and transport processes, together with thermal convection, resulted in novel electrochemical sensors. This contribution intends to sketch the latest achievements of new techniques using thermal impact on electrodes and to try a first approach to form a scientific subject „Modern Thermoelectrochemistry“. Experimental Most important experimental techniques of modern thermoelectrochemistry are Joule heating of wire or band electrode structures 1, 2, laser irradiation 3-5, and microwave heating of nearelectrode solution spots 6. Inductive electrode heating 7 and Joule heating of near-electrode regions 8 have been also proposed. The latter two techniques are more or less in an experimental stage. For chemical sensor applications, continuous Joule heating proved to be useful, since, by minimal effort; a high intensity thermal stirring can be achieved combined with a rather precise temperature control of the electrode interface. For kinetic investigations, thermal modulation by fast heat pulses is preferred. Joule heating of thin wire electrodes allowed high-temperature voltammetry above the boiling point of the solvent by repetitive application of heat pulses 1. Results and discussion Fig. 1 shows the phenomena occurring at a heated wire electrode in a solution containing a reversible redox couple when short heat pulses are overlaid to a potential staircase. Periodically repeated measurements can be combined to form high-temperature voltammograms (Fig. 2). This method has been named Temperature-Pulse Voltammetry (TPV). Thin wire electrodes proved to be useful for many tasks since they possess extremely fast heating-up and cooling-down periods. Problems are encountered with surface modification of such microelectrodes upon heating. Recently, the surface of a 25 µm gold wire has been modified with a layer of carbon nanotubes by means of an electrophoretic procedure 9. Thermal modulation by lasers has been evaluated by definition as a „thermoelectrochemical impedance“ 10-11. The relaxation period following a laser-induced fast temperature jump 30

provides information on fundamental properties like maximum entropy of double layer formation and related quantities 12.

Fig. 1. Current response of a heated wire electrode (Pt, 25 µm) with heat pulses of 0.1 s duration overlaid to an electrode potential staircase excitation Continuously Joule-heated wires have been made the basis of numerous chemical sensors, among them enzyme sensors 13 and DNA probes 14-15. Simultaneous determination of two or more bioactive substances (e.g. different carbohydrates) has been enabled by evaluating different temperature functions of individual voltammetric signals 16. TPV, i.e. electric pulse heating, also was designed for analytical voltammetry. Fig. 2 gives an example. Laser activation of voltammetric electrodes has found broad range of analytical application 5. This holds true also for microwave activation methods 6.

Fig. 2. Temperature pulse voltammograms for a 5 mM equimolar solution of ferrocyanide and ferricyanide in 0.1 M KCl. 31

Conclusions Modern thermoelectrochemical methods open the route to use the temperature as a really independent variable. The main application field of Joule electrode heating, laser illumination and microwave activation of electrodes is analytical chemistry. Fundamental kinetic information is obtained by fast temperature changes as well as by thermal modulation of electrochemical processes. References 1. Voss T., Kirbs A., Gründler P.: Fresenius‘ J. Anal. Chem. 367, 320 (2000). 2. Chen Y. T., Jiang Y. Y., Lin Z. Y., Sun J. J., Zhang L., Chen G. N.: Luminescence 23, 63 (2008). 3. Valdes J. L., Miller B. J.: Phys. Chem. 92, 525(1988). 4. Climent V., Coles B. A., Compton R. G.: J. Phys. Chem. B 105, 10669 (2001). 5. Akkermans R. P., Suarez M. F., Roberts S. L., Qiu F. L., Compton R. G.: Electroanalysis 11, 1191 (1999). 6. Cutress I.J., Marken F., Compton R.: Electroanalysis 21, 113 (2009). 7. Qiu F., Compton R., Coles B., Marken F.: J. Electroanal. Chem. 492, 150 (2000). 8. Baranski A. S.: Anal. Chem. 74, 1294 (2002). 9. Gründler P., Frank O., Kavan L., Dunsch L.: Chemphyschem 10, 559 (2009) 10. Olivier A., Merienne E., Chopart J. P., Aaboubi O.: Electrochim. Acta: 37, 1945 (1992). 11. Rotenberg Z. A.: Electrochim. Acta 42, 793 (1997). 12. Climent V., Coles B. A., Compton R. G.: J. Phys. Chem. B 106, 5258 (2002). 13. Lau C., Borgmann S., Maciejewska M., Ngounou B., Gründler P., Schuhmann W.: Biosens. Bioelectronics 22, 3014 (2007). 14. Wang J., Flechsig G. U., Erdem A., Korbut O., Gründler P.: Electroanalysis 16, 928 (2004). 15. Peter J., Reske T., Flechsig G. U.: Electroanalysis 19, 1356 (2007). 16. Lau C., Reiter S., Schuhmann W., Gründler P.: Anal. Bioanal. Chem. 379, 255 (2004).

32

Electrochemical Behavior of Oligonucleotides Gontaining Guanine Stretches Luděk Havran, Pavlína Vidláková, Hana Pivoňková, Iva Kejnovská, Michaela Vorlíčková a Miroslav Fojta Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Kralovopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, E-mail:[email protected] DNA is an electro- and surface-active substance producing at mercury, carbon or some other electrodes analytically useful signals 1. At mercury electrodes, adenine and cytosine in nucleic acids produce a cathodic peak CA (due to its reduction). Guanine gives anodic signal G, which is obtained in cyclic voltammetry (CV) or in anodic stripping modes (due to oxidation of a reduction product of guanine that is reduced at very negative potentials). At carbon electrodes guanine and adenine in NAs undergo oxidation at positive potentials and produce oxidation signals Aox and Gox 2. At the mercury-based electrodes nucleic acids yield several capacitive (non-faradaic) signals due to adsorption/desorption or reorientation of their molecules at the electrode surface. The DNA, depending on its nucleotide sequence and external conditions, can undergo a variety of conformational transitions and adopt different secondary structures such as hairpins, cruciforms, left-handed Z-DNA, triplexes or quadruplexes. Some of them may occur in natural DNAs as local structures stabilized by negative DNA supercoiling and it is generally accepted that (at least) some of them have biological (regulatory) functions 3. In vitro some of these “non-B” structures can be modeled using synthetic oligonucleotides (ON) 4. G-rich ONs easily form G-quadruplexes, mainly in the presence of K+ ions. In this contribution we studied electrochemical behavior of ONs with possessing G-stretches of different lengths at the hanging mercury drop electrode (HMDE). Set of 15-mer ON containing 0 – 15 G was used for this study. For ONs with 0 to 3 G residues intensity of the peak G linearly increased with the number of G. On the contrary, for ONs with 5 to 15 guanines the peak G height decreased with expanding length of the G stretch. Gel electrophoresis and CD specrophotometry data revealed formation of stable tetraplex structures by ONs exhibiting the apparently anomalous electrochemical behavior. Our result suggests that accessibility of guanine residues involved in the quadruplex structure for electrode processes at HMDE is strongly restricted, making thus possible to monitor electrochemically the quadruplex formation. Acknowledgements This work was supported by grants of the GA ASCR IAA400040903, MEYS CR (LC06035), and institutional research plans Nos. AV0Z50040507 and AV0Z50040702. References 1. E. Paleček, Naturwiss. 45, 186 (1958). 2. E. Paleček, F. Jelen, v Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics (Eds: E. Paleček, F. Scheller, J. Wang), Elsevier, Amsterdam, 2005, Vol. 1, pp 74-174. 3. Paleček, E. Crit. Rev. in Biochem. Mol. Biol. 26, 151 (1991). 4. Blackburn, G. M.; Gait, M. J. Nucleic acids in chemistry and biology; Oxford university press: Oxford, 1996.

33

Voltammetric Displays of Reactivity of Electroactive Species in Different States of Dispersion (Review) Michael Heyrovský a and Andrey V. Korshunov b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic; e-mail: [email protected] b Department of General and Inorganic Chemistry, Tomsk Polytechnic University, Lenin Avenue 30, 634050 Tomsk, Russian Federation; e-mail: [email protected] The authors of early polarographic papers sometimes described particular disturbances of polarographic curves, which they connected with the presence of insoluble or colloidal particles in the solution 1-4. After years of experience with polarographic research it can be now concluded that electrolysis with mercury electrodes allows us to specify nearer the state of dispersion of the studied liquid medium. According to electrochemical behavior four different degrees of dispersion can be distinguished. In true solutions the redox process generates concentration gradients of the oxidized and the reduced forms of the electroactive species on surface of the working electrode. The electroactive molecules or ions are then brought to the electrode by a diffusion flux and after they have undergone the electrode reaction the products are transported by diffusion back to the bulk of the solution. Their electroactivity is characterized in polarographic/voltammetric methods in a specific region of potentials by cathodic or anodic current of intensity given by concentration of the species. Reproducibility of polarographic/voltammetric curves of true solutions is excellent. The theory of diffusion-controlled currents has been worked out for various electrochemical methods. Next degree of aggregation after true solutions is the colloidal state where the average sizes of particles may vary between 1 and 100 nm. The electrode reactions of colloidal particles are not identical with those of the same species in true solutions, however, the reagents are brought to the working electrode and the products transported from it by diffusion. The electroactivity of colloidal solutions is therefore characterized by reduction or oxidation diffusion-controlled currents, like that of true solutions, only the potential and the parameters of the currents are different 5, as the properties of particles (their size and structure) depend on the agglomeration of the primary ions or molecules. According to experimental conditions the aggregation of chemical species in solution can continue to a certain degree and then it stops. At that stage the formed particles are usually of a certain variety of shapes and sizes and the system is polydisperse. Under certain precautions and complex procedures, particles of equal shape and size can be prepared, the well defined monodisperse colloids 6. In polarography/voltammetry the slopes of the curves of monodisperse colloids are steeper than those of the polydisperse ones. Aggregates of electroactive species consisting of particles sized between about 100 nm and 1 μm in diameter form fine suspensions which show certain stability in solution. Their particles move in the medium by the thermal Brownian motion which acts as motor of their electroactivity by making them approach and then leave the working electrode – no stirring is needed for display of electroactivity. Diffusion flux of reagents and products to and from the working electrode does not occur in fine suspensions. The exchange of electrons with the working electrode occurs during fortuitous impingements on it by the particles, and the resulting current – potential curve has the form of sharp irregular cathodic or anodic flares 7-9.

34

The voltammetric curves are not well reproducible; they can give only certain qualitative information about electrode reactions of the dispersed particles, which differ from the reactions of the species in true solutions. If on the polarographic/voltammetric curve of a mixture of electroactive compounds appear superimposed irregular sharp peaks, it is a sign that some of the species in the mixture is in form of suspended particles. When the electroactive species in solution occurs in form of coarse suspension settled on bottom of the cell, its electroactivity can be seen only by stirring the solution which brings individual particles into contact with the electrode 10-12. The electroactivity is expressed by peak-shaped polarographic or voltammetric curves occurring over relatively wide range of potentials, as the impingements of the particles upon the electrode depend on the stirring. Hence the reproducibility of the curves is poor. The electrode reactions of big particles differ essentially from those of single ions or molecules, as the sizes and the electronic and spatial structures are basically different. Acknowledgement The authors thank the Czech GAAV for the grant No IAA 400400806, GA ČR for the grant No. 203/07/1195 and the Russian Fund for Basic Research for the grant No 08-08-12077. References 1. Sanigar E. B. : Rec. Trav. Chim. Pays-Bas 44, 549 (1925). 2. Shikata M., Hozaki N.: J. Soc. Chem. Ind. Japan 32, 1135 (1929). 3. Majer V.: Chem. Listy 37, 202 (1943). 4. Bowers R. C., Kolthoff I.M.: J. Am. Chem. Soc. 81, 1836 (1959). 5. Heyrovský M., Jirkovský J.: Langmuir 11, 4288 (1995). 6. Matijevic' E.: Langmuir 10, 8 (1994). 7. Korshunov A., Heyrovský M.: Electroanalysis 18, 423 (2006). 8. Korshunov A., Heyrovský M., Bakardjieva S., Brabec L.: Langmuir 23, 1523 (2007). 9. Korshunov A., Heyrovský M.: J.Electroanal.Chem. 629, 23 (2009). 10. Micka K. in Advances in Polarography (Longmuir I.S., ed.) p.1182. Pergamon Press, Oxford, 1960. 11. Micka K.: Chem.Listy 49, 1144 (1955); Collect.Czech.Chem.Commun. 21, 647 (1956). 12. Micka K.: Chem.Listy 55, 852 (1961).

35

Electrochemical Detection of Single Nucleotide Polymorphisms Using Enzyme-Linked Assay a,b Petra Horáková , Eva Šimková a,c, Zdenka Vychodilová a,c, Marie Brázdová a, Karel Vytřas b and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics AS CR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic. b Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University Of Pardubice, Nám. Čs. Legií 565, 532 10 Pardubice, Czech Republic. c Faculty of Science, Masaryk University, Kotlářská 2, 611 37, Brno, Czech Republic. E-mail: [email protected] Single-nucleotide polymorphism (SNP) (point mutation) is the most common type of alterations in DNA sequence. It occurs when a single nucleotide is replaced with another. Two of every three SNPs found in genes involve the replacement of cytosine (C) with thymine (T). SNPs in noncoding regions of the genome may have no effect on cell function, but in coding or regulating regions of genes they may predispose people to disease and influence their response to drugs, bacteria, viruses, and other substances. The p53 protein is a transcription factor important in humans and animals. It regulates the cell cycle and, as a tumor suppressor, it plays a role in cancer prevention. The p53 controls many anti-cancer mechanisms 1. If the p53 gene is mutated in specific “hot-spots“, tumor suppression is severely reduced. It was found, more then 50 % of human tumors contain mutation of the p53 gene. Molecular biologists proposed a lot of methods for SNP typing based on primer extension (PEx) or polymerase chain reaction (PCR) combined with electrophoresis or fluorescence detection. Here we present a method utilizing PEx connected with electrochemistry, enzyme linked assay 2,3 and magnetic beads 4. In electrochemical sensing of DNA, responses of modified (labeled) DNAs are often utilized. The DNA can be modified by different electroactive groups (e.g. ferrocene 5, nitro- or aminophenyl 6, complexes of osmium or ruthenium 7, and others) or by enzymes. Labeling with enzymes is widely applied due to the advantages of inherent biocatalytic signal amplification. Electrochemical enzyme-linked assays require conversion of a substrate into a products differing from the substrate by its electrochemical properties. When electrochemically inactive substrate is converted into an active product, appearance of the latter and changes in its concentration can easily be monitored. In the primer extension scheme used in this work, the primer is hybridized with complementary sequence of target DNA and treated with DNA polymerase and biotinylated dNTP. The extension of the primer by the labeled dNTP occurs (or does not occur) according to complementarity of the first free nucleobase on target DNA template following the primer corresponding sequence (Fig.1A). Duplex DNA (consisting of the target strand and primer with dA20 overhang on its 5´ end) is immobilized onto magnetic beads bearing dT25 strands. If the biotinylated dNTP was introduced, the streptavidin alkaline phosphatase conjugate is bound to the biotin tag and after washing, the product of enzymatic reaction, 1-naphthol, is formed from the substrate 1-naphthyl phosphate. Than the 1-naphthol-containing solution is separated from the magnetic beads, added to background electrolyte (0,5 M K2CO3 and 0,5 M NaHCO3 pH 9,5) and analyzed by linear sweep voltammetry (initial potential -0,5 V, end potential +0,9 V, scan rate 1 Vs-1, potential step 5 mV) at a basal-plane PGE.

36

Fig.1. (A) Scheme of primer extension by SNP typing of p53- G245S hot-spot. In the wild type p53 gene nucleobase guanine occurs within the position corresponding to the mutation hot-spot. During the PEx reaction with a sequence-specific primer, DNA polymerase and a biotinylated dCTP (Cbio) or dUTP (Ubio), only the Cbio is attached to 3’-end of the primer according to the G-C complementarity, while Ubio is not For the G245S mutant (in which the guanine is replaced by adenine) the primer is extended by Ubio, but not by Cbio. (B) Real voltammograms observed after PEx of samples described in A and enzyme-linked assay using magnetic beads. We utilized the primer extension combined with enzyme-linked assay on magnetic beads and electrochemical detection for the SNP typing. This method was successfully applied in model experiments with synthetic oligonucleotides as well as in analysis of PCR products of human p53 gene. Acknowledgement This work was supported by MEYS CR (LC06035) and by GACR (203/07/1195). References 1. Petitjean A., Achatz M. I., Borresen-Dale A. L., Hainaut P., Olivier M.: Oncogene 26, 2157 (2007). 2. Fojta M., Brázdilová P., Cahová K., Pečinka P.: Electroanalysis 18, 141 (2006). 3. Horáková-Brázdilová P., Fojtová M., Vytřas K., Fojta M.: Sensors 8, 193 (2008). 4. Paleček E. and Fojta M..: Talanta 74, 276 (2007). 5. Brázdilová P., Vrábel M., Pohl R., Pivoňková H., Havran L., Hocek M., Fojta M. : Chem. Eur. J. 13, 9527 (2007). 6. Cahova H., Havran L., Brázdilová P., Pivoňková H., Pohl R., Fojta M., Hocek M. : Angew. Chem. 120, 2089 (2008). 7. Vrábel M., Horáková P., Pivoňková H., Kalachova L., Černocká H., Cahová H., Pohl R., Šebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M. : Chem. Eur. J. 15, 114 (2009).

37

Porézní grafit a jeho využití jako elektrochemického senzoru Terezie Kašparová a, Iva Jelínková a, Aleš Horna a,b, Vojtěch Adam c,d, René Kizek d a Radanal s.r.o., Okružní 613, CZ-530 03 Pardubice, E-mail: [email protected] b Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Univerzitní institut, Centrum výzkumu potravin, Nad Ovčírnou 3685, CZ-760 01 Zlín c Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav výživy zvířat a pícninářství, Zemědělská 1, CZ-613 00 Brno d Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Ústav Chemie a Biochemie, Zemědělská 1, CZ-613 00 Brno Porézní grafit jako pracovní elektroda je v současné době v elektrochemii velmi zajímavým fenoménem. Oproti pevným pracovním elektrodám s povrchy vyžadujícími mechanické čistění, skrývají průtokové elektrody, vyrobené z porézního grafitu ohromné aplikační možnosti. Coulometrická elektroda vyrobená z porézního grafitu má daleko větší povrch a difuze tedy není určujícím krokem rychlosti redoxní reakce jak je tomu u klasické pevné elektrody. Oxidačně redukčním reakcím na povrchu coulometrické elektrody podléhá 100% přítomného analytu. Selektivitu a citlivost detekce lze ještě více zvýšit sériovým propojením dvou a více elektrod. Dochází tak k vytvoření elektrodového pole, přičemž na každé elektrodě je vloženo rozdílné napětí.

Obr. 1. Porézní grafitová elektroda o velikosti pórů 0,22 μm Takto vytvořené elektrodové pole z porézního grafitu může sloužit jako vysoce selektivní nástroj k identifikaci látek. Volbou složení mobilní fáze a vhodného potenciálu, při kterém bude mít stanovovaná látka nejvyšší proudovou odezvu (tzv. dominantní pík), lze dosáhnout maximální citlivosti stanovení každé látky. Látky podléhající redoxním dějům při nižším potenciálu budou zcela oxidovány a nebudou už poskytovat signál při nastaveném vyšším potenciálu. To je zásadní rozdíl od amperometrického uspořádání, kde je rychlost reakce limitována difuzí k povrchu elektrody. Pokud se chromatograficky nedaří rozdělit dvě látky, které se liší svými elektrochemickými vlastnostmi, je možné je rozlišit voltametricky. Porézní grafitové elektrody se tak staly základem aplikací nejúspěšnějších komerčně dostupných elektrochemických detektorů Coulochem® a CoulArray®. Pomocí detektoru CoulArray®, který pracuje s porézními grafitovými elektrodami řazenými za sebou v blocích vždy po čtyřech, můžeme získat třídimenzionální pohled na vzorek a navíc v případě, že máme k dispozici standardy elektroaktivních látek, může látky identifikovat na základě jejich elektrochemické charakteristiky, pro kterou se využívá poměrů tří nejdominantnějších píků (obr. 2). V následující Tabulce I je uveden přehled komerčně dostupných elektrochemických cel s počtem elektrod z porézního grafitu. Dalším zde uvedeným parametrem je mrtvý objem cely, což je objem od vstupu po první senzor a celkový objem cely, což je objem od vstupu po výstup. Posledním uvedeným parametrem je maximální pracovní tlak jednotlivých cel.

38

Voltamogram 2. Pre‐Dominant  3. Dominant  4. Post‐Dominant

Obr. 2: A: blok čtyř sériově řazených průtočných coulochemických elektrod. B, D: predominantní, dominantní a post-dominantní píky v CoulArray chromatografickém záznamu. C: voltamogram získaný z CoulArray Softwaru Tabulka I. Vnitřní objemy a maximální pracovní tlak coulochemických cel s elektrodami z porézního grafitu

5010A Standard Analytical Cell

2

Mrtvý objem* [μl] 6,8

5011A High Sensitivity Analytical Cell

2

6,8

24,8

42

5014B Microdialysis Cell

2

-

19

42

5020 Guard Cell

1

-

40

422

5021A Conditioning Cell

1

6,7

17

41

5030 Low Volume (LC/MS) Cell

1

0,3

3,1

41

5125 Synthesis Cell

1

71

225

200

5150 Synthesis Cell

1

356

1032

200

Elektrochemická cela

Počet elektrod

Celkový vnitřní objem [μl] 34,4

Maximální pracovní tlak [bar] 42

*Objem od vstupu po první senzor Jednokanálová elektrochemická cela model 5030 (Low Volume LC/MS Cell) o objemu od vstupu k senzoru 0,3μl, je využitelná pro aplikace využívající spojení elektrochemie a hmotnostní spektrometrie. Tento senzor vyhovuje průtoku využívaného ve spojení LC/MS. Jeho využití spočívá v postkolonové derivatizaci analytu, který sám dává malý celkový iontový proud a není tudíž pomocí MS detekovatelný. Nejvíce používanými jsou dvoukanálové coulochemické cely ESA, modely 5010 (Standard Analytical Cell) a 5011 (High Sensitivity Analytical Cell), které se používají pro detekci celého spektra elektroaktivních látek s výjimkou cukrů. V současné době nejvýznamnější a vlastně první aplikací, pro kterou byly vůbec coulochemické cely vyvinuty, je klinické stanovení hladin plasmatických katecholaminů. Pro toto stanovení se využívá spojení analytické cely 5011 (High Sensitivity Analytical Cell) s kondicionační celou 5021 39

(Conditioning Cell), která slouží jako předřazený postkolonový reaktor. Při tomto uspořádání se využívá vlastností katecholaminů se cyklicky oxidovat a redukovat. Na rozdíl od doprovodných elaktroaktivních látek způsobujících šum se katecholaminy nerozkládají. Další významnou aplikací porézního grafitu je konstrukce tzv. ochranné cely 5020 (Guard Cell), která slouží k odstranění elektroaktivních látek z mobilní fáze před nástřikem analytu. To výrazně snižuje šum základní linie a zlepšuje citlivost detekce jako poměru signálu k šumu. Konstrukce guard cely je pozoruhodná v tom, že je to jediná elektrochemická cela, která snáší tlak až 400 barů a tudíž je v HPLC systému umístěna hned za chromatografickou pumpou. Společným rysem všech coulochemických cel je využití suché referentní H/Pd elektrody, která skutečně nevyžaduje žádnou údržbu a uživatel o ní prakticky ani nemusí vědět. Používání H/Pd referentní elektrody neznamená, že by se nedalo použít coulochemickou celu s referentní Ag/Cl elektrodou. Pro tento účel je komerčně dostupná 5014 (Mikrodialysis Cell), která je obecně používána pro analýzu mikrodialyzátu, tedy silně zasolených médií. Od roku 2007 jsou komerčně dostupné dva typy preparativních cel 5125 a 5150 (Synthesis Cell), které využívají porézní grafit jako heterogenní reaktor pro syntézu metabolitů odvozených od aktivních komponent v biologických testech. Uplatnění mají hlavně v analytických laboratořích, které se zabývají ADME-TOX (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) a predikcí oxidační stability toxicity látek. Ke spolehlivému určení chemické struktury látky je často potřebná syntéza dostatečného množství daného metabolitu, který však zpravidla není komerčně dostupný. Tyto cely jsou schopny syntetizovat řádově mikrogramy produktů. V syntéze porézní grafit simuluje práci enzymů schopných vyvolat několik chemických reakcí jako například N- a O-dealkylaci, aromatickou hydroxylaci, N-oxidaci, deaminaci a dehydrogenaci. Poděkování Práce byla podpořena z projektu KAN208130801 a projektu VITAMINY2000. Literatura 1. Matson W. R.., Langlais P., Volicer L., Gamache P. H., Bird E., Mark K. A.: Clin. Chem. 30, 1477 (1984). 2. Flanagan R. J., Perett D., Whelpton R.: Electrochemical Detection in HPLC. Analysis of Drugs and Poisons. The Royal Society of Chemistry, Cambridge 2005.

40

Reduction of Pesticide Bifenox in the Presence of Cyclodextrin Cavities Magdaléna Hromadová a, Lubomír Pospíšil a, Romana Sokolová a, Miroslav Gál a and Stefania Giannarelli b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Dolejškova 3, 18223 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Department of Chemistry and Industrial Chemistry, University of Pisa, Via Risorgimento 35, 56100 Pisa, Italy Bifenox (methyl 5-(2,4-dichloro-phenoxy)-2-nitrobenzoate), trade name Modown, is used in the control of broad-leaved weeds and grasses to increase the production of commercially important foodstuffs like cereals, maize, rice or beans. Bifenox is activated by solar radiation and its herbicidal action is directly linked to the production of reactive free radicals in the foliar tissue, where they inhibit the photosynthetic process and cause the cell damage. In this work we investigated the effect of cyclodextrins of different cavity sizes on the reduction of bifenox focusing primarily on the fate of a primary nitro anion radical and the reactive intermediates. Cl O C Cl

O

OCH 3 NO 2

Fig. 1. Bifenox. The reduction of bifenox was studied in aprotic solvents in the absence 1,2 and presence of cyclodextrin molecules of different cavity sizes (αCD, βCD and γCD). Protection of the active groups of bifenox was investigated by electrochemical, UV-VIS, FTIR, EPR and GCMS methods. UV-Vis spectroscopy confirmed the 1:1 complex formation of bifenox with βCD and γCD. In acetonitrile and dimethylsulfoxide (Fig. 2, curve a, 0.5 mM bifenox) the model compound yields the anion radical, which is further reduced by an overall addition of three electrons and four protons to the corresponding phenyl-hydroxylamine. In the presence of β-cyclodextrin the first reduction wave is shifted towards more positive potentials, the reduction process becomes irreversible (curve c, 0.05M βCD) and the total uptake of two electrons is observed. On the contrary, the first reduction step of bifenox is not affected by an addition of glucose (curve b, 0.35 M). Therefore, a simple availability of protons from the OH groups is not the main factor in the further transformation of the bifenox anion radical in the presence of cyclodextrins. The complex formation with βCD facilitates the proton transfer to the bifenox radical anion and affects the product distribution of an exhaustive electrolysis at –1.0 V. For example, a yield of dichlorophenol decreases with the ability of cyclodextrins to form a complex with bifenox, i.e. in the order βCD, γCD and αCD.

41

-4 -3

0.5 V/s

-2

-3

c a

-1

i / μA

0 1 -0.5

-1.0

-2

c b

-1

a −

1e 0 -0.5

-1.0

E/V

-1.5

-2.0

Fig. 2. DC polarograms of 0.5 mM bifenox in 0.1M tetrabutylammonium hexafluorophosphate and dimethyl sulfoxide in the absence (curve a) and after addition of 0.35 M glucose (curve b) or 0.05M βcyclodextrin (curve c), respectively. The inset shows cyclic voltammograms of 0.5 mM bifenox in the absence (curve a) and presence of 0.05M βCD (curve c) at the scan rate 0.5V/s. Acknowledgements A Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (IAA400400802), Grant Agency of the Czech Republic (GACR 203/08/1157 and 203/09/1607) and Ministry of Education (COST OC140) are greatly acknowledged for the financial support. References 1. Hromadová M., Mořkovská P., Pospíšil L., Giannarelli S.: J. Electroanal. Chem. 582, 156 (2005). 2. Mořkovská P., Hromadová M., Pospíšil L., Giannarelli S.: Langmuir 22, 1896 (2006).

42

Voltametrické stanovení antioxidantů ve vybraných palivech a mazivech Jaromíra Chýlková a, Renáta Šelešovská a, Jaroslava Michalíková b, Libor Dušek a a Zdenka Zoubková a a Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemickotechnologická, Univerzita Pardubice, Studentská 95, 532 10 Pardubice 2 Česká republika, E-mail: [email protected] b Katedra dopravních prostředků a diagnostiky, Dopravní fakulta Jana Pernera, Univerzita Pardubice, Studentská 95, 532 10 Pardubice 2 Úvod Jednou z hlavních příčin stárnutí motorových olejů je jejich oxidace. Projevuje se tmavnutím olejů vlivem vzniku barevných oxidačních produktů, dále tvorbou pryskyřic, které jsou výsledkem polymeračních reakcí oxidačních zplodin, zvyšováním viskozity olejů a jejich rostoucí kyselostí. Tyto skutečnosti vedou k celé řadě negativních jevů. Především dochází k ucpávání úzkých profilů, a tedy ke zhoršování rozvodu oleje, kyselé oxidační produkty zvyšují korozi mazaných kovových součástí 1,2. Výše popsaným pochodům lze zabránit přídavky vhodných antioxidantů, které se v systému oxidují přednostně; zpomalují degradaci oleje a zvyšují jeho užitnou hodnotu. Jsou chráněna jak maziva, tak mazané součásti, což vede k ekonomickým úsporám i k ochraně životního prostředí vlivem snižování produkce kapalných i pevných odpadů. Jako nízkoteplotní antioxidanty, které působí při teplotách do 120 °C, se používají buď různě substituované fenoly, např. 2,6-di-t-butyl-4-methylfenol (BHT) nebo sekundární aromatické aminy, jako je N-phenyl-1-nafthyl amin. V řadě produktů se kombinují oba typy. Obsah antioxidantů v olejích se v průběhu používání oleje v provozu snižuje, až dojde k jejich vymizení a tedy ke ztrátě ochranných vlastností. V této fázi je nutno olej vyměnit. Vzhledem k tomu, že opotřebovaný motorový olej představuje poměrně složitou matrici, je třeba vyvíjet spolehlivé a snadno proveditelné metody analýzy jeho aditiv, které jsou vhodné pro použití v široké odborné praxi. Proti oxidaci je nutno chránit i bionaftu, protože přírodní antioxidant – vitamin E, který obsahuje, nedokáže zabránit jejímu žluknutí. Jedná se o oxidační proces, při němž vznikají nižší mastné kyseliny a nerozpustné polymery, které mohou poškodit motor v důsledku koroze a vzniku úsad. Oxidační stabilita bionafty se zvyšuje rovněž přídavky syntetických antioxidantů na podobné bázi jako u olejů 3. Materiály a metody Podmínky voltametrického stanovení antioxidantů fenolického typu byly testovány na modelových roztocích 2,6-di-t-butyl-4-methylphenolu (BHT) připravených vážením pevné substance čistoty min 99 % (AppliChem) a rozpuštěním v redestilované vodě. Rušivý vliv antioxidantů na bázi sekundárních aromatických aminů byl připraven vážením pevné látky Nphenyl-1-nafthyl aminu o čistotě 98 % (Acros Organics) a rozpuštěním opět v redestilované vodě. Koncentrace zásobních roztoků se pohybovaly okolo 4,5 g/l. Roztoky byly uchovávány v době mezi měřením v chladu při teplotě 4 °C a v temnu. Veškerá měření byla realizována pomocí elektrochemického analyzátoru EP 100 (HSC Servis, Bratislava). Elektrodový systém se skládal ze tří elektrod − zlaté indikační elektrody, referentní argentchloridové elektrody opatřené kapalinovým můstkem s náplní nasyceného roztoku NaNO3 a pomocné platinové elektrody. Elektrochemická oxidace BHT probíhala v rozsahu potenciálů 0 až 1200 mV metodou DC. Stanovení bylo prováděno v kyselém

43

prostředí4 za přítomnosti organických rozpouštědel, a to ethanolu, acetonitrilu a jejich směsi. K eliminaci rušivého vlivu aminických antioxidantů sloužil roztok dusitanu sodného o koncentraci přibližně 1 mol.l-1. Výsledky a diskuse Vzhledem ke struktuře analyzovaných látek bylo třeba kvůli zajištění jejich rozpustnosti provádět stanovení v prostředí organického rozpouštědla. V důsledku velké reaktivity fenolů v alkalickém prostředí hrozil pokles jejich koncentrace vlivem rekcí s dalšími složkami vzorku; proto bylo stanovení BHT nutno realizovat v kyselém prostředí. Vhodné složení základního elektrolytu – směs ethylakoholu a acetonitrilu (9 : 3) za přítomnosti 0,2 M H2SO 4 bylo nalezeno na základě celé řady experimentů. V tomto prostředí poskytuje oxidace BHT dobře vyhodnotitelné vlny (E1/2 ∼970 mV), jejichž výška lineárně závisí na stanovovaném množství (obr 1).

Obr. Obr. 1. Voltametrické stanovení BHT metodou DC v prostředí 0,2 M H2SO4, za přítomnosti směsi EtOH: acetonitril 9 : 3 (stanovované množství v rozsahu 0,096 mg/15 ml až 0,866mg/15 ml). Probíhá-li oxidace pouze v kyselém roztoku samotných rozpouštědel, je linearita rovněž zachována (obr.2), ale za přítomnosti EtOH nastává oxidace základního elektrolytu již při potenciálu cca 1000 mV, což může u reálných vzorků znesnadňovat vyhodnocení. V prostředí acetonitrilu je sice dosahováno vyšší citlivosti stanovení, ale půlvlnový potenciál, příslušející v tomto prostředí oxidaci BHT (1110 mV), je blízko potenciálu začínající oxidace acetonitrilu (1210 mV) a opět se hůře vyhodnocuje výška vlny BHT.

44

Kalibrace BHT 8 y = 8,4162x - 0,0254

7

6

5 ETOH + ACET ACET ETOH Lineární (ACET) Lineární (ETOH + ACET)

uA

y = 5,2112x + 0,0792 4

3

2

1

0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

mg/15 ml

Obr. 2. Závislost mezi výškou vlny oxidace BHT, vyjádřené velikostí proudu, a stanovovaným množstvím v prostředí 0,2 M H2S04 za přítomnosti různých organických rozpouštědel. V reálných vzorcích olejů se může vyskytovat více typů antioxidantů. Bylo proto zkoumáno, jak je stanovení BHT ovlivněno přítomností N-phenyl-1- napthyl aminu (PNA). Bylo zjištěno, že významná koncentrace tohoto sekundárního aminu, cca 2,5 x vyšší než koncentrace BHT, stanovení ovlivňuje. Jak je zřejmé z obr. 3, vyhodnotí-li se výška vlny BHT ve směsi s PNA pomocí metody standardního přídavku, získá se výsledek s chybou -56 %. Je to dáno superpozicí obou vln, kdy zvláště vlna PNA vykazuje výrazné maximum. Pokles proudu za maximem se sčítá s narůstajícím proudem oxidace BHT. Výsledkem je nižší výška vlny tohoto fenolického antioxidantu. Existuje několik způsobů, jak výše uvedený problém řešit. V této práci bylo využito reakce sekundárních aromatických aminů s kyselinou dusitou, kdy vznikají N- nitrosaminy5.Této reakce je možné posléze využít k selektivnímu stanovení těchto antioxidantů. Rušivý vliv kyseliny dusité na vlnu odpovídající oxidaci BHT lze eliminovat asi 5 minutovým stripováním HNO2 z kyselého prostředí základního elektrolytu inertním plynem. Na obr. č. 3 je také dokumentováno stanovení BHT po eliminaci vlny PNA. Výsledek v tomto případě vykazuje odchylku od správné hodnoty o -1,4 %.

45

b a d c

Obr. 3. Voltametrické stanovení BHT v přítomnosti 2,5x vyšší koncentrace PNA metodou DC (základní elektrolyt: 0,2 M H2SO4, EtOH : acetonitril 9 :3) a – 0,481 mg BHT/15 ml a 1,115 mg PNA/15 ml b − přídavek 0,481 mg BHT/15 ml c – 0,962 mg BHT /15 ml po eliminaci PNA d – přídavek 0,481 mg BHT/15 ml Na základě těchto výsledků lze u reálných vzorků doporučit v případě výskytu vlny aminických antioxidantů (E1/2 mezi 600 až 700 mV) vždy jejich vlnu potlačit přídavkem dusitanu sodného. Izolace antioxidantů z olejů již byla řešena4 − spočívá v extrakci definovaného množství oleje roztokem ethanolu za spolupůsobení ultrazvukového pole. Závěr Navržená metoda voltametrického stanovení antioxidantů může být alternativou k spektrometrickému stanovení pomocí FTIR. Díky cenové dostupnosti elektrochemických analyzátorů jistě najde uplatnění v široké odborné veřejnosti, zabývající se analýzou olejů. Poděkování Tato práce vznikla v rámci výzkumného záměru MSM0021627502 „Pokročilé analytické a separační metody a jejich aplikace v diagnostice a technologii živých a neživých materiálů“. Literatura 1. http://oleje.cz/index.php?left=main&page=clanky_vlastnosti_oleju7. staženo 3. března 2009. 2. http://oleje.cz/index.php?left=main&page=clanky_vlastnosti_oleju4. staženo 3. března 2009. 3. http://www.chemagazin.cz/Texty/CHXVII_6_cl12.pdf. staženo 3. března 2009. 4. Chýlková J., Šelešovská R., Machalíková J., Dušek L., Weidlich T.: 12th International Conference on Electroanalysis, ESEAC 2008, June 16 -19 , Praha 2008. 5. Černý V. J. a kol.: Organická synthesa – Organikum, ACADEMIA, Praha 1971, str. 349.

46

Usage of Carbon Paste Electrode Modified by SWNT Zuzana Jemelkova, Jiri Zima and Jiri Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic Carbon nanotubes (CNT), discovered in 1991 1, are a new type of carbon material with unique structural, geometric, mechanical and chemical properties. There are two types of CNT, single-wall (SWNT) and multi-wall carbon nanotubes (MWNT). SWNT, consisting of hollow cylindrically wound grapheme sheet, are real single large molecules. CNT can behave as metals or semiconductors depending on the structure and their unique properties make them very attractive for the design of electrochemical biosensors 2. MWNT are more often used for the preparation of carbon paste electrode 3-6. Epinephrine is an adrenal medulla hormone. It occurs also in sympathetic postganglionic terminal and in some parts of central nervous system. It is sympathicus activator and humoral transmitter of sympathetic excitement to target tissue 7. Epinephrine falls into the catecholamines group. The principal catecholamines are norepinephrine, epinephrine and dopamine. Catecholamines include compounds with a dihydroxyphenyl group and an amino group. By electrochemical oxidation, catecholamines are easily converted into quinone species 8. Catecholamines oxidation is electrochemically reversible and this fact eliminates or limits the interference from compounds whose oxidation is not chemically reversible, e.g. from oxygen. ED also enables to obtain high sensitivity without derivatization. Other methods for epinephrine assay and study are capillary electrophoresis 9,10 and flow injection analysis 11-13. Very often used detection methods are fluorescence, chemiluminescence and mass spectrometry. Epinephrine was purchased from Zentiva (Prague, Czech Republic) as a solution containing epinephrini hydrochloridum 1.2 mg (epinephrinum 1 mg) in 1 cm3 of injection solution. All experiments were carried out in Britton-Robinson (B-R) buffer solution prepared by mixing 0.2 mol⋅dm-3 sodium hydroxide with acidic solution (0.4 mol·dm-3 each of boric acid, phosphoric acid and acetic acid – all p.a., Sigma Aldrich, USA). Carbon nanotubes were purified by a treatment with a concentrated nitric acid as written in literature 14. The modified carbon paste was prepared by mixing the carbon powder with CNT and then with mineral oil. The paste was carefully hand-mixed for about half an hour in a mortar. A 4330 Conductivity & pH Meter (Jenway Ltd., Essex, UK) fitted with the combined glass electrode was employed to measure the pH of the solutions. Differential pulse voltammograms were obtained with PalmSens (Palm Instruments BV) controlled by PalmSensPC software (Ivium Technologies, Netherland). Appropriate measurements were carried out in the three-electrode system consisting of working miniaturized carbon paste electrode, (University of Pardubice, Czech Republic), silver/silver chloride, 3 mol⋅dm-3 KCl reference electrode RE-5B (BASi, USA) and a platinum wire as the auxiliary electrode (Monokrystaly, Turnov, Czech Republic). Instrumental parameters were: applied potential range 0 to +1000 mV; scan rate 20 mV·s-1; pulse amplitude +50 mV, pulse time 0.070 s. The carbon pastes containing 0, 10, 20, 30, 50 and 100 % (m/m) of SWNT were used as an electrode material for voltammetric determination of epinephrine. The influence of pH on voltammetric behaviour of epinephrine in B-R buffer pH 2 – 12 was studied. Concentration of measured epinephrine solution was 1·10-5 mol·dm-3. In B-R buffer media pH 2 - 7 was obtained one peak of epinephrine, that broadened in more alkaline media. In B-R buffer pH 11 and 12, no peak of epinephrine was recorded and the potential window narrowed down. B-

47

R buffer pH 6 was chosen for the following calibration measurements with all kinds of carbon paste. Curve parameters and correlation coefficients for dependency of epinephrine peak height on epinephrine concentration obtained using linear regression method are shown in Table I. The Figure 1 shows the comparison of peak heights obtained with different kinds of carbon paste. The carbon pastes containing 20 or 30 % of SWNT afford the lowest peaks and the best results are obtained with carbon paste modified with 50 % of SWNT. Also adsorptive stripping differential pulse voltammetry was used for determination of epinephrine, but epinephrine did not accumulate on the carbon paste. The peak heights and areas did not change significantly with increasing accumulation time tacc. 4000 I, nA 3000

2000

1000

0

2

4

6

8

10

12 pH

Fig. 1. The comparison of peak height (IP) of 1·10-5 mol·dm-3 solution of epinephrine in B-R buffer with different pH; carbon paste modified with 0 % SWNT (■); 10 % SWNT (□); 20 % SWNT (●); 30 % SWNT (○); 50 % SWNT (▲); 100 % SWNT (∆). Table I Curve parameters and correlation coefficients for dependency of epinephrine peak height on epinephrine concentration obtained using linear regression method; in B-R buffer pH 6. Concentration Slope Intercept Correlation Type of carbon (µA·µmol-1·dm3) paste (µA) coefficient range (mol⋅dm-3) 0 % SWNT

1⋅10-6 – 1⋅10-5

0.018

+ 0.009

0.998

10 % SWNT

6⋅10-6 – 1⋅10-4

0.028

+0.094

0.997

20 % SWNT

1⋅10-6 – 5.5⋅10-5

0.014

+0.001

0.993

30 % SWNT

4⋅10-6 – 5.5⋅10-5

0.016

+0.024

0.997

50 % SWNT

4⋅10-7 – 5.5⋅10-5

0.022

+0.012

0.992

100 % SWNT

4⋅10-6 – 1⋅10-5

0.014

+0.077

0.990

Carbon paste modified by 10, 20, 30 or 50 % (m/m) of SWNT was tested for determination of epinephrine and compared with bare carbon paste and carbon paste made of SWNT only. B-R 48

buffer pH 6 was chosen as optimal media for measurement with all types of carbon paste electrode. The limits of detection were 1·10-6, 6·10-6, 1·10-6, 4·10-6, 4·10-7 and 4·10-6 mol·dm-3 for carbon paste modified with 0, 10, 20, 30, 50 and 100 % of SWNT, respectively. The results show, that the higher amount of SWNT did the carbon paste contained the higher peak of epinephrine was obtained. The carbon paste containing 50 % of SWNT was chosen for following measurements with several catecholamines (dopamine, norepinephrine, epinephrine and DOPA). Acknowledgment The work was financially supported by Grant Agency of Charles University (project No. 34607/2007/B) and Ministry of Education, Youth and Sports of Czech Republic (projects No. LC 06035, project No. RP 14/63 and No. MSM 0021620857). References 1. Ijima S.: Nature 354, 56 (1991). 2. Zhao Q., Gan Z., Zhuang O.: Electroanalysis 14, 1609 (2002). 3. Rivas G. A., Rubianes M. D., Pedano M. L., Ferreyra N. F., Luque G. L., Rodriguez M. C., Miscoria S. A.: Electroanalysis 19, 823 (2007). 4. Zheng L., Song J.: Talanta 73, 943 (2007). 5. Chicharro M., Sanchez A., Bermejo E., Zapardiel A., Rubianes M. D., Rivas G. A.: Anal. Chim. Acta 543, 84 (2005). 6. Rubianes M. D., Rivas G. A.: Electroanalysis 17, 73 (2005). 7. Wenke M. Farmakologie, Avicenum, Praha 1984. 8. Koštíř J. Biochemie, Avicenum, Praha 1974. 9. Sabbioni, C.; Saracino, M.A.; Mandrioli, R.; Pinzauti, S.; Furlanetto, S.; Gerra, G.; Raggi, M.A.: J. Chromatogr. A 1032, 65 (2004). 10. Kumarathasan, P.; Vincent, R.: J. Chromatogr. A 987, 349 (2003). 11. Sanger-van de Griend, C.E.; Ek, A.G.; Widahl-Nasman, M.E.: J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 77 (2006). 12. Wei, S.L.; Song, G.Q.; Lin, J.M.: J. Chromatogr. A 1098, 166 (2005). 13. Zhao, C.; Shao, C.; Li, M.; Jiao, K.: Talanta 71, 1769 (2007). 14. Valentini F., Amine A., Orlanducci S., Terranova M. L., Palleschi G.: Anal. Chem. 75, 5413 (2003).

49

Voltammetric Determination of a Mixture of Aminoquinolines Using Carbon Film Electrode Ivan Jiránek and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Introduction Concern about environmentally friendly behavior led in the field of analytical chemistry to the concept of so called “Green analytical chemistry”. One of trends connected with this idea is an effort of substitution of mercury electrodes in the field of electrochemistry. Therefore several types of various electrodes were developed, among them also carbon film electrode (CFE) used in this study 1. CFE itself consists of a carbon film covering surface of any solid electrode (AgSAE in this case) which serves as a conductor only. Carbon film is created by immersing surface of solid electrode into the carbon ink prepared by mixing carbon powder with polystyren dissloved in some solvent. Electrochemical properties of the electrode are connected with the film, it means with carbon material which is advantageous from this point of view for its wide potential window (cca 3 V), high sensitivity and low noise together with its low price. For the sake of study of CFE’s properties, aminoquinolines - namely 5-aminoquinoline (5AQ), 6-aminoquinoline (6-AQ) and 8-aminoquinoline (8-AQ) (previously determined by different types of electrodes 2-4) were chosen as a model substances. Aminoquinolines represent a group of environmentally dangerous compounds 2-5 easily anodically oxidizable thanks to presence of amino group attached to the quinoline skelet. Structurally are closely related to NPAHs (nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons) known as carcinogenic and mutagenic substances. Aminoquinolines are also known as a structure base of drugs used against malaria and were tested as anticancer agents 6-8. Materials and methods Differential pulse voltammetry (DPV) at carbon film electrode (CFE) was used for determination of a mixture of aminoquinolines using Eco-Tribo Polarograph driven by software PolarPro version 5.1 (Polaro-Sensors, Prague) under the operational system Microsoft Windows XP (Microsoft Corp.). All measurements were carried out in a threeelectrode system. Platinum wire as an auxiliary electrode, silver/silver chloride reference electrode RAE 113 (1 mol·L-1 KCl, Monokrystaly Turnov, Czech republic) and CFE (AgSAE, disk diameter 0.55 mm, covered by carbon ink film) as a working electrode were used. Unless stated otherwise, the scan rate 20 mV·s-1, the pulse amplitude 50 mV and pulse width 80 ms were used. Electrochemical regeneration of CFE by application of 300 potential jumps between +100 mV (initial) and +600 (final) mV, each for 0.05 s. CFE was created by covering AgSAE's surface by a carbon film. The film is formed after immersing electrode's surface in conductive ink (the active part of the electrode just touch the surface of the ink). The ink was prepared by mixing 0.01 g of polystyrene and 0.09 g of carbon powder (crystalline graphite 2 μm, CR 2 Maziva Týn, Czech Republic) in 0.5 mL of dichlorethane and was thoroughly homogenized by intensive agitation for 5 minutes. Two minutes after immersing dichlorethane evaporates and the film, resp. CFE is ready to use. When it is necessary to renew the old film (for example because of passivation) it can be easily removed by wiping it off with a filter paper. New film is created by procedure described above.

50

Results and discussion A mixture of 5-AQ, 6-AQ and 8-AQ was analyzed DPV. Preliminary investigation showed up that only peaks of 6-AQ and 8-AQ are separated enough (Figure 1 and 2). For measurement of concentration dependences, BR buffer of pH 4 was chosen because of optimal combination of a good resolution and satisfactory height of peaks of both substances (6-AQ and 8-AQ; Figure 1 and 2). Calibration dependences of 6-AQ in the presence of 8-AQ and of 8-AQ in presence of 6-AQ in the concentration range (2 – 10)·10-6 mol·L-1 were measured. Constant concentration of the other substance was 0, 2, 4, 6, 8 and 10·10-6 mol·L-1, respectively. Appropriate parameters of all calibration dependences are summarized in Table 1. For the sake of illustration selected voltammograms of calibration dependences of 8-AQ in the presence of 6-AQ and 6-AQ in the presence of 8-AQ are depicted in Figures 3 and 4.

1000

Ep [mV]

1

2

800

3

600

400

2

4

6

8

10

12

pH

I [nA]

Fig. 1. Dependence of DPV peak potential of 6-AQ (1), 5-AQ (2) and 8-AQ (3) on pH of BR buffer medium.

8

50 nA

7

6 5 4 2

3

1

300

600

900

1200

E [mV]

Fig. 2. DP voltammograms of BR buffer pH 4 (1), substances and mixtures: 8-AQ (2); 5-AQ (3); 6-AQ (4); 8-AQ and 5-AQ (5); 6-AQ and 5-AQ (6); 8-AQ and 6-AQ (7) and 8-AQ, 5-AQ and 6-AQ (8) in BR buffer pH 4. Concentration of all substances (individually or in mixtures) was 1.10-5 mol.L-1.

51

8-AQ 200

6-AQ

7

I [nA]

6 5 4 3

150

2 1

100

400

600

800

1000

E [mV]

Fig. 3. DP voltammograms of a mixture of 8-AQ and 6-AQ at CFE in BR buffer pH 4. Concentration of 8-AQ was 0 (1), 2.10-6 (2), 4.10-6 (3), 6.10-6 (4), 8.10-6 (5) and 10.10-6 (6) mol.L-1, concentration of 6-AQ was constant 2.10-6 mol.L-1.

350

7

6-AQ

I [nA]

6 5 8-AQ

4 3

300

2 1 250 400

600

800

1000

E [mV]

Fig. 4. DP voltammograms of a mixture of 8-AQ and 6-AQ at CFE in BR buffer pH 4. Concentration of 6-AQ was 0 (1), 2.10-6 (2), 4.10-6 (3), 6.10-6 (4), 8.10-6 (5) and 10.10-6 (6) mol.L-1, concentration of 8-AQ was constant 6.10-6 mol.L-1.

52

Table I. Parameters of calibration dependences of 8-AQ in the presence of 6-AQ and of 6-AQ in the presence of 8-AQ. Slope Intercept Correlation Concentration of Concentration of 6-AQ [mol·L-1] [µA·mol-1·L] [µA] coefficient 8-AQ [mol·L-1] -6 6 (2 – 10)·10 0 4.44·10 4.98 0.9977 -6 -6 6 (2 – 10)·10 2·10 3.40·10 4.27 0.9980 -6 -6 6 4·10 2.73·10 5.66 0.9817 (2 – 10)·10 -6 * -6 6·10 (2 – 10)·10 -6 * -6 8·10 (2 – 10)·10 -6 * -5 1·10 (2 – 10)·10 -6 6 0 (2 – 10)·10 4.51·10 6.29 0.9967 2·10-6 (2 – 10)·10-6 3.92·106 2.58 0.9986 -6 -6 6 (2 – 10)·10 3.59·10 2.27 0.9958 4·10 -6 -6 6 (2 – 10)·10 2.90·10 1.96 0.9950 6·10 -6 -6 6 (2 – 10)·10 1.97·10 3.94 0.9848 8·10 -5 -6 6 (2 – 10)·10 1.31·10 1.45 0.9903 1·10 * - These dependences are not linear Conclusion The newly developed method is suitable for the determination of 8-AQ in the presence of 6-AQ in the concentration range of 8-AQ 2 – 10·10-6 mol·L-1 in the presence of 6-AQ of concentration from 0 to 4·10-6 mol·L-1 and for determination of 6-AQ in the presence of 8-AQ in the concentration range of 6-AQ 2 – 10·10-6 mol·L-1 in the presence of 8-AQ at concentration from 0 to 10·10-6 mol·L-1. With increasing concentration of remaining substance (6-AQ, resp. 8-AQ) the sensitivity of determination is decreasing and it is more difficult to evaluate corresponding voltammograms. Acknowledgement This work was financially supported by the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (project LC06035 and project MSM 0021620857). References 1. Yosypchuk B., Barek J., Fojta M.: Electroanalysis 18, 1126 (2006).

2. Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 3. Zima J., Stoica A. I., Zítová A., Barek J.: Electroanalysis 18, 158 (2006). 4. Stoica A. I., Zima J., Barek J.: Anal. Lett. 38, 149 (2005). 5. http://monographs.iarc.fr/monoeval/crthgr02a.html, downloaded 10th March 2005. 6. Green N., Hu Y. H., Janz K., Li H. Q., Kaila N., Guler S., Thomason J., Joseph-McCarthy D., Tam S. Y., Hotchandani R., Wu J. J., Huang A. R., Wang Q., Leung L., Pelker J., Marusic S., Hsu S., Telliez J. B., Hall J. P., Cuozzo J. W., Lin L. L.: J. Med. Chem. 50, 4728 (2007). 7. Aragon P. J., Yapi A. D., Pinguet F., Chezal J.M., Teulade J.C., Chapat J. P., Blafne Y.: Chem. Pharm. Bull. 52, 659 (2004). 8. Vlahov R., Parushev, Vlahov J.: Pure Appl. Chem. 62, 1303 (1990). 53

Amperometrická detekce v HPLC s využitím BDD elektrody David Jirovský a, Zdenka Bartošová a, Aleš Horna b a Katedra analytické chemie, Univerzita Palackého, Tř. Svobody 8, Olomouc 771 46 b Univerzita Tomáše Bati, Univerzitní institut, Centrum výzkumu potravin, Zlín & Radanal s.r.o., Okružní 613, Pardubice, Česká republika

HPLC s elektrochemickou detekcí (HPLC/ECD) sehrává dnes nezastupitelnou roli při analýze zejména biologicky aktivních látek. Selektivita těchto detekčních systémů je dána skutečností, že pouze molekuly podléhající za daných podmínek oxidaci nebo redukci dávají proudovou odezvu. Během několika dekád, během nichž se z HPLC/ECD vyvinula špičková moderní instrumentální technika, se rutinně využívaly především elektrodové materiály, které se osvědčily v klasických voltmetrických technikách, tj. zejména platina, zlato a různé formy uhlíku. Přes celou řadu výhodných vlastností těchto materiálů je jedním z omezujících faktorů jejich využitelný potenciálový rozsah, vymezující současně jejich aplikovatelnost na látky, které v tomto rozmezí podléhají elektrochemické konverzi. Borem dopovaná diamantová elektroda (BDD) je nový typ amperometrické elektrody pro HPLC/ECD, který v sobě spojuje výhody v současnosti používaných tuhých elektrod s výhodami materiálu, který vyniká rozšířeným potenciálovým rozsahem, excelentní inertností a nízkým šumem. Současně má velmi malé sklony k pasivaci, a to i při vysokých kladných potenciálech. Díky těmto unikátním vlastnostem umožňuje detekci látek, které nebylo dosud možné elektrochemicky detekovat a posunuje tím výrazně analytické hranice techniky HPLC/ECD. Poděkování Autoři děkují za finanční podporu práce výzkumnému záměru MSM 6198959216.

54

A New Type of Capacitive Transducer for the Determination of Ions Kurt Kalcher a, Anchalee Samphao b and Franc Svegl c a Institute of Chemistry – Analytical Chemistry, Karl-Franzens-University, Universitaetspl. 1, A-8010 Graz, Austria; E-mail: [email protected] b Ubon Ratchathani University, Department of Chemistry, Faculty of Science, Ubon Ratchathani, 34190 Thailand; E-mail: [email protected] c National Institute of Civil Engineering, ZAG, Dimiceva 4, SI-1000 Ljubljana, Slovenia, E-mail: [email protected] Introduction A new type of capacitive transducer, which can be used as a base for chemical sensors, is presented here. In contrast to classical capacitive sensors which rely on the change of the dielectric property of the capacitor we have worked out a design, where the effective change of the surface is the parameter responsible for the capacity change.

Compared to ion selective field effect transistors where also a capacitive effect causes the measurable effect the new sensors are simpler in practical setup because they do not require a reference electrode. Experimental On glass lamellas (20 x 20 mm, thickness 0,2 mm) a self adhesive circular paper (diameter 8 mm) was attached centrically. Gold was sputtered on both sides (usual thickness 24 nm or more) with a sputter device (BAL TEC SCD 005). The paper was removed afterwards, and gold on the edges was removed with a fine sand paper. Contact wires were attached on both sides of the capacitor, which was finally sealed with a glue (two components) leaving the spare circular area and a small brim of the gold layer uncovered. The capacitor was soldered parallel with an inductor (470 µH). The general scheme of the experimental set-up employed for measurements is shown in Fig.1. The oscillator was combined with an excitation circuit and a frequency counter (MXC-1600 universal counter, VoltCraft) connected to a personal computer via its RS 232 interface for recording the data. The evaluation of data was done with a personal computer by a laboratory-written software written in Visual Basic. The software read one data point per second.

circuit

sensing Area

inductor

excitation

capacitor

frequency counter

PC

Fig.1. Basic measuring configuration to determine the capacitance of the sensor Results and discussion By using the measuring device as described in the experimental part the capacity is measured via the resonance frequency of the LC oscillator with known and constant inductivity L. The model of the working principle is shown in Fig. 2. If ions are present in the solution applied to the spare area of the transducer (sensing area) the capacitor plate dimensions are increased leading to an increase of capacitance.

55

Au + + + + + + Glass Au

++++ + +

a

solution applied

+

+

Au + + + + + + Glass Au

+

+

+

+

+

++++++ b

Fig. 2. Plate polarizations in the absence (a) and the presence (b) of a solution containing ions Figure 3 shows some exemplary results as obtained with sodium, potassium and calcium chloride. The sensors give exploitable responses in the range from 2⋅10-2 to 10-4 mol/L of ion equivalent concentration. 220 218 216 Capacitance (pF)

CaCl2

KCl

NaCl

214 212 210 208 206 204 2

3

4

5

6

7

pX

Fig. 3. Dependence of the capacitance on the type and concentration of electrolytes; sensing area 28 mm2; gold layer 24 nm; glass thickness 0,2 mm; total size 20 x 20 mm; inductance 470 µH; applied volume 200 µL; batch operation. Conclusions The capacitive transducer is simple, reliable, and has a long operational and storage lifetime. It has promising features for application as sensor to detect ions. Acknowledgements This research was supported by the Royal Thai Government.

56

Měření koncentrací významných iontů v živých buňkách pomocí fluorescenčních sond Jan Krůšek Fyziologický ústav AV ČR, v. v. i., Vídeňská 1083, 142 20 Praha 4, Česká republika, E-mail: krusek@biomed. cas. cz

Měření koncentrací iontů v roztocích je častá úloha, ke které se používá řada různorodých metod a přístupů. Speciální úloha měření koncentrací iontů uvnitř živých buněk v reálném čase je velmi zajímavá pro výzkumníky z mnoha různých oborů biologie a biomedicíny. Elektrochemická metoda využívající iontově selektivní mikroelektrody s kapalným iontoměničem byla rozvinuta v 70. letech 1 a asi největších úspěchů zaznamenala při měření draselných iontů a pH. Nevýhodou metody při měření uvnitř buněk je nutnost zavést mikroelektrodu do buňky, což se zvláště u malých buněk neobejde bez značného poškození a zkreslení výsledků. V současné době je asi nejrozšířenější metodou měření změn intracelulárních koncentrací iontů použití speciálních fluorescenčních sond. Stále se rozšiřuje sortiment molekul, které mění své spektrální vlastnosti po navázání určitého ligandu. Zvlášť významnou skupinou mezi nimi jsou fluorescenční molekuly, jejichž excitace nebo emise se mění po navázání určitého iontu. Změny se mohou týkat jak intenzity fluorescence, tak průběhu excitačního a emisního spektra i doby života fluorescence. Byl syntetizován sortiment barviv, která pokrývají širokou škálu iontů. Jednotlivá barviva vhodná pro jeden ion se ještě dále odlišují v použitých spektrálních rozsazích excitace a emise a v rozsahu koncentrací, ve kterém jsou schopné efektivně detekovat změny. Některé z iontů se projevují zhášením fluorescence. Asi nejširší sortiment fluorescenčních sond byl vyvinut pro měření koncentrace volného Ca2+, protože tento ion funguje jako důležitý vnitrobuněčný signál a proto je v centru zájmu. Zásadní výhodou, která usnadňuje měření změn vnitrobuněčného Ca2+ je to, že očekávaně fyziologické změny jsou často i o několik řádů koncentrace. V současné době se nejčastěji používají sondy Fura-2 a Fluo-3 a Fluo-4. Tyto sondy jsou použitelné v rozsahu přirozené vnitrobuněčné koncentrace Ca2+ 10-8 – 10-6 M; mimo tuto oblast jejich citlivost silně klesá. Emitují v oblasti modrozeleného světla ale Fura-2 se excituje v ultrafialové oblasti, zatímco obě sondy Fluo se budí v modré oblasti spektra. Celá skupina fluorescenčních sond na měření koncentrace Ca2+ pokrývá celé optické spektrum a rozsah koncentrací jde až do milimolárních hodnot. U ostatních dvojmocných iontů existují více nebo méně selektivní sondy pro Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Co2+, ale i pro těžké kovy, jako Hg2+, Pb2+, Ba2+ a Cd2+. Experimentálním problémem je, že protože selektivita sond mezi těmito ionty není většinou dostatečná, je potřeba předem vědět, který ion chceme detekovat a zajistit, aby se pozadí ostatních iontů neměnilo. Sledování trojmocných iontů jako Fe3+, Al3+, La3+ a Tb3+ je také možné, ale většinou se k němu používají sondy jinak používané pro měření dvojmocných iontů, takže je nutné zajistit konstantní iontové podmínky. Ze sond pro jednomocné kationty jsou používány sondy pro měření pH, Na+ a K+. Selektivita mezi ionty K+ a Na+ ale není příliš veliká a také očekávané změny koncentrace jsou mnohem menší než u vápníku.

57

Ze sond pro anionty jsou používány sondy pro chloridové ionty, z nichž některé mohou detekovat i ostatní halogenidy. Přehled o dosažitelném sortimentu sond a jejich vlastnostech je možné získat z katalogů výrobců, například Invitrogen/Molecular Probes 2. Bylo vyvinuto několik metod, jak dopravit dostatečnou koncentraci vhodné sondy do cytoplasmy studovaných buněk. Nejčastější je použití tzv. AM-forem sond (acetoxylmethylesterové). Molekula sondy je ve funkční podobě většinou elektricky nabitá a neprochází buněčnou membránou. Chemicky modifikovaná sonda má nabité skupiny maskovány tak, že nenese žádný náboj a může vstupovat do buněk. V buňce jsou působením vhodných enzymů (esteráz) maskující skupiny odštěpeny, molekula sondy získává zpět elektrický náboj a nemůže již z buňky uniknout. Tímto způsobem může dojít i k několikanásobnému navýšení koncentrace funkční sondy v cytoplasmě proti původní koncentraci prekurzoru v okolním roztoku. Postupně bylo rozvinuto několik technik měření. Parametry fluorescence celé populace buněk můžeme měřit pomocí fluorescenčního spektrometru. Výhodou je, že můžeme měřit změny jak v emisi, tak v excitaci bez spektrálního omezení. Rychlost časových měření je někdy omezena, pokud chceme měřit celá spektra. Pokud se omezíme na měření jen určitých vlnových délek, měření se může výrazně zrychlit. Největším omezením tohoto způsobu měření je že sledujeme průměrné hodnoty signálů z celé populace buněk a individuální rozdíly nám unikají. Signály z jednotlivých buněk a statistiku v rámci populace poskytuje průtoková cytometrie. Na vhodně zvolených vlnových délkách emise sledujeme signály z jednotlivých buněk v suspenzi posupně rychle protékajících paprskem excitačního laseru. Na moderních přístrojích můžeme současně sledovat i větší počet různých fluoroforů. Nevýhodou metody je nutnost používat buňky v suspenzi, což u některých, zejména přisedle rostoucích buňkách, může být zdrojem artefaktů. Různé metody fluorescenční mikroskopie touto nevýhodou netrpí. Použití klasického nebo konfokálního fluorescenčního mikroskopu umožňuje sledovat v čase chování jednotlivých identifikovaných buněk. Různé modifikace mikroskopů umožňují i měřit excitační a emisní spektra i doby života fluorescence. Limitace metody vyplývají z kombinace tří parametrů: intenzity fluorescence z jedné buňky, obrazového rozlišení použité kamery a časové rychlosti snímání. Vysoká citlivost kamer umožňuje rychlé snímání. Citlivost a obrazové rozlišení silně závisejí na kvalitě kamery a použité optiky, které se významně projevují v ceně přístroje. Rychlost snímání ale zásadním způsobem závisí i na intenzitě fluorescence. Tvůrci nových fluorescenčních sond se snaží o co nejintenzivnější emisi a fotostabilitu molekul. Intenzita záření samozřejmě závisí na koncentraci fluorescenční sondy v cytoplasmě, což je faktor, který je omezen potenciálními škodlivými účinky cizorodé molekuly na studované funkce buněk. U některých digitálních kamer můžeme rychlost měření výrazně zvýšit i omezením rozlišovací schopnosti. Jednou z nevýhod fluorescenčních barviv je častá nerovnoměrnost v obarvení různých buněk i nestejnoměrnost v intenzitě obarvení z různých částí jedné buňky. To může být způsobeno buď skutečně různou koncentrací barviva v cytoplasmě, ale i nestejnou výškou sloupce obarvené cytoplasmy v různě silných buňkách nebo částech buněk, kterou není schopen klasický mikroskop rozlišit. Protože detekované změny optického signálu závisejí přímo i na

58

původní koncentraci barviva, byly vyvinuty metody, jak tuto závislost odstranit. U některých sond je spektrální poloha maxima excitace nebo fluorescence jiná u volné molekuly a u molekuly obsazené detekovaným iontem. Změna fluorescence vyvolaná navázáním studovaného iontu se pak projevuje ve změně tvaru spektra. V takovém spektru je pak výhodné vyhledat různé oblasti, ve kterých je znaménko iontem vyvolaných změn opačné, nebo oblast, kde je změna nulová. Vydělením signálů získaných z vhodně vybraných částí spektra můžeme dosáhnout toho, že výsledný signál není závislý na koncentraci fluorescenční sondy, ale jen na vazbě detekovaného iontu. Tomu se říká poměrové měření a je možné jak v emisi, tak v excitaci. Jinou možností, jak odstranit nežádoucí závislost na koncentraci fluorescenční sondy je měření dob života excitovaného stavu. U některých sond je navázání sledovaného iontu provázeno změnou doby života excitovaného stavu a tím i změnou rychlosti dohasínání fluorescence. Tato změna je nezávislá na koncentraci sondy, ale závisí jen na koncentraci studovaného iontu a je možné ji měřit pomocí speciálních přístrojů 3. Porovnání a výběr vhodných sond z hlediska jejich spektrálních vlastností usnadňují informace buď v katalogu výrobce 2, nebo na webu 4. Největší nevýhodou měření změn koncentrací pomocí fluorescenčních sond je ne vždy dostatečná selektivita a přesnost kalibrace. Řada sond reaguje podobně na různé chemicky podobné ionty, i když často s různou citlivostí. Pokud si nejsme jisti, který ion se ve studovaném preparátu mění, je možné použít kombinaci různých vhodně vybraných sond, které nám částečně mohou pomoci změnu lépe identifikovat. Kalibrace sond je nedokonalá zejména proto, že citlivosti sond mírně závisí i na přítomnosti ostatních iontů, které v cytoplasmě živé buňky nemůžeme přesně kontrolovat. Proto je lépe údaje o absolutních koncentracích iontů považovat spíše za orientační. Naproti tomu detekce změn koncentrací iontů bývá mnohem spolehlivější. Z hlediska selektivity se jako perspektivní se jeví použití geneticky kódovaných sond. Molekuly známých fluoreskujících proteinů mohou být metodami molekulové biologie vhodně propojeny s bílkovinnou molekulou selektivně vážící studovaný ion (nebo jinou molekulu). Vhodně zkonstruovaný fúzní protein si může zachovat vysokou selektivitu vazby propojenou s vhodnou změnou opticky detekovatelných vlastností fluoroforu. Takovou sondu si studovaná buňka může vyrobit sama na základě genetické informace dopravené do cytoplasmy. U takových sond můžeme dokonce vložením „adresy“ určit, ve které části buňky budou měřit. Rostoucí množství informací o unikátních vazebných vlastnostech různých proteinů dává naději na nové generace selektivnějších detekčních systémů založených na fluorescenci. Literatura 1. Koryta J., Štulík K.: Iontově selektivní elektrody, Academia Praha 1984 2. Haugland R. P.: Handbook of Fluorescent Probes and Research Products 9th Edition Molecular Probes Inc.(2002). 3. Lakowicz J. R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition, Springer; 2006 invitrogen. com/site/us/en/home/support/Research-Tools/Fluorescence4. http://www. SpectraViewer. html staženo 7. 4. 2009.

59

Electrochemical Nucleic Acid-Based Biosensors: Terms and Methodology Jan Labuda Institute of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, 812 37 Bratislava, Slovakia; E-mail: [email protected]

This work reports on the IUPAC project 2006-026-1-500 “Electrochemical nucleic acidsbased biosensors: terms and methodology” solved within the Analytical Chemistry Division from 2007 to 2009. The previously published IUPAC technical report “Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification”1 did not deal extensively with nucleic acids as the biological recognition element but considered the work on other types of biosensors. Since that time a significant progress in the development and application of electrochemical sensors based on deoxyribonucleic acid (DNA) and other nucleic acids (including aptamers and peptide nucleic acids) has been achieved. On the other hand, so far there have been no efforts to essential classification in this dynamically developing field. An electrochemical nucleic acid-based biosensor is defined as the biosensor which integrates a nucleic acid as the biological recognition element and an electrode as the electrochemical signal transducer. In this regard, the previous IUPAC report on electrochemical biosensors1 is fully acceptable for electrochemical nucleic acid-based biosensors including the biosensor definition and information obtained. From the point of view of electroanalytical chemistry, the electrochemical nucleic acid-based biosensor represents a nucleic acid modified electrode which is used mostly in voltammetric and chronopotentiometric detection modes. Recently, measurements of electrochemical impedance have become increasing application for the NAbased biosensors. A sensor is a device that responds to some stimulus by generating a functionally related output2. NA-based biosensors belong to the family of chemical sensors. In this case, these analytical devices transform (bio)chemical stimulus from an analyte in relation to NA into the analytically useful information (analyte concentration, NA chemical structure and/or its change, etc.). Terms of sensor and sensing or assay are sometimes puzzled. Here, it is necessary to distinguish strictly between the NA biosensors and NA sensing. While at the electrochemical NA biosensor, the NA has to be in an intimate contact with the electrode prior to and during the NA interaction with an analyte, the NA electrochemical sensing is of broader meaning when the interaction of any NA with an analyte or NA itself is detected /measured electrochemically. According to1, the biosensors can be classified considering biological specificity – conferring mechanism, mode of signal transduction and analytes or reactions that they monitor. The classification of the biosensors according to the 3rd point of view i.e., analytes or reactions, is also acceptable for the electrochemical nucleic acid-based biosensors, only the ratio of the NA biosensors utilization is shifted from analytes more to reactions of NA when compared to the enzyme- and immuno-sensors. Specificity of the biosensor response1 can be also accepted as a typical feature of the device. DNA-based sensors take advantage of the DNA strands’ lock and key properties to achieve their selectivity3. Typically, specificity/selectivity is induced by both a selective nucleic acid surface film and chemical properties of an analyte. The NA based biosensors are specific either to the analyte (nucleotide bases sequence, protein) or to NA itself (its damage). Contrary to analytical selectivity, this specificity covers also the response to a group/family of analytes.

60

The report provides terms and methodology related to biorecognition elements, detection principles, type of interactions to be addressed, construction and performance of the electrochemical nucleic acids biosensors including their critical evaluation which should be valuable for a wide audience from academic, biomedical, environmental and food-testing, drug-developing etc. labs to sensors producers. Acknowledgement: The author as the task group chairman thanks the task group members Prof. Ana Maria Oliveira Brett, Prof. Gennady Evtugyn, Prof. Miroslav Fojta, Prof. Marco Mascini, Prof. Mehmet Ozsoz, Prof. Ilaria Palchetti, Prof. Emil Palecek, and Prof. Joseph Wang for the colaboration. The work was supported by the IUPAC (ACD project No. 2006026-1-500) and the Grant Agency VEGA (Project No. 1/0852/08) of the Ministry of Education of Slovakia. References 1. Thévenot D. R., Toth K., Durst R. A., Wilson G.S.: Pure Appl. Chem. 71, 2333 (1999). 2. Göpel W., Hesse J., Zemel J. N.: Sensors: A Comprehensive Survey. WCH, Weinheim (1991). 3. Kalantar-zadeh K., Fry B.: Nanotechnology-Enabled Sensors. Springer Science+Business Media, LLC, New York (2008).

61

Využití derivátů bis(thio)močoviny jako ionoforů při přípravě fosforečnanových iontově-selektivních elektrod a E. Khaled , H. N. A. Hassan a, A. Girgis b a Radovan Metelka c a Microanalysis Laboratory, National Research Centre, Dokki, Cairo, Egypt b Department of Pesticide Chemistry, National Research Centre, Dokki, Cairo, Egypt c Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Universita Pardubice, nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice Úvod Rychlé a jednoduché určení obsahu fosforečnanových aniontů je důležité např. při sledování kvality vod, potravin a životního prostředí. Použití fosforečnanových iontově-selektivních elektrod představuje jednoduchou a levnou možnost stanovení s přijatelnou přesností a selektivitou. Při hledání vhodných ionoforů se v současné době věnuje pozornost sloučeninám obsahujícím ve své struktuře thiomočovinu, jejíž přítomnost významně zvyšuje selektivitu pro fosforečnanové anionty 1. Různými organickými řetězci navázanými na thiomočovinu lze ovlivňovat sílu vodíkové vazby mezi ionoforem a sledovanými anionty a lze tak přizpůsobovat vlastnosti ionoforu daným požadavkům na selektivitu. Podobně působí i změna vzdálenosti mezi aktivními místy v molekule nebo zavedení cyklických struktur.

Příspěvek popisuje syntézu a možnosti použití vybraných derivátů bismočoviny a bisthiomočoviny jako neutrálních ionoforů v iontově-selektivních elektrodách (ISE) pro potenciometrické sledování hydrogenfosforečnanů. Připravené ionofory byly spolu s vhodným změkčovadlem smíchány s uhlíkovým práškem pro přípravu uhlíkové pastové elektrody nebo s přídavkem polyvinylchloridu (PVC) do formy tištěné elektrody. Bylo optimalizováno složení jednotlivých typů elektrod a testovány potenciometrické charakteristiky připravených senzorů, které byly porovnány s klasickou PVC membránovou iontově-selektivní elektrodou. Zjištěné údaje o selektivitě, detekčním limitu, času odezvy a době použitelnosti jednotlivých typů senzorů byly příznivé pro tištěné elektrody. Materiály a metody K přípravě senzorů byl použit vysokomolekulární polyvinylchlorid a uhlíkový prášek (syntetický 1 – 2 µm, vše Aldrich). Jako plastifikátory sloužily o-nitrofenyloktylether (o-NPOE, Sigma), dibutylftalát (DBP, BDH), dioktylftalát (DOP, Sigma), dioktylsebakát (DOS) a trikresylfosfát (TCP, Fluka). Všechny chemikálie byly analytické čistoty a ke všem experimentům byla použita redestilovaná voda.

Všechna měření byla realizována na pH-metru Metrohm 692 s využitím Ag/AgCl referentní elektrod s dvojitým můstkem (Metrohm 6.0726.100) a kombinované pH měrné skleněné elektrody (Metrohm 6.0202.100). Odpor připravených senzorů byl kontrolován multimetrem 46-Range Digital Multimeter (Radioshack) s propojením na osobní počítač. Body tání připravených ionoforů byly určeny na přístroji Electrothermal 9100 (Electrothermal Engineering Ltd.), jejich elementární analýza na Vario EL (Elementar Analysensysteme GmbH) a IČ spektra v KBr tabletách na spektrofotometru FT/IR 300E (Jasco, Inc.). 1H-NMR spektra byla zaznamenána na přístroji Varian Mercury 300 (Varian, Inc.).

62

Obr. 1. Schéma syntézy ionoforů na bázi derivátů bis(thio)močoviny. Výchozí sloučenina 1 (2,2'-[1,2-ethanediylbis(thio)]bisbenzenamin) byla připravena syntézou podle 2. Směs 1 (5 mmol) a odpovídajícího isokyanátu nebo isothiokyanátu (10 mmol) byla míchána určitou dobu v 25 ml bezvodého tetrahydrofuranu (THF) při pokojové teplotě. Vzniklá pevná fáze derivátu 2 (viz obr. 1) byla oddělena a krystalizována z vhodného rozpouštědla. V případě 2e byla reakční směs vakuově odpařena do sucha, odparek následně rozmělněn v 5 ml diethyletheru a rekrystalizován. Tištěné uhlíkové elektrody (SPE) byly připraveny vytištěním směsi (viz Tabulka I) na substrát z PVC, ponechány 2 h při 60 °C a po vytvrdnutí byla izolační vrstvou definována elektrodová plocha 5 × 5 mm. Uhlíková pasta (CPE) byla naplněna do pístového držáku a uchována v 0,001 M HPO42– ztitrovaném NaOH na pH 7,2. V případě PVC membránové elektrody byla směs nalita do Petriho misky a po odpaření rozpouštědla vyseknuta kruhová membrána o tloušťce 0,1 mm, která byla umístěna na změkčený konec PVC trubičky naplněné 0,001 M HPO42– o pH 7,2 a na den ponořena do stejného roztoku. Tabulka I. Příprava jednotlivých senzorů. Senzor Optimální složení elektrodového materiálu SPE 6 mg 2d + 1,8 g o-NPOE + 5 g PVC 8 % + 3 g uhlíkového prášku CPE 12,5 mg 2d + 500 mg uhlíkového prášku + 200 µl o-NPOE PVC membrána 1,8 mg 2d + 240 mg o-NPOE + 120 mg PVC + 6 ml THF Výsledky a diskuse Po přimíchání syntetizovaných ionoforů do různých elektrodových materiálů reagovaly takto připravené iontově-selektivní elektrody změnou jejich potenciálu v závislosti na množství hydrogenfosforečnanů. Z testovaných aniontů významně rušil octan, thiokyanatan a hydrogenuhličitan, jejich kalibrační závislosti ale byly nelineární se směrnicemi od 30,5 až po 42,0 mV dekádu aktivity–1 (Obr. 2). Vyšší selektivitu pro HPO42– poskytoval ionofor na bázi fenylsubstituované bisthiomočoviny (2d), kdy na rozdíl od derivátů s jinou funkční skupinou nebo na bázi bismočoviny vznikají silnější vodíkové vazby se sledovanými anionty.

63

Po nalezení optimálního množství ionoforu v jednotlivých typech elektrodového materiálu byl testován vliv použitých plastifikátorů s různou dielektrickou konstantou, ovlivňujících polaritu elektrodové fáze, mobilitu ionoforu a tvorbu komplexů s analyzovanými ionty. Nejlepších výsledků bylo dosaženo s o-NPOE, u ostatních látek byly zaznamenány nízké hodnoty směrnic kalibračních závislostí. Výsledná složení jednotlivých typů iontověselektivních elektrod jsou uvedena v Tabulce I. Závislost potenciometrické odezvy hydrogenfosforečnanových senzorů na pH byla sledována v rozmezí pH 6 – 10. Připravené elektrody vykazovaly stabilní Nernstovské odezvy při pH 6 – 8, při nižších hodnotách se zhoršovaly detekční limity. Všechna následující měření byla prováděna při pH 7,2.

Obr. 2. Potenciometrické odezvy PVC membránové elektrody s ionoforem 2d a o-NPOE při pH 7,2 v přítomnosti různých aniontů. Zjištěné analytické parametry hydrogenfosforečnanových ISE jsou shrnuty v Tabulce II. Příznivé údaje pro tištěné elektrody podtrhuje i dlouhá doba jejich použitelnosti; při uchovávání při 4 °C je lze použít po přípravném měření i za 4 měsíce, kdy dojde pouze k mírné změně směrnice kalibrační závislosti. Tabulka II. Analytické parametry ISE s ionoforem 2d. Senzor PVC * Rovnice lineární regrese Směrnice, mV/dekádu aktivity -28,0 ± 2,0 Úsek, mV -2,7 ± 2,9 Korelační koeficient 0,9980 1,0 × 10–5 Detekční limit, mol l–1 Čas odezvy, s 6 Doba použitelnosti, týdny 2–3 * Parametry regrese určeny z pěti kalibračních závislostí.

64

CPE -29,0 ± 1,1 27,7 ± 4,6 0,9979 4,4 × 10–6 3 4

SPE -32,8 ± 0,5 199,4 ± 1,5 0,9997 4,0 × 10–6 2,2 16

Závěr Příspěvek shrnuje možnosti konstrukce hydrogenfosforečnanových ISE s využitím nově syntetizovaných ionoforů na bázi substituované bisthiomočoviny a bismočoviny. Tiskovou technologií s uhlíkovými materiály lze tyto elektrody připravit snadno, rychle a ve velkých sériích, přičemž stačí pouze malé množství speciálních chemikálií; 6 mg ionoforu postačí k tisku 80 elektrod. Jejich hlavní výhodou oproti jiným konfiguracím je relativně dlouhá doba použitelnosti. Poděkování Autoři děkují za podporu z bilaterálního projektu mezi Českou republikou a Egyptem (projekt č. 27). R. M. děkuje za finanční podporu Ministerstvu školství, mládeže a tělovýchovy (projekty MSM0021627502 a LC06035). Literatura 1. Khaled E., Hassan H. N. A., Girgis A., Metelka R.: Talanta 77, 737 (2008). 2. Cannon R. D., Chiswell B., Venanzi L. M.: J. Chem. Soc. A 1967, 1277.

65

Tenkovrstvý bezkontaktní vodivostní detektor pro kapalinovou chromatografii Jiří Míka, František Opekar a Pavel Coufal Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, Hlavova 8, 128 43 Praha 2, Česká republika E-mail: [email protected]; [email protected] 1. Úvod V záplavě všech dnes používaných detekčních metod v kapalinové chromatografii (HPLC), dalo by se říci, se detekce založené na měření změn impedance poněkud ztrácejí. Přitom se však jedná o velmi elegantní a spolehlivé metody. Jak dokazuje práce 1 a citace v ní uvedené, jsou v HPLC velmi dobře použitelné. Běžně je detekční cela tvořena tubulárními elektrodami umístěnými vně trubičky s analyzovaným roztokem. Cílem tohoto příspěvku je dokázat, že detekční celu lze navrhnout i s využitím thin-layer uspořádaní. Detektor s takto nově zkonstruhovanou celou je velmi dobře použitelný pro detekci v kapalinové chromatografii i jiných průtokových systémech. A je tak přinejmenším schopen konkurovat rozsáhle používaným spektrofotometrickým detektorům. 2. Experimentální část 2.1. Základní testování Samotný detektor (obr. 1.), jakožto základní stavební kámen celého výzkumu je vhodné představit hned na úvod. Vodivostní cela je tvořena skleněnou destičkou (a) s elektrickými kontakty, k nimž přiléhá vrstva Mylaru (b), což je polymerní fólie pokrytá tenkou vrstvou hliníku. Odleptáním přebytečného hliníku ohřátou H3PO4 vznikají vlastní elektody. Rozměry elektrod jsou 10 mm délka, 1mm šířka a vzájemná vzdálenost též 1 mm. Mylar přiléhá polymerní částí k detekčnímu kanálku, čímž jsou elektrody izolovány od testované kapaliny polymerem o tloušťce 20 μm. Detekční kanálek je vytvořen vyříznutím 1x8 mm kanálku do vrstvy Nescofilmu (c) o tloušťce 0,24 mm. Shora je detekční kanál uzavřen teflonovým blokem (d), kterým prochází dvě teflonové hadičky pro přívod a odvod kapaliny. Takto připravená cela je připojena k elektronickému obvodu a tím je vytvořen detektor. Detektor (4) je zapojen do aparatury (obr. 2) jenž se sestává z lineárního čerpadla (1) s nastavitelným průtokem, jako zásoba mobilní fáze slouží 100 ml polyethylénová nádobka (2) opatřená filtrem pevných částic. Vzorek je do proudu mobilní fáze dávkován šesticestným ventilem s 10 µl smyčkou (3). Po průchodu detektorem vytéká kapalina do odpadní nádobky (5). Důležitou součástí detektoru je zdroj střídavého elektrického napětí (6) s nastavitelnou hodnotou amplitudy a frekvence. Pro sběr a vyhodnocování dat slouží osobní počítač (7) opatřený měřící kartou PCI 6034 a programem LabView. Jako mobilní fáze je používána deionizovaná voda a jako analyt chlorid draselný.

Obr. 1. Schéma detekční cely. Popis viz text.

66

2.2. Použití v HPLC. Při tomto experimentu byla základní aparatura z obr. 2. modifikována. Lineární čerpadlo bylo nahrazeno reciproční pumpou, změněny byly zásobní nádoby pro mobilní fázi, přidán byl odplynovač a 10 µl dávkovací smyčka byla nahrazena smyčkou 20 µl. Po průchodu těmito součástmi je mobilní fáze, tvořená roztokem acetonitrilu a deionizované vody, vedena do separační kolony (MAG1; 4,6x150 mm; Biospher PSI 100 C18 5 µm). K detekci přítomnosti analytu v mobilní fázi je používán výše popsaný vodivostní detektor a UV detektor, pracující při 220 nm. Ke sběru a vyhodnocování dat je opět používán osobní počítač, tentokrát vybavený programem CSW. Vzorek pro analýzu je tvořen směsí čtyř látek – kyselinou oktansulfonovou (OCTS), mléčnou (ML), benzoovou (BEN) a kapronátem sodným (KAPR).

Obr. 2. Blokové schéma používané aparatury. Detaily v textu. 3. Výsledky a diskuze 3.1. Základní testování a) Optimalizace hodnoty průtokové rychlosti mobilní fáze byla provedena pouze rychlým předběžným testem. Tímto testem bylo zjištěno, že zvyšující se hodnota průtokové rychlosti má vliv na zvýšení odezvy přístroje, avšak při průtocích vyšších než 150 µl/min je tento efekt téměř zanedbatelný. Tudíž se jako nejvhodnější průtoková rychlost, i z hlediska rychlosti analýzy, jevila rychlost 150 µl/min.

b) Jelikož bylo možné na zdroji střídavého napětí měnit hodnotu frekvence procházejícího signálu, byla provedena optimalizace této frekvence. Testovány byly frekvence 50, 100, 200, 300 a 400 kHz, při maximální amplitudě 10V. Jako analyt sloužily roztoky KCl o koncentracích od 1.10-3 do 1.10-8 mol/l. Naměřená data byla vyhodnocena, graficky zpracována a pro přehlednost rozdělena do dvou obrázků, viz obr. 3. a obr. 4. Z důvodu nejlepší stability signálu a dobrého poměru S/N při nízkých koncentracích analytu, byla jako optimální zvolena hodnota 100 kHz. 10000 9000 8000

odezva

[mV]

7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 0

50

100

150

200

250

frekvence

[kHz]

300

350

400

Obr. 3. Závislost odezvy přístroje na frekvenci vstupního střídavého napětí pro vyšší - 1.10-4 mol/l , - 5.10-5 koncentrace KCl. Symboly: - 1.10-3 mol/l , - 5.10-4 mol/l, mol/l, - 1.10-5 mol/l. 67

400 350

odezva

[mV]

300 250 200 150 100 50 0

50

100

150

200

250

frekvence

300

350

400

450

[kHz]

Obr. 4. Závislost odezvy přístroje na frekvenci vstupního střídavého napětí pro nízké - 5.10-7 mol/l , - 1.10-7 koncentrace KCl. Symboly: - 5.10-6 mol/l , - 1.10-6 mol/l, mol/l, - 5.10-8 mol/l , - 1.10-8 mol/l . 3.2. Použití v HPLC a) Předběžným testem systému byla, s přihlédnutím ke spotřebě rozpouštědel, rozlišení píků a malým rozměrům cely, určena optimální průtoková rychlost, 0,8 ml/min. Zároveň bylo nalezeno i optimální složení mobilní fáze – 60% acetonitrilu, 40% deionizované vody.

b) Jak je uvedeno výše v textu, jsou pro detekci používány dva detektory zapojené v sérii. Jelikož UV detektor pracuje v oblasti vlnových délek, při kterých intenzivně absorbuje velké množství látek, zdá se být porovnání testovaného detektoru s UV detektorem jako dobré kritické hledisko. Během měření byla na kolonu nastřikována směs čtyř výše zmíněných látek o koncentracích 1; 0,5; 0,2; 0,1; 0,08; 0,05; 0,02; 0,01 mmol/l. Chromatogramy registrované oběma detektory jsou zobrazeny na obr. 5. B

A 4 600

600 500

500

[mV]

300

400

2

odezva

[mV] odezva

1 400

3

3

200

300 200 100

4

1

100

0 0 0

1

2

čas

0

3

1

2

čas

[min]

3

[min]

Obr. 5. Chromatogramy analyzovaného vzorku. A – impedanční detektor, B – UV detektor. Legenda: 1 – kyselina oktansulfonová, 2 – kyselina mléčná, 3 – kyselina benzoová, 4 – kapronát sodný. Mobilní fáze: 60%AcN, průtok – 0,8 ml/min, kolona: MAG1, 4,6x150 mm, Biospher PSI 100 C18 5 µm, v.č. 2071, rok 2006. Nástřik: 20 µl, koncentrace složek: 2,5.10-4M kys. oktansulfonová, 5.10-4M kys. mléčná, 1,25.10-3M kys. benzoová, 2,5.10-3M kapronát sodný. Jak je z těchto chromatogramů patrné, UV detektor není schopen registrovat všechny procházející látky. Na obr. 6. jsou zobrazeny závislosti výšek píků na koncentraci složek 68

vzorku pro detekované látky. Lineárními částmi kalibračních závislostí byly proloženy lineární regresní přímky, jejichž parametry jsou uvedeny v tab. I. Na základě těchto hodnot byly pro každou složku vzorku vypočteny limity detekce jak pro impedanční detektoru, tak pro UV detektor. A

B

kys. oktansulfonová

700

kys. benzoová

500 600

400

300

[mV]

[mV]

400

odezva

500

odezva

kys. mléčná

200

kys. benzoová 100

300

200

100

kapronát sodný

kapronát sodný 0

0 0,0

0,2

0,4

0,6

koncentrace

0,8

1,0

0,0

[mmol/l]

0,2

0,4

koncentrace

0,6

0,8

1,0

[mmol/l]

Obr. 6. Závislost odezvy vodivostního detektoru na koncentraci složky v nástřiku. A – impedanční detektor, B – UV detektor. Tabulka I. Parametry regresních přímek: B – směrnice [mV.dm3/mmol], A - úsek [mV], R - korelační koeficient, SD – standardní chyba, N – počet bodů, LOD – limit detekce [μmol/dm3]. Analyt

B

A

OCTS

622,3 ± 9,8

0,9 ± 3,9

0,9993

8,91

8

1,45

ML

284,6 ± 4,7

4,6 ± 1,9

0,9992

4,25

8

3,16

BEN

127,6 ± 1,6

-1,3 ± 0,7

0,9997

1,36

6

7,05

KAPR

54,0 ± 4,2

-1,1 ± 0,5

0,9969

0,54

3

16,67

BEN*

2277,4 ± 111,8

39,7 ± 11,1

0,9952

17,36

6

R

SD

N

LOD

0,03

* platí pro UV detektor 4. Závěr Byl sestaven bezkontaktní impedanční detektor zcela nové konstrukce. Pro tento detektor byly nalezeny optimální detekční parametry na modelovém systému. Závislosti odezvy na frekvenci bylo možno velmi dobře modelovat s použitím standardního náhradního obvodu detekční cely. Následně byl detektor vyzkoušen pro HPLC separace, kde se velmi dobře osvědčil. Tento detektor je vhodný především pro detekci nabitých látek, které jen slabě absorbují záření. Pro detekci dobře absorbujících látek se jako vhodnější jeví použití standardního UV detektoru, který má pro tyto látky vyšší citlivost a nižší LOD. Poděkování Poděkování za finanční podporu patří Grantové agentuře České republiky, grant č. 203/07/0896 a MŠMT ČR, výzkumný záměr č. 0021620857. Literatura 1. Hamplová A., Coufal P., Bosáková Z., Opekar F., Kubíček V.: Chem. Listy 102, 194 (2008).

69

Elektrochemická studie HOMO/LUMO energií derivátů difenyl-pyrrolo-pyrolu Tomáš Mikysek a, Jiří Ludvík b, Jiří Klíma b, Jan Vyňuchal c a Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice Nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, E-mail: [email protected] b Ústav fyzikální chemie Jaroslava Heyrovského AVČR, Dolejškova 3, 182 23, Praha 8 c VUOS a.s., Rybitví 296, 533 54, Rybitví

Tento příspěvek se zabývá elektrochemií nově navržených a syntetizovaných derivátů 3,6difenyl-2,5-dihydro- pyrrolo-[3,4-c]-pyrrol-1,4-dionu (DPP) 1. Chlorovaný derivát DPP je od roku 1986 vyráběn švýcarskou firmou Ciba jako HPP (High Performance Pigment) a našel uplatnění v celé řadě odvětví. Tyto látky vykazují elektroluminiscenci, která je důležitým předpokladem pro jejich využití v oblasti OLED (Organic Light Emitting Device) diod a světelných panelů 2. Pomocí cyklické voltametrie lze popsat základní elektrochemické chování látek a také lokalizovat HOMO/LUMO energetické hladiny. Pro elektrochemickou charakterizaci byly vybrány tři „základní“ deriváty (U10, U12 a U29 – obr. 1), které byly zkoumány pomocí cyklické voltametrie (CV) a voltametrie s rotující diskovou platinovou elektrodou (RDV) v nevodném prostředí (acetonitril).

N

O

O C4H9

N

N

O

C4H9

C7H15

O N

N

C7H15

O

C4H9

N

N

C4H9

O

N

U10 U12 Obr. 1. Strukturní vzorce vybraných derivátů DPP.

U29

Z výsledků cyklické voltametrie vyplývá, že zkoumaný systém se skládá ze dvou oxidačněredukčních procesů, přičemž oba vykazují reverzibilní chování a počet přenesených nábojů odpovídá jednomu elektronu. Strukturní podobnost nabízí sledování vlivu substituentů, z CV bylo zjištěno, že délka alkylového řetězce nemá zásadní vliv na elektrochemické chování látek, zatímco pirimidinové skupiny, prodlužující délku molekuly, mají vliv na potenciál píků oxidace i redukce. Oxidace je posunuta přibližně o 500 mV k méně pozitivním potenciálům a zároveň redukce se posouvá o 200 mV k negativnějším potenciálům. Ze závislosti velikosti odezvy na druhé odmocnině změny polarizačního napětí vylývá, že elektrodový proces je řízen převážně difúzí i když v tomto případě jde o organické pigmenty a tudíž se nabízí i možný vliv adsorpce zkoumaných derivátů na elektrodu, tento jev však během měření nebyl pozorován. Dalším krokem při vyhodnocení dat z CV bylo stanovení HOMO/LUMO energií, teré bylo stanoveno pro derivát U10 na 2,34 eV, pro U12 2,36 eV zatímco u U29 2,0 eV (obr. 2). Tyto výsledky jsou v souladu s teoreticky vypočteným modelem.

70

Obr. 2. Cyklické voltamogramy látek U10, U12 a U29; c = 5.10-4 mol dm-3, v=100 mV s-1. Na základě předběžných výsledků bude možné navrhnout optimální substituenty a využití derivátů pro další elektronické aplikace. V současné době jsou některé DPP chromofory využívány a patentovány jako OLED, vlhkostní čidla. Poděkování Tato práce vznikla za finanční Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky projektu MSM0021627502 a výzkumného centra LC 510. Autoři by rovněž rádi poděkovali za podporu v rámci projektu Ministerstva průmyslu a obchodu (FT-TA3/048). Literatura 1. Zollinger H.: Color Chemistry. Wiley-VCH, Weinheim 2003. 2. http://www.OLED100.eu, staženo 12.února 2009.

71

Pulse Voltammetric Determination of 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol and 2,4-Dinitrophenol in Drinking and River Water Using Boron-Doped Diamond Film Electrode Jana Musilová a, Jiří Barek a, Pavel Drašar b and Karolina Pecková a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 8, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Chemical Technology, Faculty of Food and Biochemical Technology, Technická 5, 16628 Prague 6, Czech Republic

Boron doped diamond (BDD) is versatile electrode material, which have gained popularity in a variety of electrochemical applications 1-3. BDD film electrodes (BDDFE) possess excellent electrochemical properties, such as extreme hardness, low and stable background current over a wide potential range, microstructural stability at extreme cathodic and anodic potentials, high current densities, good responsiveness for many redox analytes without pretreatment, and resistance to electrode fouling 4. BDDFE can be used to determine a wide variety of inorganic and organic compounds using electrochemical reduction and oxidation. Nitrophenols coming from pesticide degradation, car exhausts, and industrial wastes are listed as priority pollutants by the US Environmental Protection Agency (US EPA), as they are considered to be potentially carcinogenic and mutagenic. Pesticides based on simple nitrophenols are used as growth stimulators in agriculture 5. US EPA has restricted the concentration of 2-nitrophenol (2-NP), 4-nitrophenol (4-NP) and 2,4-dinitrophenol (2,4-DNP) in natural water to be less than 10 μg/L 6. Moreover, nitrophenols are a suitable model of nitrated explosives. A differential pulse voltammetric method was developed for the determination of 2-NP 7, 4-NP 8 and 2,4-DNP 9 at BDDFE. The method was successfully applied for the direct determination of these compounds in drinking and river water. Limits of detection were about 4.10-7 mol L-1 using electrochemical reduction and 1.10-6 mol L-1 using electrochemical oxidation. The calibration dependence of direct determination of 2,4-DNP in river water in (2-10).10-6 mol L-1 range using electrochemical reduction is depicted in Fig.1. Acknowledgements This work was financially supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC06035, MSM 0021620857 and RP 14/63) and by the NATO grant CBP.EAP.CLG.982972.

72

I, nA

Ip,nA

-300

-100

6

-50

5

-240

0 0,0

4

-6

-5

5,0x10 1,0x10 -1 c, mol.L

3

-180

2 1

-120

-400

-600

-800 E, mV

Fig. 1. Cathodic DP voltammograms and calibration dependence for 2,4-DNP at BDDFE in model samples of river water and BR buffer pH 4 (1:1), c(2,4-DNP): 0 (1), 2.10-6 (2), 4.10-6 (3), 6.10-6 (4), 8.10-6 (5), 10.10-6 (6) mol L-1. References 1. Chailapakul O., Siangproh W., Tryk D. A.: Sens. Lett. 4, 99 (2006). 2. Pleskov Y. V.: Russ. J. Electrochem. 38, 1275 (2002). 3. Compton R. G., Foord J. S., Marken F.: Electroanalysis 15, 1349 (2003). 4. Xu J. S., Chen Q. Y., Swain G. M.: Anal. Chem. 70, 3146 (1998). 5. Kolektiv autorù SRS: List of the Registered Plant Protection Products, The state phytosanitary administration, Brno 2006. 6. Jinadasa K., Mun C. H., Aziz M. A., Ng W. J.: Water Sci. Technol. 50, 119 (2004). 7. Musilova J., Barek J., Drasar P., Peckova K.: Proc. 4th International Student Conference, Prague, 28.-29.1.2008 (Opekar F., Svobodova E., ed.), p. 147. Sevcik Consultancy, Prague 2008. 8. Musilová J., Barek J., Drašar P., Pecková K.: Moderní elektrochemické metody, Jetřichovice, 26.-29.5.2008 (Barek J., Navrátil T., ed.), p. 69. Praha 2008. 9. Musilová J., Barek J., Drašar P., Pecková K.: 12th International Conference on Electroanalysis, Prague, 16.-19.6.2008 (Czech Chemical Society), p. 118. Prague 2008.

73

Electrochemical Impedance Spectroscopy of Lecithin Bilayers Supported on Porous Membranes Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková and Vladimír Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] Introduction The cell surrounded by a plasma membrane is an essential element of all living organisms. With lipid bilayer as a fundamental structure of the membrane, multiple functions are performed: permeability barrier of ions and molecules, ion accumulation and active transport, phagocytosis and pinocytosis. Biological membrane contains among others a heterogeneous mixture of lipids, differing in their head-group structure, hydrocarbon chain length, degree of unsaturation of acyl chain and mode of attachment of the hydrocarbon chain. Model membranes with different stability were studied in the past – lecithin membranes 1, 2 solid supported membranes 3, 4 or lipid bilayers on porous material 5. Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) is often used for characterization of artificially prepared membranes and for active ion transport through the membrane. Some membrane proteins have been successfully reconstituted on solid supported membranes. Porous membranes were used for reconstitution of ion channels 6. In the presented work, polycarbonate porous membrane served as support for lecithin bilayer formation and the effect of ionophore valinomycin has been examined. Experimental Lecithin (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and Valinomycin were purchased from Sigma, KCl „suprapure“ from Merck, CaCl2.6H2O, p.a. (Penta, Czech Republic). Water used throughout the work was from Mili-Q-system (Mili-Q-Gradient, Milipore) (conductivity < 0.5 µS.cm-1). Polycarbonate membrane with 8µm pores was from Milipore.

Two equivalent Ag/AgCl electrodes and Pt wire were used for AC Impedance measurement. Electrochemical measurement was performed with CHI660C Electrochemical Workstation, HCH Instruments, UK. 5 or 10 mV amplitude sine – wave signal perturbation was applied in the 0.1 - 1000 Hz frequency range. Impedance data were analyzed using CHI660C software v. 8.1. Two types of experimental adjustment were applied: 1) U_Cell. The part of polycarbonate membrane (alone or with lecithin solution) was placed between two parts of glass U_shaped cell, which were then filled with 0.1 M KCl; 2) Insert – made from polythene tube cup with hole 0.3 cm2, on which polycarbonate membrane was sealed with epoxy resin. On both side of polycarbonate membrane covering the hole, lecithin solution was added and left to evaporate for 30 minutes. Then the modified membrane was immersed into 0.1 M KCl. Concentration of lecithin was 40 mg.mL-1 in n-heptane with 5 % of EtOH or But-OH. In experiment with valinomycin, its 1·10-6 M solution in EtOH was added together with lecithin solution. Results The dependence of an imaginary part (Z´´) on the real part (Z´) over a frequency range of 0.1 Hz to 1000 Hz for lecithin membrane in U_cell arrangement is shown in Fig.1.

74

Fig. 1. Nyquist graph showing formation of lecithin bilayer within pores of polycarbonate membrane. Free membrane - polycarbonate membrane without lecithin. Form the electrochemical point of view, the formed lecithin bilayer within pores of polycarbonate membrane can be simulated by equivalent circuits depicted in Fig. 2. As it is demonstrated in Fig. 1, rather stable phospholipids membrane is formed about 1 hour after immersing into KCl solution. The time variation corresponded to an increase in the membrane capacitance, i.e., thinning of the lipid structure 5. Similar results were obtained in case of the second experimental arrangement. C1

A

Rs Rp

B

C1 C2 R R1 R2

Fig. 2. Equivalent circuits applied for simulation of lecithin bilayer within pores of polycarbonate membrane.

75

Successful incorporation of valinomycin, i.e., ionophore, which selectively permits potassium cation transfer through the phospholipid membrane, is confirmed by low capacitance of the lecithin membrane and sudden increase of capacitance, when KCl electrolyte was changed for 0.1 M CaCl2 solution (Fig. 3).

3000 C 2500

C [u F ]

2000

CaCl2

C1 C2 Cfree

1500 1000 500 0 0:00

1:00

2:00 Time [h]

Fig. 3. Changes of capacitances of lecithin bilayer within pores of polycarbonate membrane. Free membrane - polycarbonate membrane without lecithin. Conclusions Using electrochemical impedance spectroscopy, formation and stability of lecithin bilayer on porous polycarbonate membrane was examined. Suitability of this system as a perspective for incorporation of ion channels has been demonstrated on experiment with ionophore Valinomycin. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge financial support by the GA AV CR, project No. IAA400400806. References 1. Tien H. T.: Bilayer Lipid Membranes Marcel Dekker, Inc., New York 1974. 2. Janchenova H., Stulik K., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 612, 186 (2008). 3. Ye J. S., Ottova A., Tien H. T., Sheu F. S.: Electrochem. Commun. 3, 580 (2001). 4. Rose L., Jenkins A. T. A.: Bioelectrochemistry 70, 387 (2007). 5. Ikematsu M., Iseki M., Sugiyama Y., Mizukami A.: J. Electroanal. Chem. 403, 61 (1996). 6. Dhoke M. A., Ladha P. J., Boerio F. J., Lessard L. B., Malinowska D. H., Cuppoletti J., Wieczorek D. S.: Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes 1716, 117 (2005).

76

Determination of 5-Amino-6-Nitroquinoline on Carbon Paste Electrode Lenka Němcová, Jiří Barek and Jiří Zima Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected]

5-Amino-6-nitroquinoline (5A6NQ) belongs to the group of nitro- and aminoderivates of heterocyclic hydrocarbons (HHC), which are due to their chemical composition, properties and occurrence similar to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) 1. PAHs accompanied by HHCs occur in a variety of complex matrices including petroleum and petroleum distillates, smoked and flame-broiled foods 2, effluents from a variety of industrial facilities 3, municipal waste-waters, cigarette smoke, creosote leachate, and airborne emissions from waste incinerators and internal combustion engines 4. Usually, methods for the determination of the HHCs and PAHs are gas chromatography connected with mass spectrometry or other detection technique, liquid chromatography with fluorescent, spectrophotometric or electrochemical detection 5. Heterocyclic amines (HCA) are group of very baleful compounds, which are often mutagenic and carcinogenic 6. They are produced when meats are heated above 180 °C for long periods of time 7. We can found them as products of incineration of fossil fuel 8 and also in cigarette smoke 9. Nevertheless, numerous derivates of quinoline are used in pharmaceutical industry. Dichloroderivate of 8-hydroxyquinoline is used under the name Endiaron for treatment of intestinal infections. 4-Aminoquinoline (chloroquine) 10 and 8-aminoquinoline (primaquine) 11 are used for treating malaria. The compound under investigation was not shown to have carcinogenic or mutagenic properties up to now (it is not included in the IARC, NTP, OSHA list). However, its toxicological properties were studied on Tetrahymena pyroformis, and were shown to be comparable to 4amino-2-nitrophenol 12, which shows carcinogenic effects in animals. Still, 5A6NQ was also used for preparing the new type of radioligands 13 and local anesthetics 14. The main advantage of modern electrochemical methods is their high sensitivity and low cost of analysis. The advantages of the carbon paste electrode 15 are low background current, broad potential window 16, the ease of biological or chemical modification of the paste composition 17 and the ease of the renewal of the working surface of the carbon paste electrode (CPE) 18. Materials and methods For the voltammetric measurements, a computerized voltammetric analyzer Eco-Tribo Polarograph with software PolarPro 4.0 (all Polaro Sensors, Prague, Czech Republic) was used. The voltammetric parameters used: scan rate 20 mV s-1, for pulse techniques the pulse amplitude of 50 mV (for cathodic reactions -50 mV). The surface of working carbon paste electrode (2 mm in diameter for voltammetric methods) was renewed mechanically by protruding the piston and smoothing the surface with a piece of wet filter paper. The reference electrode was silver/silver chloride electrode RAE 113 (Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) filled with 3 M KCl. Platinum wire served as auxiliary electrode. For voltammetric methods based on the reduction, the samples were deaerated with nitrogen before analysis. Two HPLC systems were used for analysis of 5A6NQ. For oxidation of 5A6NQ, the system consisted of a piston high pressure pump HPP 5001, LCI 30 sample injector with 20 μl sample loop and LCD 2040 UV/VIS spectrophotometric detector (all Laboratorní přístroje, Praha, Czech Republic). The reverse-phase column Lichrospher® C18, 100 (5 μm), 125 × 4 mm was used (LichroCART, Merck). Whole system operated under CSW 1.7 program (DataApex, Czech Republic). For reduction of 5A6NQ, the system consisting of Beta 10 serial dual piston pump, DG–3014 solvent degasser, valve D with 20 μl sample loop and

77

Sapphire 800 UV/VIS spectrophotometric detector (all Ecom, Czech Republic). The reversephase column Kromasil B C18 (7 μm), 250 × 4.6 mm was used (Prochrome). The mobile phase flow rate was 0.5 ml min-1 and the CPE was working in the wall-jet configuration. The system operated under Clarity 2.3.0 program (DataApex, Czech Republic). An ADLC 2 amperometric detector was used with both systems. As working electrode the same CPE as in case of voltammetric methods was used (3 mm in diameter). An ultrasonic bath PS02000A (Powersonic, USA) was used to facilitate dissolution of the analytes. pH of the solutions was measured with a conductivity and pH meter Jenway 4330 (Jenway, UK) with a combined glass electrode. Spectrophotometer PU 8800 (Philips, UK) was used to study the stability of the stock solution. All experiments were carried out at a laboratory temperature. 5-Amino-6nitroquinoline was obtained from Aldrich. Its stock solution (1 × 10-3 mol l-1) was prepared by dissolving the accurately weighted amounts of the substance in methanol (Lach-Ner, Neratovice, Czech Republic). Working solutions of lower concentrations were prepared by further dilution of the stock solution with methanol. Spectrophotometric study of the stability of the stock solution demonstrated that it was stable for at least four months. BrittonRobinson (BR) buffers were prepared in a usual way (i.e. by mixing a solution which was 0.04 mol l-1 phosphoric acid, 0.04 mol l-1 acetic acid and 0.04 mol l-1 boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol l-1 sodium hydroxide). All the chemicals used were of analytical reagent grade (Lachema, Brno, Czech Republic). For model samples BR buffers (pH 11) were used, which were prepared from 0.2 mol l-1 phosphoric acid, 0.2 mol l-1 acetic acid and 0.2 mol l-1 boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol l-1 sodium hydroxide. For model samples, tap drinking water was used and a sample of river water was taken from the river Vltava in the centre of Prague. The mobile phase for HPLC contained methanol for HPLC (Chromservis, Praha, Czech Republic) and BR or phosphate buffer. Phosphate buffers were prepared from 0.01 mol l-1 sodium dihydrogen phosphate with the appropriate amount of concentrated phosphoric acid. Carbon paste contained 250 mg of glassy carbon spherical microparticles with a diameter of 0.4–12 μm (Alpha Aesar, USA) and 90 μl of mineral oil (Fluka Biochemica, Switzerland). All aqueous solutions were prepared using deionized water obtained from a MilliQ Plus system (Millipore, Molsheim, France). The volume of measured solution when using batch voltammetric methods was always 10 ml. The model sample was prepared by mixing 1 ml of BR buffer pH 11 (0.2 mol l-1), 4 ml sample of drinking or river water sample, respective amount of the 5A6NQ stock solution and finally adjusted by methanol to 10 ml. The limit of determination (LQ) was calculated as the amount of 5A6NQ, which gave the signal which was three times the background noise (S/N). Results and Discussion Voltammetric Study At first, the influence of pH of the supporting electrolyte on the voltammetric behavior of the test substance was investigated. Because of the low solubility of tested 5A6NQ in water, a mixture of BR buffer with methanol 1:1 (v/v) was used as the supporting electrolyte. At first, anodic direct current (DC) and differential pulse (DP) voltammetry were studied for the analyte determination based on the oxidation of the amino group. The effect of pH on peak (wave) current is summarized in Fig. 1 (Fig. 2). Both figures show the shift of peak (wave) potential to less positive values with increasing pH thus reflecting the easier oxidation of the amino group in more alkaline medium. As the optimum for measuring the anodic 5A6NQ calibration dependence the medium of BR pH 11 and methanol (1:1) was chosen.

Then, cathodic direct current (DC) and differential pulse (DP) voltammetry were used to study the reduction of the nitro group. The effect of pH on peak (wave) current is summarized in Fig. 3 (Fig. 4). Both figures show the shift of peak (wave) potential to less positive values

78

with decreasing pH as the reduction of the nitro group becomes easier when protonation of the substance takes place in more acidic medium. The measurement of the reduction reaction on CPE is complicated by the presence of oxygen, which is included not only in the measured solution from which it could be easily removed by nitrogen purging but also in the carbon paste where it often severely interferes with the reaction under study making sometimes the measurement impossible. As the optimum for measuring the cathodic 5A6NQ calibration dependences the medium of BR pH 11 and methanol (1:1) was chosen. Optimum conditions for the voltammetric determination 5A6NQ are summarized in Table I. The calibration curves were measured in the concentration range 2×10-6–1×10-4 mol l-1. The practical applicability of the voltammetric methods was demonstrated by the determination of 5A6NQ in model samples of drinking and river water (Table II). Slopes of the calibration lines in drinking and river water correspond to the values in deionized water. The achieved limits of detection are slightly higher, which is caused by higher noise in model samples. 1200

I, nA

2 12

11

3

8

10

9

900

6 5

7

4

600

300

1

0 400

600

800

1000

1200

1400

E, m V

Fig. 1. Anodic DP voltammograms of 5A6NQ (1 × 10-4 mol l-1) in BR buffer and methanol (1:1) medium with pH values of BR buffer matching the curve´s number (2 to 12), (1). 2

I , nA

1600

3 9 8

1200

12 10

7

5

11

800

6

4 1

400

0 400

800

1200

1600

E, m V

Fig. 2. Anodic DC voltammograms of 5A6NQ (1 × 10-4 mol l-1) in BR buffer and methanol (1:1) medium, with pH values of BR buffer matching the curve´s number (2 to 12), (1). -6 5 0 0

I , nA

12 8

10

-4 5 0 0

6 2

-2 5 0 0

1 .6

4

1

-5 0 0

-2 0 0

-4 0 0

-6 0 0

-8 0 0

-4

E , mV

-1

-1 0 0 0

Fig. 3. Cathodic DP voltammograms of 5A6NQ (1 × 10 mol l ) in BR buffer and methanol (1:1) medium, with pH values of BR buffer matching the curve´s number (2 to 12), (1) supporting electrolyte 0.1 mol l-1 H3PO4 pH 1.6 and methanol (1:1) medium, (pH 1.6).

79

-6 5 0 0

I , nA

6

10 8

1 .6

-4 5 0 0

12

2

4

-2 5 0 0

1 -5 0 0

-2 0 0

-4 0 0

-6 0 0

-8 0 0

-4

E , mV

-1 0 0 0

-1

Fig. 4. Cathodic DC voltammograms of 5A6NQ (1 × 10 mol l ) in BR buffer and methanol (1:1) medium, with pH values of BR buffer matching the curve´s number (2 to 12), (1) supporting electrolyte 0.1 mol l-1 H3PO4 pH 1.6 and methanol (1:1) medium, (pH 1.6). HPLC study 5A6NQ could occur in more complicated matrices, where for its determination it is not possible to use the batch voltammetric methods without preceding separation step. One of the possibilities is the utilization of HPLC with amperometric detection, which was studied further. The aim of this work was not the separation of a mixture of compounds, but only the study of the optimum conditions for the detection of 5A6NQ. Thus, the mobile phase containing 90% methanol was used to achieve low retention time. The amperometric detector of the wall-jet type was placed in the series behind UV/VIS detection (295 nm). At first, optimum pH value of the mobile phase was found from the region enabled by the column used. For this reason, the hydrodynamics voltammograms were measured in BR buffers pH 3, 5 and 7, always in a mixture with methanol (1:9) for potentials from 0 to +1.4 V, when studying the oxidation of the amino group, and in 0.01 mol l-1 phosphate buffer pH 2, 4 and 6, always in a mixture with methanol (1:9) for potentials from 0 to -1.4 V, when studying the reduction of the nitro group. Table III summarizes the parameters of the measured calibration lines and optimal media. The calibration curves were measured in the concentration range 2 × 10-7 – 1 × 10-4 mol l-1. Electrochemical detection using reduction of 5A6NQ was less sensitive and more complicated then the determination based on the oxidation of 5A6NQ. When working with negative potentials, higher noise during the amperometric detection complicated the analysis.

Table I. Parameters of the calibration lines for voltammetric determination of 5A6NQ on CPE. Intercept, LQa, Slope, 2 R Method Base electrolyte nA 10-6mol l-1 mA mol l-1 Anodic, DPV MeOH–BR pH 11 (1:1) 6.89 8.1 0.9959 2.0 Anodic DCV MeOH–BR pH 11 (1:1) 8.73 21.7 0.9963 3.1 MeOH–0.1 mol l-1 H3PO4 pH -18.3 -33.1 0.9959 1.3 Cathod., DPV 1.6 (1:1) Cathod., DPV MeOH–BR pH 11 (1:1) -16.2 -95.7 0.9933 1.9 -1 Cathodic, MeOH–0.1 mol l H3PO4 pH -24.7 -81.0 0.9963 1.5 1.6 (1:1) DCV a 2 LQ limit of determination, R coefficient of determination

80

Table II. Parameters of the calibration lines for voltammetric determination of 5A6NQ in model samples of drinking and river water, measured in BR buffer pH 11 and methanol (1:1). Slope, LQa, Intercept, Concentration R2 Method -1 -1 -6 mA mol l nA 10 mol l-1 range mol l Drinking water Anodic DPV 6.78 -7.2 0.9981 7.2 8 × 10-6 – 1 × 10-4 7.96 -4.7 0.9983 7.4 Anodic DCV River water Anodic DPV 6.75 -7.5 0,9986 5.5 6 × 10-6 – 1 × 10-4 8.43 18.5 0.9975 5.6 Anodic DCV a 2 LQ limit of determination, R coefficient of determination Table III. Parameters of the calibration lines for HPLC determination of 5A6NQ on CPE. Method LQa, 10-7mol l-1 HPLC UV/VIS, 295 nm, MeOH–BR pH 7 (9:1) 1.1 HPLC ED, +1.2 V, MeOH–BR pH 7 (9:1) 1.6 HPLC UV/VIS, 295 nm, MeOH–Phosphate buffer pH 2 (9:1) 1.3 HPLC ED, -0.9 V, MeOH–Phosphate buffer pH 2 (9:1) 4.9 a LQ limit of determination Ackowledgement This research was supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project No. LC 06035, MSM 0021620857, and the development project RP 14/63). References 1. Zima, J.; Stoica, A.I.; Zítová, A.; Barek, J.: Electroanalysis 18, 158 (2005). 2. Tomaniová, M.; Kocourek, V.; Hajšlová, J.: Chemické Listy 91, 357 (1997). 3. Barek, J.; Bencko, V.; Cvačka, J.; Šuta, M.: Chemické Listy 92, 794 (1998). 4. White, P.A.: Mutation Research 515, 85 (2002). 5. Barek, J.; Cvačka, J.; Moreira, C.; Zima, J.: Chemické Listy 90, 805 (1996). 6. Stratil, P.; Kubáň, V.: Chemické Listy 99, 3 (2005). 7. Felton, J.S.; Knize, M.G.; Dolbeare, F.A.; Wu, R.: Environmental Health Perspectives 102, 201 (1994). 8. Okumura, L.L.; Stradiotto, R.N.: Electroanalysis 19, 709 (2007). 9. Vineis, P.; Pirastu, R.: Cancer Causes and Control 8, 346 (1997). 10. Lo, W.L.; Tsang, C.W.: Journal of the Hong Kong Medical Association 38, 43 (1986). 11. Queener, S.F.; Barlett, M.S.; Nasr, M.; Smith, J.W.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37, 2166 (1993). 12. González, M.P.; Díaz, H.G.; Cabrera, M.A.; Ruiz, R.M.: Bioorganic & Medicinal Chemistry 12, 735 (2004). 13. Karramkam, M.; Dollé, F.; Valette, H.; Basret, L.; Bromoullé, Y.; Hinnen, F.; Vaufrey, F.; Franclin, C.; Baury, S.; Coulon, Ch.; Ottaviani, M.; Delaforge, M.; Loc´h, Ch.; Bottlaender, M.; Crouzel, Ch.: Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2611 (2002). 14. Goda, F.E.; Aziz, A.; Ghoneim, H.A.: Bioorganic & Medicinal Chemistry 13, 3175 (2005). 15. Adams, R.N.: Analytical Chemistry 30, 1576 (1958). 16. Kuwana, T.; French, W.G.: Analytical Chemistry 36, 241 (1964). 17. Švancara, I.; Vytřas, K.: Chemické Listy 88, 138 (1994).

81

Specifické vlivy uspořádání elektrodových systémů na jejich vlastnosti (miniaturizace, plasty a nové materiály, interakce, geometrie, parametry) Ladislav Novotný Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, Česká republika, E-mail: [email protected] Úvod Voltametrické/polarografické a příbuzné elektrodové systémy představují rozhodující součást příslušné instrumentace z hlediska vytváření a následného přenosu příslušného typu elektrochemického signálu 1-4. Hlavní pozornost bývá přitom soustředěna na složení jejich aktivního materiálu, nejčastěji z hlediska funkčnosti, dané aplikace, hygieny, případné toxicity, dostupnosti, ceny apod. Vlastní konstrukce bývá upravována zvláště s ohledem na jejich konkrétní využitelnost 5-24.

Ačkoliv jsou materiálové vlastnosti aktivní části elektrod velmi důležitým parametrem, jejich chování a funkční vlastnosti bývají ovlivňovány i dalšími vlivy a okolnostmi. Je tomu tak zejména v případě, kdy nejde jen o pasivní užití materiálu elektrody, ale i o aktivní aplikaci jednotlivých režimů a módů. Uspořádání elektrodového systému a jeho provedení takové vlastnosti významně ovlivňuje. V rámci vývoje elektrod a elektrodových systémů byla a je tudíž dlouhodobě věnována pozornost též uplatnění příslušných fyzikálních a fyzikálněchemických vlivů, které mají určující vliv na zmíněné funkční vlastnosti. Cílem tohoto sdělení je informace o příkladech faktorů, které se takto (v závislosti na daných podmínkách) uplatňují či mohou uplatnit. Materiály a metody Pro výzkum faktorů ovlivňujících vlastnosti různých elektrodových uspořádání byly použity polarografické systémy PA 4 (Laboratorní přístroje Praha), PC-ETP (ECO-TREND PLUS s.r.o. Praha a ROTKEV, s.r.o. Praha) vč. příslušenství jako je SMDE-1, referentní Ag/AgCl elektroda, rtuťová elektroda tužkového typu, Pt-elektroda ad. Měření byla prováděna běžně v tříelektrodovém uspořádání, v případě miniaturizovaných elektrod byl pro srovnání využita též dvouelektrodová konfigurace. Kromě toho byla použita řada laboratorně zhotovených elektrod a čidel zejména na bázi rtuti, kompozitních amalgam (případně modifikovaných meniskem rtuti), elektrod s plastovým zakončením či plastovými nástavci, kapilárních a miniaturizovaných elektrod a ovládacích systémů. Pro potřeby realizace speciálních funkčních režimů byly využity kombinace upravených pulzních generátorů.

Měření byla prováděna vesměs ve vodných roztocích při laboratorní teplotě. Použité chemikálie byly čistoty p.a. Před měřením byly roztoky vybublány dusíkem. Jako testovací metody byly využity DC-voltametrie (DCV), diferenční pulzní voltametrie (DPV), elektrokapilární a mezifázová měření. DPV byla aplikována za následujících parametrů: rychlost scanu 20 mV.s-1, vzorkování 20 ms, amplituda pulzu 50 mV, frekvence pulzů 5 Hz. Výsledky a diskuse Funkčnost různých elektrodových uspořádání, fyzikální a fyzikálně-chemické souvislosti řídí se zejména odpovídající cílovou aplikací. Jejich roli lze nejlépe ilustrovat na následujících příkladech účelových řešení, navazujících na předchozí etapy a generace:

82

− Původní kapilární elektrody stály (vzhledem ke způsobu jejich aplikace a celkovému provedení měřících systémů) téměř mimo zájem vývojářů. O několik desítek let později, na přelomu 70. a 80. let, byly naopak velmi aktuální laboratorní systémy se zabudovanými řídícími jednotkami (nazývané laboratorními kombajny), u nichž se po instalaci počítalo pouze s obsluhou, nikoli s možností zasahovat do jejich chodu, programů, uspořádání, přenášet je bez dalšího seřízení z místa na místo atp. Příkladem byl analyzátor fy Metrohm 646 VA-Processor.

Souběžně s tím však začala vznikat jak rigidnější bloková uspořádání 5-8 tak flexibilnější komponentní 5, 6, 8-14 sestavy. Příkladem toho byla na jedné straně zařízení SMDE fy P.A.R. a SMDE-1 k.p. Laboratorní přístroje, na straně druhé SMDE/HMDE kazetového, tužkového či komponentního až miniaturizovaného (UMME, UmμE) provedení. Rozdílnost uspořádání, ačkoliv zprvu zdánlivě téměř bezvýznamná, ovlivnila koncepci dalších variant těchto zařízení. Limity dané vibracemi, rezonancemi, rychlostí mechanické odezvy, bodovou únavou materiálu, dynamickými a hydrostatickými efekty měly vliv např. na geometrické a funkční parametry sestavy. − Změna povahy, struktury a smáčivosti okolí materiálu případně držáku elektrody vedla např. – v závislosti na typu aplikace – ke změně mezifázových poměrů, rozsahu využitelných pracovních potenciálů apod. Příkladem byla mezifázová a jiná měření s elektrodami opatřenými plastovými nástavci, v přítomnosti agresivních (např. HF) nebo povrchově aktivních (R-OH, R-SH aj.) látek či rozpouštědel (DMF aj.). − Tvarové, topologické či materiálové změny spoluurčovaly dynamické vlastnosti, smáčivost apod. Bylo tomu tak např. u tvarově modifikovaných kapilárních těl elektrod při použití voltametrie ve vodných roztocích. − Smáčivost ovlivňovala analytické pozadí, šum, poměr signál/šum, kapacitní efekty apod., projevující se např. změnami pozadí na DPV-záznamech. − Vlastní funkčnost a její parametry byly určovány 6, 9-24 užitnými režimy a módy, jejich sekvencemi, kombinacemi a synchronizací jednotlivých kroků. Příkladem toho 6, 9, 10, 12-14, 20-23 jsou schémata na obr. 1 naznačující miniaturizovaná uspořádání, elektrody s plastovými či jinými nástavci, možné časové změny plochy elektrody a sekvence ovládacích pulzů např. v kombinaci s DC, CV a DPV voltametrií.

Obr. 1. Schémata naznačující miniaturizovaná uspořádání, elektrody s plastovými či jinými nástavci, možné časové změny plochy elektrody a sekvence ovládacích pulzů apod.

83

Závěr Výsledky měření a pozorování potvrdily sledované specifické vlivy uspořádání elektrodových systémů na jejich vlastnosti. Vlastní příčinou uplatnění těchto vlivů byly zejména změny fyzikálních (hydrostatických, hydrodynamických, povrchových aj. a fyzikálně-chemických (kapilárních, adhezních ad.) vlastností elektrod, zvláště v oblasti styku jejich elektrochemicky aktivního mezifází s materiálem elektrody. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů MSMT LC06035 a VZ 0021627502-UPa. Literatura 1. Heyrovský J., Kůta, J.: Základy polarografie, NČSAV, Praha 1962. 2. Wang J.: Analytical Electrochemistry, VCH Publishers, New York 1994. 3. Barek J., Fogg A. G., Muck A., Zima J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 291 (2001). 4. Paleček E., Scheller F., Wang J.: Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics, str. 789. Elsevier, Amsterdam 2005. 5. Novotný L., Čs. pat. PV 9200-78, 2367-80; AO 210852, 220439, Praha 1978/1980. 6. Novotný L.: Kandidátská disertační práce. ÚFCHE-J. Heyrovského ČSAV, Praha 1981. 7. Peterson W. M.: Internat. Lab. 1/2, 51 (1979). 8. Novotný L., Čs. pat. PV 6100-78, AO 202316, Praha 1978. 9. Novotný L.: Electroanalysis 2, 257 (1990). 10. Novotný L.: US pat. č. 5173101, 5294324. 11. Polaro-Sensors: Dokumentace k Eko-Tribo polarografu PC-ETP, Praha 1993. 12. Novotný L.: Fresen. J. Anal. Chem. 184, 362 (1998). 13. Novotný L.: Chem. Listy 95, 147 (2001). 14. Novotný L., Heyrovský M.: Croat. Chim. Acta 70, 151 (1997). 15. Švancara I., Vytřas K., Bobrowski A., Kalcher K.: Talanta 58, 45 (2002). 16. Vytřas. K., Švancara I., Metelka R.: Electroanalysis 14, 1359 (2002). 17. Navrátil T., Kopanica M.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 153 (2002). 18. Paleček E.: Bioelectrochem. Bioenerg. 28, 71 (1992). 19. Paleček E.: Electroanalysis 8, 7 (1996). 20. Novotný L.: Electroanalysis 8, 135 (1996). 21. Novotný L., Fojta M., Heyrovský M.: Electroanalysis 12, 1233 (2000). 22. Novotný L.: Electroanalysis 12, 1240 (2000). 23. Novotný L.: PUV 7103-1997; PUV 9008-99; PV 1-2001; PUV 19501-2007, Praha 1997/1999/2001/2007. 24. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002).

84

Voltammetric Determination of Nitrofen at a Carbon Paste Electrode Vít Novotný and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry,, Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Introduction Carbon paste electrodes, invented in 1958 by Adams 1 still find an important place in modern electroanalytical chemistry 2. The use of carbon paste electrodes prepared from paraffinic pasting liquid is usually restricted to the determination of substances yielding signal in the anodic potential range 3. In my previous work, however 4, it was described that Acifluorfen can be easily determined in submicromolar concentrations by differential pulse voltammetry (DPV) at a carbon paste electrode. In this work, the same approach was applied Nitrofen, which is similar to Acifluorfen by its chemical structure, properties and its use as a herbicide. The needs to determine Nitrofen in the environment may arise from its teratogenity, carcinogenity and high toxicity for aquatic organisms. Materials and methods Nitrofen stock solution (2,4-dichlorfenyl-4-nitrofenylether, 99 % Sigma-Aldrich Laborchemikalien, Germany) c = 1·10-3 mol·L-1 was prepared by dissolving of 0,0284 g of the substance in 100 mL of methanol. Other used chemicals: boric acid, acetic acid (99%), phosphoric acid (85%), sodium hydroxide, methanol, all p. a.) were purchased from Lachema Brno, Czech Republic.

Britton - Robinson (BR) buffers of the desired pH were prepared by mixing 0.2M-NaOH with a solution containing 0.04 mol·L-1 boric acid, acetic acid and phosphoric acid. Measurements of pH were made using a Jenway 3510 pH-meter (Jenway, Essex, Great Britain) with a combined glass membrane electrode (type 924 005) calibrated by standard aqueous buffers. Deionized water (Millipore, USA) was used for all measurements. Voltammetric measurements were performed on Eco-Tribo Polarograph using PolarPro 4.0 software (all Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The measurements were carried out in a three-electrode system – platinum auxiliary electrode PPE (Monokrystaly, Turnov, Czech Republic), silver/silver chloride reference electrode RAE 113 (1 mol·L-1 KCl, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic), and a teflon, piston-like carbon paste electrode with inner diameter of 3 mm. The method used for the measurements was DPV with a scan rate of 20 mV·s-1, pulse amplitude of -50 mV and pulse width of 80 ms. The carbon paste was prepared by mixing 250 mg of glassy carbon microspheres (0,4 – 12 μm diameter, Alpha Aesar, USA) and 100 μL of mineral oil (Fluka Biochemika, Switzerland). The electrode surface was renewed by wiping a small amount of the paste with paper. Results and discussion To find the optimum conditions for determining Nitrofen by DPV on CPE the optimum pH had to be selected. The DP voltammograms measured in a solution of 50 % BR buffer of the

85

desired pH and 50 % methanol can be seen in Fig. 1 and 2. Voltammograms for odd and even pH values are in separate graphs for clarity. The pH range of the BR buffer investigated was pH 2-12. The maximum peak height was obtained for BR buffer pH 9 and so this pH value was selected for the following measurements.

5

6

-8

4 -6

I [μA]

3

-4

1

2

-2

0 -400

E [mV]

-600

-800

-1000

Fig. 1. DP voltammograms of Nitrofen (c = 1·10-5 mol·L-1) at CPE. Measured in a mixture of 50 % BR buffer of the desired pH and 50 % methanol. BR Buffer pH: 2.0 (1), 4.0 (2), 6.0 (3), 8.0 (4), 10.0 (5) and 12.0 (6).

-8

4

5

-6

3

I [μA] -4

2 -2

0 -400

1

-600

E [mV]

-800

-1000

Fig. 2. DP voltammograms of Nitrofen (c = 1·10-5 mol·L-1) at CPE. Measured in a mixture of 50 % BR buffer of the desired pH and 50 % methanol. BR Buffer pH: 3.0 (1), 5.0 (2) 7.0 (3), 9.0 (4) and 11.0 (5). Conclusion The optimum pH for the determination of Nitrofen by DPV at CPE was found to be pH 9. Calibration dependence for this pH value has been measured and shows non-linearity due to adsorption or extraction of the analyte to the electrode material. These phenomena have yet to be studied before a successful method for the determination of Nitrofen on CPE is developed.

86

Acknowledgements The financial support of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project LC06035 and MSM 021620857) References 1. Adams R. N., McClure J. H., Morris J. B.: Anal. Chem. 30, 471 (1958). 2. Švancara I., Vytřas K., Barek J., Zima J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 311 (2001). 3. Švancara I., Vytřas K.: Anal. Chim. Acta 273, 195 (1993). 4. Novotný V.: Diploma thesis. Charles University, Prague 2008.

87

Amalgam Electrodes in Amperometric Detection of the Antineoplastic Drug Carmustine in Liquid Flow Methods a Karolina Pecková , Lucie Vrzalová a, Vladimír Bencko b and Jiří Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b 1. LF UK & VFN, Institute of Hygiene and Epidemiology, Studničkova 7, CZ-128 00 Prague 2, Czech Republic Introduction Carmustine (BCNU, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitroso-urea, Fig. 1) is N-nitroso group containing antineoplastic drug classified as alkylating agent. As the other nitrosoureas, BCNU has the unique ability unlike most chemotherapeutics, to cross the blood-brain barrier. Therefore, it is useful in treating brain tumors. Other cancers treated with BCNU include multiple myeloma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphomas, lung cancer, and colon cancer 1. The extended use of BCNU and other nitrosoureas (streptozotocine, lomustine) for medicine purposes initiated further studies on their toxicity: According to International Agency for Research on Cancer (IARC) classification, BCNU is probably carcinogenic to humans (group 2A) based on sufficient evidence of carcinogenicity in experimental animals 2.

Other effort is devoted to the development of sensitive analytical methods for the determination of trace amounts of nitrosoureas including BCNU in different biological and environmental matrices and in stability and pharmacological studies. Polarographic methods were used for determination of BCNU and structurally relative nitrosoureas in pure form, capsules, blood 3, and plasma 4, and for pharmacokinetic studies 5. Our previous study 6 was devoted to the determination of nitrosoureas (BCNU, streptozotocin) using modern electroanalytical techniques at a hanging mercury drop electrode (HMDE) or silver solid amalgam electrodes (AgSAE). In this study, the possibility of combination of flow injection analysis (FIA) and HPLC with amperometric detection in “wall-jet” arrangement using three common types of AgSAE (i.e., mercury meniscus modified (m-AgSAE), polished (pAgSAE), and mercury film modified (MF-AgSAE)) 7 for BCNU determination is presented. O Cl

Cl N

NH

NO

Fig. 1. Structural formula of BCNU. Experimental The stock solution of BCNU (c = 1·10–3 mol L–1) was prepared by dissolving of the pure substance (Sigma-Aldrich, 98 %) in ethanol. The column LiChrospher 100 RP-18 endcapped (125 × 4 mm, 5 μm) and pre-column LiChrospher PAH (4 × 4 mm, 5 μm, all Merck) were used in HPLC setup (high-pressure pump LaChrom-7100, autosampler L-7200 with interface D-7000, and software HPLC System Manager v. 4.0; all Merck Hitachi). The mobile phase was degassed by passing nitrogen continuously through the whole measurement period. Electrochemical detector in “wall jet” geometry described earlier 8 with three electrode system driven by ADLC 1 (Laboratorní přístroje, Prague) potentiostat was used. The working electrode was AgSAE with the disc diameter of 2.47 mm, Ag/AgCl (3 mol L–1 KCl) reference and platinum wire auxiliary electrodes (both Monokrystaly, Turnov) were used. The electrode

88

surface – capillary outlet distance was kept at 0.5 mm. The surface of AgSAE was modified as follows: The polished surface of p-AgSAE was obtained by polishing with alumina (1.1 µm) for 3 min. The mercury meniscus of m-AgSAE was obtained by immersion of p-AgSAE in liquid mercury. The mercury film for MF-AgSAE was deposited electrochemically from 0.01 mol L–1 HgCl2 in 1 mol L-1 KCl solution. Before starting the work each day the electrochemical activation of m-, p-, and MF-AgSAE was carried out in 0.2 mol L-1 KCl at – 2200 mV under stirring the solution for 300 s. Results and Discussion Several parameters were optimized for HPLC-ED and FIA-ED setups, including composition and pH of the mobile phase (run electrolyte) and its flow rate (Fm), detection potential (Edet), and sample injection volume (Vinj). For m-AgSAE also the mercury volume (VHg) for meniscus formation was optimized.

While the pH of the buffer itself has no influence on the retention time of BCNU in HPLC, it is of high importance when considering its instability in aqueous media 2,9 and response of the electrochemical detector. It was shown in our previous study 6 that the direct current (DC) and differential pulse (DP) voltammograms of BCNU at m-AgSAE exhibit one, well developed irreversible peak of decreasing peak height in the pH range of 2.0 – 10.0 corresponding to the two electron reduction of N-nitroso group. Its peak potential (Ep) shifts significantly to more negative values in the pH range of 2.0 – 6.0 and remains at about Ep = –1.1 V (vs. Ag/AgCl/ 1 mol L–1 KCl) at higher pH values.

pH pH pH pH pH

12

2.0 5.0 7.0 10.0 12.0

A

– I [μA]

– Ip [μA]

For FIA, the influence of the detection potential (Edet) imposed on m-AgSAE on peak heights of BCNU (hydrodynamic voltammogram (HDV)) in run electrolyte Britton – Robinson (BR) buffer pH 2.0 – 12.0 is depicted at Fig. 2A. BR buffer pH 7.0 was selected for further experiments, which was considered previously as optimal medium for DC and DP voltammetric determination of BCNU at m-AgSAE 6. In this media, at the detection potential Edet = –1.5 V the maximum signal/background ratio was obtained. The optimum flow rate was set at 5.5 mL min–1, where the maximum peak heights were achieved. B

4 3

0.6 2

0.4 8 0.2 1

4 0.0 0

0.8

1.2

1.6 – E det [V]

0

1

2

3

4 t [min]

Fig. 2. (A) The dependence of peak heights Ip of BCNU (c = 1⋅10–4 mol L–1) on applied detection potential Edet at m-AgSAE in “wall-jet” arrangement in FIA-ED. Run electrolyte BR buffer pH 2.0, 5.0, 7.0, 10.0, 12.0. Flow rate 1 mL min–1, injection volume 20 μL. (B) The record of FIA peaks of BCNU obtained for the lowest attainable concentration range. c (BCNU): 0 mol L–1 (1), 6·10–6 mol L–1 (2), 8·10–6 mol L–1 (3), 1·10–5 mol L–1 (4). Run electrolyte BR buffer pH 7.0, Edet= –1,5 V, flow rate 5.5 mL min–1, injection volume 20 μL. 89

For HPLC determination the mobile phase based on the literature survey 10 consisting of BR buffer (pH 5) / methanol (50/50) was used. The retention time of BCNU in this system was 4.8 min (capacity factor of 3.0), but the coinciding oxygen signal preceding BCNU complicates the analysis. The oxygen presence causing problems in HPLC-ED setups was described also in other studies 11, 12 dealing with reducible organic analytes. In our case, the oxygen comes from injection by autosampler, where the injected zone is confined between air zones. The resolution between BCNU and oxygen was increased when the BR buffer/methanol ratio was changed to 60/40. It resulted in separation of both peaks with capacity factors of 1.9 for oxygen and 5.3 for BCNU with total analysis time of 10 min. An example of this separation is given at Fig. 3B. It presents chromatograms recorded at mAgSAE modified from 0 mL (polished electrode, p-AgSAE) to 1.8 μL of mercury. Although the peak height and area is obviously increasing with increasing VHg, the meniscus formed by higher volumes could be inadvertently diminished or removed during manipulation with the detector or electrode itself. Therefore, 0.4 μl of Hg for meniscus formation were used for both, HPLC-ED and FIA-ED.

A

3

2

– I [μA]

– Ibackground [μA]

– Ip [μA]

The HDVs for HPLC-ED varying the pH of the BR buffer (pH 2.0 – 7.0) in the mobile phase are at Fig. 3A. The shape of these HDVs respects the shapes of DC voltammograms as described in ref. 6, i.e., the potential where the maximum peak height was observed shifts to more negative potentials and simultaneously this height maximum is decreasing with increasing pH. The consequent decrease of Edet after the height maximum is caused by increase of the background current due to the decomposition of the mobile phase. The noise in all these experiments was comparable of about 10 μA. For further measurements the pH 3.0 and the Edet of –1.2 V were chosen based on maximal signal/noise ratio. The optimum flow rate Fm was set at 1 mL min–1 and the injected sample volume Vinj was set at 25 μL.

B

BCNU

3

4 2

16

oxygen

2

1

1 8 0

0.9

1.2

1.5 – E det [V]

0 0

4

8 t [m in]

Fig. 3. (A) The dependence of the peak height Ip of BCNU (full symbols; c = 1·10–3 mol L–1) and of the background current (hollow symbols) on applied detection potential Edet. Mobile phase: BR buffer / methanol (60/40; v/v); pH of the BR buffer 3.0 (■,□), 5.0 (▲,∆), 7.0 (●,○). Flow rate 1 mL min–1, injection volume 10 μL. (B) Chromatograms of BCNU (c = 1·10–3 mol L–1), 0 µL (1), 0.6 µL (2), and 1.8 µL (3) of mercury used to form the meniscus of m-AgSAE. Mobile phase: BR buffer pH 3.0 / methanol (60/40; v/v), flow rate 1 mL min–1, injection volume 25 μL, detection potential –1.2 V. Detection at m-AgSAE in “wall-jet” arrangement in HPLC-ED.

90

The repeatability of electrode response for HPLC-ED and FIA-ED was tested at previously found optimal conditions, at the lowest and highest concentration of linear dynamic range, all summarized in Table I. At lower concentrations, for peak heights lower values of relative standard deviation (RSD) of cca 7-9.5 % were obtained than for peak areas with cca 13-15 % for m-, p-, and MF-AgSAE in HPLC-ED and m-AgSAE in FIA-ED. For higher concentrations, maximal RSD as low as 2.30 % for peak height using m-AgSAE in FIA-ED was obtained even without any electrode pretreatment. Calibration curves measured under optimized conditions are linear over two concentration ranges; parameters are summarized in Table II. It follows from that table that LQs achieved for HPLC-ED at m-, p-, and MF-AgSAE are comparable (cca 2·10–5 mol L–1). These values are one order of magnitude higher than for DCV and DPV at m-AgSAE 6 due to the presence of the organic modifier in the mobile phase and high noise of the HPLC-ED setup itself. This was proved by constant noise level of 10 μA for m-AgSAE of decreasing disc diameters from 2.47 mm down to 0.55 mm. In FIA-ED in aqueous media lower LQ of 7.1⋅10–6 mol L–1 was achieved. Fig. 2B presents BCNU peaks for the lowest attainable concentration range. Table I. Repeatability of peak height Ip and peak area Ap of BCNU calculated as relative standard deviations (RSD) of ten consecutive measurements for various types of AgSAE in HPLC-ED and FIA-ED. Conditions: HPLC-ED – mobile phase BR buffer pH 3.0 / methanol (60/40; v/v), flow rate 1 mL min–1, injection volume 25 μL, detection potential –1.2 V. FIA-ED – run electrolyte BR buffer pH 7.0, flow rate 5.5 mL min–1, injection volume 20 μL, detection potential –1.5 V. Electrode m-AgSAEa p-AgSAE MF-AgSAE m-AgSAEa p-AgSAE MF-AgSAE Method HPLC/FIA HPLC HPLC HPLC/FIA HPLC HPLC –1 –5 –5 –5 –5 –5 2·10 2·10 c [mol L ] 4·10 / 2·10 4·10 / 2·10–5 –6 –6 6·10 6·10 15.75/0.54 47.80 46.35 Ip [μA] 344.4/0.41 1063.8 961.42 Ap [μA s] RSD [%] 7.34/9.26 6.46 7.18 13.81/14.6 14.84 12.89 a 0.4 μL of Hg used for Hg meniscus Conclusions Presented amperometric determination of BCNU illustrates the mechanical stability of amalgam electrodes in flowing systems and their usefulness in analytical chemistry of electrochemically active organic compounds nowadays. Acknowledgements K. P. thanks to the Grant Agency of the Czech Republic (project 203/07/P261), the project was further financially supported by the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects LC 06035 and MSM 0021620857).

91

Table II. Parameters of the calibration straight lines for the HPLC-ED and FIA-ED determination of BCNU using various types of AgSAE. Conditions as in Table I. Type of AgSAE Concentration Slopea Interceptb Correlation LQc range [mol L–1] coefficient [mol L–1] Evaluated from peak heights 22.4 0.9978 HPLC/m-AgSAE 2.17⋅106 1.5⋅10–5 (1 – 10)⋅10–5 6.3 0.9887 HPLC/p-AgSAE 2.02⋅106 1.5⋅10–5 (1 – 10)⋅10–5 6 –5 1.38·10 18.6 0.9981 HPLC/MF-AgSAE (2 – 10)⋅10 2.4⋅10–5 6.96·104 0.0 0.9996 FIA/m-AgSAE 7.1⋅10–6 (0.6 – 10)⋅10–5 Evaluated from peak areas –5 868.4 0.9853 HPLC/m-AgSAE 5.95⋅107 (1 – 10)⋅10 –5 7 –198.2 0.9944 HPLC/p-AgSAE 6.40⋅10 (1 – 10)⋅10 7 –5 3.86·10 3.6 0.9963 HPLC/MF-AgSAE (2 – 10)⋅10 4 –5 5.61·10 0.0 0.9992 FIA/m-AgSAE (0.6 – 10)⋅10 a –1 –1 b for peak heights in [μA mol L] and peak areas in [μA s mol L]; for peak heights in [μA] and peak areas in [μA s]; c the limit of quantitation (LQ) was calculated using the standard deviation of the mean of the peak heights obtained for ten consecutive determinations of lowest measurable concentration (sc) and the slope b of the analytical curve related by Eq.: LQ = 10sc/b (ref. 13). References 1. URL: http://www.chemocare.com/BIO, accessed 15. 2. 2009. 2. IARC: IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Overall Evaluations of Carcinogenicity: An Updating of IARC Monographs Volumes 1 to 42. Supplement 7. IARC, Geneva 1987. 3. Snycerski A., Fijalek Z.: Chem. Anal. (Warsaw) 41, 1025 (1996). 4. Bartosek I., Daniel S., Sykora S.: J. Pharm. Sci. 67, 1160 (1978). 5. Russo R., Bartosek I., Piazza E., Santi A. M., Libretti A., Garattini S.: Cancer Treat. Rep. 65, 555 (1981). 6. Pecková K., Vrzalová L., Bencko V., Moreira J. C., Barek J., in Sensing in Electroanalysis, Vol. 3 (K. Vytřas, K. Kalcher, I. Švancara, eds.), p. 141. University of Pardubice, Pardubice, 2008. 7. Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002). 8. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 9. Fredriksson K., Lundgren P., Landersjo L.: Acta Pharm. Suec. 23, 115 (1986). 10. Krull I. S., Strauss J., Hochberg R., Zervas N. T.: J. Anal. Tox. 5, 42 (1981). 11. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 12. Jiranek I., Peckova K., Kralova Z., Moreira J. C., Barek J.: Electrochim. Acta 54, 1939 (2009). 13. Inczédy J., Lengyel T., Ure A. M.: Compendium of Analytical Nomenclature (Definitive Rules 1997). Blackwell Science, 1998.

92

Rozdíly v chování zvolených slabě a silně adsorptivních látek na elektrochemicky obnovovaných miniaturizovaných površích Petra Polášková a, Ladislav Novotný b, Veronika Ostatná c a Emil Paleček c a Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Náměstí Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, Česká republika, E-mail: [email protected] b Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, Česká republika c Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Úvod Po víc než půlstoletí od objevu a zavedení polarografie dominovaly rtuťové elektrody 1 jako elektrochemická čidla pro příslušné metody elektrochemické analýzy. Během posledních desetiletí byly však postupně stále více preferovány pevné nertuťové elektrody 2-5. V mnoha případech je náhrada rtuti těmito elektrodami možná, vhodná či výhodná 2, v některých případech je však obtížná či nemožná. Dokonalý mechanicky obnovovaný povrch byl např. využit při mezifázových a elektrosorpčních studiích 6, studium organizovaných vrstev nukleových kyselin 7, 8, analýze nukleových kyselin 3, 9 a proteinů 10 apod. Kromě toho byly a jsou stacionární rtuťové elektrody stále velmi užitečné pro voltametrickou stopovou analýzu 2, 6, 11, 12 . V průběhu uplynulých desetiletí zaznamenal vývoj elektrod na bázi (či s obsahem) rtuti rovněž výrazný pokrok. Za zmínku stojí především miniaturizované stacionární kapkové a meniskové elektrody 13-15, 18, 23, kompresně-expanzní elektrody 14-16, 18, 23, rtutí modifikované pevné amalgamové elektrody 4, 17-21 (vč. speciálních kompozitních amalgam 18, 23 a „plastictip“ nebo „glass-tip“ 18, 22, 23, 25 elektrod). Účinným prostředkem, jak dále zvýšit kvalitu výsledků zejména při opakovaném využívání stále stejných miniaturizovaných povrchů obsahujících rtuť, je jejich elektrochemické obnovování 26, dříve aplikované 25 např. před prováděním elektrokapilárních měření. Jeho účinnost závisí přitom mj. na možnostech odstranění povrchově-aktivních látek. Toto sdělení bylo zaměřeno na rozdíly v chování zvolených slabě (2-aminoanthrachinon 2-AA) a silně (dithiothreitol DTT) adsorptivních látek na elektrochemicky obnovovaných miniaturizovaných rtuťových površích 24-26. Materiály a metody Pro měření v roztocích 2-AA byl využit polarograf počítačový Eko-Tribo polarograf (ECOTREND PLUS s.r.o. Praha a ROTKEV, s.r.o. Praha), v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda sloužila visící rtuťová minielektroda tužkového typu HMDE, referentní elektrodou byla Ag/AgCl/ KCl (3 mol.l-1) a pomocnou elektrodou byl Pt-drát. Elektrochemické chování v přítomnosti DTT bylo studováno pomocí analyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, Utrecht, Nizozemí). Měřené roztoky byly vybublány dusíkem. Pro měření pH sloužil pH-metr (Jenway 4330, UK). Měření byla prováděna s využitím DC voltametrie DCV a diferenční pulzní voltametrie DPV. DPV byla aplikována za následujících parametrů: rychlost scanu 20 mV.s-1, vzorkování 20 ms, amplituda pulzu 50mV, frekvence pulzů 5 Hz. Výsledky a diskuse Problém elektrochemického obnovování povrchu souvisí se změnami, které na něm probíhají od okamžiku vytvoření mezifázového elektrodového rozhraní. Adsorpce přítomných látek a hromadění produktů na elektrodách patří mezi nejvýznamnější faktory ovlivňující analytické parametry prováděných měření. Ze shromážděných poznatků vyplynulo, že kvalitu měření lze zejm. v případě miniaturizovaných elektrod výrazně zvýšit vyvoláním řízené desorpce alespoň části rušivých složek k povrchu elektrody těsně před vlastním měřením. Při provedených testovacích měřeních záleželo přitom zjevně na typu adsorpce u sledovaných povrchově aktivních látek.

93

Ukázalo se například, že 2-aminoanthrachinon 2-AA se choval jako povrchově aktivní depolarizátor vykazující reverzibilní adsorpci. Závislost výšky jeho voltametrického píku na koncentraci sledovala průběh monotónně rostoucí adsorpční izotermy. V rozsahu hodnot 0 až 10 byla závislost ΔI vs. v1/2 přibližně lineární, při vyšších hodnotách došlo k progresivnímu růstu ΔI. Při nízkých hodnotách v to bylo patrně způsobeno relativně větším uplatněním transportních dějů v blízkosti elektrody v porovnání s ději adsorpčně-desorpčními. Při rychlých scanech dominoval naopak adsorpčně-desorpční efekt a výrazně pomalejší transportní proces se uplatňoval v porovnání s ním v podstatně menší míře. U elektrod malých rozměrů klesal vliv transportních procesů souběžně se zmenšováním elektrody. Podle očekávání rostla též účinnost a rychlost elektrochemických čistících procesů. Bylo zřejmé, že elektrochemické obnovení elektrody spočívalo zejména v odstranění reverzibilně naadsorbovaných složek roztoku do stupně, který odpovídal použitému režimu elektrochemického čištění. Tak například v případě 2-AA (který vykazoval slabě adsorptivní charakter), byly závislosti ΔI vs. v1/2 získané za elektrochemického obnovování i mechanického obnovování povrchu elektrody co do průběhů vzájemně podobné. Komplikovanějším se ukázalo elektrochemické obnovování mezifází v přítomnosti silně adsorptivních látek. Jejich afinita k povrchu měla za následek, že je nebylo možno zcela odstranit. V případě dithiothreitolu se jednalo o silně povrchově aktivní depolarizátor, vykazující na rtuťové elektrodě až chemisorpci. Průběh ΔI vs. v byl proto v širokém rozsahu rychlosti scanu 0 až 200 mV.s-1 přibližně lineární. Koncentrační závislost proudového signálu I–c vykazovala esovitý nárůst a jeho průběh byl dokonce v oblasti vysokých koncentrací nemonotónní. Bylo tudíž zřejmé, že při aplikaci rychlosti scanu vykazoval celkově adsorpčnědesorpční proces omezenou rychlost a tudíž i značnou irreverzibilitu. Možnosti elektrochemického obnovení povrchu elektrody byly tak rovněž omezeny. Větší šanci na aplikaci elektrochemického obnovování měly i v tomto případě elektrody malých rozměrů, u nichž bylo prokázáno jak urychlení transportních procesů, tak zvýšení proudových hodnot. Za běžných podmínek a při běžné čistotě chemikálií a roztoků se uplatňování elektrochemického obnovování blíží modelovému případu 2-AA. U elektrod, jejichž povrchy podléhají za daných režimů elektrochemického obnovování redox nebo chemickým reakcím, chemisorpci apod., mají i tyto procesy adekvátní vliv na výsledky uplatnění popsaných procedur obnovování. Nicméně zmíněné principy zůstávají i zde zachovány. Závěr Ukázalo se, že i za rozdílů v adsorptivitě přítomných látek a při různorodých procesech probíhajících na elektrodách může být elektrochemické obnovování miniaturizovaných stacionárních elektrod na bázi rtuti úspěšně aplikováno jak pro elektroanalytické účely tak pro studium bioaktivních látek. Mezi výhody jeho aplikace patří práce za podmínek geometricky „ideálně konstantní“ plochy elektrody, minimalizace spotřeby rtuti během opakovaných měření apod.

Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů MSMT LC06035 a VZ 0021627502-UPa a grantu AV ČR KAN400310651-EP, institucionálních výzkumných plánů AV0Z50040507 a AV0Z50040702. Poděkování patří též prof. J. Barkovi za cenné připomínky a pomoc.

94

Literatura 1. Heyrovský J., Kůta J.: Principles of Polarography. ČSAV, Praha 1965. 2. Paleček E., Scheller F., Wang J.: Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics, str. 789. Elsevier, Amsterdam 2005. 3. Paleček E., Jelen F., v knize: Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics (Paleček E., Scheller F., Wang J., ed.), str. 74-174. Elsevier, Amsterdam 2005. 4. Barek J., Fisher J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 5. Tarlov M. J., Steel A. B., v knize: Biomolecular Films. Design, Function, and Applications (J. F. Rusling, ed.), str. 545-608. Marcel Dekker, New York 2003. 6. Novotný L., v knize: Electrochemistry for Environmental Protection (Štulík K., Kalvoda R., ed.), str. 49-87. UNESCO ROSTE, Venice 1996. 7. Ostatná V., Paleček E.: Langmuir 22, 6481 (2006). 8. Vetterl V., Hason S., v knize: Electrochemistry of Nucleic Acids and Proteins. Towards Electrochemical Sensors for Genomics and Proteomics (Paleček E., Scheller F., Wang J., ed.), str. 17-71. Elsevier, Amsterdam 2005. 9. Paleček E., Fojta M.: Talanta 74, 276 (2007). 10. Paleček E., Ostatná V.: Electroanalysis 19, 2383 (2007). 11. Barek J., Fogg A. G., Zima J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 31, 291 (2001). 12. Wang J.: Analytical Electrochemistry. VCH Publishers, New York 1994. 13. Novotný L.: Electroanalysis 2, 287 (1990). 14. Novotný L.: Fresen. J. Anal. Chem. 362, 184 (1998). 15. Novotný L.: Chem. Listy 95, 147 (2001). 16. Novotný L.: Electroanalysis 8, 135 (1996). 17. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rew. Anal. Chem. 32, 141 (2002). 18. Novotný L.: PUV 7103-1997; PV 1-2001; PUV 19501-2007. 19. Novotný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 20. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 14, 1138 (2002). 21. Jelen F., Yosypchuk B., Kouřilová A., Novotný L., Paleček E.: Anal. Chem. 74, 4788 (2002). 22. Novotný L.: Electroanalysis 12, 1240 (2000). 23. Novotný L.: 12th Int. Conf. on Electroanalysis, Prague 16 – 19 June 2008, Book of Abstracts, Chem. Listy 102, str. 122. 24. Novotný L., Polášková P.: 12th Int. Conf. on Electroanalysis, Prague 16 – 19 June 2008, Book of Abstracts, Chem. Listy 102, str. 123. 25. Novotný L.: Kandidátská disertační práce. AV ČR, Praha 1998. 26. Polášková P., Novotný L., Ostatná V., Paleček E.: Electroanalysis 21, 625 (2009).

95

Využití elektrochemických metod ke stanovení celkové antioxidační aktivity Jana Skopalová a, Magdaléna Čevorová a, Jan Hrbáč b a David Milde a a Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, tř. Svobody 8, 771 46 Olomouc, E-mail: [email protected] b Katedra fyzikální chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, tř. Svobody 26, 771 46 Olomouc, Česká republika

Antioxidanty jsou v současné době velmi diskutovaným tématem, a to jak z hlediska jejich biologického účinku, tak z hlediska jejich výskytu v různých potravinách. Antioxidanty hrají důležitou roli při eliminaci negativního působení vysoce reaktivních volných radikálů. Tyto radikály snadno reagují s biologicky významnými molekulami (zejm. s lipidy, bílkovinami, nukleovými kyselinami), mění jejich strukturu a funkci, což může vést k poškození buněk, tkání i orgánů a vzniku závažných chorob. Řada potravin, zejména rostlinného původu, je významným zdrojem antioxidantů (fenolických kyselin, flavonoidů, karotenoidů, vitamínů skupiny C a E, apod.). V potravinách jsou tyto látky zastoupeny v různé míře obvykle ve složitých směsích. Působení jednotlivých složek těchto směsí je komplikované, neboť se mohou vzájemně ovlivňovat, a to jak synergicky, tak inhibičně. Z praktického hlediska je významné určování celkové antioxidační aktivity potravin, tedy jejich úhrnného potenciálu eliminovat volné radikály. V literatuře je popsáno mnoho metod stanovení celkové antioxidační aktivity (total antioxidant activity, TAA). V praxi nejpoužívanější jsou metody spektrální založené na sledování schopnosti vzorku eliminovat syntetické radikály, reaktivní kyslíkové radikály nebo lipidovou peroxidaci 1. Elektrochemické techniky se využívají buď v kombinaci s metodami spektrálními ke generování reaktivních radikálů (např. kation-radikál 2,2'-azino-bis(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonátu, ABTS⋅+) 2, nebo častěji samostatně. Cyklickou voltametrií lze např. sledovat interakce antioxidantů se superoxidovým a hydroperoxylový radikálem generovaným na rtuťové elektrodě 3,4 nebo určovat TAA z hodnot potenciálu a proudu anodických píků snadno oxidovatelných látek přítomných ve vzorcích 5. Celkovou antioxidační aktivitu lze stanovit také coulometrickou titrací elektrochemicky generovaným bromem 6, biamperometricky sledováním poklesu proudu proudové odezvy reverzibilního redoxního páru difenylpikrylhydrazil/difenylpikrylhydrazin (DPPH⋅/DPPH) v přítomnosti antioxidantů 7, průtokovou potenciometrií 8 a HPLC s elektrochemickou detekcí 9. V příspěvku je prezentována aplikace lineární a diferenčně pulzní voltametrie s elektrodou ze skelného uhlíku na stanovení celkové antioxidační aktivity různých druhů piva (obr. 1 a 2). Voltametricky určené hodnoty TAA vzorků piva vztažené na ekvivalentní koncentraci Troloxu (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-karboxylové kyseliny) jsou porovnány s výsledky paralelní analýzy stejných vzorků dvěma nezávislými metodami: standardní spektrofotometrickou metodou 10, při níž se sleduje pokles intenzity absorpčního maxima stabilního volného radikálu 1,1-difenyl-2-(2,4,6-trinitrofenyl)hydrazylu (DPPH) při jeho redukci antioxidanty, a chemiluminiscenční metodou 11 založenou na oxidaci luminolu peroxidem vodíku katalyzovanou křenovou peroxidasou. Emise záření je zprostředkována tvorbou volných radikálů a je inhibována reakcí volných radikálů s antioxidanty přítomnými ve vzorku.

96

Obr. 1: Lineární voltamogramy piva Bernard světlý ležák 30 krát zředěného fosfátovým pufrem pH 7,0 (plná křivka) a Troloxu o koncentracích 5·10-6, 1·10-5, 2·10-5 a 5·10-5 mol/l ve fosfátovém pufru pH 7,0 (tečkované křivky) po odečtu křivky základního elektrolytu. Pracovní elektroda ze skelného uhlíku, rychlost polarizace 100 mV/s.

Obr. 2: Diferenční pulzní voltamogram piva Litovel Dark 10 krát zředěného fosfátovým pufrem pH 7,0 (plná křivka) s přídavkem standardního roztoku Troloxu (0,08 mmol/l, tečkovaná křivka). Tenkou čarou je znázorněna křivka základního elektrolytu (PBS pH 7,0). Pracovní elektroda ze skelného uhlíku, rychlost polarizace 20 mV/s, výška pulsu 50 mV, šířka 80 ms.

97

Poděkování Autoři děkují pivovaru Litovel za poskytnuté vzorky. Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM 6198959216. Literatura 1. Paulová H., Bochořáková H., Táborská E.: Chem. Listy 98, 174 (2004). 2. Iveković D., Milardović S., Roboz M., Grabarić B. S.: Analyst 130, 708 (2005). 3. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Avramchik O.A.: J. Electroanal. Chem. 518, 56 (2002). 4. Korotkova E.I., Karbainov Y.A., Avramchik O.A.: J. Anal. Bioanal. Chem. 375, 465 (2003). 5. Kohen R., Vellaichamy E., Hrbáč J., Gati I., Tirosh O.: Free Rad. Biol. Med. 28, 871 (2000). 6. Ziyatdinova G. K., Budnikov H. C., Pogorel'tzev V. I., Ganeev T. S.: Talanta. 68, 800 (2006). 7. Milardović S., Iveković D., Rumenjak V., Grabarić B. S.: Electroanalysis 17, 1847 (2005). 8. Shpigun L. K., Arharova M. A., Brainina K. Z., Ivanova A. V.: Anal. Chim. Acta 573574, 419 (2006). 9. Nakamura T., Nishi H., Kokusenya Y., Sato T.: Chem. Pharm. Bull. 46, 1388 (1998). 10. Karabín M., Dostálek P., Hofta P.: Chem. Listy 100, 184 (2006). 11. Girotti S., Ferri E., Maccagnani L., Budini R., Bianchi G.: Talanta 56, 407 (2002).

98

The Electrochemistry of Natural Pigments Romana Sokolová a, Ilaria Degano b, Magdaléna Hromadová a, Lubomír Pospíšil a, Jan Fiedler a, Jana Bulíčková a and Miroslav Gál a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Dolejškova 3, 18223 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Department of Chemistry and Industrial Chemistry, University of Pisa, Via Risorgimento 35, 56100 Pisa, Italy

The electrochemical properties of flavonoid compounds (hematoxylin, quercetin) were studied in buffered aqueous and non-aqueous solutions. The role of the preceding protonation/deprotonation on the electron transfer was estimated. The absorption spectra of these compounds, which contain a chromophore, were recorded during their oxidation. The electrochemical techniques were combined with GC-MS analysis in order to identify the degradation products. The mechanism of the formation of degradation products will be discussed.

Hematoxylin

Quercetin

Acknowledgments This research was supported by Grant Agency of the Czech Republic (203/09/1607 and 203/08/1157) and Ministry of Education (COST OC140).

99

Určování kritických micelárních koncentrací cyklickou voltametrií bez elektroaktivní značky Jitka Součková, Jana Skopalová, Jakub Táborský a Michaela Vymětalíková Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého, tř. Svobody 8, 77146 Olomouc, Česká republika, E-mail: [email protected]

Kritická micelární koncentrace surfaktantu (CMC), tj. koncentrace, při níž dochází ve vodném roztoku surfaktantu k formování micel, je jednou z nejvýznamnějších parametrů charakterizujících povrchově aktivní látky. Jak uvádí literatura, k zjišťování tohoto parametru je možné využít velké množství fyzikálně-chemických metod. Kromě běžných metod, jako je měření povrchového napětí 1-4, rozptylu světla 5,6 a dalších spektrálních metod 2,7-9 je možné užít např. kapilární elektroforézu 6 nebo micelární elektrokinetickou chromatografii 7. Nemalý význam při určování cmc mají také elektrochemické metody 10, ze kterých je v praxi nejužívanější vodivostní měření 1,2,6-9,11. Poloha zlomu na titrační konduktometrické křivce odpovídá oblasti CMC. Dalšími metodami jsou polarografie a voltametrie, kde je CMC nejčastěji určována nepřímo z difúzních koeficientů redox-aktivních elektrochemických značek 6,12. CMC je možné určovat také přímo z koncentračních změn potenciálů nebo proudů desorpčních píků měřených AC-polarografií 13. Příspěvek je věnován možnosti využití cyklické voltametrie s HMDE k určení CMC bez přítomnosti elektroaktivní značky. Byly sledovány změny potenciálů kapacitních adsorpčních a desorpčních píků v závislosti na koncentraci roztoku surfaktantu. Na obr. 1 můžeme sledovat vznik zlomu, jehož poloha (obdobně jako u konduktometrické křivky) odpovídá oblasti vzniku micel dané povrchově aktivní látky. V určitých systémech můžeme sledovat kromě potenciálových posunů píků také změny v kapacitních proudech. K určení CMC tedy může být využito i proudových změn. Cílem práce bylo otestovat funkčnost navržené metody. Za modelovou látku byl zvolen dodecylsulfát sodný (SDS) patřící k nejznámějším a nejprostudovanějším anionickým surfaktantům. Kritické micelární koncentrace SDS určené z naměřených dat v různě koncentrovaných fosfátových pufrech o pH 7,0 byly porovnány s výsledky konduktometrického měření provedeného za stejných experimentálních podmínek. Hodnoty CMC zjištěných oběma metodami byly v dobré shodě. Také rychlost a jednoduchost provedení obou metod je srovnatelná. Z těchto důvodů je možné CV s HMDE bez elektrochemicky aktivní značky zařadit mezi metody vhodné k určování CMC povrchově aktivních látek.

100

Obr.1: Závislost potenciálu adsorpčních píků na logaritmu koncentrace roztoku povrchově aktivní látky a určení její CMC. Poděkování Autoři děkují za finanční podporu práce výzkumnému záměru MSM 6198959216. Literatura 1. Umlong I. M., Ismail K.: Colloid Surf. A 299, 1-3 (2007). 2. Das D., Ismail K.: J. Colloid Interface Sci. 327, 1 (2008). 3. Frese Ch., Ruppert S., Sugár M., Schmidt-Lewerkühne H., Wittern K. P., Fainerman V. B., Eggers R., Miller R.: J. Colloid Interface Sci. 267, 2 (2003). 4. Li Y., Hao J., Li G.: J. Dispersion Sci. Technol. 27, 6 (2006). 5. Kodama M., Kubota Y., Miura M.: Bull. Chem. Soc. Jpn. 45, 9 (1972). 6. Tesařová E., Tuzar Z., Nesměrák K., Bosáková Z., Gaš B.: Talanta 54, 4 (2001). 7. Fuguet E., Ràfols C., Rosés M., Bosch E.: Anal. Chim. Acta 548, 1-2 (2005). 8. Briz J. I., Velázquez M. M.: J. Colloid Interface Sci. 247, 2 (2002). 9. Müllerová M., Šváb M., dos Snatos M. M.: Chem. Listy 101, 6 (2007). 10. Nesměrák K., Němcová I.: Anal. Lett. 39, 6 (2006). 11. Miura M., Kodama M.: Bull. Chem. Soc. Jpn. 42, 2 (1972). 12. Mandal A. B., Nair B. U.: J. Phys. Chem. 95, 22 (1991). 13. Shinozuka N., Hayano S.: Solution Chemistry of Surfactants (Mittal K. L., ed.), Vol. 2, Plenum Press, New York 1979.

101

Možnosti stříbrné pevné amalgámové elektrody při analýze a stanovení fytochelatinů Renáta Šelešovská a, Lenka Bandžuchová a, Jaromíra Chýlková a a Miloslava Fojtová b a Ústav environmentálního a chemického inženýrství, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, Doubravice 41, 533 53 Pardubice, [email protected] b Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, 611 37 Brno Úvod Stříbrná pevná amalgámová elektroda (AgSAE) představuje velmi dobrou alternativu ke rtuťovým elektrodám; kombinuje výhody rtuťových a pevných elektrod. V literatuře byly popsány různé modifikace AgSAE 1-3, zahrnující rtuťovým meniskem modifikovanou (mAgSAE), rtuťovým filmem modifikovanou (MF-AgSAE) a leštěnou (p-AgSAE) stříbrnou pevnou amalgámovou elektrodu. Příprava AgSAE je velice jednoduchá a byla podrobně popsána v literatuře 2,4.

Jak je zřejmé z publikovaných prací 4,5, amalgámové elektrody ve spojení s voltametrickými metodami mohou najít uplatnění při stanovení kontaminantů životního prostředí, tzn. při monitorování a ochraně životního prostředí. Významnou oblastí jejích uplatnění může být také sledování změn v genetickém materiálu vyvolaných genotoxickými látkami 6. Vedle nukleových kyselin mohou jako biomarkery znečištění prostředí sloužit i jiné biomolekuly. Například vystavení živých organismů působení těžkých kovů, které představují jeden z hlavních problémů životního prostředí, vyvolá syntézu peptidů nebo malých proteinů bohatých na cystein, které se nazývají metalothioneiny (MT, živočišné) nebo fytochelatiny (PC, rostlinné) 7-9. PC jsou tedy rostlinné peptidy hrající klíčovou úlohu v mechanismech ochrany rostlinných buněk před toxickými účinky těžkých kovů. Jejich obecný vzorec je (γ-Glu-Cys)n-Gly, kde Glu je kyselina glutamová, Cys cystein a Gly glycin, n může nabývat hodnot 2-11 7. Vzhledem k tomu, že je jejich syntéza in vivo v přítomnosti těžkých kovů indukována, jsou považovány za biomarkery znečištění životního prostředí těžkými kovy a jejich toxicity u rostlin. Fytochelatiny vážou kovy do komplexů prostřednictvím koordinační vazby mezi ionty kovu a thiolovou skupinou cysteinu obsaženého v molekule peptidu a tím potlačují jejich toxické působení během transportu přes cytoplasmu do vakuol 10-12. Pro analýzu cysteinu a peptidů obsahujících cystein byla navržena a v literatuře popsána řada elektrochemických metod a postupů. Pomocí voltametrických nebo potenciometrických metod byl např. studován vznik komplexů kovových iontů s cysteinem 13,5, metalothioneiny 14-17 i fytochelatiny 18,19, případně jejich stanovení. Specifickým přístupem v analýze peptidů a proteinů obsahujících cystein (cystin) je tzv. Brdičkova reakce 20, která zahrnuje několik elektrodových dějů probíhajících na rtuťové elektrodě v přítomnosti iontů kobaltu, včetně katalýzy vylučování vodíku. Tyto děje se projevují charakteristickými signály využitelnými nejen pro stanovení peptidů obsahujících cystein 21,22, ale i pro jejich vzájemné odlišení 23. V této práci byly měřeny signály cysteinu, glutathionu a syntetických i přírodních fytochelatinů v přítomnosti kobaltnatých iontů na stříbrné pevné amalgámové elektrodě ve srovnání s elektrodou rtuťovou. Materiály a metody Všechny chemikálie použité pro přípravu základního elektrolytu a standardních roztoků byly čistoty p.a. Amoniakální pufr o pH 9,5 byl připraven smícháním 1M chloridu amonného s roztokem amoniaku (Lachema, Brno). Standardní roztok kobaltnatých iontů byl připraven rozpuštěním Co(NO3)2.6H2O (Sigma-Aldrich). Cystein a glutathion byly zakoupeny také od firmy Sigma-Aldrich a vzorky syntetických fytochelatinů PC2 a PC3 byly dodány firmou

102

Vidia s.r.o. (Jesenice u Prahy). Vzorky fytochelatinů z rostlinných buňek byly získány z rostlinné suspenzní kultury Nicotina tabacum BY-2 kultivované v přítomnosti 50μM CdSO4. Pro měření voltametrických signálů cysteinu, glutathionu a PC na HMDE a p-AgSAE byla použita diferenční pulzní voltametrie (DPV) se šířkou pulzu 80 ms a výškou pulzu -50 mV. Jako referentní elektroda sloužila nasycená argentchloridová elektroda a pomocná byla platinová elektroda. Počáteční potenciál byl -100 mV a konečný -1500 mV pro elektrody se rtuťovým povrchem a -1350 mV pro p-AgSAE. Potenciál akumulace byl -100 mV, doba akumulace 2 s a rychlost polarizace 20 mV s-1. Jako základní elektrolyt byl použit 0,1M amoniakální pufr o pH 9,5, který obsahoval 0,001 mol L-1 Co2+. Při běžném užívání byla stříbrná pevná amalgámová elektroda přibližně jednou týdně vyleštěna. Vždy na začátku pracovního dne, stejně jako po přestávce v měření delší než 1 hodina, byla prováděna elektrochemická aktivace povrchu elektrody. Aktivace probíhala v roztoku 0,2 M chloridu draselného při potenciálu –2200 mV po dobu 5 minut za neustálého míchání roztoku. Regenerace elektrodového povrchu byla zapracována přímo do návrhu jednotlivých použitých měřicích metod v programu Polar 5.1 a jednalo se o zařazení 30 elektrochemických skoků mezi potenciály -100 a -1500 mV. Regenerace probíhala přímo v základním elektrolytu. Výsledky a diskuse Na úvod této práce byly ověřeny výsledky 22 dosažené při stanovení cysteinu a glutathionu na p-AgSAE ve srovnání s HMDE. Bylo potvrzeno, že cystein dává na obou elektrodách jeden pík v oblasti očekávané Brdičkovy reakce. Zatímco na rtuťové elektrodě leží pík B kolem potenciálu -1300 mV, na leštěné amalgámové elektrodě je sledovaný pík (BP) posunut k pozitivnějším popteciálům, což svědčí o slabší adsorpci cysteinu na povrchu elektrody, jenž neobsahuje kapalnou rtuť. Reprodukovatelnost opakovaného měření RSDM (n = 11) (pro koncentraci 5.10-7 M) vychází na obou elektrodách menší než 1 % a reprodukovatelnost opakovaného stanovení RSDS (n = 5) cysteinu ve vzorcích připravených ze standardů o koncentraci 1.10-7 M je pro obě elektrody pod 4 %. Tyto i další statistické parametry pro stanovení cysteinu na obou elektrodách jsou shrnuty v Tabulce I. Detekční limity vypočtené pro obě elektrody jsou téměř shodné, ale vzhledem k menšímu povrchu amalgámové elektrody je možné ji prohlásit za citlivější nástroj pro stanovení cysteinu s využitím Brdičkovy reakce.

Tabulka I. Statistické parametry pro stanovení cysteinu a glutathionu na p-AgSAE a HMDE Parametr cystein glutathion p-AgSAE HMDE p-AgSAE HMDE (B2) RSDM (n = 11), % 0,48 0,48 2,29 1,10 RSDS (n = 5), % 2,12 3,24 1,31 7,60 4,8.10-9 6,8.10-9 5,4.10-9 3,7.10-6 Kritická úroveň*, mol L-1 9,5.10-9 1,3.10-8 1,0.10-8 6,9.10-6 Limita detekce*, mol L-1 * -1 -8 -8 -8 2,0.10 3,9.10 4,4.10 1,8.10-5 Mez stanovitelnosti , mol L * Parametry vypočteny programem ADSTAT 24. Voltametrické křivky získané při měření glutathionu na testovaných elektrodách se výrazně liší (viz Obr. 1). Zatímco na p-AgSAE byl v oblasti Brdičkovy reakce naměřen opět pouze jeden pík BP při stejném potenciálu jako při měření cysteinu, na HMDE byly zaznamenány 2 píky B1 při potenciálu -1270 mV, což je hodnota velmi blízká potenciálu píku B pro cystein, 103

a pík B2 kolem potenciálu 1050 mV. Dále je na HMDE pozorován ještě pík při potenciálu 720 mV před píkem kobaltu. Statistické parametry vypočtené pro obě elektrody jsou rovněž uvedeny v Tabulce I. Pro amalgámovou elektrodu byly opět získány velice dobré parametry včetně detekčního limitu pro stanovení glutathionu 1.10-8 M. Pík B1 na HMDE vykazuje špatnou reprodukovatelnost a pík předcházející píku redukce Co2+ neroste s koncentrací. Proto je ke stanovení glutathionu na HMDE použitelný pouze pík B2, přestože reprodukovatelnost opakovaného stanovení je výrazně horší než pro p-AgSAE, a také citlivost stanovení je nižší o více než dva řády (viz Tabulka I). p-AgSAE

-1200

Co

-1000

Co

I [nA]

-800

-600

-400

B1

BP

HMDE

B2

-200

0 -600

-700

-800

-900

-1000

-1100

-1200

-1300

-1400

-1500

E [mV]

Obr. 1: Porovnání voltametrických křivek glutathionu získaných na p-AgSAE a HMDE. Metoda – DPV, elektrolyt – 0,1M amoniakální pufr (pH 9,5) s přídavkem 0,001M Co2+, Ein = Eacc -100 mV, Efin -1500 mV, tacc 2 s a v 20 mV s-1. 1 – p-AgSAE (cglu = 1.10-6 M), 2 – HMDE (cglu = 2.10-5 M). Tabulka II. Statistické parametry pro stanovení PC2 a PC3 na p-AgSAE a HMDE Parametr PC2 PC3 p-AgSAE HMDE (B2) p-AgSAE HMDE (B2) RSDM (n = 11), % 1,53 1,69 0,93 1,85 RSDS (n = 5), % 1,25 0,63 0,84 2,13 7,5.10-9 1,1.10-7 5,4.10-9 9,7.10-8 Kritická úroveň*, mol L-1 1,4.10-8 2,1.10-7 1,1.10-8 1,6.10-7 Limita detekce*, mol L-1 3,3.10-8 3,4.10-7 3,4.10-8 2,7.10-7 Mez stanovitelnosti*, mol L-1 * Parametry vypočteny programem ADSTAT 24. V další části práce byla pozornost věnována syntetickým fytochelatinům PC2 a PC3. Na pAgSAE byl pro obě látky naměřen opět pouze pík BP při stejném potenciálu. Je zřejmé, že na této elektrodě není možné jednotlivé látky od sebe odlišit. Ukázka koncentrační závislosti pro PC3 na amalgámové elektrodě je uvedena na Obrázku 2. Statistické parametry vypočtené pro oba peptidy jsou shrnuty v Tabulce II. Detekční limit pro oba PC je téměř shodný a z obrázku 3 je zřejmé, že po střídavých přídavcích standardů PC2 a PC3 o stejné koncentraci do roztoku narůstá pík lineárně. Z toho plyne, že p-AgSAE je pro oba peptidy stejně citlivá, a tedy pro

104

kvantifikaci PC v neznámém vzorku je možné použít libovolný standard s relativně dobrou přesností. Na rtuťové elektrodě byly na voltamogramech obou fytochelatinů zaznamenány píky B1, B2 a rovněž pík předcházející redukci kobaltnatých iontů. Od glutathionu se výsledky liší intenzitou jednotlivých signálů a také citlivost stanovení opět s využitím píku B2 je pro PC asi o dva řády lepší než pro glutathion (viz Tab. II). Na HMDE je tedy možné rozlišit cystein, glutathion a PC podle počtu získaných píků, případně jejich intenzity. PC2 a PC3 již ale rozlišit nelze ani na rtuťové elektrodě. Citlivější pro stanovení PC je rovněž amalgámová elektroda. -300

-250

I [nA]

-200

-150

-100

-50 -800

-900

-1000

-1100

-1200

-1300

-1400

E [mV]

Obr. 2: Koncentrační závislost pro syntetický PC3 naměřená na p-AgSAE. Metoda – DPV, elektrolyt – 0,1M amoniakální pufr (pH 9,5) s přídavkem 0,001M Co2+, Ein = Eacc -100 mV, Efin -1350 mV, tacc 2 s a v 20 mV s-1, cPC3 = 5,44.10-8 – 3,8.10-7 M. 80

-300

I = 2.5816c + 0.189 R = 0.9993

I [nA]

60

PC2

40 20

-200

0 10 20 -8 -1 c [10 mol L ]

I [nA]

0

30

-100

PC3 0 -800

-900

-1000

-1100

-1200

-1300

-1400

E [mV]

Obr. 3: Záznam křivek získaných na p-AgSAE po střídavých přídavcích PC2 a PC3. Metoda – DPV, elektrolyt – 0,1M amoniakální pufr (pH 9,5) s přídavkem 0,001M Co2+, Ein = Eacc 100 mV, Efin -1350 mV, tacc 2 s a v 20 mV s-1, přídavky cPC2/PC3 = 5,5.10-8 M. 105

Na závěr byla leštěná stříbrná pevná amalgámová elektroda aplikovaná na analýzu přírodních vzorků fytochelatinů z rostlinné suspenzní kultury Nicotina tabacum BY-2 kultivované v přítomnosti kadmia. Byly analyzovány 2 vzorky lišící se dobou kultivace v prostředí kovu (3 a 5 dní) a ke každému vzorku také kontrola kultivovaná po stejnou dobu bez kadmia. K analýze byly využity zředěné buněčné lyzáty bez jakékoli předchozí separace (pouze normalizované na celkový obsah proteinů). V závislosti na době vystavení buněk kademnatým iontům a na jejich koncentraci bylo pozorováno výrazné zvýšení intenzity katalytického píku BP, jak je zřejmé z Obrázku 4. Pík BP v těchto vzorcích také roste v závislosti na koncentraci. -250

-500

-400

I [nA]

-200

Cd5D Cd5D

-150 -100

I [nA]

-300

B

-50 -1000

-1100

-1200

-1300

E [mV]

-200

Cd3D

-100

K3D

El

K5D A

0 -800

-900

-1000

-1100

-1200

-1300

-1400

E [mV]

Obr. 4: Analýza vzorků PC z rostlinné suspenzní kultury Nicotina tabacum BY-2 kultivované v přítomnosti 50μM Cd2+ s využitím p-AgSAE. Metoda – DPV, elektrolyt – 0,1M amoniakální pufr (pH 9,5) s přídavkem 0,001M Co2+, Ein = Eacc -100 mV, Efin -1350 mV, tacc 2 s a v 20 mV s-1. A – voltamogramy jednotlivých vzorků: El – elektrolyt, K3D – kontrolní vzorek kultivovaný 3 dny, K5D – kontrolní vzorek kultivovaný 5 dní, Cd3D – vzorek kultivovaný v přítomnosti Cd 3 dny, Cd5D – vzorek kultivovaný v přítomnosti Cd 5 dní. B – dva přídavky vzorku Cd3D. Závěr Výsledky této práce ukazují, že p-AgSAE může nejen nahradit HMDE při monitorování obsahu fytochelatinů (jako peptidů bohatých na cystein) v rostlinných buňkách a jejich syntézu indukovanou ionty těžkých kovů, ale dokonce dosahuje výrazně lepší citlivosti pro všechny testované látky. Poděkování Tato práce vznikla s podporou Výzkumného záměru MSM 0021627502 a Výzkumného centra LC06035. Literatura 1. Novotný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy, 1118, 94 (2000). 2. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis, 1733, 14 (2002). 3. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 141, 32 (2002).

106

4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24.

Yosypchuk B.: Disertační práce. Univerzita Pardubice, Pardubice 2003. Šelešovská R.: Disertační práce. Univerzita Pardubice, Pardubice 2004. Fojta M.: Electroanalysis, 1449, 14 (2002). Grill E., Winnacker E. L., Zenk M.H.: Science, 674, 230 (1985). Rauser W. E.: Plant Sci., 171, 51 (1987). Rauser W. E.: Plant Physiol., 1141, 109 (1995). Wojcik M., Tukiendorf A.: Plant Growth Regul., 71, 44 (2004). Wojcik M., Vangronsveld J., Tukiendorf A.: Environ. Exp. Bot., 151, 53 (2005). Clemens S., Simm C.: New Phytologist, 323, 159 (2003). Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis, 1138, 14 (2002). Šestáková I., Miholová D., Slámová A., Mader P., Svakova J.: Electroanalysis, 1057, 6 (1994). Šestáková I., Miholová D., Vodičková H., Mader P.: Electroanalysis, 237, 7 (1995). Šestáková I., Kopanica M., Havran L., Palecek E.: Electroanalysis, 100, 12 (2000). Šestáková I., Mader P.: Cell Mol. Biol., 257, 46 (2000). Scarano G., Morelli E.: Anal. Chim. Acta, 13, 319 (1996). Yosypchuk B., Šestáková I., Novotný L.: Talanta, 1253, 59 (2003). Brdička R.: Collect. Czechoslov. Chem. Commun., 112, 5 (1933). Fojta M., Fojtová M., Havran L., Pivonkova H., Dorcak V., Sestakova I.: Anal. Chim. Acta, 171, 558 (2006). Šelešovská R., Fojta M., Navrátil T.: Anal. Chim. Acta, 344, 582 (2007). Dorčák V., Šestáková I.: Bioelectrochem., 14, 68 (2006). Meloun M., Militký J., Forina M.: Linear Regression Models. Chemometrics for Analytical Chemistry. PC-Aided Regression and Related Methods., Ellis Horwod, Chichester, 1992.

107

Cadmium Transport through Biological Membranes Ivana Šestáková and Tomáš Navrátil J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry, v.v.i., Academy of Sciences of the Czech Republic, Dolejškova 3, 182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected]

Cadmium is a nonessential metal and prevalent environmental pollutant in industrial countries. The main routes of human exposure to cadmium are acute exposure in the working environment (inhalation of dusts and fumes, occasionally oral intake) and acute and chronic exposure of the population through food, air and water. In mammals, including humans, high Cd concentrations can result in bone and kidney damage 1. Uptake of Cd by plants is the main entry pathway into human food chain. Cd accumulation in plants affects water and nutrient uptake and photosynthesis and results in growth inhibition, leaf chlorosis and finally death 2. Generally, the uptake by plants depends on the concentration of Cd in the soil and also other factors – pH, the presence of complexing ligands etc., which are conveniently assessed by means of soil solution analyses. Using anodic stripping voltammetry, plant available portions of Cd were found substantially lower than the total Cd concentration in soil solutions in study, where different plants on three types of soils were included 3. From complexing ligands, low molecular weight organic acids are important as plant exudates in soil solution 4, whereas sulfur containing ligands – phytochelatins – sequester Cd2+ inside the cell vacuole. Voltammetrically determined fytochelatins concentration (Fig. 1) could be correlated with total Cd concentration found in different parts of plant 5.

-4000

List

Stéblo

Kořen

A

-3500

B

C

-3000

I [nA]

-2500 -2000 -1500 -1000 -500 0 -800

-1000

-1200

-1400

E[mV]

-1600

-800 -1800

-1000

-1200

-1400

E[mV]

-1600

-1800 -800

-1000

-1200

-1400

-1600

-1800

E[mV]

Fig. 1. Determination of phytochelatins using Brdička reaction. DC voltammetry on HMDE, acc. 30s -800 mV, v = 250 mV.s-1. Extracts from barley: A – leave, B - stem, C - root. Whereas events and reactions after Cd2+ has crossed the membrane (Fig. 2) were widely studied 6, the question how is Cd2+ transported remain rather complex. There is apparently no specific transporter for this cation. Instead, Cd2+- transport activity has been described for several cation transporters with broad substrate specificity – e.g. IRT1, ZNT1, LTC1 (Fig.3).

108

Fig. 2. Phytochelatins synthesis in response to Cd2+.

Fig. 3. Ions transport across cell membranes (ref. 2). Synthetically prepared transporters or channels present in protoplasts prepared from plant parts are applied to artificially prepared phospholipids membrane in order to study ion transport. For such studies, supported lipid bilayers are promising solution 8. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge financial support by GA AVCR project No. IAA400400806.

109

References 1. Robards K, Worsfold P.: Analyst 116, 549 (1991). 2. Clemens S.:Planta 212, 475 (2001). 3. Jaklová Dytrtová J., Šestáková I., Jakl M., Száková J., Miholová D., Tlustoš P.: Cent. Eur. J. Chem. 6, 71 (2008). 4. Jaklová Dytrtová J., Šestáková I., Jakl M., Navrátil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 5. Čížková P.: Ph.D. Thesis, Czech University of Agriculture, Prague, 2006. 6. Kotrba P., Macek T., Ruml T.: Coll. Czech. Chem. Commun. 64, 1057 (1999). 7. Mae M., Myrberg H., Jiang Y., Paves H., Valkna A., Langel U.: Biochim.Biophys.Acta 1669, 101 (2005). 8. Ide T., Kobayashi T., Hirano M.: Anal. Chem. 80, 7792 (2008).

110

Elektrochemické senzory pro sledování biochemických a technických membránových procesů Barbora Šustrová a,b, Vladimír Mareček a a Karel Štulík a,b a Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Praha 8, Česká republika, E-mail: [email protected] b Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, Hlavova 8, 128 43 Prague 2, Česká republika

Elektrochemické měřící techniky patří k nepostradatelným metodám studia membránových procesů. Výběr nebo vývoj senzoru, vhodného pro sledování studovaného procesu, je často limitujícím krokem použité metody. Zaměřili jsme se na vývoj biosenzoru, jehož principem je komplexační reakce mezi ligandem a sledovaným iontem, kde ligand je kovalentně vázán k povrchu kovové elektrody. Kovalentní vazbou molekul organických látek k povrchu elektrody přes thiolovou funkční skupinu získáme monovrstvu, tzv. self-assembled film. Principem funkce nového senzoru jsou rozdílné parametry ligandem modifikované elektrody před a po vytvoření komplexu s iontem. Vznik komplexu může ovlivnit potenciál elektrody a kapacitu elektrické dvojvrstvy. Dalším parametrem může být rychlost tvorby komplexu, která by měla být závislá na koncentraci iontu. Pro tento účel jsme vybrali makrocyklickou sloučeninu kalix[4]aren, který je na spodním kruhu molekuly substituovaný přes fenolický kyslík thiolovou –SH skupinou. Prvním krokem studia je tvorba membrány na povrchu kovové elektrody, popis elektrochemických vlastností a studium její stability. Ve druhém kroku bychom chtěli substitucí horního kruhu molekuly kalix[4]arenu vhodnou funkční skupinou zvýšit selektivitu senzoru pro vybraný ion, sledovat podmínky vzniku komplexu a ovlivnění tohoto procesu například změnou pH základního elektrolytu nebo inhibitorem. Získaných poznatků využijeme k sestrojení zlaté mikroelektrody pro sledování určitých buněčných membránových procesů. V této etapě jsou elektrochemická měření realizována cyklickou voltametrií (CV) na zlaté diskové elektrodě d = 1 mm na přístroji Electrochemical Workstation, CHI660C (IJ Cambria Scientific, UK). Před každým měřením je elektroda mechanicky očištěna na alumině 1,0 µm a následně 0,05 µm a elektrochemicky očištěna cyklováním v 0,1 M H2SO4. Počet cyklů: 50, potenciálové rozmezí: 1,4 V až -0,4 V, polarizační rychlost: 0,5 V.s-1. V průběhu měření je povrch elektrochemicky aktivován v roztoku 0,1 M NaOH při potenciálu -1,8 V po dobu 5 min. V příspěvku budou prezentovány počáteční získané výsledky popsaného elektrochemického systému. Poděkování Tato práce je finančně podporována Grantovou Agenturou Akademie Věd ČR (IAA 400400806). Literatura 1. Guidelli R., Aloisi G., Becucci L., Dolfi A., Moncelli M.R., Buoninsegni F.T.: J. Electroanal. Chem. 504, 1 (2001). 2. Krysinski P., Monocelli M.R., Tadini-Buoninsegni F.: Electrochimica Acta 45, 1885 (2000). 3. Rifai S., Laferriere M., Qu D., Wayner D.D.M., Wilde C.P., Morin M.: J.

111

Electroanal. Chem. 531, 111 (2002). 4. Hong J., Ham S.: Tetrahedron Letters 49, 2393 (2008). 5. Konovalov A.I., Antipin I.S.: Mendeleev Commun. 18, 229 (2008). 6. Becker A., Tobias H., Porat Z., Mandler D.: J. Electroanal. Chem. 621, 214 (2008). 7. Yagi K., Khoo S.B., Sugawara M., Sakaki T., Shinkai S., Odashima K., Umezawa Y.: J. Electroanal. Chem. 401, 65 (1996). 8. Malel E., Sinha J.K., Zawisza I., Wittstock G., Mandler D.: Electrochimica Acta, 53, 6753 (2008). 9. Sheffer M., Vivier V., Mandler D.: Electrochem. Commun. 9, 2827 (2007). 10. Creavent B.S., Donlon D.F., McGinley J.: Coord. Chem. Rev. 253, 893 (2009).

112

Co nového v elektroanalýze s bismutovými elektrodami aneb Ohlédnutí za děním v oboru v letech 2006-2009 Ivan Švancaraa, Karel Vytřasa a Kurt Kalcherb a Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice Nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice; e-mail: [email protected] b Ústav analytické chemie, Universita Karla Františka ve Štýrském Hradci, A-8020, Graz (Rakousko). Souhrn Od svého objevu na přelomu starého a nového tisíciletí 1,2 se elektrody na bázi bismutu těší neustálé pozornosti a i nyní představují jednu z nejintenzivněji zkoumaných detekčních systémů s nertuťovými elektrodami 3-7. O stále rostoucí popularitě bismutových elektrod svědčí i skutečnost, že z úhrnného množství kolem sto padesáti publikací a několika desítek konferenčních příspěvků připadá skoro polovina na nejnovější období po roce 2007. Nepřehlédnutelné jsou i poslední aktivity, kdy bismutové elektrody, především konfigurace typu filmu nebo disperse kovového prášku, inspirovaly k vývoji a testování dalších příbuzných elektrod a čidel s povlaky či disperzemi z antimonu, olova, gallia nebo kobaltu.

V současnosti elektroanalýza s bismutovými elektrodami zasahuje prakticky do všech oblastí aplikované elektrochemie a k dispozici je již velký výběr metod kvalitativní a kvantitativní analýzy, především v kombinaci s elektrochemickými rozpouštěcími technikami ke stanovení toxických těžkých kovů. Neustále přibývají nové typy bismutových elektrod, senzorů a detektorů, včetně nejrůznějších inovací již existujících konfigurací a konstrukčních řešení. Velké pokroky byly také udělány na poli charakterizace jednotlivých typů elektrod, či způsobů jejich přípravy a užívání. Aktuální stav v oboru, typické trendy, či některé výhledy do budoucna jsou pak předmětem tohoto příspěvku, kde jsou shrnuty klíčové vědecko-výzkumné aktivity na poli bismutových elektrod, s důrazem na dění v posledních třech letech. Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (projekt MSM0021627502 a Výzkumné centrum LC06035). Literatura 1. Hočevar S. B., Ogorevc B., Wang J., in: YISAC '00: 7th Young Investigators’ Seminar on Analytical Chemistry, Book of Abstracts, p. 19, UNI Graz, Graz (2000). 2. Wang J., Lu J.-M., Hočevar S. B., Farias P. A. M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 3. Vytřas K., Švancara I., Metelka R., v: Monitorováni cizorodých látek v životním prostředí, Svazek IV (Vytřas K., Kellner J., Fischer J., ed.), str. 159 - 170. Univerzita Pardubice, Pardubice (2002). 4. Economou A.: Trends Anal. Chem. 24, 334 (2005). 5. Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005). 6. Švancara I., Vytřas K.: Chem. Listy 100, 90 (2006). 7. Kokkinos C., Economou A.: Curr. Anal. Chem. 4, 183 (2008).

113

Elektrochemická a spektrální studie krátkých oligonukleotidů Libuše Trnková a, Radka Mikelová a, František Jelen b, Iva Kejnovská b a Michaela Vorličková b a Ústav chemie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kamenice 5, 625 00 Brno, Česká republika, e-mail: [email protected] b Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Úvod V poslední době je elektrochemický výzkum DNA, oligodeoxynukleotidů (ODNs) a jejich složek podporován a současně doplňován dalšími neelektrochemickými metodami 1,2, jednak kvůli lepší možnosti interpretace elektrochemických dat a jednak kvůli zkoumání vlivu nabitého fázového rozhraní na jejich strukturu a funkci. Nedílnou součástí tohoto přístupu je verifikace myšlenek, které během obou studií vznikají a které jsou velmi užitečné pro výzkum a vývoj DNA senzorů. Náš příspěvek je jedním z příkladů, jaké významné poznatky na jedné straně a jaká úskalí na straně druhé skýtá komparativní studie krátkých syntetických ODN pomocí voltametrie, spekter cirkulárního dichroismu a gelové elektroforézy. Ke sledování redukčních signálů adeninů a cytosinů v ODN řetězci byla použita lineární sweep voltametrie (LSV) v adsorptivním stripping módu a pro rozšířenou evaluaci dat eliminační voltametrie (Elimination Voltammetry with Linear Scan – EVLS). Již v předešlých publikacích je diskutována separace redukčních signálů adeninu (A) a cytosinu (C) v závislosti na různých experimentálních podmínkách, jako je pH, teplota, rychlost polarizace elektrody a hlavně sekvence bází. Z posledních našich výsledků vyplývá, že eliminační procedura je vhodným a doplňkovým nástrojem pro studium strukturních změn ODNs v roztoku a na povrchu elektrody.

O eliminační voltametrii (EVLS) se poprvé psalo před více než 12 lety 3,4. Eliminační princip, některé složky proudu eliminující a jiné zachovávající, spočívá v matematické úpravě celkových voltametrických proudů měřených při různých rychlostech polarizace. Tato úprava resultuje do tzv. eliminační funkce vyjádřené jako lineární kombinace naměřených voltametrických proudů. Pomocí eliminační funkce E4 (eliminace kinetického a kapacitního proudu se zachováním proudu difúzního) EVLS poskytuje pro ireverzibilní děj zcela adsorbované elektroaktivní částice velmi citlivý a analyticky významný signál 5-8. Na základě tohoto zjištění vznikla užitečná kombinace EVLS s adsorptivní rozpouštěcí technikou (Adsorptive stripping - AdS), která byla schopna separovat potenciálově blízké procesy, jejichž voltametrické signály se překrývají 9-15. Doposud se diskutovalo o tom, že AdS EVLS společné redukční signály adeninu (A) a cytosinu (C) v ODNs na rtuťových elektrodách separuje a to jak ve směsi homo-ODNs, tak v jednotlivých hetero –ODNs, včetně hairpinů 9-13. Cílem této práce je za asistence CD spekter a gelové elektroforézy diskuse nad detekcí různých struktur ODN u elektrody ve spojení s jejich možnými strukturními změnami. Materiál a metody Homo- a hetero-deoxyoligonukleotidy (ODN): 5´-CCC CCC CCC- 3´ (dC9), 5´-AAA AAA AAA- 3´ (dA9), 5´- CCC AAA CCC - 3´ (H3), 5´- CAC CAC CAC - 3´ (H4), a 5´- ACC CAC CCA - 3´ (H9) byly syntetizovány firmou Thermo Fischer Scientific (Ulm, Germany). Lyofilizovaný vzorek ODN byl rozpuštěn (podle návodu dodaného výrobcem) v třikrát destilované vodě (z křemenné aparatury) a jejich koncentrace v roztoku byla stanovena pomocí UV/Vis spektrometru (UV 4, Spectronic Unicam, Cambridge, Velká Británie). pH elektrolytů bylo měřeno přístrojem pH-metrem CyberScan PC 5500 (Eutech Instruments, Nijkerk, Netherlands) pomocí elektrody Single pore glass. Pro experiment bylo vždy odebráno příslušné alikvotní množství ODN, zbytek byl uchováván při teplotě 4°C. Výsledná koncentrace ODN, pokud není uvedeno jinak, je 2μM (vztaženo na fosfor). Jako elektrolyt byl

114

použit fosfát-acetátový pufr o různém pH (0,08M kyseliny fosforečné, 0,08M kyseliny octové). pH bylo upraveno 0,4M hydroxidem sodným. Použité chemikálie (Sigma Aldrich Chemical Corp. USA) byly čistoty ACS. Tepelná denaturace byla prováděna při pH 8 a pro úpravu pH byl použit Britton-Robinson pufr. pH bylo upravováno 0,1 M a 0,02 M HCl a pak elektrochemický i spektrální experiment byl prováděn při teplotě 8 nebo 25°C. Voltametrická měření (Linear sweep voltammetry – LSV) byla prováděna na elektrochemickém analyzátoru (AUTOLAB 20 firmy EcoChemie, Utrecht, Holandsko) ve spojení se zařízením pro rtuťovou visící kapkovou elektrodu (VA-Stand 663 firmy Metrohm, Švýcarsko). Tříelektrodový systém byl tvořen rtuťovou pracovní elektrodou, Ag/AgCl/3M KCl referenční elektrodou a pomocnou platinovou elektrodou. Potenciálové okno odpovídalo rozsahu E od –1.0 V do –1.75 V. Adsorpce ODNs byla prováděna při potenciálu –0.1 V při různých akumulačních časech (0-120s) za stálého míchání s konstantní rychlostí (1500 rpm). Roztoky byly zbaveny kyslíku probubláváním argonem (99,999vol.%) před prvním měřením 10 minut. Všechny voltametrické křivky byly zaznamenávány se stejným potenciálovým krokem 2 mV při všech rychlostech polarizace (25, 50, 100, 200 a 400 mV/s). Získané voltametrické křivky byly upraveny pomocí filtru (Savitzky&Golay, úroveň 2 nebo 3), který je součástí GPES (General Purpose Electrochemical System) softwaru 4.9 (EcoChemie). Výpočty EVLS byly provedeny v Excelu (Microsoft, USA). Pro měření cirkulárního dichroismu (CD spektra) byly ODN připraveny stejným způsobem jako u LSV. CD spektra ODN byla měřena na Jobin Yvon Mark VI dichrographu (I.S.A., Francie) a byla v rozmezí 210 až 330 nm zaznamenána jako závislost Δε [M-1cm-1] na vlnové délce. Byly použity křemenné kyvety Hellma o optické dráze 1 cm. Polyakrylamidová gelová elektroforéza (16%) byla provedena na temperované aparatuře SE – 600 (Hoefer, San Francisco, CA, USA). Vzorky ODN dA9, dC9, H3, H4 a H9 (stejné jako u LSV); 2 μg vzorku byly naředěny 1mM fosfátem sodným s 0,3 mM EDTA, pH 8, poté byly tepelně denaturovány 3´/90°C. Iontová síla byla upravována pomocí 10x koncentrovaného RB pufru, požadovaného pH. Ke vzorkům se přidává barvivo oranž G pro sledování migrace vzorků rozpuštěné v 50% glycerolu, který slouží jako zatěžkávací roztok. Jako vodící elektrolyt byl použit Robinson-Britton pufr o požadovaném pH. Výsledný elektroforegram byl barven komerčně dodávaným barvivem Stains All (Sigma Aldrich Chemical Corp. USA). Snímání obarvených gelů bylo prováděno na densitometru Personal Densitometer SI, 375 A (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Výsledky a diskuse Naše práce se zabývala jak elektrochemickou, tak i spektroskopickou (CD) a elektroforetickou analýzou DNA fragmentů tvořených A a C s různou sekvencí. Navazuje na předchozí studii nonamerů pomocí adsorptivní techniky (AdS) a eliminační voltametrie (EVLS), díky které se v závislosti na experimentálních podmínkách (pH, teplota, rychlost polarizace) podařilo rozlišit redukční signály A a C. Jednalo se o homo- (dA9 a dC9) a hetero-ODNs se stejným poměrem A/C a s rozdílnou sekvencí bází.

Na visící rtuťové elektrodě (HMDE) byly ODNs po dobu 0 - 120s a při potenciálu – 0,1 V adsorbovány a měřeny jejich redukční odezvy při různých rychlostech polarizace. Získané LSV křivky byly podrobeny eliminační proceduře E4. Pro násobky rychlostí polarizace 2 (rychlost polarizace 1 2ν , ν a 2ν , kde ν je referenční rychlost) má eliminační

115

funkce f ( I ) , která současně eliminuje nabíjecí a kinetický proud (Ic, Ik), ale zachovává proud difúzní (Id ) tvar: f ( I ) = − 11.657 I 1 2 + 17.485 I − 5.8284 I 2 , kde I je referenční proud měřený při referenční rychlosti polarizace, I1/2 a I2 jsou celkové proudy měřené při poloviční a dvojnásobné polarizační rychlosti. Pro zcela adsorbovanou elektroaktivní částici tato funkce poskytuje dobře čitelný EVLS signál, tj. pík (peak I p ), který přechází v ostrý

protipík (counterpeak I cp ), a vytváří tak charakteristický pík-protipík (peak-counterpeak, I p + I cp ). Teoretická hodnota poměru I p ( I p + I cp ) , kde I p a I cp reprezentují výšky píku a protipíku, je 0.4097. Bylo zjištěno, že vyšší experimentálně zjištěná hodnota tohoto poměru ve srovnání s hodnotou teoretickou indikuje přítomnost předřazené chemické reakce prvního řádu 16. Jako příklad jsou uvedeny výsledky EVLS E4 pro ODN H3 (pH 6.3, teplota 25 oC), kdy jsou indikovány dva redukční procesy, potenciálově odpovídající procesům redukce adeninů a cytosinů. Odečtené poměry obou procesů, pohybující se v závislosti na pH, rychlosti polarizace a teplotě v rozmezí mezi 0.59 - 0.67, potvrzují přítomnost reakce (Obr. 1).

2.00

I (uA) f(I)

1.50

EVLS E4

1.00 0.50 0.00 -1600 -0.50 -1.00

E (mV) -1500

-1400

-1300

-1200

LSV

-1.50 -2.00 -2.50 -3.00 Obr. 1. Voltamogramy ODN H3 (CCCAAACCC). LSV a EVLS křivky (referenční rychlost polarizace: ¿ 100mV/s; { 200 mV/s a ‹ 400 mV/s), pH 6,3 a teplota 25 oC. Otázkou zůstává, zda této reakci odpovídá protonizace (relativně velmi rychlá reakce), změna struktury adsorbovaného ODN, resp. jiná změna ODN vyvolaná nabitým fázovým rozhraním. Kvůli odpovědi na tuto otázku jsme hledali další možnosti v neelektrochemickém experimentu a podařilo se nalézt určité sekvenčně dependentní závislosti. CD spektra spolu s gelovou elektroforézou odhalila, že elektrochemické chování ODNs je výsledkem tvorby interkalovaného sekvenčně podmíněného cytosinového kvadruplexu.

116

Závěr Spojení elektrochemického, CD spektroskopického a elektroforetického studia krátkých fragmentů DNA se ukazuje jako vhodný nástroj ke sledování strukturních změn oligonukleotidů v závislosti na pH, teplotě, rychlosti polarizace a na jejich denaturaci. Ukazuje se, že významnou roli v těchto závislostech hraje i nabité fázové rozhraní představované povrchem elektrody a elektrolytem. Pro důkladnější pochopení této role je vhodné na voltametrická data každého ODN aplikovat EVLS.

Poděkování Řešení projektu bylo realizováno s podporou projektů MSM 0021622412 (INCHEMBIOL) a LC06035 (BIO-ANAL-CHEM) od MŠMT České republiky. Poděkování patří i paní Ireně Postbieglové za pomoc při přípravě roztoků ODN i při některých elektrochemických experimentech. Literatura 1. Kypr, J., Kejnovská, I., Renčiuk, D., Vorlíčková, M.: Nucleic Acids Res., 37, 1713 (2009). 2. Zemánek, M., Kypr, J., Vorlíčková, M.: Int. J. Biol. Macromol., 36, 23 (2005). 3. Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 4. Trnková L., Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996). 5. Trnková L., Kizek R., Dračka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 6. Trnková L.: Chemické Listy 95, 518 (2001). 7. Trnková L., Kizek R., Dračka O.: Bioelectrochemistry 55, 131 (2002). 8. Trnková L.: Talanta 56, 887 (2002). 9. Trnková L., Jelen, F., Postbieglová, I.: Electroanalysis 15, 1529 (2003). 10. Trnková L., Postbieglová, I., Holík, M.: Bioelectrochemistry 63, 25 (2004). 11. Trnková L., Jelen F., Petrlova J., Adam V., Potesil D., Kizek R.: Sensors, 5, 448 (2005). 12. Trnková L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 13. Trnková L., Jelen F., Postbieglová I.: Electroanalysis 18 (2006) 662. 14. Trnkova L.: Utilizing of Bio-electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research (Eds.: V. Adam, R. Kizek), Research Signpost, Kerala, India, 2007, pp. 51-74. 15. Mikelová R., Trnková L., Jelen F.: Electroanalysis 19, 1807(2007). 16. Trnková L., Dračka O.: The 59th Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, Seville, Spain, September 7-12, 2008, CD of Abstracts, Lecture: Elimination Voltammetry of an Irreversible Electrode Process with the Preceding Chemical Reaction for a Totally Adsorbed Electroactive Substance.

117

Metody snižování detekčního limitu v kapilární elektroforéze při použití neselektivních detektorů Petr Tůma a Eva Samcová Ústav biochemie, molekulární a buněčné biologie, 3. lékařská fakulta, Universita Karlova v Praze, Ruská 87, 100 00 Praha 10, E-mail: [email protected] Úvod Kapilární elektroforéza (CE) se vyznačuje vysokou separační účinností, krátkou dobou separace, malou spotřebou vzorku a separačního pufru a malými nároky na úpravu vzorku. Z těchto důvodů je CE v současné době stále častěji využívána při analýze klinických a biologických vzorků 1,2. Jedním z největších nedostatků CE je její malá koncentrační citlivost, která se v kombinaci s fotometrickou detekcí v UV oblasti spektra nebo vodivostní detekcí pohybuje v rozmezí 10-6 – 10-5 mol.L-1 (LOD). Tento příspěvek je zaměřen na využití on-line technik, kterými lze jednoduše zvýšit citlivost CE a dosáhnout submikromolárních detekčních limitů. Přednosti těchto technik jsou dokumentovány při stanovení aminokyseliny glycinu v mikrodialyzátu centrálního nervového systému potkanů 3 a stanovení kyseliny močové v alantoické tekutině kuřecích embryí 4. Materiál a metody Veškerá elektroforetická měření byla provedena na přístroji HP3DCE system (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) se sériově zabudovaným bezkontaktně vodivostním detektorem a diod-array detektorem. Bezkontaktní vodivostní detektor je tvořen 2 mm tubulárními elektrodami oddělenými 1 mm mezerou; operuje se střídavým sinusovým signálem o frekvenci 1,25 MHz a amplitudou 50 V 5. CE separace byly provedeny v nepokrytých křemenných kapilárách (vnitřní průměr 75 μm, vnější průměr 363 μm, Composite Metal Services, UK). Podrobné experimentální podmínky jsou uvedeny u popisků jednotlivých obrázků. Všechny použité chemikálie dosahovaly analytického stupně čistoty a pro přípravu základních elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla použita deionizovaná voda (Millipore, Bedford, USA). Výsledky a diskuse a) Stanovení glycinu v mikrodialyzátu centrálního nervového systému Pro stanovení nízkých koncentrací inhibičního neurotransmiteru glycinu v mikrodialyzátu nervové tkáně bylo použito zvýšené dávkování vzorku do kapiláry. 75 % přídavek acetonitrilu k mikrodialyzátu potlačí elektrickou vodivost vzorku a umožní zvýšit délku nadávkované zóny do kapiláry z 1 % (doporučované dávkování) až na 20 % z celkové délky kapiláry. Zóna vzorku se po přídavku acetonitrilu zaostřuje a vzrůstající délka nadávkované zóny neovlivní účinnost separace. Za těchto podmínek lze dosáhnout LOD 0,2 μmol.L-1. Přednost uvedené techniky lze jednoznačně dokumentovat při analýze modelové směsi glycinu a alaninu o nízké koncentraci 4 μmol.L-1, viz obr. 1. Je-li tento vzorek dávkován do kapiláry přímo bez jakékoliv úpravy s délkou nadávkované zóny 1 % z délky kapiláry je poměr signál/šum pro glycin 3,3, což je na úrovni LOD této metody. Je-li tentýž vzorek nejprve zředěn acetonitrilem v poměru 1:3 a dávkované množství zvýšeno na 20 % z délky kapiláry, je poměr signál/šum pro glycin 24. Tímto způsobem lze v CE i při použití univerzální vodivostní detekce stanovovat mikromolární i submikromolární hladiny aminokyselin v tělních tekutinách.

118

Obr. 1. CE analýza modelové směsi glycinu a alaninu o koncentraci 4 μmol.L-1. A – přímá analýza vzorku s nízkým dávkováním 50 mbar po dobu 3 s (cca 1 % z délky kapiláry); B – vzorek zředěn acetonitrilem v poměru 1:3, vysoké dávkování tlakem 50 mbar po dobu 60 s (cca 20 % z délky kapiláry). Experimentální podmínky: separační pufr – 1,7 mol.L-1 kyselina octová + 2 % polyethylenglykol 8.000 Da (pH 2,1); nepokrytá křemenná kapilára – celková délka 43 cm, 30 cm k detektoru, vnitřní průměr 75 μm; separační napětí +20 kV; bezkontaktní vodivostní detekce; identifikace píků: 1 – glycin, 2 – alanin. b) CE stanovení kyseliny močové v alantoické tekutině s dávkováním z krátkého konce kapiláry Další on-line technikou zvýšení citlivosti v CE je zkrácení separační dráhy. Krátkou separační dráhu o délce cca 8 cm lze dosáhnout na komerčních přístrojích CE, když je vzorek dávkován do kapiláry z jejího krátkého konce (detekční konec kapiláry) 6. V této studii bylo CE stanovení kyseliny močové provedeno: a) standardním dávkováním vzorku z dlouhého konce kapiláry (délka separační dráhy je 72 cm) a b) dávkováním z krátkého konce kapiláry (délka separační dráhy je 8 cm), viz Obr. 2. Z porovnání separačních parametrů pro oba typy dávkování (viz Tabulka I) jednoznačně vyplývá výrazné zkrácení migračního času v krátké kapiláře z cca 520 s na pouhých 52 s; šířka píku se při dávkování z krátkého konce 3x sníží, ale též klesne účinnost separačního procesu přibližně 10x. Trojnásobně se sníží LOD až na 0,8 μmol.L-1. Krátkou separační dráhu lze s úspěchem použít pro velmi rychlé separace jednoduchých směsí látek a zároveň dosáhnou LOD na submikromolární úrovni. Tabulka I Porovnání separačních a detekčních parametrů při dávkování z krátkého a dlouhého konce kapiláry. Typ dávkování Parametr a Krátký konec Dlouhý konec Migrační čas tm, s 52,4 ± 0,2 523,2 ± 2,1 Šířka píku v polovině výšky w1/2, s 0,7 ± 0,0 2,1 ± 0,0 b 33 300 ± 900 338 800 ± 6 100 Počet teoretických pater N 391 800 ± 10 600 473 800 ± 8 500 Počet teoretických pater N, m-1 -1 0,8 2,5 LOD, μmol.L a -1 Všechny parametry byly určeny pro koncentraci kyseliny močové 10 mg.L .

119

b

Počet teoretických pater byl vypočten ze vztahu N = 5,54 (tm/w1/2)2

Obr. 2. CE stanovení kyseliny močové v alantoické tekutině kuřecích zárodků s dávkováním z krátkého (A) a dlouhého (B) konce kapiláry. Experimentální podmínky: separační pufr: 60 mM MES + 30 mM Tris + 0,001% (w/V) polybren (pH 6,1); nepokrytá křemenná kapilára – délka k detektoru 8 cm (A) a 72 cm (B); celková délka 80 cm, vnitřní průměr 75 μm ; separační napětí -30 kV; hydrodynamické dávkování: 20 mbar po dobu 10 s; UV detekce při 292 nm; identifikace píků: 1 – kyselina p-aminosalicylová, 2 – kyselina močová. Závěr Pomocí jednoduchých technik prováděných on-line na separační kapiláře lze významně zvýšit citlivost CE a dosáhnout LOD cca 10-7 mol.L-1 v kombinaci s neselektivní vodivostní a UV detekcí. Je to jeden z dalších kroků, který zvyšuje konkurenceschopnost CE v porovnání s kapalinovou chromatografií a zároveň významně rozšiřuje aplikační možnosti CE při praktických analýzách vzorků biologického původu. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekt 203/07/0896) a Grantové agentury Akademie věd České republiky (grant IAA 400400704). Literatura 1. Jabeen R., Payne D., Wiktorowicz J., Mohammad A., Petersen J.: Electrophoresis 27, 2413 (2006). 2. Shihabi Z. K., Friedberg M. A.: Electrophoresis 18, 1724 (1997). 3. Maione S., Marabese I., Sca Rossi F., Berrino L., Palazzo E., Trabace L., Rossi F.: Neuroscience 97, 311 (2000). 4. Matějčková J., Tůma P., Samcová E., Zemanová Z.: J. Sep. Sci. 30, 1947 (2007). 5. Gaš B., Zuska J., Coufal P., van de Goor T., Electrophoresis 23, 3520 (2002). 6. Tůma P., Samcová E.: Chem. Listy, v tisku.

120

Monitoring DNA modification by cisplatin using catalytic hydrogen evolution at mercury-based electrodes

Pavlína Vidláková a, Petra Horáková a,b, Lucie Těsnohlídková a,c, Luděk Havran a a Miroslav Fojta a 1 Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Královopolská 135, CZ-612 65 Brno, Czech Republic 2 Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Nám. Čs. Legií 565, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic 3 Česko-anglické gymnázium, Třebízského 1010, CZ-370 05 České Budějovice 6, Czech Republic e-mail: [email protected] Electroanalytical methods are powerful tools for studying structure, interactions and damage of nucleic acids 1. Since the second half of fiftieth it has been known that DNA is electroactive 2. At mercury electrodes, adenine and cytosine in DNA produce a cathodic peak CA (due to its reduction). Guanine gives anodic signal G, which is obtained in cyclic voltammetry (CV) or in anodic stripping modes (due to oxidation of reduction product of guanine that is reduced at very negative potentials). At carbon electrodes guanine and adenine in NAs undergo oxidation at positive potentials and produce oxidation signals Aox and Gox 1. In addition, when the DNA is chemically modified, its electrochemical properties can be changed. For example, chemical modification of an electroactive base (such as guanine) can result in diminution of its electrochemical signal. On the other hand, attachment of a new electrochemically active group to DNA can give rise to a new signal that may be utilized to monitor the DNA modification. Cisplatin (cis-diamminedichloroplatinum) is an anticancer drug clinically used to treat several types of malignancies 3. It is generally accepted that the main mechanism of action of this compound relies in damage to DNA, involving several types of covalent adduct, the most frequent of them being intrastrand cross-links in sequence motifs GG, AG and GNG (where N stands for any nucleotide). Therefore, guanine is the primary site of DNA modification by cisplatin. As shown previously by other authors, cisplatination of DNA actually results in diminution of guanine oxidation peak measured at carbon electrodes 4. However, we found that sensitivity of determination of the DNA cisplatination via the guanine peak decrease is insufficient to monitor DNA modification levels relevant for studies of the drug effects on DNA recognition by specific proteins, processing of nucleic acids by enzymes etc. (usually representing rb = 0.02 to 0.10, where rb is number of platinum atoms bound per DNA nucleotide). Using mercury-based electrodes and CV we observed remarkable enhancement of cathodic currents in the presence of cisplatin-modified DNA. Based on characteristic dependence on scan rate, these effects have been ascribed to catalytic hydrogen evolution accompanying electrochemical reduction of the cisplatin DNA adducts. In square-wave voltammetry the catalytic currents gave rise to well developed and analytically useful peak. Conditions were optimized for sensitive determination of the cisplatin-modified DNA, particularly pH of background electrolyte (with respect to kinetic character of the analytical signal). Using the SWV peak it was easy to detect DNA cis-platination at levels as low as rb = 0.01 and its intensity increased linearly up to rb = 0.12 i.e., within the region relevant for the biochemical studies. Moreover, we developed a competitive assay for monitoring selective modification of specific sequence motifs in synthetic oligonucleotides (ON), based on the ON cisplatination in an excess of non-specific DNA, followed by separation of the ON with magnetic beads and electrochemical determination of the cisplatin bound. 121

Acknowledgements This work was supported by grants of the GA ASCR (IAA400040903, IAA500040701), MEYS CR (LC06035), Czech Science Foundation (203/07/1195) and institutional research plans Nos. AV0Z50040507 and AV0Z50040702. References 1. Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., Eds. Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics, Elsevier, Amsterdam, 2005. 2. E. Paleček, Naturwiss. 45, 186 (1958). 3. D. Lebwohl, R. Canetta, European Journal of Cancer 34, 1522 (1998). 4. V. Brabec, Electrochimica Acta 45, 2929 (2000).

122

Voltammetric Determination of Carcinogenic Air Pollutant 2-Nitrofluorene Using Polished Silver Solid Amalgam Composite Electrode Vlastimil Vyskočil a, Zuzana Krejčová a, Aleš Daňhel a, Tomáš Navrátil b and Jiří Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, Prague 2, CZ-128 43, Czech Republic, E-mail: [email protected] b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, CZ-182 23, Czech Republic

The emissions of gasoline and diesel engines contribute significantly to ever increasing pollution of living environment. A specific part of exhaust gases is composed of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons (NPAHs). They belong in environment to substances, which are causally connected with increasing rate of cancer disease 1. Presence of these compounds in environment threatens natural biological functions of ecosystem and healthy organism growth 2. In the eighties and the nineties of the last century, L. Möller studied influences of NPAHs on living organisms and their DNA 3. Carcinogenic 2-nitrofluorene was chosen as a NPAHs model marker 4, 5 and lately, the genotoxic effect of structurally similar compounds, e.g. 2,7-dinitrofluorene, was studied as well6. The main risk in NPAHs effect on organisms is the fact that the pernicious tumor grow can be provoked by small amount of carcinogen. Whereas the disease can manifest itself after many years since the initiatory exposition occurred. That is why the need for extremely sensitive and selective methods of NPAHs determination is still growing 7. Nitro compounds belong between relatively easy reducible compounds, chemically as well as electrochemically 8. Study of NPAHs electrochemical reduction can contribute to elucidation of mechanism of their genotoxic effect and can lead to better understanding of processes that occur during the degradations of these compounds in organism. Studied compound – 2-nitrofluorene (2-NF) – is proven to be carcinogenic to rats and thus possibly carcinogenic to humans (IARC class 2B) 4, 9, and its presence is demonstrably proven in vehicle exhaust gases, too 10, 11. The nitro group bonded to the aromatic rings is easily electrochemically reducible and thus 2-NF is suitable candidate for the application of modern polarographic and voltammetric methods. One of the first references about polarography of 2-NF is from the sixties of the last century 12. However, 2-NF, as a possible environmental pollutant, was electrochemically determined using mercury electrodes as lately as in last ten years 13, 14. Results of 2-NF determination obtained using mercury electrodes, as well as using mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) 15, gave us valuable information for the development of 2-NF determination procedure using polished silver solid amalgam composite electrode (p-AgSA-CE) 16 (Fig. 1). This electrode is prepared from silver amalgam powder and epoxy resin, and represents combination of solid composite electrode and solid amalgam electrode. Due to the fear of the toxicity of metal mercury and its vapors 17, p-AgSA-CE represents a liquid-mercury-free electrode usable as a mercury electrodes replacement – silver amalgam is non-toxic and its electrochemical properties are similar to metallic mercury 16, 18-22. The possible use of solid silver amalgam electrodes for the amperometric detection in flow-through applications (e.g. HPLC or FIA) is also advantageous 23. The stock solution of 2-NF was prepared in methanol due to low solubility of 2-NF in water. Optimal conditions for 2-NF determination have been investigated in buffered aqueousmethanolic solution. DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at p-AgSA-CE were used. The influence of pH on voltammetric behavior of 2-NF was

123

investigated in methanol – Britton-Robinson buffer solutions (1:1). Corresponding selected voltammograms of 2-NF are depicted in Fig. 2 (DCV at p-AgSA-CE) and Fig. 3 (DPV at p-AgSA-CE). One well-shaped irreversible cathodic peak of 2-NF reduction (P1) was observed in whole pH range (Fig. 3) and its peak potential shifted towards more negative potentials with increasing pH. On the basis of similar results of 2-NF reduction obtained at m-AgSAE 15, this peak was assigned to four-electron reduction of nitro group of 2-nitrofluorene to hydroxylamino group. The smaller second peak (P2), firstly observed in BR buffer pH 6 – methanol (1:1) medium, was observed in neutral as well in alkaline medium. The concentration dependences were measured under optimum conditions (identical for both, DCV and DPV): methanol – BR buffer pH 5 and pH 11 (resulting pH 5.8 and 11.3, respectively; 1:1). Limit of determination was around 10–6 mol L–1 for DCV at p-AgSA-CE and 10–7 mol L–1 for DPV at p-AgSA-CE respectively. Obtained results were compared with previous determinations of 2-NF at mercury electrodes 13, 14 and at m-AgSAE 15. Practical applicability of these new developed methods was demonstrated on the determination of 2-NF in drinking water. 5

A

B 4

3 2

1

Fig. 1. Scheme of p-AgSA-CE (A) and the detailed photo of polished electrode surface (B). 1 – composite mixture of silver amalgam and epoxy resin; 2 – copper wire; 3 – glass tube; 4 – plastic fixture to the analyzer; 5 – electronic contact.

124

6

500 nA 5 4 3

I 2 1

0

-200

-400

-600

-800 -1000 -1200 -1400 -1600

E, mV

Fig. 2. Selected DC voltammograms of 2-NF (c = 1×10–4 mol L–1) at p-AgSA-CE, d = 2.9 mm, in methanol – BR buffer (1:1) medium, resulting pH 2.8 (1), 4.8 (2), 7.0 (3), 8.7 (4), 10.4 (5) and 12.2 (6); polarization rate = 20 mV s–1.

500 nA 6 5 4

I 2

P

3 2 1

P 0

-200

-400

1 -600

-800 -1000 -1200 -1400 -1600

E, mV

Fig. 3. Selected DP voltammograms of 2-NF (c = 1×10–4 mol L–1) at p-AgSA-CE, d = 2.9 mm, in methanol – BR buffer (1:1) medium, resulting pH 2.8 (1), 4.8 (2), 7.0 (3), 8.7 (4), 10.4 (5) and 12.2 (6); polarization rate = 20 mV s–1. Peak description – see in text.

125

Acknowledgements This work was financially supported by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035, MSM 0021620857 and RP 14/63), by the Grant Agency of the Czech Republic (project No. 203/07/1195) and by the Grant Agency of the Academy of Sciences of the CR (Project No. IAA400400806). References 1. Jacob J., Karcher W., Belliardo J. J., Dumler R., Boenke A.: Fresenius. J. Anal. Chem. 340, 755 (1991). 2. Moreira J. C., Barek J.: Quim. Nova 18, 362 (1995). 3. Moller L.: Environ. Health Perspect. 102, 139 (1994). 4. Moller L., Rafter J., Gustafsson J. A.: Carcinogenesis 8, 637 (1987). 5. Edenharder R., Tang X.: Food Chem. Toxicol. 35, 357 (1997). 6. Moller L., Cui X. S., Torndal U. B., Eriksson L. C.: Carcinogenesis 14, 2627 (1993). 7. Zielinska B., Samy S.: Anal. Bioanal. Chem. 386, 883 (2006). 8. Page J. E., Smith J. W., Waller J. G.: J. Phys. Chem. 53, 545 (1949). 9. Ueda O., Kitamura S., Kubo R., Yano Y., Kanzaki Y., Fujimoto T., Tatsumi K., Ohta S.: Xenobiotica 31, 33 (2001). 10. Schuetzle D.: Environ. Health Perspect. 47, 65 (1983). 11. Albinet A., Leoz-Garziandia E., Budzinski H., Villenave E.: Sci. Total Environ. 384, 280 (2007). 12. Gary J. T., Day R. A.: J. Electrochem. Soc. 107, 616 (1960). 13. Barek J., Pumera M., Muck A., Kaderabkova M., Zima J.: Anal. Chim. Acta 393, 141 (1999). 14. Vyskocil V., Bologa P., Peckova K., Barek J.: Proc. 4th International Student Conference (Opekar F., Svobodova E., eds.), p. 108. Sevcik Consultancy, Prague 2008. 15. Vyskocil V., Jirak J., Peckova K., Barek J.: Proc. XXVIII. International Scientific Conference (Barek J., Novotny T., eds.), p. 127. Czech Chemical Society, Prague 2008. 16. Yosypchuk B., Navratil T., Lukina A. N., Peckova K., Barek J.: Chem. Anal. 52, 897 (2007). 17. Boyd A. S., Seger D., Vannucci S., Langley M., Abraham J. L., King L. E.: J. Am. Acad. Dermatol. 43, 81 (2000). 18. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Sensors 6, 445 (2006). 19. Yosypchuk B., Novotny L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002). 20. Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002). 21. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 22. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Navratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 23. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009).

126

Potentiometric Stripping Analysis at Antimony Film Electrodes Eva Tesařová and Karel Vytřas Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice E-mail: [email protected] Introduction Potentiometric stripping analysis (PSA) introduced by Jagner and Granelli 1 arose from polarographic methods or, more specifically, from anodic stripping voltammetry. In the last case, metals from a sample are electrolytically concentrated by deposition onto mercury electrodes. Further, in the original PSA version, the amalgamated metals are reoxidized by an oxidizing agent, either dissolved oxygen or a Hg(II) salt used in excess to form a mercury film (for more details, see recent reviews 2,3). In some countries, however, handling of mercury and its salts in laboratories is classified as a hazard. A novel approach of the PSA reported recently was based on total replacement of mercury by bismuth. Having used carbon paste electrodes as supports, bismuth(III) salts were applied to form bismuth films on which metal ions could be preconcentrated forming “fused alloys” (analogously to amalgams formed at mercury electrodes). In addition, the salts successfully substituted mercury(II) in its role of the chemical oxidant 4. More recently, our attention was turned to studies with antimonybased electrodes 5-8. As a continuation, an introductory study dealing with the use of the above SbF-CPE and Sb(III) salts is presented here as a novelty in potentiometric stripping analysis 9. Experimental Reagents and solutions. All chemicals used were of analytical grade purity. 1000 μg L-1 atomic absorption standard solutions of Sb(III), Bi(III), Cd(II), Pb(II), Zn(II), Tl(I) and In(III) were provided by Aldrich, and diluted as required. A 0.01 M HCl served as a supporting electrolyte. Stock solutions of HCl, KCl, KBr and KI (all 1 M in concentration) were prepared from chemicals purchased from Fluka or Lachema. All solutions were prepared using redistilled water. Argon (99.99%) was used to remove dissolved oxygen from solutions prior to analysis, if not stated otherwise.

Equipment. A modular electrochemical analyzer AUTOLAB equipped with PGSTAT12 (EcoChemie, Utrecht, Netherland) controlled by GPES software (EcoChemie) was used for all stripping potentiometric measurements. The conventional three-electrode configuration with antimony film-plated carbon paste electrode (SbF-CPE) was employed throughout the work. The Ag/AgCl/3 M KCl and a Pt plate served as the reference and auxiliary electrodes. A PC-controlled magnetic stirrer (IKA, Staufen, Germany) rotating at approx. 400 rpm and tubing for delivering purging gas completed the whole set-up. Working Electrode. The carbon paste was prepared by intimately hand-mixing of graphite powder (0.5 g; CR-5, Maziva Týn nad Vltavou, Czech Rep.) with highly viscous silicone oil (0.3 mL; LUKOIL MV 8000, Lučební závody Kolín, Czech Rep.). Both components were homogenized to obtain a mixture that was subsequently packed into a piston-driven carbon paste holder 10, thus providing a carbon paste electrode support for in situ platting with antimony film. In some comparative measurements, a bismuth film-plated carbon paste electrode was also used. When needed, the carbon paste surface was mechanically renewed extruding ca. 0.5 mm of the paste out of the electrode holder and smoothed with a filter paper. Usually, this simple operation was made before starting a new set of experiments.

127

Procedures. Typical PSA procedure was carried out in three subsequent steps. Potentiostatic accumulation at usually –1200 mV for 30 s under stirring was followed by the rest period in quiet solution for 10 s. Then the stripping step (in open circuit) was performed from –1200 mV to +100 mV. For some comparative experiments, a constant current stripping analysis (CCSA) mode was also employed, with positive current of either +1 μA or +5 μA applied during the stripping step. Stripping potentiograms were registered as dt/dE vs. E curves. Results and discussion In PSA, dissolved oxygen the molar concentration of which in water is quoted to be about 1 × 10-3 mol L-1 acts as a natural oxidant and its predominant role can fairly be explained by theoretical calculations (for theory, see e.g. 11-14). As follows from the reaction for which the standard potential E0 is defined, the oxidation ability of oxygen is influenced mainly via the pH value. This dependence is involved in the so-called formal (or conditional) redox potential E0f. Thus, for a medium of 0.01 M HCl, the corresponding formal redox potential is a quite high value, +1.111 V. The oxidation ability of Hg(II) which was originally applied as oxidant is limited by the presence of an excess of chloride ions, forming stable chloromercurates. For 0.01 M HCl, the corresponding formal redox potential for mercury gives a value of +0.580 V. As regards bismuth, standard potential of the reaction Bi3+ + 3 e = Bi is not given in the literature but it could be recalculated providing a value of +0.294 V 4. Thus, compared to previously mentioned oxygen or mercury, Bi(III) can be characterized as much softer oxidant and, as well known, the weaker the oxidant, the higher the sensitivity of signals measured in PSA. In media containing halide ions, corresponding values of its formal redox potential are even lower due to formation of chloro- and/or bromobismuthates.

Concerning antimony(III), the standard potential of the reaction Sb3+ + 3 e = Sb is also not available in the literature and had to be recalculated as well, and was determined as +0.26 V 15 (we obtained +0.263 V as a more precisely value but the difference is out of significance). This redox equilibrium is also affected by the presence of halide ions because analogously to bismuth(III), antimony(III) also undergoes to step-wise complexations in the presence of halide ions; it means that corresponding formal redox potentials calculated via side-reaction coefficients are lower as well. The utilization of Sb(III) species as especially gentle oxidants then leads to further improvement of the detection characteristics of PSA and the first observations concerning this task are presented in the following paragraphs. However, it should be noted that all theoretical calculations are of informative character only; for example, equilibrium data for the antimonyl ion formation (Sb3+ + H2O = SbO+ + 2 H+) which certainly occurs are not available. In this work, generating of the antimony film in situ was selected due to its simplicity. With respect to the concentration level of Pb(II) and Cd(II) salts chosen as model analytes, a spike of 1 ppm (8.21 × 10-6 mol L-1) was found convenient and used throughout. In situ plating (SbF-CPE) enabled to investigate in parallel the role of trivalent antimony spiked to the solution as potentially acting oxidizing agent. Simultaneously, a constant current was applied to reoxidate the metals accumulated. The lowest peaks were recorded when dissolved oxygen was not removed. It should be noted that peaks of roughly the same shape were obtained when the current of +5 μA was applied during the stripping step after removal of oxygen. Significant improvement was observed when lower current (+1 μA) was used. However, the highest signals for both the metals were obtained in deareated solution in which only Sb(III) could play a role of oxidant. It should be mentioned that in medium of 0.01 M HCl taken as a supporting electrolyte, a side-reaction coefficient is αSb ≡ αSb(Cl,OH) = 5.332 and calculation of the corresponding E0f value for Sb3+/Sb gives +0.250 V whereas in non-deareated solutions, reoxidation by present oxygen is dominant (E0f(O2/H2O) for a medium of 0.01 M HCl is +1.111 V, see above). The function of 128

trivalent antimony in oxidizing metals deposited onto the SbF-CPE was further investigated in media containing higher concentration of halide ions (Cl-, Br-, I-) to confirm experimentally the effect of their complexation with Sb3+ upon the sensitivity of potentiometric stripping determination. To verify possible analytical applications, calibrations for lead and cadmium were tested. Because of the preliminary character of this study, calibrations were made in 0.01 M HCl only; the corresponding potentiograms are shown in Figure 1. Concerning both the metal ions, calibration dependences were found linear in the range studied (up to 100 ppb, see Figure 1). The calibration plots examined provided the following regression data: Ap = 0.0065 c(Pb) – 0.0818; ρ2 = 0.996 Ap = 0.0076 c(Cd) – 0.0461; ρ2 = 0.998 where Ap is a peak area given in ms and c(Pb) or c(Cd), resp., are concentrations of the corresponding metal ions given in ppb units. Concentration dependences were well reproducible (not shown).

25

peak area / ms

30

dt/dE / s/V

20

800 600

Pb

Cd

400

Cd

Pb

200 0 10

30

50

70

90

110

concetration / ppb

15 10 5 0 -1.2

-1.1

-1

-0.9

-0.8

-0.7

-0.6

-0.5

-0.4

E / V vs Ag/AgCl Fig. 1. Calibration dependences for Cd and Pb. Successive standard additions of 10 ppb for each metal ion were applied for reoxidation with Sb(III) in 0.01 M HCl. Experimental conditions: c(Sb) = 1 ppm; deposition time, 30 s; deposition potential, -1200 mV vs. Ag/AgCl; equilibrium time, 10 s; upper stripping potential limit, +100 mV. Conclusions The theoretical considerations and the corresponding experiments made have confirmed that the trivalent antimony exhibits considerably moderate and selective oxidizing capabilities that can be utilized in PSA. For applications in analytical practice, the use of complexing media containing higher concentrations of chloride or bromide ions (if not interfere with species to be determined) is especially recommended. At the same time, carbon paste electrodes have

129

proven themselves to be suitable supports for antimony films with a performance similar to that observed with bismuth film-plated CPEs 4. With respect to the operability at the ppb level, both stripping voltammetry and stripping potentiometry combined with SbF-CPEs seem to have some promise in environmental monitoring of heavy metals 6-9. Acknowledgements This research has been supported by the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects LC 06035 and MSM 0021627502). References 1. Jagner D., Granelli A.: Anal. Chim. Acta, 83, 19 (1976) . 2. Estela J. M., Tomás C., Cladera A., Cerdà V.: Crit. Rev. Anal. Chem. 25, 91 (1995). 3. Konvalina J., Vytřas K.: Chem. Listy 95, 344 (2001). 4. Vytřas K., Švancara I., Metelka R.: Electroanalysis 13, 1359 (2002). 5. Pauliukaitė R., Metelka R., ŠvancaraI., Królicka A., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 10, 47 (2004). 6. Hočevar S. B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Anal. Chem. 79, 8639 (2007). 7. Švancara I., Hočevar S. B., Baldrianová L., Tesařová E., Ogorevc B., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 13, 5 (2007). 8. Tesařová E., Baldrianová L., Hočevar S. B., Švancara I., Vytřas K., Ogorevc B.: Electrochim. Acta, 54, 1506 (2009). 9. Tesařová E.,. Vytřas K: Electroanalysis (2009), in press; DOI: 10.1002/elan.200804518. 10. Švancara I., Metelka R., K. Vytřas, in: Sensing in Electroanalysis (Vytřas K., Kalcher K., Eds.), University of Pardubice, Pardubice 2005, pp. 7-18. 11. Šůcha L., S. Kotrlý S.: Solution Equilibria in Analytical Chemistry. Van Nostrand Reinhold, London 1972. 12. Inczédy J., Analytical Applications of Complex Equilibria. Akedémiai Kiadó, Budapest 1976. 13. Kotrlý S., L. Šůcha: Handbook of Chemical Equilibria in Analytical Chemistry. Horwood, Chichester 1985. 14. Trémillon B.: Reactions in Solution. An Applied Analytical Approach. Wiley, Chichester 1997. 15. Vereecken P. M., Ren S., Sun L., Searson P. C.: J. Electrochem. Soc. 150, C131 (2003).

130

Příprava a vlastnosti monovrstevných filmů thiolátek na pevných a pastových amalgámových elektrodách Bogdan Yosypchuk a Vladimír Mareček Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Praha 8, Česká republika, E-mail: [email protected]

Velký počet látek obsahujících síru se adsorbuje na povrchu různých kovů a spontánně tvoří velmi stabilní monovrstevné filmy (SAM – self-assembled monolayer). Zlato, stříbro, platina a rtuť jsou obvyklé materiály pro vytvořeni SAM. Oblast použití SAM je velmi široká – od biosenzorů po protikorozní ochranu kovů 1. Pro vytvoření monovrstev s malým množstvím defektů je nezbytný rovný povrch na atomární úrovni, což na omezené ploše lze zajistit u monokrystalů pevných kovů. Ideálně rovný povrch poskytuje samotná kapalná rtuť nebo rtutí pokryté kovy. Pevné amalgámy různých kovů se dobře smáčí rtutí, a proto lze připravit elektrody pokryté rtuťovým meniskem (m-MeSAE) nebo rtuťovým filmem (MF-MeSAE; kde Me – Ag, Au, Cu, Bi aj.). Tyto elektrody mají výhody jak rtuťových, tak i pevných elektrod 2. Elektrody z pastových amalgámů po jejich zarovnání na skle se velmi podobají rtuťovým filmovým elektrodám a jejich velkou výhodou je jednoduché mechanické obnovení povrchu 3. Pravě tyto tři druhy amalgámových elektrod s kapalným povrchem byly zvoleny jako podložka pro vytvoření monovrstevných filmů thiolátek s minimálním množstvím defektů. Byly zjištěny optimální podmínky vytvoření monovrstev a adsorpční charakteristiky studovaných thiolátek: míra pokrytí povrchu elektrody thiolátkou, hustota náboje, plocha elektrody připadající na jednu molekulu, adsorpční izotermy, energie adsorpce ΔG aj. Tyto vrstvy budou využity pro přípravu biosenzorů a jako první vrstva modelových fosfolipidových dvojvrstevných membrán. Rozsah potenciálů, ve kterém se může studovat thiolátka kovalentně vázaná na materiál elektrody, je omezen na jedné straně anodickým rozpouštěním pracovní elektrody a na druhé straně potenciálem redukce vazby kov-síra. V závislosti na elektrochemické aktivitě kovu tvořícího amalgám a také na pevnosti vazby kovu se sírou se poloha píku redukce kovu může pohybovat v širokém rozsahu potenciálů. Potenciály píků na MeSAE tvořenými kovy ušlechtilejšími než rtuť se liší podstatně méně, než v případě přítomnosti elektronegativnějších prvků v elektrodovém materiálu 4. Tato skutečnost se využívá pro vytvoření monovrstvy stabilní ve vhodném rozsahu potenciálů, což dovoluje např. studovat propustnost této monovrstvy nebo fosfolipidové dvojvrstvy pro kationy různých těžkých kovů. Poděkování Tato práce byla podpořena Grantovou Agenturou České republiky (grant čís. 203/07/1195) a Grantovou Agenturou Akademie věd České republiky (grant čís. IAA400400806). Literatura 1. Finklea H. O., v knize: Encyclopedia of Analytical Chemistry; (Meyers R. A., ed. John Willey & Sons Ltd, New York, 2000). 2. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002). 3. Yosypchuk B., Šestáková I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 4. Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Listy, 103, 284 (2009).

131

Voltametrické stanovení směsi 1-nitropyrenu a 1-aminopyrenu na borem dopované diamantové filmové elektrodě

Jiří Barek a Oksana Yosypchuk Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, UNESCO Laboratoř elektrochemie životního prostředí, Albertov 6, 128 43 Praha 2, E-mail: [email protected] Úvod Polycyklické aromatické uhlovodíky a jejich nitro a aminoderiváty patří k rozšířeným chemickým karcinogenům vyskytujícím se v našem pracovním a životním prostředí 1. Jejich hydroxyderiváty pak patří k prokázaným metabolitům těchto látek, které jsou často využívány při biologickém monitorování expozice těmto škodlivým látkami 2.

Jedna ze stanovovaných látek 1-nitropyren (1-NP) patří mezi nitrované polycyklické aromatické uhlovodíky (NPAH). NPAH Jsou významnou součástí výfukových plynů naftových i benzínových motorů. Ve vzorcích částic, které jsou emitovány naftovými motory, bylo určeno více než padesát NPAH, přičemž převládající sloučeninou je 1-nitropyren 3. Druhou stanovovanou látkou je 1-aminopyren (1-AP), který patří do skupiny amino derivátů polycyklických aromatických uhlovodíků (APAH). Je jedním z produktů přeměny 1-NP v savčích organismech a byl nalezen v moči, stolici, krvi, ledvinách, játrech a plících laboratorních zvířat 4. Vzhledem k tomu, že nitroskupina a aminoskupina jsou elektrochemicky aktivní, je možno k jejich stanovení použít moderní voltametrické metody. Pro tyto účely se používají rtuťové, amalgámové, uhlíkové a další stacionární pracovní elektrody. Borem dopovaná diamantová filmová elektroda (BDDFE) patří mezi nejnovější typy elektrod odpovídající konceptu tzv. zelené analytické chemie. Kvůli svým vhodným mechanickým a elektrochemickým vlastnostem se používá i pro stanovení NPAH5 a APAH 6. Vzhledem k tomu, že v literatuře doposud nebyla nalezena zmínka o stanovení 1-nitropyrenu a 1-aminopyrenu na BDDE, byla v předpokládané studii věnována pozornost stanovení směsi těchto látek na základě jejich oxidace resp. redukce na jediné pracovní elektrodě, a to BDDFE. Materiály a metody Voltametrická měření byla prováděna s využitím počítačového Eco-Tribo Polarografu PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha) v programu PolarPro verze 5. Jednotlivá měření byla prováděna ve tříelektrodovém zapojení s referentní argentchloridovou elektrodou (3 mol dm–3 KCl, Monokrystaly, Turnov, ČR), pomocnou elektrodou byl platinový plíšek (Monokrystaly, Turnov, ČR) a pracovní elektrodou byla borem dopovaná diamantová filmová elektroda o průměru disku 3,0 mm (Windsor Scientific Ltd, Velká Británie).

Byla použita diferenční pulsní voltametrie (DPV) s následujícimi parametry: rychlost polarizace 20 mV s–1, šířka pulsu 100 ms, výška pulsu -50 mV pro měření 1-NP a +50 mV pro měření 1-AP. Při měření směsi 1-NP a 1-AP elektrochemická regenerace prováděna nebyla. Po ukončení měření byla pracovní elektroda uchovávaná v deionizované vodě. Vzdušný kyslík byl z roztoku odstraňován pětiminutovým probubláním dusíkem. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Výška píků obou sledovaných látek při diferenční pulsní voltametrii byla vyhodnocována od spojnice minim před a za píkem. Mez detekce (LOD) byla počítaná jako trojnásobek směrodatné odchylky stanovení odpovídající

132

nejnižšímu bodu proměřené koncentrační závislosti a mez stanovitelnosti (LOQ) jako desetinásobek této směrodatné odchylky. Výsledky a diskuse V předchozím práci7 bylo zjištěno, ze 1-NP a 1-AP lze každý zvlášť stanovit metodou DPV na BDDE dostatečně přesně a citlivě. Obě látky byly měřeny v prostředí methanol:BR pufr o pH 3,0 (7:3) (výsledné pH vodně-methanolického roztoku 4,5). Dosažená mez detekce 1-NP byla 3·10–7 mol dm–3 a mez stanovitelnosti 8⋅10–7 mol dm–3 s korelačním koeficientem R = 0,9998, pro 1-AP byla dosažená mez detekce 6·10–8 mol dm–3 a mez stanovitelnosti 2⋅10–7 mol dm–3 s korelačním koeficientem 0,9996. Tento příspěvek prezentuje možnost voltametrického stanovení 1-NP a 1-AP ve směsi metodou DPV na BDDE. Borem dopovaná diamantová filmová elektroda dovoluje stanovit obě studované látky zároveň během dvou potenciálových scanů. Jeden scan od -300 do -1500 mV umožňuje redukci 1-NP (Ep ∼ -680 mV), při dalším scanu od +230 do +680 mV se oxiduje 1-AP (Ep ∼ +420 mV). Je třeba upozornit na to, že při anodickém scanu by se neměl vkládat potenciál větší než +700 mV, jelikož pak dochází k tvorbě polymerních sloučením 1-aminopyrenu, které se usazují na povrchu elektrody a tím ji silně pasivují. Pro každou konstantní koncentraci 1-AP (1·10–4, 1·10–5 a 1·10–6 mol dm–3) byly proměřeny koncentrační závislosti 1-NP v rozmezí 1·10–6 až 1·10–4 mol dm–3 (Obr. 1). Po každém měření 1-NP byla zaznamenávaná i křivka 1-AP. Výšky píků 1-AP při jeho koncentraci 1·10–4 a 1·10–5 mol dm–3 vykazují rovnoměrné kolísání s RSD 4% a 11%. Při koncentraci 1·10–6 mol dm–3 1-AP docházelo k trendovému nárustu výšek jeho píků (Obr. 2A, B). Daný fakt lze vysvětlit tak, že při katodickém scanu dochází k redukci 1-NP na 1-AP. Tento 1-AP vzniklý jako produkt redukce se částečně adsorbuje na povrchu elektrody. Měřený signál pak opovídá oxidaci 1-AP adsorbovaného na elektrodě a oxidaci 1-AP z roztoku. Při zvyšující se koncentraci 1-NP roste i množství adsorbovaného 1-AP na elektrodě a zaznamenáváný signál roste.

7 -1000

6 -800

I, nA

5 -600

4

-400

3 2

-200

-300

1

-600

-900

-1200

E, mV

Obr. 1. Voltamogramy směsi 1-NP a 1-AP v prostředí MeOH-BR pufr o pH 3,0 (7:3). Koncentrace 1-AP 1·10–6 mol dm–3, koncentrace 1-NP : 0 (1), 1·10–5 (2), 2·10–5 (3), 4·10-5 (4), 6·10–5 (5), 8·10–5 (6) 1·10–4 mol dm–3 (7). Měřeno metodou DPV na BDDE. Parametry kalibračních přímek jsou uvedeny v Tabulce I. Všechny tři koncentrační závislosti roztoku 1-NP ve směsi s 1-AP jsou lineární v celém rozsahu koncentrací, nicméně hodnoty jejich korelačních koeficientů (R = 0,9986; 0,9953 a 0,9953) jsou o něco horší než korelační koeficient (R = 0,9998) odpovídající stanovení samotného 1-NP v roztoku. Dosažené meze 133

stanovitelnosti a meze detekce samotného 1-NP a v jeho směsi s 1-AP jsou srovnatelné. Směrnice kalibračních přímek 1-NP jsou takřka stejné při všech koncentracích 1-AP, lze tedy konstatovat, že 1-AP v koncentračním rozmezí 1·10–6 až 1·10–4 mol dm–3 nemá vliv na citlivost stanovení 1-NP. A

B

14

140

12

Ip(1-AP), nA

Ip(1-AP), nA

135 10

8

125

6

4

130

0,0

-5

2,0x10

4,0x10

-5

-5

-5

6,0x10

c(1-NP), mol dm

8,0x10

120

-4

1,0x10

0,0

-3

-5

2,0x10

-5

4,0x10

-5

6,0x10

c(1-NP), mol dm

-5

8,0x10

-4

1,0x10

-3

Obr. 2. Závislost výšky píku 1-AP na koncentraci 1-NP v prostředí MeOH-BR pufr (7:3), pH BR pufru 3,0. Koncentrace 1-AP 1·10–6 (A) a 1·10–5 mol dm–3 (B). Koncentrace 1-NP 1·10–6 – 1·10–4 mol dm–3. Měřeno metodou DPV na BDDE. Tabulka I. Parametry kalibračních přímek 1-NP ve směsi s 1-AP. Měřeno metodou DPV na BDDE v prostředí MeOH-BR pufr (7:3), pH BR pufru 3,0. c, LOD1 LOQ1 směrnice úsek R mol dm-3 -1 3 -3 nA mol dm nA mol dm mol dm-3 1-AP 1-NP -7,65 0,9986 2⋅10-7 1⋅10-6 -8,66⋅106 6⋅10-7 -14,74 0,9953 1⋅10-5 1⋅10-6 - 1⋅10-4 -8,33⋅106 2⋅10-7 7⋅10-7 -4 6 -7 -11,71 0,9980 -7,79⋅10 3⋅10 9⋅10-7 1⋅10 1 vypočteno z 11 opakovaných měření roztoku 1-NP o koncentraci 1⋅10-6 mol dm-3 Závěr Na základě provedeného výzkumu elektrochemického chování roztoku směsi 1-nitropyrenu a 1-aminopyrenu ve vodně-methanolickém prostředí na bórem dopované diamantové filmové elektrodě metodou diferenční pulsní voltametrie byly vyvozeno následující:

1. Optimální podmínky pro DPV stanovení studovaných látek ve směsi na BDDE jsou: prostředí methanol: BR pufr o pH 3,0 (7:3) (výsledné pH vodně-methanolického roztoku 4,5). 2. Kalibrační křivky 1-NP proměřené v rozmezí 1·10–6 až 1·10–4 mol dm–3 při stálé koncentraci 1-AP 1·10–4, 1·10–5 a 1·10–6 mol dm–3 jsou lineární v celém rozsahu s korelačními koeficienty R = 0,9986; 0,9953 a 0,9980. Dosažené meze detekce jsou 2⋅10-7; 2⋅10-7 a 3⋅10-7 mol dm-3 a meze stanovitelnosti 6⋅10-7; 7⋅10-7 a 9⋅10-7 mol dm-3.

134

3. Z provedené studie plyne, že za stanovených podmínek lze na borem dopované diamantové filmové elektrodě provést voltametrické stanovení 1-nitropyrenu ve směsi s 1-aminopyrenem dostatečně citlivě a přesně. Poděkování Tato práce vznikla v souvislosti s řešením výzkumného záměru MSM0021620857, dále byla finančně podporována Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (projekt LC 06035) a Grantovou agenturou České republiky (projekt GAČR 203/07/P261). Literatura 1. Barek J., Cvačka J., Moreira J. C., Zima J.: Chmem. Listy 90, 805 (1996). 2. Barek J., Mejstřík V., Švagrová I., Zima J.: Chem. Listy 88, 341 (1994). 3. Barek, J., Bencko, V., Cvačka, J., Šuta, M.: Chem. Listy 92, 794 (1998). 4. J. Kielhorn, U. Wahnschaffe and I. Mangelsdorf : Environmental Health Criteria 229: Selected Nitro-Oxy Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. World Health Organization, Geneva 2003. 5. Čížek, K.: Disertační práce, Univerzita Karlova v Praze, Praha 2006. 6. Jandová, K.: Diplomová práce, Univerzita Karlova v Praze, Praha 2007. 7. Yosypchuk O., dostupné z URL: http://kalch.upce.cz/merck09/pdf/Yosypchuk.pdf.

135

č. Obsah Libuše Trnková, Kamila Neplechová, 1 Zdenka Balcarová, Luděk Havran, Miroslav Fojta Peter Barath, Kateřina Klosová, Libuše 2 Trnková Martin Bartoš, Dana Hloušková a Blanka 3 Hyhlíková Zdenka Bartošová, David Jirovský D., Jana 4 Skopalová a V. Maier Jana Bulíčková, Miroslav Gál, Magdaléna 5 Hromadová and Lubomír Pospíšil Aleš Daňhel, Bogdan Yosypchuk and Jiří 6 Barek Hana Dejmková, Marie Švecová, Jiří Zima 7 and Jiří Barek Dana Deýlová, Jiří Barek and Bogdan 8 Yosypchuk

Str. Elektrochemická a chemická redukce guaninu a 8azaguaninu 4

Možnosti implementace eliminační voltametrie do elektrochemických analyzátorů Izotachoforetické stanovení biogenních aminokyselin Stanovení perorálních antidiabetik pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí Electrochemical characterization of water soluble fullerenes Crystallic Silver Amalgam Electrode

Carbon Paste Electrodes Modified by RoomTemperature Ionic Liquid Voltammetric Determination of 4-Nitrophenol and 5-nitrobenzimidazole on different amalgam electrodes Jan Fischer, Abdul Niaz, Jiří Barek, Voltammetric Determination of Picric Acid Using 9 Bogdan Yosypchuk, Sirajuddin and Silver Amalgam Paste Electrode and Carbon Paste Muhammad Iqbal Bhanger Electrode Miroslav Fojta, Pavel Kostečka, Miroslava Electrochemical and capillary zone electrophoresis Bittová, Martin Bartošík, Luděk Havran, study of pyrimidine residues modification by 10 Tibor Hianik, Libuše Trnková and Emil osmium tetroxide, 2,2’-bipyridine. Detection of Paleček unpaired and mispaired thymines in DNA heteroduplexes. Miloslava Fojtová, Petra Horáková, Hana Monitoring of in vitro DNA synthesis and PCR Pivoňková, Eva Šimková, Zdenka amplification using 7-deaza-purines as 11 Vychodilová, Luděk Havran and Miroslav electroactive markers Fojta Peter Gruendler, Andreas Kirbs and Lothar Modern Thermoelectrochemistry 12 Dunsch Luděk Havran, Pavlína Vidláková, Hana Electrochemical behavior of oligonucleotides 13 Pivoňková, Iva Kejnovská, Michaela containing guanine stretches Vorlíčková a Miroslav Fojta Michael Heyrovský and Andrey V. Voltammetric displays of reactivity of 14 Korshunov electroactive species in different states of dispersion (Review) Petra Horáková, Eva Šimková, Zdenka Electrochemical Detection of Single Nucleotide 15 Vychodilová, Marie Brázdová, Karel Polymorphisms Using Enzyme-Linked Assay Vytřas and Miroslav Fojta Porézní grafit a jeho využití jako Terezie Kašparová, Iva Jelínková, Aleš 16 Horna, Vojtěch Adam a René Kizek elektrochemického senzoru Magdaléna Hromadová, Lubomír Pospíšil, Reduction of Pesticide Bifenox in the Presence of 17 Romana Sokolová, Miroslav Gál and Cyclodextrin Cavities Stefania Giannarelli Jaromíra Chýlková, Renáta Šelešovská, Voltametrické stanovení antioxidantů ve 18 Jana Machalíková, Libor Dušek a a Zdenka vybraných palivech a mazivech 136

7 11 13 14 15 17 19 22

26

28 30 33 34 36 38 41 43

Zoubková Zuzana Jemelkova, Jiri Zima and Jiri Barek Usage of carbon paste electrode modified by 19 47 SWNT Ivan Jiránek and Jiří Barek Voltammetric Determination of a Mixture of 20 50 Aminoquinolines Using Carbon Film Electrode David Jirovský, Zdeňka Bartošová, Aleš Amperometrická detekce v HPLC s využitím BDD 21 54 Horna elektrody Kurt Kalcher, Anchalee Samphao and A New Type of Capacitive Transducer for the 22 55 Franc Svegl Determination of Ions Jan Krůšek Měření koncentrací významných iontů v živých 23 57 buňkách pomocí fluorescenčních sond Jan Labuda Electrochemical nucleic acid-based biosensors: 24 60 terms and methodology E. Khaled , H. N. A. Hassan, A. Girgis a Využití derivátů bis(thio)močoviny jako ionoforů 25 Radovan Metelka při přípravě fosforečnanových iontově-selektivních 62 elektrod Jiří Míka, František Opekar a Pavel Coufal Tenkovrstvý bezkontaktní vodivostní detektor pro 26 66 kapalinovou chromatografii Tomáš Mikysek, Jiří Ludvík, Jiří Klíma, Elektrochemická studie HOMO/LUMO energií 27 70 Jan Vyňuchal derivátů difenyl-pyrrolo-pyrolu Jana Musilová, Jiří Barek, Pavel Drašar and Differential Pulse Voltammetric Determination of Karolina Pecková 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol and 2,4 28 72 Dinitrophenol in Drinking and River Water Using Boron-Doped Diamond Film Electrode Tomáš Navrátil and Ivana Šestáková Electrochemical Impedance Spectroscopy of 29 74 Lecithin Bilayers Supported on Porous Membranes Lenka Němcová, Jiří Barek and Jiří Zima Determination of 5-Amino-6-Nitroquinoline on 30 77 Carbon Paste Electrode Ladislav Novotný Speciální vlivy uspořádání elektrodových systémů 31 na jejich vlastnosti (miniaturizace, plasty a 82 speciální materiály, interakce, symetrie, parametry) Voltammetric Determination of Nitrofen at a Vít Novotný 85 32 Carbon Paste Electrode Karolina Peckova, Lucie Vrzalova, Amalgam Electrodes in Amperometric Detection 33 Vladimír Bencko a Jiří Barek of the Antineoplastic Drug Carmustine in Liquid 88 Flow Methods Petra Polášková, Ladislav Novotný, Rozdíly v chování zvolených slabě a silně 34 Veronika Ostatná a Emil Paleček adsorptivních látek na elektrochemicky 93 obnovovaných miniaturizovaných površích Jana Skopalová, Magdalena Čevorová, Jan Využití elektrochemických metod ke stanovení 35 96 Hrbáč a David Milde celkové antioxidační aktivity Romana Sokolová, Ilaria Degano, The Electrochemistry of Natural Pigments Magdaléna Hromadová, Lubomír Pospíšil, 36 99 Jan Fiedler, Jana Bulíčková and Miroslav Gál Určování kritických micelárních koncentrací Jitka Součková, Jana Skopalová, Jakub 100 37 Táborský a Michaela Vymětalíková cyklickou voltametrií bez elektroaktivní značky Renáta Šelešovská, Lenka Bandžuchová, Možnosti stříbrné pevné amalgámové elektrody při 38 102 Miloslava Fojtová, Jaromíra Chýlková analýze a stanovení fytochelatinů

137

Transport of Cadmium Through Biological Membranes Barbora Šustrová, Vladimír Mareček a Elektrochemické senzory pro sledování 40 Karel Štulík biochemických a technických membránových procesů Ivan Švancara, Karel Vytřas a Kurt Kalcher Co nového v elektroanalýze s bismutovými 41 elektrodami aneb Ohlédnutí za děním v oboru v letech 2006-2009 Libuše Trnková, Radka Mikelová, Elektrochemická a spektrální studie krátkých 42 František Jelen,Iva Kejnovská, Michaela oligonukleotidů Vorlíčková Petr Tůma a Eva Samcová Metody snižování detekčního limitu v kapilární 43 elektroforéze při použití neselektivních detektorů Pavlína Vidláková, Petra Horáková, Lucie Monitoring DNA modification by cisplatin using 44 Těsnohlídková, Luděk Havran a Miroslav catalytic hydrogen evolution at mercury-based Fojta electrodes Vlastimil Vyskočil, Zuzana Krejčová, Aleš Voltammetric Determination of Carcinogenic Air Daňhel, Tomáš Navrátil and Jiří Barek Pollutant 2-Nitrofluorene Using Polished Silver 45 Solid Amalgam Composite Electrode Eva Tesařová and Karel Vytřas Potentiometric Stripping Analysis at Antimony 46 Film Electrodes Bogdan Yosypchuk a Vladimír Mareček Příprava a vlastnosti monovrstevných filmů 47 thiolátek na pevných a pastových amalgámových elektrodách Jiří Barek a Oksana Yosypchuk Voltametrické stanovení směsi 1-nitropyrenu a 148 aminopyrenu na borem dopované diamantové filmové elektrodě 39

Ivana Šestáková and Tomáš Navrátil

138

108 111 113 114 118 121 123 127 131 132

DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK

AS-DETECTOIL Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod. na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika, čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. - jako kontrolní a bezpečnostní systém.

POPIS ZAŘÍZENÍ Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V - akumulátor, trafo) a z výstupu pro instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a jiného systému. Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí. Techn.údaje: připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg Kontakt: [email protected], tel./fax: 286 890 502; tel.: 266 053 877

139

PROGRAM KONFERENCE

pondělí 25. května 16.00 - PREZENCE A UBYTOVÁNÍ ÚČASTNÍKŮ 18.00 - VEČEŘE úterý 26. května 8.00 - SNÍDANĚ 8.45 - ZAHÁJENÍ SEMINÁŘE 9.00 – 10.20 BLOK 1 Předsedající: J. Součková •

Electrochemical Nucleic Acid-Based Biosensors: Terms and Methodology J. Labuda

•

Electrochemical and Capillary Zone Electrophoresis Study of Pyrimidine Residues Modification by Osmium Tetroxide, 2,2’-Bipyridine. Detection of Unpaired and Mispaired Thymines in DNA Heteroduplexes M. Fojta, P. Kostečka, M. Bittová, M. Bartošík, L. Havran, T.Hianik, L. Trnková, E. Paleček

•

Monitoring of in Vitro DNA Synthesis and PCR Amplification Using 7-deaza-purines as Electroactive Markers M. Fojtová, P. Horáková, H. Pivoňková, E. Šimková, Z. Vychodilová, L. Havran, M. Fojta

•

Electrochemical Detection of Single Nucleotide Polymorphisms Using Enzyme-Linked Assay P. Horáková, E. Šimková, Z. Vychodilová, M. Brázdová, K. Vytřas, M. Fojta

10.20 PŘESTÁVKA 10.40 – 12.00 BKLOK 2 Předsedající: P. Horáková •

Elektrochemická a spektrální studie krátkých oligonukleotidů L. Trnková, R. Mikelová, F. Jelen, I. Kejnovská, M. Vorlíčková

•

Electrochemical Behavior of Oligonucleotides Containing Guanine Stretches L. Havran, P. Vidláková, H. Pivoňková, I. Kejnovská, M. Vorlíčková, M. Fojta

•

Elektrochemická a chemická redukce guaninu a 8-azaguaninu L. Trnková, K. Neplechová, Z. Balcarová, L. Havran, M. Fojta

•

Monitoring DNA Modification by Cisplatin Using Catalytic Hydrogen Evolution at Mercury-Based Electrodes P. Vidláková, P. Horáková, L. Těsnohlídková, L. Havran, M. Fojta

12.15 - Oběd

140

14.00 – 15.00 BLOK 3 Předsedající: T. Navrátil •

Amperometrická detekce v HPLC s využitím BDD elektrody D. Jirovský, Z. Bartošová, A. Horna

•

Voltametrické stanovení směsi 1-nitropyrenu a 1-aminopyrenu na borem dopované diamantové filmové elektrodě J. Barek, O. Yosypchuk

•

Differential Pulse Voltammetric Determination of 2-Nitrophenol, 4-Nitrophenol and 2,4 Dinitrophenol in Drinking and River Water Using Boron-Doped Diamond Film Electrode J. Musilová, J. Barek, P. Drašar, K. Pecková

15.00 - Přestávka 15.20 – 17.30 BLOK 4 Předsedající: A. Daňhel •

Měření koncentrací významných iontů v živých buňkách pomocí fluorescenčních sond J. Krůšek

•

Transport of Cadmium Through Biological Membranes I. Šestáková, T. Navrátil

•

Electrochemical Impedance Spectroscopy of Lecithin Bilayers Supported on Porous Membranes T. Navrátil, I. Šestáková

•

Příprava a vlastnosti monovrstevných filmů thiolátek na pevných a pastových amalgámových elektrodách B. Yosypchuk, V. Mareček

•

Určování kritických micelárních koncentrací cyklickou voltametrií bez elektroaktivní značky J. Součková, J. Skopalová, J. Táborský, M. Vymětalíková

•

Softwarové možnosti elektrochemických analyzátorů a Nabídka firmy 2Theta V. Helán

18.00 - VEČEŘE středa 27. května 8.00 - SNÍDANĚ 9.00 – 10.00 BLOK 5 Předsedající: J. Musilová •

Možnosti stříbrné pevné amalgámové elektrody při analýze a stanovení fytochelatinů R. Šelešovská, L. Bandžuchová, M. Fojtová, J. Chýlková

•

Voltammetric Determination of Carcinogenic Air Pollutant 2-Nitrofluorene Using Polished Silver Solid Amalgam Composite Electrode V. Vyskočil, Z. Krejčová, A. Daňhel, T. Navrátil, J. Barek

141

•

Voltammetric Determination of Picric Acid Using Silver Amalgam Paste Electrode and Carbon Paste Electrode J. Fischer, A. Niaz, J. Barek, B. Yosypchuk, S. M. I. Bhanger

•

Voltammetric Determination of 4-Nitrophenol and 5-nitrobenzimi-dazole on different amalgam electrodes D. Deýlová, J. Barek, B. Yosypchuk

10.20 - PŘESTÁVKA 10.40 – 12.00 BKLOK 6 Předsedající: P. Polášková •

Crystallic Silver Amalgam Electrode A. Daňhel, B. Yosypchuk, J. Barek

•

Amalgam Electrodes in Amperometric Detection of the Antineoplastic Drug Carmustine in Liquid Flow Methods K. Peckova, L. Vrzalova, V. Bencko, J. Barek

•

Speciální vlivy uspořádání elektrodových systémů na jejich vlastnosti (miniaturizace, plasty a speciální materiály, interakce, symetrie, parametry) L. Novotný

•

Možnosti implementace eliminační voltametrie do elektrochemických analyzátorů P. Barath, K. Klosová, L. Trnková

12.15 – Oběd 13.30 - VÝLET 19.00 - VEČEŘE čtvrtek 28. května 8.00 - Snídaně 9.00 – 10.00 BLOK 7 Předsedající: V. Vyskočil •

Izotachoforetické stanovení biogenních aminokyselin Martin Bartoš, Dana Hloušková a Blanka Hyhlíková

•

Metody snižování detekčního limitu v kapilární elektroforéze při použití neselektivních detektorů P. Tůma, E. Samcová

•

Využití derivátů bis(thio)močoviny jako ionoforů při přípravě fosforečnanových iontově-selektivních elektrod E. Khaled , H. N. A. Hassan, A. Girgis, R. Metelka

10.20 - PŘESTÁVKA 10.40 – 12.00 BKLOK 8 Předsedající: Z. Jemelková

142

•

Co nového v elektroanalýze s bismutovými elektrodami aneb Ohlédnutí za děním v oboru v letech 2006-2009 I. Švancara, K. Vytřas, K. Kalcher

•

Potentiometric Stripping Analysis at Antimony Film Electrodes E. Tesařová, K. Vytřas

•

A New Type of Capacitive Transducer for the Determination of Ions K. Kalcher, A. Samphao, F. Svegl

•

Modern Thermoelectrochemistry P. Gruendler, A. Kirbs, L. Dunsch

•

Porézní grafit a jeho využití jako elektrochemického senzoru T. Kašparová, I. Jelínková, A. Horna, V. Adam, R. Kizek

12.15 - Oběd 14.00 – 15.00 BLOK 9 Předsedající: D. Deýlová •

Electrochemical Characterization of Water Soluble Fullerenes J. Bulíčková, M. Gál, M. Hromadová, L. Pospíšil

•

Determination of 5-Amino-6-Nitroquinoline on Carbon Paste Electrode L. Němcová, J. Barek, J. Zima

•

Voltammetric Determination of a Mixture of Aminoquinolines Using Carbon Film Electrode I. Jiránek, J. Barek

15.00 - PŘESTÁVKA 15.20 – 17.30 BKLOK 10 Předsedající: J. Bulíčková •

Voltammetric Determination of Nitrofen at a Carbon Paste Electrode V. Novotný

•

Usage of Carbon Paste Electrode Modified by SWNT Z. Jemelkova, J. Zima, J. Barek

•

Carbon Paste Electrodes Modified by Room-Temperature Ionic Liquid H. Dejmková, M. Švecová, J. Zima, J. Barek

•

Rozdíly v chování zvolených slabě a silně adsorptivních látek na elektrochemicky obnovovaných miniaturizovaných površích P. Polášková, L. Novotný, V. Ostatná, E. Paleček

•

Voltammetric Displays of Reactivity of Electroactive Species in Different States of Dispersion (Review) M. Heyrovský, A. V. Korshunov

•

Elektrochemická studie HOMO/LUMO energií derivátů difenyl-pyrrolo-pyrolu T. Mikysek, J. Ludvík, J. Klíma, J.Vyňuchal

•

Nové možnosti softwaru Nova 1.5. P. Barath

143

18.00 - VEČEŘE pátek 29. května 8.00 – Snídaně 9.00 – 10.00 BLOK 11 Předsedající: B. Šustrová •

Voltametrické stanovení antioxidantů ve vybraných palivech a mazivech J. Chýlková, R. Šelešovská, J. Machalíková, L. Dušek, Z. Zoubková

•

Využití elektrochemických metod ke stanovení celkové antioxidační aktivity J. Skopalová, M. Čevorová, J. Hrbáč, D. Milde

•

The Electrochemistry of Natural Pigments R. Sokolová, I. Degano, M. Hromadová, L. Pospíšil, J. Fiedler, J. Bulíčková, M. Gál

•

Reduction of Pesticide Bifenox in the Presence of Cyclodextrin Cavities M. Hromadová, L. Pospíšil, R. Sokolová, M. Gál, S. Giannarelli

10.20 - PŘESTÁVKA 10.40 – 11.40 BKLOK 12 Předsedající: T. Mikysek •

Elektrochemické senzory pro sledování biochemických a technických membránových procesů B. Šustrová, V. Mareček, K. Štulík

•

Stanovení perorálních antidiabetik pomocí HPLC s elektrochemickou detekcí Z. Bartošová, D. Jirovský, J. Skopalová, V. Maier

•

Tenkovrstvý bezkontaktní vodivostní detektor pro kapalinovou chromatografii Jiří Míka, František Opekar a Pavel Coufal

11.40 – ZÁVĚR KONFERENCE 11.45 - OBĚD

144

E-mail: [email protected]

tel.: 266 053 877

tel./fax: 286 890 502

OSVĚDČENÝ ANALYZÁTOR DO KAŽDÉ LABORATOŘE, DO PROVOZU I TERÉNU, VÝZKUMU I ŠKOL, MODERNÍ, CITLIVÝ A ŠIROCE VYUŽITELNÝ přenosný počítačový

PC ECO - TRIBO VOLTAMETRICKÝ/ POLAROGRAFICKÝ ANALYZÁTOR

na základě vlastních originálních US patentů

. vysoká citlivost .snadná automatizace . ideální pro speciaci . . stolní nebo.přenosná verze (připojení na . verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP. stolní PC, laptop či notebook)

Metody: ¾ DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie, DP a Tast polarografie ¾ Chronopotenciometrie s konstantním proudem ¾ Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele

Elektrody: ™ miniaturní tužková rtuťová ™ zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná ™ pevné amalgamové: stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová) ⇒ pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii) ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace 10-10 až 10-11 mol/l. ∗ stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be ...) resp. většiny prvků Mendělejevovy tabulky ∗ stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-,... ) ∗ sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.). ⇒ hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv, v běžných podmínkách, bez demontáže.

Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe: vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie, geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství ad. Příklady: Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven, průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu; zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi 80 % atd.

• Možnost předchozí bezplatné konzultace a předvedení systému zájemcům, komplexní i pogaranční odborné zajištění; špičková odbor. pomoc, služby a metodiky, kompatibilní výzkumně-vývojová perspektiva; moderní výukový systém i systém pro výzkum

• Možnost dodávky vč. doplňkového příslušenství (univ. mineralizátoru, ionometru ap.) •• Certifikovaný přístroj

145

Martijn van Dijk Eco Chemie BV Kanaalweg 29G, 3526 KM Utrecht, The Netherlands Corresponding author: Martijn van Dijk Phone: +31 30 2893154 Fax: +31 30 2880715 Email: [email protected] WWW: www.ecochemie.nl Distributor: NOVA-LAB s.r.o. Phone: +420777 58 00 63 Email: [email protected] WWW: www.nova-lab.cz Founded in 1986 and since 1999 a member of the Metrohm group of companies, Eco Chemie designs and manufactures state of the art Autolab series of instrumentation and software for electrochemistry and biochemistry. ISO 9001:2000 certified, Eco Chemie has been setting the benchmark in electrochemical research instrumentation for almost two decades. With our background and knowledge in electrochemistry and biochemistry and our worldwide distributor network, our mission is to serve the research community worldwide by supplying modern, affordable instruments, software and accessories. The Autolab instruments serve a wide range of industries and research applications. Ever since the foundation everyone within the company has been dedicated to the development, production and testing of Autolab electrochemical instruments and their software. This focus coupled with the flexibility of the company resulted in the finest range of potentiostats/galvanostats available today. The flexibility of Eco Chemie is reflected in the modularity of the Autolab instruments. Potentiostat range from 12 to 100 V output voltage with the possibility to add a variety of modules throughout the lifetime of the instrument.

146

Some of the popular modules include: • FRA2 (Module for impedance spectroscopy, for battery and corrosion research) • BA (Bipoteniostat and Array, second working electrode in combination with other techniques like; Scanning Electro Chemical Microscope, Scanning Tunneling Microscope and Raman) • ADC10M (Fast sampling module, scan rates up to 250 kV/s in combination with • SCAN250 true analog sweep generator) • ECD (Low current amplifier, current ranges from 10 pA to 100μA) • MUX (Multiplexing module, possibility of measuring a maximum of 96 complete electrochemical cells or 256 working electrodes in sequence) • BOOSTER 10A/20A (Current booster) The Autolab instruments can be controlled by two different software packages: General Purpose Electrochemical Software for all common DC electrochemical techniques and the Frequency Response Analyzer software for impedance spectroscopy (in combination with the FRA2 module). The combination of the Autolab hard- and software gives the user an unrivalled instrument to perform a wide range of electrochemical experiments. Fundamental electrochemistry, corrosion and battery & fuel cell research are easily achieved with Autolab systems.

147

BEST Servis, Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Katedra analytické chemie, UNESCO Laboratoř elektrochemie životního prostředí, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze

Sborník přednášek mezinárodní odborné konference

XXIX. Moderní elektrochemické metody

Jetřichovice 25. – 29. května 2009

Uspořádali: Barek Jiří, Navrátil Tomáš

ISBN 978-80-254-3997-5

148