Mire tud választ adni ma az élelmiszer-anaitika?

Mire tud választ adni ma az élelmiszer-anaitika? – Gluténmentes termékek vizsgálatának nemzetközi tapasztalati, tények, megoldandó feladatok, fejlesztési irányok Tömösközi Sándor, Bugyi Zsuzsanna, Török Kitti Gluténmentes élelmiszerek jogi szabályozása és vizsgálata Munkaértekezlet Vidékfejlesztési Minisztérium 2011. november 8. BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

1

A probléma… 1. A fogalmak tisztázása Gabona/búzafogyasztással kapcsolatos rendellenességek - lisztérzékenység/cöliákia - gabona /búza / glutén allergia 2. A kiváltó okok tisztázása - Mely fehérjék miért felelősek? - Tudunk-e mindent? 3. Milyen válaszokat tud adni ma az analitika? BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

2

A lisztérzékenység / cöliákia * Rendellenesség leírása : felszívódási zavar – autoimmun betegség

* Patofiziológia: Többfaktoros rendellenesség

* Felelős komponensek - fehérjék - többségében prolaminok (prolin és glutamin aminosavakban gazdag fehérjék) - gliadin a búzában - hordein az árpában - szekalin a rozsban - alkohol oldhatóak és ellenállnak a fehérjebontó enzimeknek BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

3

A lisztérzékenység / cöliákia * Felelős komponensek – transz-glutamináz - antitestjei a cöliákiás esetek többségénél megtalálható - a gliadin glutamát csoportja és az enzim lizin-oldallánca között alakít ki kovalens kötéseket - új epitóp (az eredeti fehérjében nem található) epitóp jön létre - megindítja az elsődleges immunválaszt BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

4

A búza / glutén allergia * Rendellenesség leírása: - Élelmiszer-allergia jellemző tünet együttes

* Patofiziologia: - IgE mediált immunválasz

* Felelős komponensek - magvak tartalékfehérjéi - csak egy része köthető a búza sikérfehérjéihez - jelenleg 27 potenciális búza allergént azonosítottak (Sotkovský P et al,Clin Exp Allergy. 2011 Jul) - prolamin allergének (Ω-5 gliadinok, γ-gliadinok) - glutenin allergének (9 kis moltömegű (LMW) alegység) - albumin és globulin allergének (biológiailag aktív fehérjék, amiláz, lipid transzferáz, tripszin inhibítor)

- keresztreakciók is ismertek BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

5

A probléma… Prolamin szupercsalád gliadinok glutelinek Nem-specifikus lipidtranszfer proteinek α-amiláz- és/vagy tripszin-inhibitorok

Allergiát vagy intoleranciát kiváltó gabonafehérjék BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

6

EU szabályozás: A „Big Eight”

+ 2003/89/EC,2006/142/EC

Gabonák (glutén) Rákfélék Hal Tej Tojás Mogyoró Dió Szója

Jelölési kötelezettség

Puhatestűek Zeller Mustár Szezám Csillagfürt Kén-dioxid

BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

7

Codex szabályozás: Codex stan. 118-1979

Gluténmentes: 20 mg/kg glutén koncentráció alatt Alacsony gluténszint: 20-100 mg/kg glutén koncentráció BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

8

IPAR • Szabályozás • Ellenőrzés

HATÓSÁG

FOGYASZTÓ

• Termékgyártás • Felelősség • Jelölési kötelezettség • Gazdasági szempontok

LABOROK

• Betegség (rendellenesség) • Speciális termékigény • Ellenőrzés igénye • Támogató tevékenység: •klinika •diagnosztika •analitikai

KUTATÁS

• Saját vagy külső • Megbízható analitikai apparátus biztosítása (akkreditálás) • Validált módszerek


9

Milyen mértékben teljesíthető a jelölési kötelezettség? Milyen komponenst mérünk Miben mérjük a (minőségi vagy mennyiségi meghatározandó komponenst? meghatározás?) Melyik fehérjeEpitópokat tartalmazó molekulák?

Egyéb molekulák?

molekula okozza a rendellenességet? A kérdéses epitóp meghatározása

Előfordulásuk és arányuk változó Klinika Analitikai, élelmiszerbiztonság

•Egyszerű mátrix? •Feldolgozott élelmiszer?

Technológia, fehérjekémia, analitikai, klinika…


10

A gabona/búzafehérjékkel kapcsolatos analitika specifikus problémái Klasszikus analitika Pl. Cu-meghatározás

Allergén-analitika

Immunanalitika

Pl. gliadin-meghatározás



•Pontosan ismert az analit?

•Epitóp?



•Lehetséges megbízható mennyiségi meghatározás?

•Extrakciós módszer?

- HOGYAN JÁRULHAT HOZZÁ A •Milyen módszert •Ellenanyag?  RENDELLENESSÉGGEL ÉLŐK ÉLETMINŐSÉGÉHEZ alkalmazzunk? ? •Homogenizálás? AZ ÉLELMISZERANALITIKA? -HOGYAN ADHATUNK ELFOGADHATÓ VÁLASZT A •Feldolgozási folyamatok FOGYASZTÓ, AZ IPAR ÉS A HATÓSÁG RÉSZÉRE? hatása?

MÓDSZEREK ÉRVÉNYESÍTÉSE? BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

11

A gliadin mennyiségi meghatározásának néhány specifikus kérdése • Van allergénmentes búza? • Melyik epitópot tartalmazó fehérje milyen mennyiségben van jelen? • Van különbség a búzafajták fehérjealegységeinek eloszlása között? • Vagyis mi az elérhető cél? A búza jelenlétének kimutatása vagy az egészségügyi kockázatot jelentő egyes komponensek - vagyis a toxicitás mértékének meghatározása? BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

12

A sikér (gliadin) kimutatására alkalmas analitikai módszerek érvényesítésének nehézségei •Oldékonyságuk eltérő (hidrofób és hidrofil fehérjék) •Referencia anyagok hiányoznak •Referencia módszerek hiányoznak

Az analitikai és validálási fogalmak és folyamatok átgondolása szükséges. BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

13

33 partner, 20 ország / 4 kontinens Jelenleg: 92 regisztrált intézmény 35 országból

• •

155 kutató, ezen belül 40 PhD hallgató Időtartam: 5 év – kezdet 2007 február 1. EU támogatás: 12.3 M €

Koordinátor: Roland Ernest Poms, ICC – International Association for Cereal Science and Technology, Vienna, Austria

www.moniqa.org

1 Microbiological Contaminants

Method Performance

2 Biotoxins/Phycotoxins

Quality Assurance and Control

3 Chemical Contaminants

Sampling

4 Food Allergens

Measurement Uncertainty

5 Food Authenticity

Legislation

6 Food Additives

Socio-Economic Impact

Future Issues

Traceability

7 Qualitative Method Validation

Harmonisation

8 Socio-Economic Impact


14

Problémamegoldás – referenciaanyag fejlesztése 1.

Feldolgozott modelltermék előállítása módosított recept alapján*

2. 3.

Az analitikai módszer vizsgálata

A feldolgozási folyamat hatásának vizsgálata

*Scaravelli E, Brohée M, Marchelli R, van Hengel, A J. Development of three real-time PCR assays to detect peanut allergen in processed food products. Eur. Food Res. Technol. 2008; 227:857-869


15

Kísérletterv Porkeverékek készítése

Tésztakészítés 0 , 10 és 100 ppm gliadin

ELISA 3 minta/sütés

Süteménykészítés 3 sütés/koncentrációszint 3 sütemény/sütés


16

Első kísérleti eredmények •Homogenitás problémák

Gliadin koncentráció (ppm)

10 ppm gliadin-tartalmú sütemények

Gliadin koncentráció (ppm)

Homogenitási kísérletek

100 ppm gliadin-tartalmú sütemények 120 100

80 60 40 20 0

40 35 30 25 20 15 10 5 0


17

Gliadin koncentráció, ppm

0 Gliadin koncentráció, ppm

Sigma 80 %…

Sigma 80 %…

Sigma 80 %…

Sigma 70 %…

Sigma 70 %…

Sigma 70 %…

Sigma 60 %…

Sigma 60 %…

Sigma 60 %…

Sigma 80 %…

Sigma 80 %…

Sigma 80 %…

Sigma 70 %…

Sigma 70 %…

Sigma 70 %…

Sigma 60 %…

Sigma 60 %…

Sigma 60 %…

4000

2000

14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 BOKU 60 % ethanol BOKU 60 % ethanol BOKU 60 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 70 % ethanol BOKU 80 % ethanol BOKU 80 % ethanol BOKU 80 % ethanol BOKU 60 %… BOKU 60 %… BOKU 60 %… BOKU 70 %… BOKU 70 %… BOKU 70 %… BOKU 80 %… BOKU 80 %… BOKU 80 %…

Oldási kísérlet – új fehérjeizolátum alkalmazása

Oldási kísérlet, Sigma

14000

12000

10000

8000

6000

Oldási kísérlet, BOKU

BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék 18

Új típusú mintamátrix készítése 14

Gliadinforrás: Referencia liszt

12 10

8 6 4 2

50 ppm sütemény

0 1

2

3

4

5 Gliadin concentration (ppm)

Gliadin concentration (ppm)

10 ppm sütemény

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1

2

3

4


5

19

A feldolgozási folyamat hatása Denaturáció?

Extrahálhatóság?

Immunaffinitás?

Szerkezetmódosulás?

Detektálhatóság?

Klinikai hatás? BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

20

Módszerek összehasonlítása sikér (glutén) tartalom mérése esetén Gyártó

Kit neve

LoD

LoQ

Standard sor

ELISA Systems

Gliadin

2,5 ppm gliadin

2,5 ppm gliadin

0, 2,5, 5, 10, 20, 25 ppm gliadin

Haven

Gluten-Check ELISA

1 ppm glutén

7,5 ppm glutén

37,5, 75, 150, 300, 600 ng/ml glutén

Morinaga

Wheat Protein ELISA kit

0,3 μg/kg fehérje

0,78 ng/ml fehérje

0,78, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, 25 ng/ml búza fehérje

R-Biopharm

RIDASCREEN Gliadin

1,5 ppm gliadin

2,5 ppm gliadin

0, 5, 10, 20, 40, 80 ppb gliadin

Romerlabs

AgraQuant Gluten Assay

0,6 ppm

4 ppm glutén

0, 4, 12, 40, 120 ppm glutén

Tepnel

BIOKITS Gluten Assay Kit

1 ppm glutén

3 ppm glutén

0, 3, 5, 10, 20, 50 ppm glutén

Veratox

Quantitative Gliadin Test

Nincs adat

5 ppm gliadin

0, 5, 10, 20, 50 ppm gliadin


21

Összehasonlító vizsgálatok ELISA tesztek eredményeinek összehasonlító elemzése • Ellenanyag? • Epitóp • Extrakció? FONTOS ANALITIKAI ÉS • Kalibráló ÉLELMISZERBIZTONSÁGI anyag?

KÉRDÉS


22

Stabilitás vizsgálatok A referenciaanyag jelölt modelltermék sütemény stabilitása megfelelő


23

Felmerülő problémák Glutelin : Gliadin 1:1

? Valóság?

Irodalmi adatok • Genetikai variabilitás • Környezeti tényezők hatása Genetikailag különböző búzafajták keveréke

1 fajtazonos búza

• Mintamátrixok készítése • Elválasztástechnikai vizsgálatok


24

Összegzés • A validálás egyik feltétele teljesíthető • Referenciaanyag laborszintű előállítása megoldható

• A feldolgozási folyamatoknak jelentős hatása van a rendellenességeket kiváltó komponensek mérhető koncentrációjára • Az okok és a hatások magyarázatával a tudomány részben adós

• A jelenleg forgalomban lévő kittekkel kapott eredmények eltérnek • Összemérés, analitikai módszerfejlesztés szükséges

• Első az élelmiszerbiztonság, a fogyasztók biztonsága, de… • A szabályozást harmonizálni kell(ene) a lehetőségekkel!!! BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék

25

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS • MoniQA Kiválóság-hálózat (FOOD-CT-2006-036337) • BME Allergén Munkacsoport • Dr. Gelencsér Éva és Valentin Éva, KÉKI • Dr. Bert Pöpping és Dr. Sandra Kerbach, Eurofins Analytik GmbH, Hamburg, Németország • Prof. Emmerich Berghofer, BOKU, Bécs, Ausztria


26

Köszönjük megtisztelő figyelmüket!


27

Elsődleges eredmények 2. •Visszanyerési problémák

Oldási kísérletek

Gliadin visszanyerés a porkeverékből 16000

Gliandin koncentráció (ppm)

14000 12000 10000 Névleges koncentráció

8000

Mért átlagos koncentráció 6000 4000 2000 0 1


28

Homogenizálási kísérlet •Új homogenizálási módszer kidolgozása Gliadin homogenizálás oldatban Gliadin koncentráció, ppm

180 160 140 120 100 80 60 40 20 0


29

Mire tud választ adni ma az élelmiszer-anaitika?

Recommend Documents