Model Obesitas Pada Tikus sebagai Metode............
MODEL OBESITAS PADA TIKUS SEBAGAI METODE UNTUK MENJELASKAN MEKANISME PENGARUH BARIATRIC SURGERY TERHADAP PENGENDALIAN OBESITAS
R S U HAJI
SURABAYA
Oleh :
Dr.dr. Koernia Swa Oetomo, SpB. FINACS. FICS(K)Trauma
RUMAH SAKIT UMUM HAJI SURABAYA 2014
DAFTAR ISI Daftar Isi.........................................................................................................i Daftar Singkatan & Istilah..............................................................................ii Daftar Gambar................................................................................................iv Daftar Tabel....................................................................................................v Ringkasan.......................................................................................................vi Summary........................................................................................................vii Bab I. Pendahuluan........................................................................................ 1 1.1. LatarBelakang........................................................................ 1 Bab II. Pembahasan........................................................................................3 2.1. Tikus Model Obesitas...........................................................................3 2.1.1 Tikus Model Obesitas Monogenik.............................................3 2.1.2. Tikus Model Obesitas Poligenik...............................................4 2.1.3 Diet-Induced Obesity(DIO).......................................................6 2.2. Teknik Operasi Adjustable bariatric surgery pada............................9 2.2.1. Pengamatan Hasil Operasi LAGB..........................................9 2.3 Metode Pemeriksaan Beberapa Parameter Adiposopati.......................10 2.4 Parameter Adiposopati..........................................................................10 2.4.1 Leptin.........................................................................................10 2.4.2 Adiponektin...............................................................................12 2.4.3 Vaspin-1.....................................................................................14 2.4.4 Chemerin....................................................................................15 2.4.5 Teknik Immunohistokimia...........................................................16 2.4.6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).........................23 2.4.7. Identifikasi dengan metode Western blot.................................. 26 2.4.8. Metode Flowcytometery.............................................................26 BAB III. Kesimpulan..................................................................................... 28 Daftar Pustaka................................................................................................28
i
DAFTAR SINGKATAN DAN ISTILAH ACRP ADIPOR ADSF AGRP AGT AP-1 aP2 ATF-6 ATP BMI BMR C/EBP CETP COX CRP DMH ER ERK FABP FFA FIZZ3 GLUT HDL HDL HSL IKK IL IGT IRS JAK JNK LDL LPL LPS LRb MAPK MC4R MCP-1 MIF MIP mTOR NECP NEFA NFκB NPY
: adipocyte C-reactive protein : adiponectin receptor : Adipocyte Secreted Factor : Agouti-Related Peptide : Angiotensinogen : Activator protein-1 : Adipocyte protein 2 :Activating transcription factor-6ATP : adenosin triphospate : Body Mass Index : basal metabolic rate : CCAAT/enhancer-binding protein : Cholesteryl ester transfer protein : cyclooxygenase : C-reactive protein : Dorsomedial Hipotalamic Nucleus : Endoplasmic reticulum : Extracellullar Signal Regulated Kinase : fatty acid binding protein : free fatty acid : Found in Inflammatory Zone : Glucose transporter : High density lipoprotein : High-density lipoprotein : hormone-sensitive lipase : Inhibitor of nuclear factor κB kinase : interleukin : Impaired glucose tolerance : insulin receptor substrat-1 : Janus Kinase : C-Jun N-terminal kinase : low density lipoprotein : lipoprotein lipase : Lipopolysaccharide : leptin receptor b :Mitogen activated Protein Kinase : reseptor-melanokortin4 : Monocyte chemoattractant protein-1 : Migration inhibitory factor : Macrophage Inflammatory protein : Mammalian target of rapamycin : National cholesterol education program : nonesterified fatty acid : nuclear factor kappa Beta : neuropeptide Y
ii
PAI-1 PERK PGE PI3K PKB PKC POMC PPARγ PVN PYY RBP4 RE-1 STAT TEE TGFβ TLR TNF TZD UPR VSMC VEGF VLDL VN WAT
: plasminogen activated inhibitor : PKR-like eukaryotic initiation factor 2a kinase : prostaglandin : phosphoinositol-3 kinase : Protein kinase B : Protein kinase C : Pro-opiomelanokortin : peroxisome proliferator activated receptor : Paraventricular Nucleus : peptide YY : Retinol Binding Protein : Inositol-requiring enzyme-1 : Signal Transducer and Activators of Transcription : total energy expenditure : Transforming growth factor β : Toll-like receptor : tumor necrosis factor : thiazolidinedione : Unfolded protein response : vascular smooth muscle cell : Vascular endothelial growth factor : very low density lipoprotein : Ventromedial Hypothalamic Nucleus : White Adipose Tissue
iii
DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Gambaran gastric banding pada tikus. Gaster dibagi..........................9 Gambar 2. Fotomikrograf jaringan paru janin gorilla pada fase akhir gestasi.......19 Gambar 3. Densitas reseptor leptin pada jaringan lemak.......................................19 Gambar 4. Densitas Reseptor Leptin.....................................................................19
iv
DAFTAR TABEL Tabel 1. Perbedaan fenotip antara model tikus obesitas dengan cara diet.............7 Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak yang digunakan pada model......................8 Tabel 3. Komposisi Larutan pada ELISA............................................................25
v
RINGKASAN Obesitas didefinisikan sebagai kondisi abnormal atau kelebihan lemak yang serius dalam jaringan adipose sehingga menyebabkan ketidakseimbangan energi. Pengendalian asupan makanan menjadi penting dalam kaitannya dengan obesitas, karena sebagian besar jaringan lemak ini terpusat di perut yang selanjutnya menjadi obesitas viseral. Adiposopati ("lemak sakit") didefinisikan sebagai perubahan patogenisitas anatomi jaringan adiposa yang terjadi karena tidak ada keseimbangan kalori, sehingga menghasilkan respon patofisiologi endokrin dan kekebalan yang dapat menyebabkan penyakit metabolik (Bays et al, 2008). Secara patofisiologi, obesitas dan konsep adiposopati ditandai dengan hipertropi dan hiperplasi jaringan adipose melalui proses diferensiasi dari preadiposit menjadi adiposit matang (mature adipocyte). Pemahaman mekanisme obesitas dan hubungannya dengan factor resiko masih belum banyak diketahui. Karena itu diperlukan pengembangan model obesitas pada hewan coba. Ada dua tikus model obesitas yaitu tikus model dengan mutasi genetik dan dengan diet untuk menginduksi obesitas. Ada beberapa tikus model obesitas dengan mutasi genetik seperti Lethal Yellow Mutant Mouse (Ay), Ob/ob dan db/db, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD) Mouse, Tikus M16, tikus Kuo Kondo, Zucker Fatty Rat, Wistar Fatty Rat, dan Diet-Induced Obesity (DIO). Di Indonesia penggunaan tikus model mutasi genetik belum ada karena itu pada penelitian ini akan digunakan tikus model obesitas dengan pemberian diet tinggi lemak. Pentingnya penatalaksanaan obesitas mendorong untuk dilakukan pencegahan atau pengobatan obesitas. Salah satu metode yang sudah diketahui adalah metode teknik bariatric surgery pada tikus. Mekanisme bariatric surgery dalam perbaikan fungsi adiposit masih belum diketahui sehingga perlu dikembangkan model hewan yang dapat menggambarkan peranan bariatric surgery untuk penatalaksanaan obesitas. Laparoscopic adjustable gastric banding (LAGB) adalah penempatan silicon inflatable gastric band horizontal mengellingi bagian atas gaster. Keuntungan LAGB adalah gastric banding tidak mengganggu penyerapan makanan sehingga tidak terjadi kekurangan vitamin. Karena itu adjustable gastric banding pada tikus merupakan model yang sesuai untuk menginvestigasi efek bariatric surgery pada tikus model obesitas. Kata Kunci : tikus model obesitas, adjustable gastric banding, adiposopati
vi
SUMMARY Obesity is defined as a condition of abnormal or excess fat in adipose tissue so serious cause of energy imbalance. Controlling food intake is important in relation to obesity, because most of the fat tissue is concentrated in the stomach which then becomes visceral obesity. Adiposopati ("sick fat") is defined as the change in pathogenicity of the anatomy of adipose tissue that occur because there is no balance of calories, resulting in the pathophysiology of endocrine and immune responses that can lead to metabolic diseases (Bays et al, 2008). The pathophysiology, obesity and adiposopati concept characterized by hypertrophy and hiperplasi adipose tissue through a process of differentiation from preadiposit into mature adipocytes (mature adipocyte). Understanding the mechanism of obesity and its relationship with risk factors is still not well known. What is needed is the development of obesity in animal models. There are two mouse models of obesity that is mouse models with genetic mutations and with diet to induce obesity. There are several mouse models of obesity with a genetic mutation such as the Mutant Mouse Lethal Yellow (Ay), Ob / ob and db / db, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD) Mouse, Rat M16, rat Kuo Kondo, Zucker Fatty Rat, Wistar Fatty Rat, and Diet-Induced Obesity (DIO). In Indonesia the use of rat models of genetic mutation has not been there because it is in this research will be used rat models of obesity with the provision of high-fat diet. The importance of the management of obesity encouraged to do the prevention or treatment of obesity. One method that is known is a method of bariatric surgery technique in rats. Mechanism of bariatric surgery in the repair function of adipocytes is still unknown so the need to develop animal models that can describe the role of bariatric surgery for the treatment of obesity. Laparoscopic adjustable gastric banding (LAGB) is an inflatable silicone gastric band placement of the horizontal upper gastric mengellingi. Advantages LAGB is gastric banding does not interfere with the absorption of food so there is no shortage of vitamins. Because it is adjustable gastric banding in rats is a suitable model to investigate the effects of bariatric surgery on rat model of obesity. Keywords: obesity model of rat, adjustable gastric banding, adiposophaty
vii
BAB I PENDAHULUAN 1.1.
Latar Belakang
Obesitas didefinisikan sebagai kondisi abnormal atau kelebihan lemak yang serius dalam jaringan adipose sehingga menyebabkan ketidakseimbangan energi. Mortalitas dan morbiditas obesitas semakin meningkat dan peningkatan ini terkait dengan factor resiko seperti diabetes mellitus tipe 2, hipertensi, kanker, gangguan pernafasan, osteoarthritis, hipertensi dan hipertrigliseritemia (Misra dan Khurana, 2008). Obesitas disebabkan multifaktorial seperti diet, kebiasaan pola hidup, genetic, polutan, agen infeksi dan endokrin. Untuk itu perlu dipahami mekanisme patofisiologi obesitas terutama mekanisme yang menjelaskan hubungan antara obesitas dengan factor resiko lainnya. Pengendalian asupan makanan menjadi penting dalam kaitannya dengan obesitas, karena sebagian besar jaringan lemak ini terpusat di perut yang selanjutnya menjadi obesitas viseral. Pengendalian asupan makanan melibatkan proses biokimia antara lain keterlibatan beberapa hormon dan sitokin yang menentukan rasa lapar dan kenyang. Pengendalian asupan makanan tersebut melibatkan system syaraf pusat dan perifer (Pe’russe et al., 2001). Apabila tidak terjadi keseimbangan energi dengan asupan makanan maka akan menyebabkan disfungsi adiposit sehingga inilah yang melatarbelakangi timbulnya adiposopati. Adiposopati ("lemak sakit") didefinisikan sebagai perubahan patogenisitas anatomi jaringan adiposa yang terjadi karena tidak ada keseimbangan kalori, sehingga menghasilkan respon patofisiologi endokrin dan kekebalan yang dapat menyebabkan penyakit metabolik (Bays et al, 2008). Secara patofisiologi, obesitas dan konsep adiposopati ditandai dengan hipertropi dan hiperplasi jaringan adipose melalui proses diferensiasi dari preadiposit menjadi adiposit matang (mature adipocyte). Pada sel preadiposa, mekanisme diferensiasi melibatkan 3 (tiga) factor transkripsi yaitu Peroxisome proliferator activated receptor (PPAR)-γ, CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP)α dan sterol regulated enhancer binding protein (SREBP)-1. Ketiga factor tersebut menginduksi gen untuk mensintesis beberapa sitokin (adipositokin). Beberapa adipositokin yang dikeluarkan oleh jaringan adipose adalah leptin, adiponektin, resistin, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin-6, vaspin dan chemerin. Sitokin inilah yang menentukan factor resiko yang terkait dengan obesitas (Goralski et al, 2007; Hajer et al, 2008). Pemahaman mekanisme obesitas dan hubungannya dengan factor resiko masih belum banyak diketahui. Karena itu diperlukan pengembangan model obesitas pada hewan coba. Menurut Kanasaki et al (2011) ada dua tikus model obesitas yaitu tikus model dengan mutasi genetik dan dengan diet untuk menginduksi obesitas. Ada beberapa tikus model obesitas dengan mutasi genetik seperti Lethal Yellow Mutant Mouse (Ay), Ob/ob dan db/db, Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD) Mouse, Tikus M16, tikus Kuo Kondo, Zucker Fatty Rat, Wistar Fatty Rat, dan Diet-Induced Obesity (DIO). Di Indonesia penggunaan tikus model mutasi genetik belum ada karena itu pada penelitian ini akan digunakan tikus model
1
obesitas dengan pemberian diet tinggi lemak. Pentingnya penatalaksanaan obesitas mendorong untuk dilakukan pencegahan atau pengobatan obesitas. Salah satu metode yang sudah diketahui adalah metode teknik bariatric surgery pada tikus. Prosedur bariatric surgery sampai saat ini semakin baik dan merupakan satu-satunya pilihan untuk menurunkan berat badan secara signifikan sehingga dapat bertahan dalam waktu yang lama (Aills et al, 2008; Ahima dan Oseiy, 2008; Arias et al, 2009). Keberhasilan bariatric surgery dalam penanganan obesitas adalah dapat menurunkan berat badan sekitar 20 – 40 kg dari berat badan awal dan pengurangan BMI sekitar 10 – 15 kg/m 2. Mekanisme bariatric surgery dalam perbaikan fungsi adiposit masih belum diketahui sehingga perlu dikembangkan model hewan yang dapat menggambarkan peranan bariatric surgery untuk penatalaksanaan obesitas (Ahima dan Oseiy, 2008). Laparoscopic adjustable gastric banding (LAGB) adalah penempatan silicon inflatable gastric banding horizontal mengellingi bagian atas gaster. Keuntungan LAGB adalah gastric banding tidak mengganggu penyerapan makanan sehingga tidak terjadi kekurangan vitamin (Carson et al, 2004; Bult et al, 2008). Karena itu adjustable gastric banding pada tikus merupakan model yang sesuai untuk menginvestigasi efek bariatric surgery pada tikus model obesitas.
2
BAB II PEMBAHASAN Obesitas, didefinisikan sebagai indeks massa tubuh (BMI)> 30 kg/m2, merupakan masalah kesehatan yang signifikan. Obesitas telah mencapai proporsi epidemi global, dan world memperkirakan bahwa ada lebih dari 1 milyar orang dewasa mengalami kelebihan berat badan sedangkan 300 juta mengalami obesitas. Perubahan Masyarakat dan transisi gizi di seluruh dunia telah mendorong epidemi obesitas selama beberapa dekade terakhir. Pertumbuhan ekonomi serta modernisasi, urbanisasi dan globalisasi pasar makanan adalah beberapa faktor yang telah memberikan kontribusi terhadap epidemi obesitas. Penurunan aktivitas fisik juga telah dikaitkan dengan peningkatan kesempatan untuk menggunakan transportasi otomatis, memiliki teknologi di rumah, dan terlibat di lebih pengejaran rekreasi pasif (Kopelman, 2008). Obesitas dikaitkan dengan kematian dini melalui peningkatan risiko penyakit kronis, termasuk diabetes tipe 2, penyakit jantung, dan kanker tertentu. Selain itu, obesitas berhubungan dengan kesulitan pernafasan, masalah muskuloskeletal kronis, sakit pinggang, masalah kulit, dan infertilitas. Hasil penelitian epidemiologi menyebutkan bahwa mekanisme molekuler dari masalah kesehatan yang terkait dengan obesitas belum banyak diketahui (Kanasaki, 2011). Sebagian besar bukti mengusulkan masalah kesehatan terkait obesitas telah diperoleh dari analisis epidemiologi dari subyek manusia, mekanisme molekuler yang tepat dari masalah kesehatan terkait. Dalam tulisan ini, kami akan meringkas laporan yang berhubungan dengan patologi obesitas dengan menggunakan model hewan. 2.1.
Tikus Model Obesitas
Ada beberapa model tikus obesitas yaitu: 2.1.1 Tikus Model Obesitas Monogenik Lethal Yellow Mutant Mouse(Ay) Di antara beberapa tikus obesitas yang biasa digunakan dalam penelitian pertama kali dilaporkan adalah tikus mutasi agouti(agouti knockout mice). Agouti adalah gen bertanggung jawab terhadap folikel melanosit untuk memproduksi pigmen merah / pheomelanin pigmen kuning dan menghambat pigmen hitam / pigmen coklat (Matsunaga et al, 2000). Lethal Yellow Mutant Mouse (Ay) merupakan salah satu dari lima mutasi dominan agouti dan telah digunakan sebagai tikus model obesitas yang sangat baik (Kanasaki et al, 2011). Mutasi Ay dicirikan dengan delesi DNA genomik pada urutan basa nukletida sekitar 120-170 kb, sehingga terjadi gangguan ekspresi agouti (Trevaskis et al, 2005). Tikus model Ay menunjukkan beberapa fenotip seperti warna bulu kuning, obesitas dewasa, diabetes tipe-II, hyperleptinemia, peningkatan pertumbuhan secara linier suseptibilitas tumor yang lebih tinggi, dan infertilitas (Kanasaki et al, 2011). Tikus model ini menunjukkan pertumbuhan jaringan adiposa yang berlebih 3
dimana tidak terjadi perubahan asupan makanan sehingga mengalami peningkatan lemak akibat perubahan metabolisme energi. Model agouti yang berlebih pada jaringan adiposa relevan dengan obesitas manusia karena ekspresi gen agouti juga ditemukan dalam jaringan adiposa manusia dan meningkat pada jaringan adiposa tipe 2. Kemungkinan ekspresi ektopik dari agouti di pankreas tikus merangsang pelepasan insulin oleh pankreas-sel βsehingga dapat meningkatkan lipogenesis. Ekspresi agouti transgenik di kulit tidak menginduksi obesitas akan tetapi lebih mengarah pada peran agouti dalam obesogenik(Grayson et al, 2010). Pada tahun 1949, peneliti menemukan tikus obesitas yang dihasilkan dari mutasi gen obesitas (ob). Mutasi ob / ob adalah resesif dimana terjadi mutasi pada gen leptin. Karakterisasi mutasi ini adalah terjadi delesi sepasang basa tunggal di daerah pengkode leptin. Protein leptin berperan penting dalam mengendalikan nafsu makan. Oleh karena itu pada tikus ob / ob terjadi keinginan makan tak terkendali sehingga terjadi obesitas, diabetes tipe 2, resistensi insulin dan hyperinsulinemia (Prasad et al, 2010). Tikus db / db diidentifikasi awalnya pada tahun 1966 sebagai tikus model obesitas. Mutasi db (singkatan dari "diabetes") adalah mutasi yang terjadi pada gen resesif autosomal dimana terjadi mutasi basa nukleotida G menjadi T sehingga sinyal leptin terganggu. Gangguan sinyal leptin di hipotalamus menyebabkan hyperphagia dengan hyperleptinemia, resistensi insulin, dan meningkatnya kadar insulin (Kodera et al, 2011). 2.1.2. Tikus Model Obesitas Poligenik Meskipun model monogenik memberikan informasi penting tentang biologi obesitas, obesitas manusia kemungkinan besar dimediasi oleh beberapa gen. Oleh karena itu, model poligenik lebih relevan pada obesitas manusia. Strain tikus obesitas Selandia Baru (NZO) adalah model tikus obesitas poligenik yang menunjukkan diabetes tipe 2 hanya pada jantan. Tikus NZO berat badan meningkat dengan cepat selama 2 bulan pertama karena terjadi hiperphagia yang terkait dengan resistensi leptin, meskipun memiliki gen leptin dan reseptor leptin yang normal. Di antara model tikus obesitas poligenik, fenotipe tikus NZO yang paling jelek dengan jumlah lemak lebih dari 40% dari total berat badan umur 6 bulan. Selain itu, tikus NZO menunjukkan penurunan aktivitas latihan dibandingkan dengan kontrol(Joost, 2010). Tsumura Suzuki Obese Diabetes (TSOD) Mouse Tikus obesitas TSOD jantan menunjukkan hiperglikemia dan hyperinsulinemia. Nilai rata-rata konsentrasi glukosa darah pada tikus TSOD meningkat 232 mg / dl pada 13 minggu, 269 mg / dl pada 16 minggu, dan 346 mg / dl pada 24 minggu.Diabetes berat tidak berkembang karena TSOD tikus menunjukkan peningkatan jumlahsel β dan melindungi sekresi insulin untuk mengontrol glukosa darah (Iizuka et al, 2005). Tikus Model M16 4
Tikus M16, sebuah model tikus obesitas poligenik yang dikembangkan melalui seleksi jangka panjang selama 3 sampai 6 minggu. Tikus model M16 menunjukkan hiperphagia, hiperinsulinemia, dan hiperleptinemia dibandingkan dengan kontrol. Tikus M16 jantan dan betina hiperglikemia sedang dibandingkan dengan kontrol. Kadar glukosa pada tikus M16 adalah sekitar 56% dan 22% lebih tinggi pada usia 8 minggu (Allan et al, 2004). Tikus Kuo Kondo (KK) Tikus KK adalah model obesitas poligenik yang juga menunjukkan diabetes tipe 2. Tikus KK ini dikembangkan di Jepang dengan ukuran tubuh besar. Tikus KK menunjukkan fenotip hiperphagia, hiperinsulinemia, resistensi insulin dan obesitas moderat pada umur 2 bulan. Strain tikus KK telah dimodifikasi dengan mentransfer gen obesitas (Ay); tikus KKAy banyak digunakan untuk penelitian obesitas dan diabetes pada pengujian terapi eksperimental (Okazaki et al, 2002). Zucker Fatty Rat (ZFR) Zucker Fatty Rat adalah tikus model obesitas yang mengalami mutasi gen lemak (fa) resesif autosomal pada kromosom 5. Gen fa merupakan gen reseptor leptin.Tikus ini ditandai dengan hiperphagia dan obesitas yang muncul usia 5 minggu akibat akumulasi lemak subkutan. ZFR juga ditandai dengan resistensi insulin tetapi kadar gula darah normal (Martin-Cordero et al, 2011). Wistar Fatty Rat (WFR) Pada tahun 1981, Ikeda et al,(1981)melaporkan model lain tikus obesitas, lemak tikus Wistar (WFR). Strain WFR diperoleh dengan mentransfer gen fa dari ZFR (13 M strain) pada tikus Wistar Kyoto yang memperlihatkan toleransi rendah glukosa. Tikus obesitas WFR umur 3 minggu menunjukkan penyakit yang terkait obesitas seperti diabetes tipe 2, hyperinsulinemia, hiperlipidemia. Kelainan metabolik yang menonjol pada WFR jantan, tetapi tidak pada WFR betina, yang hanya menampilkan resistensi insulin ringan dan intoleransi glukosa. Terjadi diabetes pada WFR tetapi tidak pada ZFR, meskipun ada mutasi fa (leptin reseptor) di kedua strain, hal ini dapat dijelaskan karena adanya faktor genetik lainnya di WFR. Strain WFR banyak digunakan untuk penelitian pada diabetes tipe 2 karena WFR menampilkan komplikasi diabetes seperti nefropati dan neuropati (Imai et al, 2003). Wistar Fatty Rat (WFR) bisa dipakai untuk diet Induced Obesity sehingga bisa dipakai untuk melihat parameter adiposopati seperti leptin, adiponectin, vaspin, dan chemerin setelah dilakukan adjustable gastric banding. (Yuka Onoa,2006,)
2.1.3 Diet-Induced Obesity(DIO)
5
High-Fat Diet. Faktor genetik dan lingkungan berperanan dalam perkembangan obesitas dan diet adalah salah satu faktor lingkungan utama yang berkontribusi terhadap obesitas. Diet tinggi lemak (HFD) sering digunakan dalam penelitian obesitas sebagai model kekurangan non-leptin. Ada perbedaan spesifik strain tikus dan HFD dalam karakteristik tikus model obesitas (Tabel 1). Di antara berbagai strain, tikus C57BL/6J adalah yang paling banyak digunakan untuk HFD. Pada strain tikus C57, ada perbedaan yang signifikan antara substrains dalam merespon HFD. Tikus DIO strain C57BL/6J, hyperinsulinemia, dan resistensi insulin yang sama dengan perkembangan penyakit manusia, tetapi tikus C57BL/KsJ menunjukkan fenotipe yang kurang (Srinivasan dan Ramarao, 2007). Diet tinggi lemak menginduksi tikus menjadi obesitas dengan memanipulasi melalui asupan makanan yang tinggi lemak. Watanabe et al (2006) melaporkan menemukan peran antiobesitogenic asam empedu (BA) pada tikus. BA telah diakui sebagai solubilizers lipid sederhana, yang berperanan penting dalam regulasi metabolik yang kompleks. Watanabe et al. menemukan bahwa diet tinggi lemak ditambah dengan asam kolat 0,5%, menyebabkan BA ditemukan dalam jumlah terbesar, mencegah berat badan dan adiposity tanpa perubahan jumlah asupan makanan. Hasil penelitian tersebut menemukan bahwa BA mengaktifkan G-protein-coupledTGR5 reseptor dan menginduksi deiodinase tipe 2. Aktivasi deiodinase tipe 2 menghasilkan konversi tiroksin (T4) untuk triiodothyronine (T3), yang meningkatkan pengeluaran energi. Selanjutnya, senyawa TGR5, INT-777, meniru efek metabolik seperti BA dapat menghambat terjadinya steatosis pada tikus diet tinggi lemak. Selanjutnya, INT-777 menginduksi efek incretin melalui sekresi glukagon peptida seperti (GLP) -1 dan toleransi glukosa. Penelitian ini mengungkapkan pentingnya potensi BA untuk pencegahan diinduksi diet obesitas dan masalah kesehatan yang terkait (Zhang et al, 2007). Metode lain intervensi gizi, dapat mencegah kelainan metabolisme yaitu diet dengan asam amino esensial ketogenic (KAA) tinggi seperti leusin, isoleusin, valin, lisin, dan treonin. Zhang et al. telah melaporkan bahwa makan tinggi leusin pada tikus mencegah obesitas yang diinduksi oleh diet tinggi lemak. Pemberian diet campuran KAA tinggi akan termodulasi jalur sintetis lipid dan pencegahan steatosis hati dan resistensi insulin dengan penurunan berat badan. Menariknya seperti tinggi-KAA telah menunjukkan peningkatan sensitivitas insulin pada diabetestipe 2(Noguchi et al, 2010). Laporan-laporan ini menunjukkan bahwa diet tinggi lemak-hewan yang disebabkan obesitas bisa menjadi contoh yang baik untuk terapi eksperimental dan penelitian translasi untuk menemukan strategi baru terapi untuk epidemi obesitas.
Tabel 1. Perbedaan fenotip antara model tikus obesitas dengan cara diet dan genetik (Srinivasan dan Ramarao, 2007;Speakman et al, 2007; Clee dan Attie, 2007; Buettner et al, ). Strain Karakteristik
6
C57BL/6J C57BLKS/J DBA/2 129sv BTBR A/J BALB/c
C3H
Diet Genetik Diet tinggi lemak dapat menginduksi Lepob/ob menyebabkan obesitas dan diabetes obesitas tetapi tidak diabetes Menginduksi obesitas dan diabetes tetapi Lepob/ob menyebabkan lebih lemah daripada C57BL/6J obesitas dengan diabetes berat Lebih toleran glukosa dibandingkan Lepob/ob menyebabkan C57BL/6J obesitas dengan diabetes berat Insulin rendah, lebih toleran glukosa Homozigot alel db dibandingkan strain lainnya menunjukkan hiperglikemia ringan Obesitas abdominal perifer tetapi bukan Lepob/ob menyebabkan resisten insulin di hepar obesitas dengan diabetes berat Kadar glukosa rendah, resistensi obesitas Tidak ada laporan dan diabetes Sama dengan A/J, toleransi glukosa Lepob/ob menyebabkan penurunan adiposit dan peningkatan termogenesis Toleransi glukosa tinggi Tidak ada laporan
AKR
Sensitif terhadap DIO dengan Tidak ada laporan hiperinsulinemia dan resistensi insulin
CAST/Ei
Kurus pada umur 12 minggu karena HFD
Nonobese diabetic
45% fat diet menginduksi hiperglikemia Tidak ada laporan ringan dengan obesitas berat
Tidak ada laporan
New Zealand Terjadi sindroma metabolik yang Tidak ada laporan Obese menyerupai manusia, dapat menginduksi obesitas dan hiperglikemi M16 Meningkatkan berat badan, lemak dan Tidak ada laporan intake makanan; baik jantan maupun betina terjadi hiperinsulinemia dan khususnya pada jantan terjadi hiperglikemia sedang Wistar
HFD dapat menginduksi obesitas dan resistensi insulin Tidak ada laporan Diet tinggi lemak yang digunakan dalam penelitian adalah diet lemak yang mengandung 32 sampai dengan 60% kalori. Hasil penelitian menyebutkan bahwa 60 kkal% lemak digunakan untuk menginduksi obesitas pada tikus. Beberapa diet tinggi lemak yang digunakan adalah diet yang mengandung lemak jenuh seperti
7
minyak kelapa, lard, beef tallaw. Berikut ini adalah tabel yang menunjukkan komposisi diet yang digunakan untuk model tikus obesitas dengan high fat diet. Tabel 2. Komposisi diet tinggi lemak yang digunakan pada model tikus obesitas (Gajda, 2008)
8
2.2.
Teknik Operasi Adjustable bariatric surgery pada tikus model obesitas
Gambar 1. Gambaran gastric banding pada tikus. Gaster dibagi menjadi 2 kantong yaitu kardia dan fundus dengan menempatkan adjustable silicone band dibawah gastroesophagealjunction sehingga terbentuk kantong atas dengan volume kurang lebih 15 mL (Kanno et al, 2008)
Hewan coba dibius dengan 0.1ml/100 gram berat badan ketamine secara intraperitoneal / intramuskuler. Pada bagian garis tengah atas abdomen diinsisi dengan surgical blade pisau bedah ukuran 15 sampai dengan peritoneum terbuka kemudian dipasang retraktor. Gaster dikeluarkan kemudian dilakukan teknik gastric banding dengan menempatkan band karet diameter 6 mm panjang dan 2 mm lebarnya dan ditempatkan melilingi bagian antara fundus dan kardia dibawah esophageal gastric junction sehingga gaster terbagi menjadi kantong atas dan bawah (Gambar 1). Band karet diusahakan tidak mengalami dislokasi dengan jalan menjahit pada dinding anterior gaster di dekat kurvatura minor yang lainnya dekat kurvatura mayor. Dinding abdomen ditutup dengan jahitan dua lapis memakai chromic cat gut 40 dan kulit memakai silk 40. Berat badan dimonitor setiap hari sampai hari ke-14 (post operative day/POD). Air masuk dan urin diukur setiap hari sampai hari ke-7 POD (Kanno et al, 2008). 2.2.1.
Pengamatan Hasil Operasi LAGB
LAGB menurunkan berat badan dibandingkan dengan kontrol. Penurunan berat badan ini dibawah fase pertumbuhan dari tikus. Tikus Wistar dipilih sebagai model eksperimental bariatric surgery karena metabolisme telah diperiksa secara detail. Pembentukan tikus model gastric banding diperlukan eksperimen dengan berbagai teknik karena perbedaan anatomi antara perut manusia dan tikus. Penelitian ini merupakan upaya untuk membentuk model tikus baru. Gastroplasty Vertikal banded (VBG) adalah membatasi prosedur yang tidak memungkinkan band yang akan diikat. Ini membatasi volume lambung dengan menciptakan kantong lambung vertikal di sepanjang lengkung dan membungkus sebuah band dengan mesh polypropylene sekitar akhir kantong vertikal untuk mencegah stoma dan dari peregangan. VBG telah hampir ditinggalkan karena terjadi operasi ulang dari outlet stenosis dan refluks serta rendahnya penurunan berat badan. Salah satu masalah utama dengan band lambung terbuka karena ukuran kantong lambung
9
tidak disesuaikan. Jika stoma terlalu lebar, penurunan berat badan terganggu. Jika stoma terlalu ketat, ada risiko intoleransi makanan pasca operasi. Penyempurnaan perangkat telah menghasilkan sebuah band adjustable yang dapat ditempatkan laparoskopi. Oleh karena itu untuk mencegah muntah pada pasca operasi, sebagian besar ahli bedah sekarang menunda penyesuaian band (Monteiro et al, 2006). Tikus mengkonsumsi pakan normal paling selama satu jam pertama sebelum dan saat malam dan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam berat badan atau asupan makanan yang ditemukan antara tikus yang makan dua kali sehari (Endo et al, 2007).
Gambar 2. Perubahan berat badan tikus dan intake pakan setiap hari setelah gastric banding
Pada penelitian akan dikembangkan investigasi tentang pengaruh adjustable gastric banding terhadap regulasi homeostasis energy dan parameter adiposopati pada tikus model diet-induce obesity (DIO) dengan pemberian diet tinggi lemak.
2.3. Metode Pemeriksaan Beberapa Parameter Adiposopati Menurut Goralski et al, (2007); Bay et al, (2008); Kanasaki et al, (2011) bahwa masih belum diketahui pengaruh bariatric surgery terhadap regulasi homeostasis energi dan beberapa parameter terkait dengan adiposopati seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin. Karena itulah parameter ini merupakan orisinalitas dari penelitian yang akan kami lakukan. parameter adiposopati yang akan diteliti adalah leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dalam darah. Pengukuran beberapa parameter adiposopati dapat dilakukan dengan beberapa teknik pengukuran seperti teknik Imunohistokimia, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), western blot dan flowcytometry. Berikut ini beberapa metode teknik pengukuran adiposopati. 2.4. PARAMETER ADIPOSOPATI 2.4.1 Leptin Leptin diproduksi secara proporsional untuk menyimpan lemak (Munzberg & Myers 2005). Leptin merupakan protein dengan 167 asam amino yang ditranskripsikan oleh gen ob. Nama leptin diambil dari bahasa Yunani yang artinya kurus. Gen leptin pada manusia terletak di kromosom 7q31; DNA-nya memiliki lebih dari 15.000 pasang basa dan ada 3 ekson yang merupakan tempat
10
utama pengkodean sintesis protein. Leptin terutama di produksi di jaringan lemak putih dan sangat sedikit ditemukan di jaringan lemak coklat. Banyak penelitian mengungkap hubungan yang kuat antara leptin dengan kejadian obes dan resistensi insulin pada anak dan dewasa (Kempf et al 2006). Meskipun peran utama leptin adalah dalam pengaturan berat badan dan metabolisme energi, beberapa penelitian menunjukkan bahwa hormon ini dapat terlibat dalam mekanisme patofisiologi lainnya. Leptin dilaporkan ikut mengatur fungsi imun, angiogenesis, pembentukan tulang dan fertilitas. Selain itu leptin ternyata juga ikut terlibat dalam proses agregasi platelet (Corsonello et al 2003). Leptin bekerja secara langsung menghambat konsentrasi lipid intrasel dengan mereduksi sintesis asam lemak dan triasilgliserol (TG) dan meningkatkan lipid oksidasi. Efek terhadap metabolisme lipid mungkin dimediasi oleh efek hambatan leptin terhadap aktivitas asetil-CoA karboksilase yaitu enzim yang membatasi kecepatan sintesis asam lemak. Hambatan enzim ini memicu reduksi malonil-CoA, yaitu suatu inhibitor karnitiltransferase I dan proses β-oksidasi di mitokodrial. Hambatan terhadap asetil-koA karboksilase akan memblok sintesis asam lemak serta ambilan dan oksidasi asam lemak di mitokondria. Leptin dengan memutarbalikan akumulasinya di jaringan perifer akan memiliki efek menguntungkan terhadap resistensi insulin dan fungsi sel beta, yang akhirnya meningkatkan homeostasis glukosa. Leptin juga secara signifikan menurunkan sekresi insulin oleh sel beta pankreas (Kim & Moussa 2000). Ketika leptin kurang atau reseptor leptin tidak berfungsi, kandungan triasilgliserol di jaringan nonadiposa misalnya pankreas, jantung dan otot skelet dapat meningkat 10-50 kali. Hal ini menunjukkan bahwa leptin mengontrol sistem homeostatis triasilgliserol intraseluler. Kenyataan bahwa fungsi dan viabilitas jaringan non adiposa bekerja sama ketika kandungan TG meningkat di atas normal mengimplikasikan bahwa homeostasis normal asam lemak intraseluler menjadi titik penting untuk mencegah komplikasi obesitas. Kelebihan asam lemak pada otot skelet, myocardium dan pankreas menyebabkan resistensi insulin, lipotoxic hearth disease dan diabetes tipe 2 adipogenik. Pada obes akibat diet, sinyaling leptin awalnya normal dan perubahan akibat lipotoksik dapat dicegah, namun kemudian terjadi resistensi leptin post reseptor yang memicu disfungsi dan lipoapoptosis jaringan nonadiposa, suatu komplikasi yang sering terjadi pada obesitas (Unger dan Orci 2000). Leptin berfungsi mengatur sensitivitas insulin dan homeostasis glukosa melalui 2 mekanisme yakni (1) dengan mengontrol keseimbangan energi dan lemak tubuh yaitu meningkatkan sel adiposit untuk memicu resistensi insulin; (2) melalui jalur adiposity-independent yang dimediasi oleh kontrol sistem saraf pusat terhadap output glukosa hepatik. Akan tetapi, fakta menunjukkan bahwa kadar leptin yang tinggi dalam sirkulasi ternyata gagal untuk meningkatkan kehilangan berat badan pada individu obes, sehingga menimbulkan hipotesis adanya resistensi leptin yaitu terbatasnya kerja leptin pada keadaan obes (Munzberg & Myers 2005).
11
Pemberian leptin pada individu obes yang secara genetik kekurangan leptin, dapat menurunkan nafsu makan dan memicu penurunan berat badannya serta memperbaiki hiperfagi dan abnormalitas endokrin yang berhubungan dengan kandungan lemak tubuh yang rendah karena sejumlah lipodistropik dan gangguan makan (Munzberg & Myers 2005). Kebanyakan individu obes memiliki kadar leptin di sirkulasi yang meningkat sebagai konsekuensi dari massa lemak yang besar, tetapi tidak adekuat merespon peningkatan kadar leptin tersebut dengan menurunkan nafsu makan. Hipotalamus tidak mampu untuk mentransduksi sinyal leptin tersebut untuk mengurangi berat badan, sehingga dikenal dengan istilah resistensi leptin (Lustig et al 2004, Munzberg & Myers 2005, Kempf et al 2006). Resistensi leptin juga mencegah pemberian leptin eksogen untuk meningkatkan pengurangan berat badan. Resistensi leptin mencegah transduksi sinyal leptin yang normal pada ventromedial hypothalamus (VMH), sehingga terjadi asupan kalori terus menerus dan berkembang menjadi obesitas (Lustig et al 2004). Ada 2 hipotesa yang telah diterima dalam mekanisme yang mendasari resistensi leptin yaitu kegagalan leptin di sirkulasi untuk mencapai targetnya di otak dan penghambatan cascade sinyaling LRb intraseluler. Leptin mencapai otak melalui sejumlah mekanisme, meliputi mekanisme transpor spesifik menembus sawar darah otak, berdifusi dari organ circum ventricular dan langsung menyeberang dari darah ke neuroendokrin. Leptin secara jelas dihantar melintasi sawar darah otak dengan sistem transpor jenuh. Aktivitas transpor ini terlihat menurun pada tikus obese yang diinduksi makanan. Namun demikian penjelasan terhadap sejauh mana leptin menembus sawar darah otak berkontribusi terhadap kerja leptin masih belum jelas, khususnya nukleus arcuatus (Munzberg & Myers 2005). Hipotesa kedua yaitu penghambatan kaskade sinyaling LRb intraseluler. Tidak aktifnya transpor leptin berkontribusi terhadap resistensi leptin. Hal ini jelas ditunjukkan bahwa kemampuan leptin untuk mengaktivasi sinyaling hipotalamus menurun pada obesitas yang diinduksi diet. Sejumlah penelitian mendukung peran potensial 2 molekul inhibitor yakni SOCS 3 dan protein tyrosine phosphatase PTP1B dalam regulasi LRb sinyaling in vitro dan in vivo (Munzberg & Myers 2005). Pada tikus obes yang diinduksi oleh diet tinggi lemak menunjukkan respon STAT3 terhadap pemberian leptin intracerebrovascular dilemahkan, meyakinkan adanya defek pada transduksi sinyal leptin neuronal (Lustig et al 2004). 2.4.2 Adiponektin Adiponektin adalah hormon yang terutama diproduksi oleh jaringan adiposa. Penelitian-penelitian mengungkapkan peran adipokin pada patofisiologi resistensi insulin dan sindrom metabolik (Mendez-Sanchez et al 2006). Adiponektin merupakan protein dengan 244 asam amino yang mirip dengan kolagen tipe VIII dan tipe X dan protein komplemen C1q. Struktur tiga dimensi pada domain globular C-terminal homolog dengan tumor necrosis factor-α (TNFα). Akan tetapi, efek fisiologis adiponektin dan TNF-α sangat berbeda dan
12
beberapa berlawanan. Lebih jauh, adiponektin menghambat sekresi TNF-α (Töre 2007). Adiponektin ditemukan dengan kadar total yang tinggi dalam darah normal berkisar 5 - 30 μg/ml (Sharma et al 2008). Adiponektin disekresikan dari jaringan adiposa dan beredar dalam bentuk multimerik mulai dari trimers, heksamer (berat molekul rendah, ~180kDa) sampai oligomer dengan berat molekul tinggi yang mengandung 12-18 subunit kompleks (berat molekul tinggi, ~400 kDa) (MendezSanchez 2006, Sharma et al 2008). Monomer-monomer adiponektin dihubungkan dengan ikatan disulfida yang bergantung pada cystein-39 di regio variabel aminoterminal. Polimorfisme single-nucleotide (G84R, G90S, Y111H dan I164T) memodifikasi pembentukan ikatan disulfida ini, dan dapat mengubah kemampuan adiponektin menjadi bentuk multimer yang lebih besar dari pada trimer, mempengaruhi aktivitas biologisnya. Hal penting lainnya terkait dengan struktur adiponektin dihubungkan dengan modifikasi post-translational, terutama glikosilasi hidroksilisil pada empat residu lysin dalam domain kolagenosa yang kritis untuk aktivitas insulin-sensitizing berkenaan dengan penghambatan produksi glukosa hepatik (Mendez-Sanchez 2006). Reseptor adiponektin terdiri atas AdipoR1 dan AdipoR2 (Mendez-Sanchez 2006, Sharma 2007) dan T-cadherin telah dilaporkan (Töre 2007). Reseptorreseptor ini banyak diteliti sebagai target farmakoterapi. AdipoR1 terletak pada kromosom 1p36.13-q41, sedangkan AdipoR2 terletak pada kromosom 12p13.31. AdipoR1 mengkode protein dengan 375 asam amino, massa molekul 42,4 kDa, dan AdipoR2 mengkode protein dengan 311 asam amino, massa molekul 35,4 kDa. AdipoR1 dan adipoR2 secara struktural berhubungan memiliki kesamaan 66,7%. Mereka menggunakan AMP-kinase sebagai second messenger tetapi tidak terlihat bergabung dengan protein G. AdipoR2 juga mengaktivasi PPARα dan p38 mitogen- activated protein kinase. AdipoR1 diekspresikan terutama di otot skelet, sementara adipoR2 diekspresikan di hepar. AdipoR1 dan AdipoR2 merupakan reseptor yang memiliki tujuh domain transmembran (Mendez-sanchez 2006). Adiponektin meningkatkan sensitivitas insulin, menstimulasi oksidasi asam lemak, ambilan glukosa dan produksi laktat di sel-sel otot (rhabdomyocytes). Di hepar adiponektin menstimulasi oksidasi asam lemak dan mengurangi glukoneogenesis (Mendez-sanchez, 2006). Sampai saat ini adiponektin merupakan salah satu adipokin terbaik dengan potensi besar untuk pengembangan terapi beberapa penyakit. Selain sebagai insulin-sensitizing, adiponektin juga sebagai anti-inflamasi, anti-aterogenik, anti-diabetik, anti-obesitas, anti-fibrotik dan anti kanker (Töre 2007). Hasil penelitian Torigoe et al (2007) dilaporkan bahwa kadar adiponektin plasma dapat memprediksi disfungsi endotel sebelum terjadi penyakit vaskular yang lebih jauh. Adiponektin dengan berat molekul tinggi lebih baik digunakan sebagai marker disfungsi endotel daripada adiponektin total. Efek adiponektin terhadap sensitisasi insulin disertai oleh anti-inflamasi. Adiponektin panjang menghambat ekspresi beberapa molekul adesi pada permukaan sel endotel yang diinduksi oleh TNF-α, antara lain vascular cell
13
adhesion molecule-1 (VCAM-1), E-selectin, dan intercellular adhesion molecule (ICAM). Adiponektin panjang juga menekan perubahan inflamasi pada sel endotel yang diinduksi TNF-α dengan memblok aktivasi nuclear factor-κB tanpa mempengaruhi aktivasi c-jun N-terminal kinase yang dimediasi TNF-α, p38 dan protein kinase B (Akt). Selain itu, efek anti-inflamasi adiponektin meliputi penekanan terhadap pembentukan koloni leukosit, mereduksi aktivitas fagositosis dan mereduksi sekresi TNF-α dari makrofag. Adiponektin juga secara cepat melakukan up-regulasi IL-10 dan secara selektif meningkatkan ekspresi jaringan penghambat metalloproteinases-1 pada level mRNA maupun protein, sedangkan mRNA, kadar protein dan aktivitas MMP-9 tidak berubah pada makrofag derivat monosit. Hal ini menunjukkan bahwa adiponektin memodulasi respon inflamasi melalui IL-10 (Mendez-sanchez 2006). Penelitian Unoki et al (2008) menyimpulkan bahwa makrofag dapat menyebabkan rangkaian patologis dengan adiposit melalui sekresi metalloproteinase-3 (MMP-3) diikuti oleh ekspresi TNFα pada adiposit di jaringan lemak viseral. Adiponektin berpartisipasi pada angiogenesis melalui kemampuannya untuk menstimulasi sinyal AMPKdependent, yang dapat memicu sintesis faktor angiogenik di otot skeletal dan angiogenesis yang diinduksi hipoksia dan respon antiapoptotic cellular pada sel endotel (Mendez-sanchez 2006). Hung et al (2008) berdasarkan hasil penelitiannya menyimpulkan 3 hal berkaitan dengan kadar adiponektin dalam sirkulasi yaitu : 1. konsentrasi adiponektin plasma berhubungan terbalik dengan markermarker inflamasi yang ada di sirkulasi 2. kadar adiponektin plasma berhubungan terbalik dengan skor resistensi insulin yang tidak bergantung pada obesitas 3. konsentrasi adiponektin yang lebih tinggi berhubungan dengan menurunnya prevalensi sindrom metabolik, dan hubungan ini tidak bergantung pada tingkat obesitas, resistensi insulin dan marker-marker inflamasi Hasil penelitian juga menunjukkan tingkat indeks massa tubuh (BMI) dan rasio pinggang-pinggul, adiposit total dan viseral berhubungan dengan menurunnya konsentrasi adiponektin plasma. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian lain yaitu kadar mRNA adiponektin di jaringan adiposa pada penderita obes lebih rendah dibandingkan dengan subyek kurus, dan lebih rendah pada jaringan adiposa viseral dibandingkan dengan subkutaneus (Hung et al 2008) 2.4.3 Vaspin-1 Visceral adipose tissue– derived serpin (Vaspin) diidentifikasi sebagai anggota kelompok serin yang terdapat dalam jaringan adiposa viseral pada tikus obesitas dengan konsentrasi insulin plasma meningkat (Hida et al, 2005). Ekspresi vaspin tampak pada kondisi diabetes yang berat dan penurunan berat badan. Sedangkan serum vaspin bisa dinormalisasi apabila diberikan pengobatan insulin atau pioglitazone. Pemberian vaspin pada tikus obes memperbaiki toleransi glukosa, sensitivitas insulin, dan perubahan ekspresi gen pada resistensi insulin. Ekspresi mRNA vaspin dalam jaringan adiposa manusia obesitas adalah lemak
14
tetapi tidak terdeteksi pada individu kurus yang mengalami glucose tolerant (Kloting et al, 2006). Induksi mRNA vaspin di jaringan adiposa manusia merupakan mekanisme kompensasi yang terkait dengan obesitas, resistensi insulin yang berat, dan diabetes tipe 2 (Kloting et al, 2006; Zvonic et al, 2007). 2.4.4 Chemerin Chemerin (RARRES2 atau TIG2) adalah protein kemoatraktan yang berfungsi sebagai ligan untuk reseptor protein Gn CMKLR1 (ChemR23 atau DEZ) dan memiliki peran dalam imunitas adaptif (Roh et al, 2007). Chemerin disekresikan sebagai protein tidak aktif dengan ukuran 18-kDa dan mengalami pembelahan ekstraseluler serin protease bagian C-terminal untuk menghasilkan chemerin aktif 16-kDa (Wittamer et al, 2003; Goralski et al, 2007). Konsentrasi chemerin aktif dalam plasma dan serum, masing-masing adalah pada manusia 3,0 dan 4,4 nM dan 0,6 dan pada tikus 0,5 nM (Goralski et al, 2007). Ekspresi chemerin dan CMKLR1 dalam jaringan adiposa putih dan coklat tikus berperan dalam proliferasi dan diferensiasi jaringan adiposit putih. Sedangkan peningkatan ekspresi chemerin dan CMKLR1 dalam lemak coklat mencit ob/ob dibandingkan dengan kontrol adalah berperan dalam diferensiasi jaringan adiposa coklat untuk fenotipe adiposa putih (Bozaoglu et al, 2007; MacDouglad et al, 2007). Konsentrasi chemerin didapatkan dalam plasma, serum, dan cairan inflamasi manusia (Bozaoglu et al, 2009). Jumlah sekresi fisiologis chemerin aktif terjadi pada awal diferensiasi adiposit. Dan ditemukan CMKLR1 dalam jaringan adiposa tikus dan kultur sel adipose baik murin maupun manusia. Ekspresi CMKLR1 dan sekresi chemerin, merupakan autokrin yang berperan dalam pengaturan jalur mekanisme adipogenesis. Selama 72 jam pertama dari diferensiasi adipocyte chemerin sudah dapat diketahui. Setelah pemberian factor diferensiasi seperti IBMX, deksametason, dan insulin selama 24 jam pada sel 3T3-L1, sel mengalami klonal ekspansi yang terdiri dari 1-2 putaran pembelahan sel (Tan et al, 2009). CMKLR1 memiliki efek spesifik pada reseptor permukaan yang mempengaruhi diferensiasi adiposit, ekspresi gen, dan metabolisme. Peningkatan sekresi adipokines (misalnya leptin, TNFα, dan CCL2) serta asam lemak bebas merangsang infiltrasi dan aktivasi makrofag dari inflamasi lokal. Sehingga makrofag melepaskan molekul pro-inflamasi dan terjadi menganggu sensitifitas adiposity terhadap insulin (Cash et al, 2008). Sel L1.2. dan makrofag tikus mengekspresikan CMKLR1 yang mengikat chemerin, dan bermigrasi ke ligan (Yoshimura dan Oppenheim, 2008). Karena itu chemerin berperan sebagai regulator parakrin untuk mengaktifkan sel imunitas sehingga jaringan adiposa putih merupakan jaringan yang berperan dalam respon inflamasi lokal dan berhubungan dalam perkembangan obesitas.
15
Mengingat tingginya tingkat ekspresi chemerin di adipocytes dan peningkatan sekresi chemerin dalam maturasi adipocyte, maka adiposa merupakan sumber sekresi chemerin yang berhubungan dengan perubahan dengan massa jaringan adiposa. Sehingga dapat menggambarkan terjadinya sistemik inflamasi chemerin pada fungsi metabolisme dalam jaringan yang lainnya. Chemerin memiliki peran regulasi adipogenesis dan metabolisme adipocyte dalam biologi jaringan adiposa. Dengan demikian, karakterisasi fungsi chemerin dan sinyal CMKLR1 di adiposit memiliki potensi pendekatan terapi terbaru untuk pengobatan obesitas, tipe2 diabetes, dan penyakit kardiovaskuler. 2.4.5 Teknik Immunohistokimia Imunohistokimia (IHC) adalah teknik yang menggabungkan anatomi histologi, teknik imunologi dan biokimia untuk mengidentifikasi komponen jaringan melalui interaksi antigen dengan antibodi spesifik target ditandai dengan label tertentu. IHC memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam konteks jaringan yang tepat (Walker dan Rapley, 2005; Westermeier dan Marouga, 2005). Prinsip dasar immunofluorescence adalah fluorescent untuk melihat antigen yang terletak di dalam intraseluler sel tertentu (misalnya, nukleus, organel, sitoplasma, membran) atau di ekstraselular (Cregger M et al. 2006). Pada teknik ini pengukuran yang akan dilakukan adalah dengan mengidentifikasi ekspresi adiposopati seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dengan teknik Imunohistokimia hampir sama dengan metode Imunositokimia, tetapi pada imunohistokimia yang dideteksi adalah antigen pada organ yang telah difiksasi (Hida K. 2005, Goraslki 2007, Sharma 2010). Prosedur imunohistokimia adalah sebagai berikut (Walker dan Rapley, 2005): Bahan : - Organ - Slide - Coverglass staining jar - Cover slide - 4 % (v/v) paraformaldehid dalam PBS - Alkohol 70% - Alkohol bertingkat (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%) - Xylol - Parafin - Gliserol - PBS pH 7.4 ~ 8 mM Na2HPO4 ~ 1.4 mM KH2PO4 ~ 140 mM NaCl ~ 2.7 mM KCl Adjust pH sampai 7.4 dengan NaOH - 0.02% Sodium azida (NaN3) dalam PBS - Aquades - 3% H2O2 dalam PBS
16
Alat : -
1% (v/v) BSA dalam PBS Antibodi Primer Antibodi Sekunder (Anti Rabbit IgG Berlabel Biotin) DAB Mayer’s Hematoxilen Entellan Inkubator 55-63°C Hot plate Pinset Pipet tetes Kotak preparat Waterbath suhu 95°C Pembuat blok Mikrotom Pisau mikrotom Bunsen Mikroskop
METODE Embedding 1. Organ direndam dalam larutan fiksatif berupa Formalin/PFA (1-7 hari). 2. Direndam dalam etanol 70% selama minimal 24 jam, dan dilanjutkan dengan etanol 80% selama 2 jam. Direndam dalam etanol 90% dan 95% secara berurutan selama masing-masing 30 menit. Dilanjutkan perendaman sebanyak 3 kali dalam etanol absolut selama 30 menit masing-masing dalam botol yang berbeda. 3. Direndam dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 30 menit. a. Proses selanjutnya dikerjakan dalam inkubator dengan suhu 5658°C. 4. Direndam dalam xylol, kemudian ke dalam parafin sebanyak 3 kali. 5. Dilanjutkan dengan embedding dengan mencelupkan organ dalam parafin cair yang telah dituang dalam wadah. Setelah beberapa saat, parafin akan memadat dan organ berada dalam blok parafin. Coating Obyek Gelas 1. Obyek gelas (baru) ditandai dengan kikir dan direndam dalam alkohol 70% selama minimal semalam. Dikeringkan dan dihindarkan dari debu. 2. Dicelupkan selama 30 detik dalam 0,5 % gelatin hangat yang dilarutkan dalam aquabides. Gelatin 0,5% sebanyak 100 ml digunakan untuk 100 obyek gelas. Poly-lisin lebih bagus digunakan dalam coating daripada gelatin. 3. Dikeringkan dalam ruang tertutup. Obyek gelas dapat digunakan dalam 2 hari.
17
Pembuatan Preparat Organ 1. Organ pada blok parafin hasil embedding dimasukkan ke penjepit (block holder) mikrotom dan diatur kesejajaran permukaan potong dengan mata pisau mikrotom. 2. Pemotongan diawali dengan mengatur ketebalan irisan diatas 10 µm untuk mempercepat pencapaian bidang potong jaringan. 3. Organ diiris dengan ukuran 4 µm. Pemotongan yang bagus akan menghasilkan bentuk potongan seperti pita. 4. Irisan diambil dengan pinset dan dimasukkan air (suhu ruang) untuk membuka lipatan yang mungkin terjadi pada preparat. 5. Hasil irisan dipindahkan dengan jarum bertangkai ke dalam air hangat (3840°C) untuk meluruskan kerutan halus yang ada. 6. Irisan yang terentang sempurna diambil dengan gelas objek. 7. Potongan terpilih dikeringkan dan diletakkan di atas hotplate (38-40°C) sampai kering. 8. Preparat disimpan dalam inkubator suhu 38-40°C selama 24 jam. Deparafinisasi dan Rehidrasi • Preparat dicelup dalam xylol sebanyak 2 kali, alkohol bertingkat (100%, 90%, 80%, 70%, 30%), dan aquades secara berurutan. • Dicuci dalam PBS pH 7,4 selama 3 x 5 menit. Permeabilisasi Sel • Cuci sel 1 kali dengan PBS. • Inkubasi sel pada 3% H2O2 dalam PBS selama 10 menit suhu ruang. • Cuci sel 3 kali dengan PBS. Bloking Sel • Inkubasi sel pada 1% BSA (Bovine Serum Albumin) selama 1 jam pada suhu ruang. • Cuci 3 kali dengan PBS. Inkubasi Sel pada Antibodi Primer • Encerkan Antibodi primer dalam Goat serum/FBS/BSA hingga konsentrasi dan volume yang diinginkan (Antibodi leptin 1:500 dalam Goat serum atau FBS). • Inkubasi sel pada antibodi primer pada suhu 4°C selama 12 jam atau pada suhu ruang selama 2 jam. • Cuci sel dalam PBS selama 3 x 5 menit. Inkubasi Sel pada Antibodi Sekunder • Encerkan antibodi sekunder berlabel biotin dalam PBS sampai konsentrasi dan volume yang diinginkan (Anti Rabbit IgG -Biotin1 : 500 dalam PBS)
18
• Inkubasi sel dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu ruang. • Cuci sel pada PBS selama 3 x 5 menit. • Tetesi dengan SA-HRP (Strept avidin horseradish peroxidase) 1:500 dalam PBS selama 40 menit. • Cuci sel dengan PBS selama 3 kali 5 menit. • Tetesi dengan DAB (Diaminobenzidine) selama 10 menit. • Cuci sel dengan aquades 3 x 5 menit. • Lakukan counterstain dengan Mayer’s hematoxilen selama 10 menit. • Cuci / tetesi dengan air kran • Cuci dengan aquades selama 10 menit. Biarkan pada suhu kamar. Mounting Setiap slide diberi label. Satu tetes medium mounting (Entellan) dijatuhkan ke atas preparat. Cover glass ditutupkan ke atas preparat yang telah diberi mounting medium. Visualisasi sel dengan menggunakan mikroskop cahaya Gambar 2. Fotomikrograf jaringan paru janin gorilla pada fase akhir gestasi yang menunjukkan : (A) Pengecatan hematoxylin-eosin, (B) surfac tant protein A , (C) LEP receptor protein pada pulmo nary epithelial cells. Kontrol negative imunohistokimia (tanpa antibodi primer) reseptor LEP (D). Tanda panah menunjukkan pulmonary type II cells ( Henson et al. 2004)
Gambar 3. Densitas reseptor leptin pada jaringan lemak (kelompok kontrol)
Gambar 4. Densitas Reseptor Leptin (restricted diet 40% group)
19
Fiksasi dan Embedding Organ Organ
Direndam dalam paraformaldehida (PFA) 4% dalam PBS, suhu 4º C selama 1-7 hari
Dehidrasi etanol bertingkat (Ethanol 70% 24 jam; 80% 2 jam; 90% 20 menit; 95% 20 menit; etanol absolut 3x20 menit), suhu ruang
Xylol , suhu ruang, 2 x 30 menit
Xylol, 30 menit, 60-63°C
Parafin 3x30 menit (56-58°C)
EMBEDDING (Organ dimasukkan dan ditata posisinya dalam parafin hangat dalam blok hingga mendingin, bagian organ yg akan diiris menghadap bawah)
Blok parafin disimpan pada 4º C
20
Pembuatan preparat organ Organ dalam blok parafin
Organ diiris ukuran 4 µm Irisan dipindah ke air hangat (38-40°C) Diambil dengan gelas objek Dikeringkan diatas hot plate (38-40°C)
Preparat Organ (yg masih mengandung parafin)
Preparat disimpan di suhu 38-40°C, 24 jam
3% hidrogen peroksida (dalam DI water), 20 menit Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x
1% NGS atau BSA dalam PBS, 30 menit, suhu ruang Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x DEPARAFINISASI & REHIDRASI Dimasukkan dalam Xylol I, Xylol II, Alkohol bertingkat (100%, 90%, 80%, 70%), Aquadest, @ 3-5 menit Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x
21
Antibodi Primer (Rabbit Anti Human Leptin) semalam, suhu dingin 4°C Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x Antibodi Sekunder berlabel biotin (Anti Rabbit IgG BiotinLabelled), 1 jam suhu ruang Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x SA-HRP (Sterp Avidin- Hoseradish Peroxidase), 30-60 menit, suhu ruang Dicuci aquades 5 menit, 3 x Cromogen DAB (3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride), 10- 20 menit, suhu ruang Dicuci PBS pH 7,4 5 menit, 3 x Counterstain (Hematoxilen), 2 menit, suhu ruang Dicuci air kran 5 menit, 3 x Mounting dengan Entellan
Pengamatan dengan mikroskop
22
2.4.6. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Prinsip dasar ELISA adalah mendeteksi pengikatan antigen (Ag) antibodi (Ab) dengan menggunakan enzim. Enzim mengubah substrat berwarna (chromogen) untuk menghasilkan warna, yang mengindikasikan keberadaan ikatan Ag: Ab. Sebuah ELISA dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen atau absorbansi dalam sampel, tergantung pada bagaimana tes dirancang (Walker dan Rapley, 2005). Pengukuran Leptin, Reseptor Leptin, Adiponektin, vaspin dan chemerin dalam serum darah tikus DIO Melalui Metode Indirect ELISA (Keller 2005, Goralski 2007, Seeger 2008, Halberg 2009) Penentuan Kondisi Optimal Tes Pada Uji ELISA Untuk menciptakan uji fase padat yang non kompetitif, baik kadar antibodi atau antigen pelapis maupun pengenceran konjugat perlu ditentukan. Titrasi chequerboard merupakan cara yang paling mudah untuk dilaksanakan, sebab melalui cara ini tiga tolok ukur dari uji dapat divariasi secara bersamaan dengan menggunakan aspek-aspek yang berbeda dari plate (Walker dan Rapley, 2005). Titrasi chequerboard dilakukan dengan cara sebagai berikut : Plate untuk ELISA dilapisi secara horisontal pada baris A sampai H seperti tampak pada gambar 6. Empat macam kadar atau pengenceran antigen atau antibodi dapat diuji dalam satu seri pemeriksaan, dimana masing-masing kadar / pengenceran dilakukan duplo (pengulangan dua kali) ke dalam sepasang baris horisontal dari plate (A dan B atau C dan D atau E dan F atau G dan H). Sesudah coating, celah-celah pada sumuran plate diblok dengan protein non-spesifik seperti BSA, gelatin atau non fat dry milk. Untuk sampel dipakai satu serum kontrol positif kuat, satu serum kontrol negatif dan hanya PBS saja. Ketiga jenis kontrol sampel tersebut dimasukkan secara vertikal ke dalam sumuran plate dalam 4 jalur ( 4x3 ) seperti tampak pada gambar 6. Setelah inkubasi dan pencucian dengan PBS, antibodi konjugat juga ditambahkan secara vertikal (Walker dan Rapley, 2005).
23
Ab konjugat Pengenceran 3
Pengenceran 1
Pengenceran 4
Pengenceran 2
Ag pelapis Pengenceran 1
Pengenceran 2 Pengenceran 3
Pengenceran 4
1 A 12
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
B C D E F G H
+ -PBS+ -PBS+ -PBS+ -PBS Sampel
Pengenceran 1: 100
Gambar 6. Titrasi chequerboard
Pilihan optimal untuk suatu assay yaitu kombinasi Ag dan konjugat yang memberi : nilai PBS ............... < 0,05 nilai kontrol negatif < 0,2 nilai kontrol positif > 1,0 Metode ELISA Antigen (serum) dilarutkan dalam coating buffer (1:50). Antigen dicoating pada plate ELISA selama semalam pada suhu 4°C. Dicuci dalam PBSTween 3x3 menit. Diblok dengan blocking buffer (BSA 1% dalam PBS) 50 µl / well. Diinkubasi selama 2 jam suhu ruang. Dicuci dalam PBS-Tween 3x3 menit (Ma et al, 2006). Coating antibodi primer (50 µl / well) dengan inkubasi selama 2 jam pada suhu ruang. Dicuci dalam PBS-Tween 3x3 menit. Coating antibodi sekunder Anti Human IgG AP Conjugated (1:2500) dalam TBS melalui inkubasi selama 2 jam pada suhu ruang. Dicuci dalam PBS-Tween 3x3 menit. Ditambahkan substrat pNPP dalam dietanolamin 10% (50 µl / well). Diinkubasi 30 menit, suhu ruang (tidak dicuci, yang dibaca adalah pNPP yang terikat Ab sekunder). Ditambahkan
24
NaOH 3M (50 µl/ well) sebagai stop reaction. Setelah 15 menit, dibaca dengan ELISA reader pada λ=405 nm. Prosedur Metode ELISA (Ma et al, 2006) • Siapkan plate ELISA dan plate layout. • Coating Antigen • Antigen (serum) dilarutkan dalam coating buffer (coating Ag 1: 50). • Plate ELISA dibungkus dengan aluminium foil dan diberi label. • Diinkubasi pada suhu 4°C semalam. • Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit. • Coating Ab primer dalam BSA 1% (50 µl / well) • Diinkubasi selama 1 jam, suhu ruang. • Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit. • Coating Ab sekunder (1:2500) dalam TBS • Ab sekunder yang digunakan : Anti Rabbit IgG AP Conjugated • Inkubasi selama 1 jam pada suhu ruang. • Dicuci dalam PBS-Tween 3 x, @ 3 menit. • Ditambahkan substrat pNPP dalam Dietanolamin 10% (50 µl / well). • Diinkubasi 30 menit, suhu ruang. • (Tidak dicuci, yang dibaca adalah pNPP yang terikat Ab sekunder) • Ditambahkan NaOH 3M (50 µl/ well) sebagai stop reaction. • Setelah 10 menit dan 15 menit, dibaca dengan ELISA reader pada λ=405 nm Komposisi Larutan Tabel 3. Komposisi Larutan pada ELISA Nama Larutan
Komposisi Bahan
Jumlah
Coating buffer
Na2CO3 NaHCO3 NaN3 dd H2O (cek pH 9,6!)
0,159 g 0,293 g 0,02 g sampai 100 ml
PBS-T
PBS Tween-20
100 ml 50 µl
Blocking Buffer (BSA 1% dalam PBS)
BSA PBS
0,1 g 10 ml
Diethanolamin pH 9,8
PNPP
10% Dietanolamin dd H2O NaN3 MgCl2 . 6 H2O (cek pH 9,8!) dalam PNPP
2,425 ml 20 ml 0,005 g 0,0025 g
1 tablet 25
Dietanolamin
Dietanolamin
5 ml
2.4.7. Identifikasi dengan metode Western blott Pengukuran Leptin, Reseptor Leptin, Adiponektin, vaspin dan chemerin dalam serum darah tikus DIO Melalui Metode western blot (Goralski 2007, Bee K 2008, Halberg 2009, Maeeda 2009). Prinsip metode ini adalah metode analisis sampel protein dimana dielektroforesis pada SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa. Protein ditransfer dideteksi menggunakan antibody pesifik dan sekunder berlabel enzim dan substrat antibodi. Contoh protein dikenakan poliakrilamid elektroforesis gel. Setelah ini gel ditempatkan di atas lembar nitro selulose dan protein dalam gel adalah elektroforesis ditransfer ke nitro selulosa tersebut. Nitro selulosa tersebut kemudian direndam dalam buffer blocker (3% skim) untuk "blok" yang spesifik mengikat protein. Nitro selulosa tersebut kemudian diinkubasi dengan antibodi spesifik untuk protein. Nitro selulosa tersebut kemudian diinkubasi dengan antibodi kedua, yang spesifik untuk pertama antibodi. Metode Western blot digunakan untuk mengetahui ekspresi parameter adiposopati pada jaringan setelah diperlakukan dengan perlakuan (Walker dan Rapley, 2005; Ma, 2006). Metode Western blot adalah sebagai berikut masing-masing sampel jaringan disuspensi dengan buffer yang mengandung 20mM TrisHCl, 1mM EDTA dan 0,1 mM PMSF. Suspensi sel diputar 12.000 rpm selama 5 menit, 4OC kemudian diputar lagi 15.000 rpm, 1 jam, 4 OC Sampel diseparasi dengan 15 % gel SDSPAGE. Gel hasil elektroforesis dicuci dengan aquades dan direndam dalam buffer blotting. Membran NC (nitroselulose) dipotong, selanjutnya dibasahi dengan PBS selama 10 menit pada suhu kamar. Membran direndam dalam buffer blotting sebelum dilakukan proses blotting. Selanjutnya transfer dilakukan selama 12 jam pada 25 Volt pada suhu 4°C. Setelah selesai transfer, membran di-blocking dalam PBS-T Skim milk 5% selama 1 jam sambil digoyang. Dicuci 3x5 menit dalam PBS-T. Inkubasi dengan antibodi primer PI3K yang telah diencerkan dalam PBS-
26
T Skim 5% (1:200) semalam pada suhu 4°C. Dicuci 3x5 menit dengan TBS. Diinkubasi dengan antibodi sekunder AP Conjugated (1:2500 dalam TBS) selama 1 jam pada suhu ruang. Dicuci dengan PBS-T selama 4x5 menit. Selanjutnya dideteksi pita protein atau antigen dengan penambahan substrat Western Blue (dalam ruang gelap) ke membran selama semalam atau sampai terlihat warna band. Reaksi dihentikan dengan pencucian membran dalam akuades (Walker dan Rapley, 2005; Ma, 2006). 2.4.8. Metode Flowcytometery Teknik flowcytometry digunakan untuk mengukur prosentase vaspin dan chemerin dalam darah. Flowcytometery menggunakan prinsip-prinsip hamburan cahaya, eksitasi cahaya, dan emisi molekul fluorochrome untuk menghasilkan data multi-parameter khusus dari partikel dan sel-sel dalam kisaran ukuran diameter 0.5um sampai dengan 40um. Sel adalah hydro-dinamis tersuspensi dalam PBS sebelum menangkap sumber cahaya secara optimal. Laser yang paling sering digunakan sebagai sumber cahaya di flowcytometer. Energi ini dirilis sebagai foto dan cahaya dengan sifat spektral tertentu yang unik untuk setiap fluorochromes. Salah satu fitur unik dari flowcytometer bahwa pengukuran fluoresensi per sel atau partikel. Hal ini kontras dengan spektrofotometri dimana penyerapannya per panjang gelombang (Walker dan Rapley, 2005). Sel dipanen dan diputar dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit dengan suhu 4oC. Endapan sel dicuci dengan phosphate buffer saline (PBS) kemudian dikocok secara perlahan. Cuci sel sampai 2 kali. Endapan terakhir ditambah dengan 100 μL PBS dan ditambah anti-CD146-FITC (1:100) dan antiCD45-PE (1:100). Sel diinkubasi dengan antibody selama 30 menit pada suhu ruang. Sampel diencerkan sampai 1 mL dan dibaca dengan flowcytometry (FACS Callibur, BD). Alat cytometers yang modern mampu menganalisis beberapa ribu partikel setiap detik, saat itu juga. Cara kerja cytometer mirip dengan mikroskop, tetapi bukan menghasilkan gambar sel melainkan menghasilkan gambar untuk sejumlah besar sel sesuai parameter ditetapkan secara otomatis (Canonico, 2010; Masouleh, 2010) . Bahan-bahan yang bisa diperiksa dengan flow cytometry adalah 1. Darah perifer 2. Aspirasi sumsum tulang 3. Cairan cerebrospinal (CSF) 4. Fluida non-CSF,FNA (Fine Needle Aspiration)/ Biopsi Jaringan
27
BAB III KESIMPULAN Model hewan obesitas dapat digunakan untuk mempelajari penyakit terkait obesitas manusia. Model hewan yang cocok adalah penting untuk menguji strategi terapi baru terhadap penyakit. Model tikus obesitas yang sesuai adalah dengan diet induce obesity melalui pemberian diet tinggi lemak. Tikus model baraitric surgery dengan metode gastric banding lebih efektif daripada metode lainnya untuk menurunkan berat badan. Beberapa metode yang dapat digunakan untuk mengetahui dan mempelajari parameter adiposopati yang akan diteliti seperti leptin, adiponektin, vaspin dan chemerin dalam darah memakai metode ELISA, Western blot, Imunohistokimia dan Flowcytometry. Berdasarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa tikus model obesitas dengan diet tinggi lemak lebih baik dan sesuai dibandingkan dengan tikus model mutasi genetik. __________________________________________________________________ DAFTAR PUSTAKA [1]. [2].
[3].
[4]. [5]. [6]. [7].
[8].
Ahima RS, Osei SY. Adipokines in obesity. Front Horm Res 2008. 36:182-97. Angela M. Gajda, MS, Michael A. Pellizzon, Ph.D.,Matthew R. Ricci, Ph.D. and Edward A. Ulman, Ph.D. Diet-Induced Metabolic Syndrome in Rodent Models Research Diets, Inc. 20 Jules Lane, NewBrunswick 2007, NJ 08901. Aills L, Blankenship J, Buffington C, Furtado M, Parrott J. ASMBS guidelines: ASMBS Allied Health nutritional guidelines for the surgical weight loss patient. Surg Obes Relat Dis 2008;4(5 Suppl):S73108. Epub 2008 May 19. Allan M. F., E. J. Eisen, and D. Pomp, “The M16 mouse: an outbred animal model of early onset polygenic obesity and diabesity,” Obesity Research 2004., vol. 12, no. 9, pp. 1397–1407. Arias E, Martínez PR, Ka Ming Li V, Szomstein S, Rosenthal RJ. Midterm followup after sleeve gastrectomy as a final approach for morbid obesity. Obes Surg. 2009.,19(5):544-8. Epub Mar 12. Arslan U, Turkoglu S, Balcioglu S, Tavil Y, Karakan T, Cengel A. Association between nonalcoholic fatty liver disease and coronary artery disease. Coron Artery Dis. 2007.,18:433– 436 Bays H, Lawrence Blonde and Robert Rosenson. Adiposopathy: how do diet, exercise and weight loss drug therapies improve metabolic disease in overweight patients? Expert Review of Cardiovascular Therapy. 2008.,Vol. 4, No. 6, Pages 871-895 Brown W. V., K. Fujioka, P. W. Wilson, and K. A. Woodworth, “Obesity: why be concerned?” The American Journal of Medicine 2009, vol. 122, no. 4, pp. S4–S11,.
28
[9].
[10]. [11]. [12]. [13]. [14].
[15].
[16]. [17]. [18].
[19]. [20]. [21]. [22]. [23].
[24].
Buettner R, Parhofer KG, Woenckhaus M, Wrede CE, Kunz-Schughart LA, Schölmerich J, Bollheimer LC. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of different fat types. J Mol Endocrinol 2006. 6(3):485-501 Bult MJ, Thijs Van dan Muller AF. Surgical treatment of obesity. European Journal of Endocrinology 2008,. 158. 135-145 Bozaoglu K, Bolton K, McMillan J, Zimmet P, Jowett J, Collier G, et al. Chemerin is a novel adipokine associated with obesity and metabolic syndrome. Endocrinology 2007., 148:4687-94. Cash JL, Christian AR, Greaves DR. Chemerin peptides promote phagocytosis in a ChemR23- and Syk-dependent manner 2010. Carson JL, Ruddy ME, Duff AE, Holmes NJ, Cody RP, Brolin RE. The effect of gastric bypass surgery on hypertension in morbidly obese patients. Arch Intern Med 2004.,154(2):193-200. Cash JL, Hart R, Russ A, Dixon JP, Colledge WH, Doran J, Hendrick AG, Carlton MB & Greaves DR. Synthetic chemerinderived peptides suppress inflammation through ChemR23. Journal of Experimental Medicine 2008 205 767–775. Canonico B, Betti M, Luchetti F, Battistelli M, Falcieri E, Ferri P, Zamai L, Barnett D, Papa S. Flow cytometric profiles, biomolecular and morphological aspects of transfixed leukocytes and red cells.Cytometry B Clinical Cytometry 2010., 78(4): 267-78 Corsonello A, Perticone F, Malara A, De Domenico D, Loddo S, Buemi M, et al. Leptin-dependent platelet aggregation in healthy, overweight and obese subjects, Int J Obes 2003.,27: 566-573 Chatzantoni Kokona, Panagiotis Papathanassopoulos, Euthymia Gourzoulidou, Athanasia Mouzaki. Leptin and its soluble receptor in plasma of patients suffering from remitting–relapsing multiple sclerosis (MS): In vitro effects of leptin on type-1 and type-2 cytokine secretion by peripheral blood mononuclear cells, T-cells and monocytes of MS patients 2004. Clee S. M. dan A. D. Attie. The genetic landscape of type 2 diabetes in mice,” Endocrine Reviews 2007, vol. 28, no. 1, pp. 48–83 Endo Y, Ohta M, Kai S, et al.: An obese rat model of bariatric surgery with gastric banding. Obes Surg 2007; 17: 815―819. Gajda A.M. High fat diet to induce obesity model. Obesity review 2008. Goralski KB, McCarthy TC, Hanniman EA, Zabel BA, Butcher EC, Parlee SD, et al. Chemerin, a novel adipokine that regulates adipogenesis and adipocyte metabolism. The J of Biol Chemistry 2007.,282:28175-88 Gregory B. Lesinski, Sri Vidya Kondadasula, Tim Crespin, Lei Shen, KariKendra, Michael Walker, William E. Carson III. Multiparametric Flow Cytometric Analysis of Inter Patient Variation in STAT1 Phosphorylation FollowingInterferon Alfa Immunotherapy. Journal of the National Cancer Institute 2004, Vol. 96, No. 17, September 1 Grayson BE, Levasseur PR, Williams SM, Smith MS, Marks DL, Grove KL. Changes in melanocortin expression and inflammatory pathways
29
[25].
[26]. [27].
[28].
[29].
[30].
[31]. [32]. [33]. [34]. [35]. [36].
in fetal offspring of nonhuman primates fed a high-fat diet. Endocrinology 2010.151(4):1622-32. Guh D. P., W. Zhang, N. Bansback, Z. Amarsi, C. L. Birmingham, and A. H. Anis, “The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis,” BMC Public Health 2009, vol. 9, article 88,. H. Ikeda, A. Shino, T. Matsuo, H. Iwatsuka, and Z. Suzuoki, A new genetically obese-hyperglycemic rat (Wistar fatty),Diabetes 1981, vol. 30, no. 12, pp. 1045–1050,. Hung J, McQuillan BM, Thompson PL, Beilby JP. Circulating adiponectin levels associate with infalmatory markers, insulin resistance and metabolis syndrome independent of obesity, Int J Obes 2008.,32:772-779 Hajer, Gideon R., Timon W. van Haeften, and Frank L.J. Visseren1. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal 2008. 29, 2959–2971 Halberg Nils ,, Todd D. Schraw, Zhao V. Wang, Ja-Young Kim, James Yi, Mark P. Hamilton, Kate Luby-Phelpsand Philipp E. Scherer. Systemic Fate of the Adipocyte-Derived Factor Adiponectin. American Diabetes Association 2009., Iizuka S, Suzuki W, Tabuchi M, Nagata M, Imamura S, Kobayashi Y, Kanitani M, Yanagisawa T, Kase Y, Takeda S, Aburada M, Takahashi KW. Diabetic complications in a new animal model (TSOD mouse) of spontaneous NIDDM with obesity. Exp Anim 2005. 54(1):71-83. Iizuka S, W. Suzuki, M. Tabuchi et al., “Diabetic complications in a new animal model (TSOD mouse) of spontaneous NIDDM with obesity,” Experimental Animals 2005, vol. 54, no. 1, pp. 71–83,. Imai K, N. Kudo, M. Koyama, and Y. Kawashima,. Effects of dehydroepiandrosterone on oleic acid accumulation in rat liver. Biochemical Pharmacology 2003, vol. 65, no. 10, pp. 1583–1591, Joost HG. The genetic basis of obesity and type 2 diabetes: lessons from the new zealand obese mouse, a polygenic model of the metabolic syndrome. Probl Cell Differ 2010. 52:1-11. Kanasaki H, dan Daisuke K. Biology of obesity: lessons from animal model of obesity. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2011. Kanno H, Teruo K, Itsuo F, Shunji K, Toshiro Y dan Takashi T. A rat gastric banding model for bariatric surgery. J Nippon Med Sch.2008., 75(4).p202-206 Kazuyuki Hida, Jun Wada, Jun Eguchi, Hong Zhang, Masako Baba, Aya Seida, Izumi Hashimoto, Tatsuo Okada, Akihiro Yasuhara, Atsuko Nakatsuka, Kenichi Shikata, Shinji Hourai, Junichiro Futami, Eijiro Watanabe, Yasushi Matsuki, Ryuji Hiramatsu, Shigeru Akagi, Hirofumi Makino, and Yashpal S. Kanwar.,. Visceral adiposetissue-derived serine proteaseinhibitor: A unique insulin sensitizing adipocytokine in obesity Communicated by George E. Palade, University of California at San Diego 2005., La Jolla, CA, June 6 (received for review November 24, 2004)
30
[37]. [38].
[39].
[40]. [41].
[42]. [43]. [44]. [45]. [46]. [47].
[48].
[49].
[50].
Kempft AM, Myra LS, Chaoying Li, Harsohena K, Terry TK, Huang. Leptin as a marker of body fat and hyperinsulinemia in college students, J of ACH 2006.,55: 175-180 Keller Pernille, Keller Charlotte, Adam Steensberg, Lindsay E. Robinson, and Bente K. Pedersen . Leptin gene expression and systemic levels in healthy men: effect of exercise, carbohydrate, interleukin-6, and epinephrine. J Appl Physiol 2005., 98:1805-1812. First published 7 January. Kerry B. Goralski, Tanya C. McCarthy, Elyisha A. Hanniman, Brian A. Zabel, Eugene C. Butcher, Sebastian D. Parlee , Shanmugam Muruganandan and Christopher J. Sinal. Chemerin, a Novel Adipokine That Regulates Adipogenesis and Adipocyte Metabolism 2007,. Kim S, Naima MM. Secretory, endocrine and autocrine/paracrine function of the adipocyte, J Nutr 2000.,130: 3110S-3115S Kodera R, Shikata K, Kataoka HU, Takatsuka T, Miyamoto S, Sasaki M, Kajitani N, Nishishita S, Sarai K, Hirota D, Sato C, Ogawa D, Makino H. Glucagon-like peptide-1 receptor agonist ameliorates renal injury through its anti-inflammatory action without lowering blood glucose level in a rat model of type 1 diabetes. Diabetologia 2011. Kopelman P, “Health risks associated with overweight and obesity,” Obesity Reviews 2007,. vol. 8, no. 1, pp. 13–17,. Lustig RH, Sen, Soberman JE, Velasquez-Mieyer,. Obesity, leptin resistance, and the effects of insulin reduction, Int Jl of Obes 2004.,28: 1344-1348 M. Watanabe, S. M. Houten, C. Mataki et al., “Bile acids induce energy expenditure by promoting intracellular thyroid Ma H, Kuan-Jiunn S, Sheau-Long L. Study of ELISA Technique. Nature and Science 2006, 4(2),p36-37 Ma H. Western Blotting Method. The Journal of American Science 2006., 2(2), p:23-27 Masouleh BM, Baraniskin A, Schmiegel W. Quantification of circulating endothelial progenitor cells in human peripheral blood: Establishing a reliable flow cytometry protocol Journal of Immunological Methods 2010.,357: 38-42 Maedaa Takehiko, , Norikazu Kiguchia, Yuka Kobayashia, Toshihiko Ikutaa, Masanobu Ozakib, and Shiroh Kishiokaa. Leptin derived from adipocytes in injured peripheralnerves facilitates development of neuropathic painvia macrophage stimulation. aDepartment of Pharmacology, Wakayama Medical University, Wakayama 641-0012, Japan; and Department of Toxicology, Niigata University of Pharmacyand Applied Life Science 2009, Niigata 950-2028, Japan Martín-Cordero L, García JJ, Hinchado MD, Bote E, Manso R, Ortega E. Habitual physical exercise improves macrophage IL-6 and TNF-α deregulated release in the obese zucker rat model of the metabolic syndrome. Neuroimmunomodulation 2011. 18(2):123-30. Matsunaga N, Virador V, Santis C. et al., “In situ localization of agouti signal protein in murine skin using immunohistochemistry with an
31
[51]. [52]. [53]. [54]. [55].
[56]. [57]. [58].
[59]. [60].
[61].
[62].
[63]. [64]. [65].
ASP-specific antibody,” Biochemical and Biophysical Research Communications 2000, vol. 270, no. 1, pp. 176–182,. Monteiro MP, Monteiro JD, Aguas AP, et al.: A rat model of restrictive bariatric surgery with gastric banding. Obes Surg 2006; 16: 48―51. Monteiro MP, Monteiro JD, Aguas AP, et al.: Rats submitted to gastric banding are leaner and show distinctive feeding patterns. Obes Surg 2006; 16: 597―602. Munzberg H, Martin GM. Molecular and anatomical determinants of central leptin resistance, Nat Neurosci 2005.,8: 566-570 Noguchi Y. N. Nishikata, N. Shikata et al. Ketogenic essential amino acids modulate lipid synthetic pathways and prevent hepatic steatosis in mice,” PLoS One 2010, vol. 5, no. 8, Article ID e12057, Ohta M, Shiromizu A, Endo Y, et al.: Intragastric balloon and laparoscopic adjustable gastric banding: treatments for patients with morbid obesity in Japan (in Japanese). J Jpn Soc Endosc Surg 2006; 11: 631―638 Okazaki M. Y. Saito, Y. Udaka et al., Diabetic nephropathy in KK and KK-A mice, Experimental Animals 2002, vol. 51, no. 2, pp. 191–196, Pe’russe, L., Chagnon, YC., Weisnagel, J. The human obesity gene map: the 2000 update, Obes Res 2001.,9:135-169 Prasad SS, Prashanth A, Kumar CP, Reddy SJ, Giridharan NV, Vajreswari A. A novel genetically-obese rat model with elevated 11 betahydroxysteroid dehydrogenase type 1 activity in subcutaneous adipose tissue. Lipids Health Dis 2010. 17;9:132. Roh S, Song SH, Choi KC, Katoh K, Wittamer V, Parmentier M, et al. Chemerin – A new adipokine that modulates adipogenesis via its own receptor. Biochem and Biophys Research Comm 2007.,362:1013-18. Seeger Jeannette, Michaela Ziegelmeier, Anette Bachmann, Ulrike Lo¨ ssner, Ju¨ rgen Kratzsch,Matthias Blu¨ her, Michael Stumvoll, and Mathias Fasshauer. Serum Levels of the Adipokine Vaspin in Relation to Metabolic and Renal Parameters. J Clin Endocrinol Metab 2008, January, 93(1):247–251 Shahab Uddin, Rong Bu, Maqbool Ahmed, Jehad Abubaker, Fouad AlDayel, Prashant Bavi and Khawla S Al-Kuraya. Overexpression of leptin receptor predicts an unfavorable outcome in Middle Eastern ovarian cancer Molecular Cancer 2009.,2, 8:74. Sharma D, Wang J, Fu PP, Sharma S, Nagalingam A, Mells J, Handy J, Page AJ, Cohen C, Anania FA, Saxena NK. Adiponectin antagonizes the oncogenic actions of leptin in hepatocellular carcinogenesis. Hepatology. Nov;52(5):1713-22. Speakman J. C. Hambly, S. Mitchell, and E. Kr ´ol. Animal models of obesity. Obesity Reviews 2007. 8(1). pp. 55–61, Srinivasan K dan P. Ramarao. Animal models in type 2 diabetes research: an overview,” Indian Journal of Medical Research 2007, vol. 125, no. 3, pp. 451–472 Tan BK, Chen J, Farhatullah S, Adya R, Kaur J, et al. Insulin and metformin regulate circulating and adipose tissue chemerin. Diabetes 2009., 58(9):1971–1977.
32
[66].
[67].
[68].
[69]. [70]. [71]. [72]. [73]. [74].
Tan Bee K., Dennis Heutling, Jing Chen, S. Farhatullah, Raghu Adya, Stephen D. Keay,1 C. Richard Kennedy, Hendrik Lehnert, and Harpal S. Randeva. Metformin Decreases the Adipokine Vaspin in Overweight Women With Polycystic Ovary Syndrome Concomitant With Improvement in Insulin Sensitivity and a Decrease in Insulin Resistance. Diabetes 2008, vol. 57, june . Trevaskis J, Walder K, Foletta V, Kerr-Bayles L, McMillan J, Cooper A, Lee S, Bolton K, Prior M, Fahey R, Whitecross K, Morton GJ, Schwartz MW, Collier GR. Src homology 3-domain growth factor receptorbound 2-like (endophilin) interacting protein 1, a novel neuronal protein that regulates energy balance. Endocrinology. 146(9):3757-64. Vivian Berg1 , Baldur Sveinbjörnsson 2,3 , Signy Bendiksen4 , Jan Brox1,5 , Khaled Meknas6 and Yngve Figenschau1,5,. Human articular chondrocytes express ChemR23 and chemerin; ChemR23 promotes inflammatory signalling upon binding the ligand chemerin21-157, Arthritis Research & Therapy 2010, 12:R228. Walker J.M dan Rapley Ralph. Medical biomethods handbook. Humana Press. Toronto 2005. Westermeier R, Marouga R. Protein detection methods in proteomics research. Biosci Rep 2005. 25(1-2):19-32 World Health Organization, “Fact sheet: Obesity and overweight,” http://www.who.int/hpr/gs.fs.obesity.shtml. Yoshimura T & Oppenheim JJ. Chemerin reveals its chimeric nature. Journal of Experimental Medicine 2008.,205 2187–2190. Yuka Onoa, Eri Hattori a, Yukitaka Fukaya a, Shoji Imai a, Yasushi Ohizumi b,. Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology 2006., 106 , 238–244 Zhang Y., K. Guo, R. E. LeBlanc, D. Loh, G. J. Schwartz, and Y. H. Yu,. Increasing dietary leucine intake educes diet-induced obesity and improves glucose and cholesterol metabolism in mice via multimechanisms,” Diabetes 2007. vol. 56, no. 6, pp. 1647–1654,
33
