Microbiële genetica Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties

Thema: Genetica

D.M. Deng , W. Crielaard

Microbiële genetica Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties Meer inzicht in de microbiële genetica van pathogene orale micro-organismen en een nieuw scala van moleculair genetische technieken hebben samen geleid tot andere strategieën in de ontwikkeling van antimicrobiële geneesmiddelen. In dit artikel wordt de belangrijke rol van de kennis van de microbiële genetica in het voorkomen en bestrijden van (orale) infectieziekten geïllustreerd. Na een aantal termen van het jargon te hebben geïntroduceerd, wordt de rol die de microbiële genetica speelt in de ‘target-based’ ontwikkeling van antimicrobiële geneesmiddelen ter preventie en behandeling van (orale) infecties besproken. Daarna wordt ook nog de impact van de microbiële genetica op vaccinontwikkeling en een aantal nog vooral experimentele preventiestrategieën behandeld.

Deng DM, Crielaard W. Microbiële genetica. Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties. Ned Tijdschr Tandheelkd 2008; 115: 93-99

Microbiële genetica en infecties Genetica en genetische technieken worden steeds meer onderdeel van het dagelijks leven. Genetische inzichten, begrippen en technieken worden niet alleen meer toegepast in fundamenteel of toegepast onderzoek, ze vinden steeds sneller hun weg naar de kliniek. Een goed voorbeeld is de vinding van de RNA-interferentietechniek (Fire et al, 1998). Nu, 10 jaar later, wordt deze techniek al toegepast in kankertherapieën. In tegenstelling tot de klassieke genetica (erfelijkheidsleer) en de klinische genetica (risicobeoordeling) is de microbiële genetica moleculair gericht. Het onderzoek richt zich vooral op de (moleculaire) mechanismen van expressie (activiteit) van sets van genen en, in de mondzorg en de medische microbiologie, vanzelfsprekend op de genen die betrokken zijn bij de virulente eigenschappen van micro-organismen. Steeds vaker worden alle genen van 1 micro-organisme tegelijkertijd geanalyseerd en gevolgd, bijvoorbeeld om het effect van een (nieuw) antimicrobieel middel te begrijpen. Alle genen samen vormen het genoom van het micro-organisme. De interpretatie van de functie van genen op het genoom en het bestuderen en vergelijken van verschillende genomen wordt genomics genoemd. De activiteit van de genen op het genoom kan worden gemeten via ‘transcriptomics’. Omdat tijdens deze analyse ‘DNA-micro-arrays’ (DNA-chips) worden gebruikt, wordt dit soort onderzoek vaak een ‘micro-array’-experiment genoemd. Ook wordt vaak de techniek ‘proteomics’ gebruikt. Hierbij worden alle microbiële eiwitten die onder een bijvoorbeeld virulente conditie aanwezig zijn, geanalyseerd.

Ned Tijdschr Tandheelkd 115 februari 2008

Cariës en parodontitis zijn de 2 belangrijkste infectieziekten in de mond. Beide ziekten zijn het resultaat van een orale microflora die uit balans is geraakt. Voor het ‘-omics’tijdperk werden micro-organismen vooral bestudeerd en gekarakteriseerd aan de hand van hun fysiologische eigenschappen. De nadruk werd gelegd op het chemisch karakteriseren van bacteriële metabole tussen- en eindproducten (bijvoorbeeld zuren) en het isoleren van de daarbij betrokken enzymen. Het onderzoek in de orale microbiologie was gecentreerd rond het karakteriseren van de micro-organismen in plaque en de rol die deze speelden in cariës, gingivitis en parodontitis (Socransky, 1977; Kleinberg, 2002). Op verschillende manieren werd duidelijk dat Streptococcus mutans en andere mutans streptokokken belangrijk waren in de etiologie van cariës, terwijl Aggregatibacter actinomycetemcomitans en Porphyromonas gingivalis als belangrijke micro-organismen in het ontstaan van parodontitis werden geïdentificeerd (Loesche, 1986; Dahlén, 1993). In de afgelopen 5 jaar is de genoomsequentie van een groot aantal (orale) bacteriën opgehelderd (Duncan, 2005). Op dit moment is de genoomsequentie van meer dan 10 orale pathogene bacteriën beschikbaar, waaronder die van Streptococcus mutans, Aggregatibacter actinomycetemcomitans en Porphyromonas gingivalis. Onderzoek naar de etiologie, de diagnostiek en de preventie van cariës en parodontitis heeft enorm geprofiteerd van deze kennis van het genoom en van de nieuwe ontwikkelingen in de biotechnologie en de moleculaire biologie. Bijna alle veranderingen in de fysiologie en de virulentie

93

Thema: Genetica

van een bacterie worden ingeleid door veranderingen in genexpressie. Streptococcus mutans UA159, een bacteriestam waarvan de genoomsequentie bekend is geworden, heeft 1 chromosoom met daarop 1.966 genen (Ajdić et al, 2002). Onder normale groeiomstandigheden is maar een gedeelte van die genen actief. Als de condities veranderen, bijvoorbeeld als de pH in de mond lager wordt, worden allerlei nieuwe genen geactiveerd, zoals groESL en clpP (Len et al, 2004). Dit is een groep genen die de bacterie beschermen tegen stresscondities of betrokken zijn bij het opruimen van door de lage pH beschadigde celcomponenten. Andere genen worden tegelijkertijd gedeactiveerd met als eindresultaat een Streptococcus mutans met een fysiologie die volledig is aangepast aan de zure, cariogene omstandigheden. Naast variatie in de activiteit van de eigen set genen hebben veel bacteriën ook nog de mogelijkheid om zich aan te passen door te muteren of door actief DNA op te nemen en te gebruiken van andere bacteriën (in de mond). De ontwikkeling van antibioticaresistentie in nosocomiale pathogenen is een voorbeeld van actieve DNA-opname door bacteriën (Wenzel, 2007). In het genoom van Streptococcus mutans UA159 kan een gen worden gevonden dat de bacterie heeft overgenomen van Actinobacillus pleuropneumoniae. Dit gen, dat een duidelijke functie heeft, kan Streptococcus mutans helpen te overleven onder nog zuurdere (cariogene) omstandigheden (Korithoski et al, 2005; Marri et al, 2006).

Microbiële genetica en preventie en behandeling van infecties Al jaren wordt veel energie gestoken in het controleren van (de effecten) van orale infectieziekten. Allerlei nieuwe preventiestrategieën zijn ontwikkeld waarvan in de cariologie het gebruik van fluoride, via het remmen van demineralisatie en het bevorderen van remineralisatie zeer succesvol is geweest (Ten Cate, 2004). Het is echter nog niet gelukt de microbiële component van de orale infecties effectief onder controle te krijgen. Er bestaan 2 inzichten die worden gevolgd bij de ontwikkeling van preventie- en behandelstrategieën tegen orale pathogene micro-organismen: de specifieke plaquehypothese en de ecologische plaquehypothese (Marsh, 1994). Bij de eerste hypothese staat het bestrijden van een specifiek pathogeen centraal. Op basis van die hypothese zijn onder andere antimicrobiële stoffen en vaccins tegen bekende pathogenen als Streptococcus mutans en Porphyromonas gingivalis ontwikkeld. Op basis van de ecologische plaquehypothese worden strategieën ontwikkeld vanuit het begrip dat de gehele microbiële populatie verschuift tijdens het infectieproces (Sbordone en Bortolaia, 2003). Het moge duidelijk zijn dat de moleculaire microbiële genetica in beide gevallen een zeer waardevolle bijdrage kan leveren. Ontwikkeling van antibacteriële geneesmiddelen Het is moeilijk gebleken (nieuwe) antimicrobiële middelen te ontwikkelen die langere tijd kunnen worden gebruikt en

94

geen bijeffecten hebben. In de afgelopen jaren zijn artikelen verschenen waarin naar voren wordt gebracht dat de ontwikkeling van antibacteriële geneesmiddelen moeilijke tijden doormaakt. Een groot aantal farmaceutische bedrijven stopte of minimaliseerde de ontwikkeling en het onderzoek van antibacteriële middelen (Overbye en Barrett, 2005; Mills, 2006). In verband met de snel verkregen resis tentie maakt de lange tijd die nodig is voor ontwikkeling en onderzoek het proces onrendabel. De ontwikkelingstijd moet worden versneld en er ontstaat steeds meer aandacht voor het ontdekken van antimicrobiële middelen waartegen resistentie minder voor de hand ligt. Genomics wordt gezien als een krachtig gereedschap om het hele proces weer vlot te trekken (Mills, 2006). In de afgelopen 15 jaar is ‘target-based’, op een specifiek doel gericht, het nieuwe paradigma in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Dit heeft de traditionele, op fysiologie gebaseerde strategie verdrongen (Sams-Dodd, 2005). Target-based geneesmiddelen zijn ontworpen om de functie of de expressie van 1 of meer virulentiefactoren te remmen, terwijl de traditionele antimicrobiële middelen gericht zijn op het doden van het pathogene micro-organisme. Targetbased antimicrobiële middelen zijn dus vaak soortspecifieke remmers, terwijl de traditionele antibiotica juist zijn gericht op aspecten die geconserveerd zijn in de moleculaire biologie van micro-organismen, zoals de machinerie van de celwandsynthese of de eiwitsynthese. Het brede spectrum van traditionele antibiotica heeft zeker in de mondzorg een aantal ongewenste bijeffecten: verstoring van de normale flora, groei van potentieel gevaarlijke bacteriën en schimmels en een verhoogde kans op transmissie van antibioticaresistentie (Curtis et al, 2002). Voor de identificatie en validatie van ‘targets’ wordt de genoominformatie van het te bestrijden micro-organisme gebruikt. Daarna volgt het identificeren of screenen van remmers en het optimaliseren van de remmers (afb. 1). Onderzoekers in de moleculaire biologie, zeker die binnen de mondzorg werkzaam zijn, concentreren zich vooral op de initiële aspecten van het hele proces: het identificeren en valideren van mogelijke targets. Een dergelijk antibacterieel target is vaak een virulentiegen dat juist functioneert tijdens het infectieproces. Het targetgen moet belangrijk zijn tijdens de virulentie. Dus het kan te maken hebben met de aanhechting of de groei van het micro-organisme of met het ‘omzeilen’ van het immuunsysteem. Als het proces waarin het gen is betrokken, geremd is, zullen de micro-organismen of niet overleven tijdens een infectie of niet virulent zijn. Als een dergelijk gen in het genoom van het micro-organisme is gevonden, wordt vervolgens het menselijk genoom onderzocht om te achterhalen of daarin ook een homoloog van het bacteriële target aanwezig is. Tevens wordt onderzocht in hoeveel aspecten dit homoloog overeenkomt met de bacteriële variant. Hiermee kan in een vroeg stadium al een risicoanalyse op potentiële toxiciteit van een geneesmiddel worden uitgevoerd (Sams-Dodd, 2005; Mills, 2006).


Deng en Crielaard: Microbiële genetica

Ontwikkeling van antibacteriële middelen in vitro De meest gebruikte methode om de Genoomsequentie functionaliteit of het belang van een bacterieel gen te onderzoeken, is het maken van een zogenaamde ‘knockout’-stam, waarin het desbetreffende gen is verwijderd of vervangen door Selectie Optimalisatie van Identificatie van een ‘marker’-gen. Door vervolgens de van targets remmer remmer fysiologische eigenschappen van deze • Optimalisatie van remmer • Ontwikkeling van screens ‘knock-out’-stam onder verschillende • Identificatie van targets • Effectiviteit in genezing • Intensieve screening • Verificatie van targets • Optimalisatie van dosis groeicondities te vergelijken met die • Mechanismen van remmer • Selectie van targets • Bijwerkingen • Hits Remmers van de originele stam kan de functie van het desbetreffende gen worden vastgesteld. Sinds de opheldering van Nieuwe antibacteriële de genoomsequenties van een aantal geneesmiddelen orale bacteriën is er een stroom van dergelijke onderzoeken op gang gekomen, waarvan 2 voorbeelden worden besproken. Beide onderzoeken zijn Afb. 1. Illustratie van de speurtocht naar nieuwe antibacteriële geneesmiddelen (aangepast op basis van illustratief voor het belang van de Rosamond en Allsop, 2000). moleculaire genetica bij de ‘targetspecifiek de werking van het Kgp-eiwit te remmen in infecbased’ ontwikkeling en validering van geneesmiddelen. Voorbeeld 1. Porphyromonas gingivalis is al lang bekend tiemodellen (Curtis et al, 2002). Gebaseerd op de kennis als een van de belangrijke pathogenen in de subgingivale dat Kgp en Rgp ook specifiek histatinen kunnen afbreken plaque. Dit micro-organisme is verantwoordelijk voor de in combinatie met driedimensionale inzichten ontwikprogressie van parodontitis en het verlies van (bot)weefsel kelde een andere groep FA-70C1 (Kadowaki et al, 2004). (Holt et al, 1988; Van Steenbergen et al, 1989). Virulentie- Ook deze stof liet een indrukwekkend remmend effect op eigenschappen van Porphyromonas gingivalis zijn onder de groei van Porphyromonas gingivalis zien. Beide onderandere aanhechtingsmechanismen, uitscheiding van toxi- zoeken zijn illustraties van het belang van de moleculaire nen, biofilmvorming en het verstoren of remmen van de genetica bij de ontwikkeling en validatie van ‘target-based’ gastheerafweer. Veel genen die betrokken zijn bij de viru- geneesmiddelen. lentie, zijn geïdentificeerd. Zo is bekend dat de genen fimA, Voorbeeld 2. Ook de genoomsequentie van Streptococcus sspA/B en gtfA betrokken zijn bij aanhechting van Porphy- mutans is sinds enige tijd bekend. Deze bacterie, die in staat romonas gingivalis aan de zachte weefsels in de mond of aan is snel suikers in zuren om te zetten en bij lage pH nog actief andere orale micro-organismen, zoals Streptococcus gordonii kan zijn, is betrokken bij cariës (Loesche, 1986). De belang(Watanabe-Kato et al, 1998; Narimatsu et al, 2004; Park et rijkste virulentie-eigenschappen van deze bacterie zijn al, 2006). De genen ftsH, galE en PG0106 zijn betrokken bij zuurresistentie en biofilmvorming. Ook voor deze bacterie kapselsynthese (Davey en Duncan, 2006; Nakao et al, 2006; zijn via ‘knock-out’-stammen veel genen geïdentificeerd die Simionato et al, 2006). De best bestudeerde virulentiefacto- betrokken zijn bij deze processen, zoals vicRK, een signaalren zijn echter een groep cysteïne proteasen (eiwitafbreken- overdrachtsysteem dat betrokken is bij beide processen, en de enzymen), de zogenaamde gingipains. Deze proteasen clp, een gen dat bij zuurresistentie belangrijk is (Lemos en zijn vooral van belang voor het ‘omzeilen’ van de afweer- Burne, 2002; Senadheera et al, 2005; Deng et al, 2007a; Deng mechanismen van de gastheer. Ze spelen een cruciale rol bij et al, 2007b). Onlangs werd een nieuwe klasse van antibioaggregatie, hemagglutinatie en hemoglobinebinding door tica, de acyldepsipeptiden, ontwikkeld specifiek tegen ClpP Porphyromonas gingivalis (Potempa et al, 2003). Genen (Brötz-Oesterhelt et al, 2005). Deze antibiotica bleken, via die betrokken zijn bij de productie van deze proteasen zijn verstoring van gecontroleerde bacteriële eiwitrecycling, kgp, rgpA en rgpB. Zowel de functie en de regulatie van actief tegen grampositieve bacteriën, zowel in vitro als in deze genen als de driedimensionale structuur van de pro- bacterie-infectiemodellen. teasen zijn uitgebreid bestudeerd (Holt et al, 2000; Nakay- De moleculaire genetica heeft via de knock-outstrategie ama, 2003). Gebaseerd op de driedimensionale structuur inderdaad een groot aantal targets in orale pathogenen kunvan het Kgp-protease kon, via computervoorspellingen de nen identificeren, maar deze strategie is relatief bewerkelijk actieve locatie van het enzym worden gevonden. Vervolgens en tijdrovend. Een alternatieve moleculair genetische stratekon een aantal remmers worden ontwikkeld, gescreend en gie, de antisense RNA-interferentietechniek, is een krachtig geselecteerd. Van al deze remmers bleek A71561 in staat nieuw gereedschap gebleken. Deze techniek, waarmee de


95

Thema: Genetica

Virulentie van geassocieerde genen Stamspecifieke genen

Micro-array expressietechnologie

“Reverse vaccinology”

Eiwitten in oppervlakte van cel

Genoomsequentie Genoomvergelijkende analyses

Levende verzwakte kandidaten voor vaccin

Genoomvergelijkende analyses

Geconserveerde eiwitten in oppervlakte

Micro-array expressietechnologie & proteomics

In vivo aanwezige eiwitten in oppervlakte

en ook proteomics kunnen worden gebruikt op biofilms met orale pathogenen en in plaquemonsters, maar het is lastig voldoende materiaal voor dit soort metingen te verkrijgen (Luppens en Ten Cate, 2005; Shemesh et al, 2007). Meer subtiele methoden, waarvan de voor- en nadelen zijn besproken door Rediers et al (2005), hebben nog nauwelijks hun weg gevonden in specifieke onderzoeken binnen de mondgezondheid.

Vaccinatie Vaccins zijn geneesmiddelen die worOp eiwit gebaseerde den toegediend voordat een infectie kandidaten voor plaatsvindt en ze zijn bedoeld om een vaccin infectieziekte te voorkomen. Vaccins hebben slechts een beperkte toepasAfb. 2. Illustratie van de verschillende processen en technologieën die de basis vormen voor genoomgebaseerde vaccinontwikkeling (aangepast op basis van Scarselli et al, 2005). sing omdat ze specifiek zijn voor 1 ziekteverwekker of zelfs voor 1 variactiviteit van een gen (artificieel) kan worden gedempt of ant (serotype) van een pathogeen micro-organisme (Cheng geneutraliseerd, is al toegepast in de bacterie Staphylococ- et al, 2003). Vaccinatie wordt in de mondzorg ook al lang cus aureus, in mycobacteriën en in de pathogene schimmel overwogen. Klinische onderzoeken hebben aangetoond Candida albicans om belangrijke genen en virulentiefacto- dat een immuunrespons van de orale mucosa tegen antigeren te identificeren (Parish en Stoker, 1997; De Backer et nen van orale pathogene micro-organismen inderdaad de al, 2001; Ji et al, 2001). Deze methode bleek ook effectief in pathogenese van orale infecties kan beïnvloeden (Persson, het valideren van targets voor geneesmiddelen en onder- 2005; Taubman en Nash, 2006). zoek naar het mechanisme van nieuwe remmers (Ji et al, Tot nu toe zijn alle vaccins die voorhanden zijn, gebaseerd 2004). Ook in Streptococcus mutans is de RNA-interferen- op bijvoorbeeld dode of verzwakte micro-organismen, tietechniek gebruikt om de functie van genen te bestuderen chemisch geïnactiveerde toxinen en gezuiverde antigenen. (Wang en Kuramitsu, 2005). In combinatie met de genoo- Het ontwikkelen van dit type vaccins kan jaren duren en minformatie kan het een krachtig gereedschap worden in regelmatig blijkt het lastig om een vaccin te produceren dat het selecteren van nieuwe targets voor specifieke remmers ook daadwerkelijk tegen infecties beschermt (Scarselli et al, 2005). Ook in de ontwikkeling van vaccins, biedt genomics van Streptococcus mutans. grote mogelijkheden. De tijd om vaccins te ontwikkelen kan Ontwikkeling van antibacteriële middelen in vivo aanzienlijk worden verkort. Ook kunnen projecten die in Microbiële pathogenen in de mond zijn onderdeel van de het verleden niet succesvol waren opnieuw worden aangegehele orale microflora. Ze groeien in biofilms (plaque) in pakt (Grandi, 2003). microbiële ‘gemeenschappen’. In een dergelijke complexe Afbeelding 2 illustreert dat genoominformatie kan wormicrobiële gemeenschap komen allerlei interacties tussen de den gebruikt in de meer traditionele ontwikkeling van verschillende bacteriën voor en vanzelfsprekend zijn er ook vaccins, maar vooral ook in de zogenaamde ‘reverse vacinteracties met de harde en zachte weefsels en met de cellen cinology’. In het reverse vaccinology-proces worden vaccins van de gastheer. Deze interacties kunnen tot zodanig ver- ontwikkeld die op eiwitten zijn gebaseerd en waarvoor de anderde microbiële eigenschappen leiden dat targets voor kandidaten worden geselecteerd vanuit de genoominforantimicrobiële middelen, die in vitro zijn geïdentificeerd matie via computeranalyses. De lokalisatie op of in de cel en gevalideerd, geen of weinig effect hebben wanneer ze in van alle eiwitten die op het genoom zijn gecodeerd, wordt vivo worden toegepast. Zoals al opgemerkt door Rediers et via zogenaamde bio-informatica voorspeld. Alle eiwitten al (2005) laten eigenschappen die van groot belang zijn in waarvan wordt voorspeld dat ze op het oppervlak van de de (orale) microbiële ecologie, zeer waarschijnlijk in vitro cel aanwezig zijn, kunnen als een eerste groep kandidaten slechts subtiele effecten zien en waarschijnlijk nooit een worden geselecteerd. Deze set van potentiële antigenen kan volledig uitgeschakeld micro-organisme. Juist deze genen/ vervolgens worden gevolgd via micro-arrays of proteomics om te achterhalen of ze ook daadwerkelijk worden geactitargets zijn dus in vitro nauwelijks op te sporen. Er zijn moleculaire technieken voorhanden die ook in in veerd door het micro-organisme. Voor toepassingen in de vivo-onderzoeken kunnen worden gebruikt. ‘Micro-arrays’ mondzorg is via deze strategie een vaccin tegen Porphyro-

96



monas gingivalis ontwikkeld (Ross et al, 2001). Vanuit een genoomsequentie van 1.800-2.000 genen werden via bioinformatica 120 kandidaten geselecteerd. Deze kandidaten werden vervolgens via moleculair biologische technieken geproduceerd en gescreend met antisera tegen Porphyromonas gingivalis. De 40 kandidaten die in deze screening positief bleken, werden gezuiverd en getest in een muisinfectiemodel. Uiteindelijk bleken 2 nieuwe vaccins inderdaad significant tot bescherming tegen infectie met Porphyromonas gingivalis te leiden. Andere experimentele preventie- en behandelstrategieën Kennis van de moleculaire genetica van bacteriën leidt niet alleen tot nieuwe kansen in allerlei target-based-strategieën, maar blijkt ook van waarde in alternatieve nieuwe preventiestrategieën, zoals de ‘vervangingstherapie’ en de steeds populairder wordende toepassing van probiotica. De vervangingstherapie gaat ervan uit dat een nietpathogene variant van een oraal micro-organisme in de orale microflora de kolonisatie van allerlei pathogenen kan voorkomen. Om op die manier cariës te kunnen voorkomen werd een Streptococcus mutans-stam gemaakt die geen lactaat meer kan produceren (en dus niet sterk kan verzuren), maar wel een verhoogde hoeveelheid toxine tegen concurrerende Streptococcus mutans-stammen maakt. Deze vervangingsstam bleek inderdaad in staat cariogene varianten uit de mond te verdringen (Hillman, 2002). Onlangs werd deze therapie nog verfijnd en veiliger gemaakt door deze niet-cariogene stam verder te muteren en afhankelijk te maken van de aanwezigheid van een specifieke voedingsstof. Mocht de therapie tot onverwachte effecten leiden, dan kan de vervangingsstam worden gestopt door de specifieke voedingsstof niet meer te geven (Hillman et al, 2007). Probiotica zijn levende micro-organismen die na consumptie de gezondheid bevorderen (Gorbach, 2002). Recente onderzoeken hebben aangetoond dat probiotica ook de mondgezondheid kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld door het reduceren van de hoeveelheid pathogene microorganismen in de mond. Een kaas met probiotica bleek effectief in het terugdringen van de hoeveelheid schimmels in de mond van ouderen (Hatakka et al, 2007). Omdat het voor de ontwikkeling van probiotica die de mondgezondheid bevorderen noodzakelijk is de moleculaire mechanismen van het gezondheidsbevorderende effect te begrijpen, zullen ook hier genomics en moleculaire genetica een grote rol gaan spelen (Meurman, 2005).

leerd en dus ook niet worden bestudeerd (Aas et al, 2005; Starke et al, 2006). Wel is duidelijk dat tijdens infecties het hele micro-ecosysteem verschuift en dat ook (veel van) de nog niet gekarakteriseerde micro-organismen deel uitmaken van de pathogene flora. Om ook inzicht te krijgen in de rol van deze ‘unculturables’ in de pathogenese, wordt op dit moment een nieuw scala aan moleculair genetische technieken ontwikkeld waarmee via zogenaamde ‘metagenomics’ de gehele orale microflora (grotendeels) in kaart kan worden gebracht (Kuramitsu, 2003). In de microbiële ecologie is metagenomics een van de belangrijkste nieuwe onderzoeksvelden, waarin plaque een centrale rol kan gaan spelen. In onderzoeken is al aangetoond dat zelfs een gezonde orale flora zeer variabel is, sterk verschilt van persoon tot persoon en van locatie tot locatie in 1 mond (Aas et al, 2005). Bij parodontitis hangt de samenstelling van de flora sterk af van de diepte van de pockets (Socransky et al, 1998).

Slotbeschouwing De in dit artikel besproken voorbeelden geven aan dat onderzoek naar inzichten in en controle van de orale pathogene micro-organismen voor nieuwe preventie- en behandelstrategieën zich laat leiden door de meest recente inzichten in de microbiële genetica. Onderzoekers gebruiken moderne moleculaire technieken en maken gebruik van genetische databases en computeralgoritmen (bio-informatica) tijdens de speurtocht naar nieuwe antibacteriële geneesmiddelen en vaccins. In de meeste gevallen bevindt het onderzoek zich echter nog in de beginfase, waarin targets worden geïdentificeerd. In de vervolgstappen staan ook nog de nodige problemen te wachten (Sams-Dodd, 2005). Het is echter geheel duidelijk dat genomics ook een belangrijke plaats zal hebben binnen dit ontwikkelingsproces (Mills, 2006). In tegenstelling tot de meeste andere infectieziekten worden infecties in de mond veroorzaakt door een complex mengsel van micro-organismen. Dit inzicht wordt steeds vaker meegenomen in de ontwikkeling en de evaluatie van nieuwe preventie- en behandelstrategieën. Er is een duidelijke trend waar te nemen van verschuiving van onderzoeken gebaseerd op de specifieke plaquehypothese naar onderzoeken gebaseerd op de ecologische plaquehypothese. Dit betekent dat modelsystemen en experimentele technieken verder worden ontwikkeld en bijgesteld en dat metagenomics een steeds belangrijkere rol gaat spelen. Literatuur

> Aas JA, Paster BJ, Stokes LN, Olsen I, Dewhirst FE. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J Clin Microbiol 2005;

Metagenomics De meeste in dit artikel besproken strategieën richten zich specifiek op 1 pathogeen micro-organisme. Zoals al aangegeven, maken de micro-organismen in de mond deel uit van een complex micro-ecosysteem. Meer dan 700 verschillende soorten micro-organismen kunnen in de mond worden aangetroffen en de helft hiervan kan (nog) niet worden geïso-


43:5721-5732.

> Ajdic' D, McShan WM, McLaughlin RE, et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a cariogenic dental pathogen. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99: 14434-14439.

> Backer MD De, Nelissen B, Logghe M, et al. An antisense-based functional genomics approach for identification of genes critical for growth of Candida albicans. Nat Biotechnol 2001; 19: 235-241.

97

Thema: Genetica

> Brötz-Oesterhelt H, Beyer D, Kroll HP, et al. Dysregulation of bacterial

> Kleinberg I. A mixed-bacteria ecological approach to understanding

proteolytic machinery by a new class of antibiotics. Nat Med 2005;

the role of the oral bacteria in dental caries causation: an alternative

11: 1082-1087.

to Streptococcus mutans and the specific-plaque hypothesis. Crit Rev

> Cate JM ten. Fluorides in caries prevention and control: empiricism

Oral Biol Med 2002; 13: 108-125.

> Korithoski B, Krastel K, Cvitkovitch DG. Transport and metabolism of

or science. Caries Res 2004; 38: 254-257.

> Cheng Q, Wang S, Salyers AA. New approaches for anti-infective drug discovery: antibiotics, vaccines and beyond. Curr Drug Targets Infect Disord 2003; 3: 66-75.

citrate by Streptococcus mutans. J Bacteriol 2005; 187: 4451-4456.

> Kuramitsu HK. Molecular genetic analysis of the virulence of oral bacterial pathogens: an historical perspective. Crit Rev Oral Biol

> Curtis MA, Aduse Opoku J, Rangarajan M, et al. Attenuation of the virulence of Porphyromonas gingivalis by using a specific synthetic Kgp protease inhibitor. Infect Immun 2002; 70: 6968-6975.

Med. 2003; 14:331-344.

> Lemos JA, Burne RA. Regulation and physiological significance of ClpC and ClpP in Streptococcus mutans. J Bacteriol 2002; 184: 6357-6366.

> Dahlén G. Role of suspected periodontopathogens in microbiological monitoring of periodontitis. Adv Dent Res 1993; 7: 163-174.

> Len AC, Harty DW, Jacques NA. Stress-responsive proteins are upregulated in Streptococcus mutans during acid tolerance. Microbiology

> Davey ME, Duncan MJ. Enhanced biofilm formation and loss of capsule synthesis: deletion of a putative glycosyltransferase in Porphyromonas gingivalis. J Bacteriol 2006; 188: 5510-5523.

2004; 150: 1339-1351.

> Loesche WJ. Role of Streptococcus mutans in human dental decay. Microbiol Rev 1986; 50: 353-380.

> Deng DM, Liu MJ, Cate JM ten, Crielaard W. The VicRK system of

> Luppens SB, Cate JM ten. Effect of biofilm model, mode of growth,

Streptococcus mutans responds to oxidative stress. J Dent Res 2007a;

and strain on streptococcusmutans protein expression as determined

86: 606-610.

by two-dimensional difference gel electrophoresis. J Proteome Res

> Deng DM, Cate JM ten, Crielaard W. The adaptive response of Streptococcus mutans towards oral care products: involvement of the ClpP serine protease. Eur J Oral Sci 2007b; 115: 363-370.

2005; 4: 232-237.

> Marri PR, Hao W, Golding GB. Gene gain and gene loss in streptococcus: is it driven by habitat? Mol Biol Evol. 2006; 23: 2379-2391.

> Duncan MJ. Oral microbiology and genomics. Periodontol 2000 2005; 38: 63-71.

> Marsh PD. Microbial ecology of dental plaque and its significance in health and disease. Adv Dent Res 1994; 8: 263-271.

> Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenor-

> Meurman JH. Probiotics: do they have a role in oral medicine and dentistry? Eur J Oral Sci 2005; 113: 188-196.

> Mills SD. When will the genomics investment pay off for antibacterial

habditis elegans. Nature 1998; 391: 806-811.

> Gorbach SL. Probiotics in the third millennium. Dig Liver Dis. 2002;

discovery? Biochem Pharmacol 2006; 71: 1096-1102.

> Nakao R, Senpuku H, Watanabe H. Porphyromonas gingivalis galE is

34: S2-S7.

> Grandi G. Rational antibacterial vaccine design through genomic technologies. Int J Parasitol 2003; 33: 615-620.

involved in lipopolysaccharide O-antigen synthesis and biofilm formation. Infect Immun 2006; 74: 6145-6153.

> Hatakka K, Ahola AJ, Yli-Knuuttila H, et al. Probiotics reduce the pre-

> Nakayama K. Molecular genetics of Porphyromonas gingivalis: gin-

valence of oral candida in the elderly -- a randomized controlled trial.

gipains and other virulence factors. Curr Protein Pept Sci 2003; 4:

J Dent Res 2007; 86: 125-130.

389-395.

> Hillman JD. Genetically modified Streptococcus mutans for the

> Narimatsu M, Noiri Y, Itoh S, Noguchi N, Kawahara T, Ebisu S. Essential

prevention of dental caries. Antonie Van Leeuwenhoek 2002; 82:

role for the gtfA gene encoding a putative glycosyltransferase in the adhe-

361-366.

rence of Porphyromonas gingivalis. Infect Immun 2004; 72: 2698-2702.

> Hillman JD, Mo J, McDonell E, Cvitkovitch D, Hillman CH. Modification of an effector strain for replacement therapy of dental caries to enable clinical safety trials. J Appl Microbiol 2007; 102: 1209-1219.

> Holt SC, Ebersole J, Felton J, Brunsvold M, Kornman KS. Implantation of Bacteroides gingivalis in nonhuman primates initiates progression

> Overbye KM, Barrett JF. Antibiotics: where did we go wrong? Drug Discov Today 2005; 10: 45-52.

> Parish T, Stoker NG. Development and use of a conditional antisense mutagenesis system in mycobacteria. FEMS Microbiol Lett 1997; 154: 151-157.

> Park Y, James CE, Yoshimura F, Lamont RJ. Expression of the short

of periodontitis. Science 1988; 239: 55-57.

> Holt SC, Kesavalu L, Walker S, Genco CA. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol 2000 1999; 20: 168-238.

fimbriae of Porphyromonas gingivalis is regulated in oral bacterial consortia. FEMS Microbiol Lett 2006; 262: 65-71.

> Ji Y, Zhang B, Van SF, et al. Identification of critical staphylococcal genes using conditional phenotypes generated by antisense RNA. Sci-

> Persson GR. Immune responses and vaccination against periodontal infections. J Clin Periodontol 2005; 32: 39-53.

> Potempa J, Sroka A, Imamura T, Travis J. Gingipains, the major cys-

ence 2001; 293: 2266-2269.

> Ji Y, Yin D, Fox B, Holmes DJ, Payne D, Rosenberg M. Validation of

teine proteinases and virulence factors of Porphyromonas gingivalis:

antibacterial mechanism of action using regulated antisense RNA

structure, function and assembly of multidomain protein complexes.

expression in Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett 2004; 231:

Curr Protein Pept Sci 2003; 4: 397-407.

> Rediers H, Rainey PB, Vanderleyden J, De Mot R. Unraveling the secret

177-184.

> Kadowaki T, Baba A, Abe N, et al. Suppression of pathogenicity of

lives of bacteria: use of in vivo expression technology and differential

Porphyromonas gingivalis by newly developed gingipain inhibitors.

fluorescence induction promoter traps as tools for exploring niche-

Mol Pharmacol. 2004; 66: 1599-1606.

specific gene expression. Microbiol Mol Biol Rev 2005; 69: 217-261.

98



> Rosamond J, Allsop A. Harnessing the power of the genome in the

Summary

search for new antibiotics. Science 2000; 287: 1973-1976.

> Ross BC, Czajkowski L, Hocking D, et al. Identification of vaccine candidate antigens from a genomic analysis of Porphyromonas gingivalis. Vaccine 2001; 19: 4135-4142.

> Sams-Dodd F. Target-based drug discovery: is something wrong? Drug Discov Today 2005; 10: 139-147.

> Sbordone L, Bortolaia C. Oral microbial biofilms and plaque-related diseases: microbial communities and their role in the shift from oral health to disease. Clin Oral Investig 2003; 7: 181-188.

> Scarselli M, Giuliani MM, Adu-Bobie J, Pizza M, Rappuoli R. The impact of genomics on vaccine design. Trends Biotechnol 2005; 23: 84-91.

> Senadheera MD, Guggenheim B, Spatafora GA, et al. A VicRK signal transduction system in Streptococcus mutans affects gtfBCD, gbpB,

Microbial genetics. New possibilities for the prevention and treatment of (oral) infections New insights in the microbial genetics of pathogenic oral microorganisms and the development of a new array of molecular genetic techniques together have led to alternative strategies in the development of antimicrobial agents. In this article the importance of insights in microbial molecular biology for the prevention and treatment of (oral) infectious diseases is illustrated. Following the introduction of relevant terminology, the role of microbial genetics in developing of target-based anti-microbial drugs for prevention and treatment of (oral) infections is discussed. Subsequently, the impact of microbial genetics on vaccine development and several, mainly still experimental, prevention strategies are discussed.

and ftf expression, biofilm formation, and genetic competence development. J Bacteriol 2005; 187: 4064-4076.

Bron

> Shemesh M, Tam A, Steinberg D. Differential gene expression profiling of Streptococcus mutans cultured under biofilm and planktonic conditions. Microbiology 2007; 153: 1307-1317.

> Simionato MR, Tucker CM, Kuboniwa M, et al. Porphyromonas gingivalis genes involved in community development with Streptococcus gordonii. Infect Immun 2006; 74: 6419-6428.

> Socransky SS. Microbiology of periodontal disease – present status

D.M. Deng, W. Crielaard Uit de afdeling Cariologie Endodontologie Pedodontologie van het Academisch Centrum voor Tandheelkunde Amsterdam (ACTA) Datum van acceptatie: 10 november 2007 Adres: prof. dr. W. Crielaard, ACTA, Louwesweg 1, 1066 AA Amsterdam [email protected]

and future considerations. J Periodontol 1977; 48: 497-504.

> Socransky SS, Haffajee AD, Cugini MA, Smith C, Kent RL jr. Microbial complexes in subgingival plaque. J Clin Periodontol 1998; 25: 134-144.

> Starke EM, Smoot JC, Smoot LM, et al. Technology development to explore the relationship between oral health and the oral microbial community. BMC Oral Health 2006; 6 (Suppl. 1): S10.

> Steenbergen TJ van, Winkelhoff AJ van, Velden U van der, Graaff J de. Taxonomy, virulence and epidemiology of black-pigmented Bacteroides species in relation to oral infections. Infection 1989; 17: 194-196.

> Taubman MA, Nash DA. The scientific and public-health imperative for a vaccine against dental caries. Nat Rev Immunol 2006; 6: 555-563.

> Wang B, Kuramitsu HK. Inducible antisense RNA expression in the characterization of gene functions in Streptococcus mutans. Infect Immun 2005; 73: 3568-3576.

> Watanabe-Kato T, Hayashi JI, Terazawa Y, et al. Isolation and characterization of transposon-induced mutants of Porphyromonas gingivalis deficient in fimbriation. Microb Pathog 1998; 24: 25-35.

> Wenzel RP. Health care-associated infections: major issues in the early years of the 21st century. Clin Infect Dis 2007; 45 (Suppl. 1): S85-S88.


99

Microbiële genetica Nieuwe mogelijkheden voor preventie en behandeling van (orale) infecties

Recommend Documents