Vrzalová Jindra
METODY STANOVENÍ HLADIN VITAMÍNU D
Stanovení Chemicky
Chromatograficky Imunochemicky
Deproteinace a extrakce předcházející analýze Kyselina/zásada (denaturace bí.) +
Acetonitril/hexan/metanol/benzen SPE – odstraní i interferující lipidy
Struktury 1α,25-dihydroxyvitamin D3 kalcitriol
kalcidiol
Jednotky 25 OH vitamin D ng/ml nmol/l
1,25 OH vitamin D pg/ml pmol/l
(nmol/l x 0.40) = ng/ml
(pmol/l x 0.42) = pg/ml
Chemicky Fotometrické a fluorimetrické
barevné reakce s chloridem antimonitým nebo s trifluoroctovou kyselinou nedostatečně citlivé a specifické obsolentní
HPLC Nejčastěji: reverzní stac. fáze mobilní fáze voda-metanol detekce je obvykle UV v oblasti 264 nm Komerční: Chromsystems Alpco Immunoassays Esa Biosciences
ESA HPLC ECD plně automatizovaný http://www.esainc.com/vit-d/downloads/Vitamin_D.pdf
HPLC/MS (/MS) Komerčně např. soupravy Perkin Elmer,
Chromsystems Neaktivní 3-epimer 25OHD3 lze rozlišit až MS/MS APCI nebo ESI iontový zdroj
NIST (USA): ID-LC-MS 2H6-25(OH)D3 a 2H3-25(OH)D2 Extrakce hexan, kolona s C18 a kyanopropyl.
náplní
APCI MS: positivní mód – [M-H2O+H+]
HPLC/MS (/MS)
Kratší doba samotné analýzy při použití MS detekce Zde např. 5 min.
Jak vydávat výsledky HPLC ?? ? Vydávání výsledků pro kliniku D2 a D3 odděleně? ?25 OHD2 a 25OHD3 a součet total 25OHD?
Mezinárodní standard nově SRM 972
Level 1 – „normální“ lidské sérum Level 2 – L.1 naředěno koňským sérem Level 3 – L.1 fortifikované 25OH D2
Level 4 – L.1 fortifikované 3-epi-25-OH D3 NIST (National Institute of Standards and
Technology)
Hladiny v SRM 972
Imunochemické 25OH D SEKK BM1/11 Celkem 56 laboratoří 25 OH vit. D
RIA
Chemiluminiscence
Diasorin IDS
CMIA – Abbott Architect (restandardizace) Siemens Bayer – Advia Centaur Liaison - Diasorin
ECLIA – Roche (nyní nově 2. generace - již navázána na SRM) ELISA - IDS
1,25 OH vit. D pouze RIA po imunoextrakci IDS
4 6
5 3
33
Imunochemické 2 „Vytěsnění“ z vazby na proteiny
Značené protilátky nebo vazebný protein
Imunochemické m. - zdroj rozdílů Různá citlivost především k vit. D2 Nutné sledovat tabulky zkřížených reaktivit a
recovery „Někdy“ skutečnost odpovídá údajům od
výrobce Carter GD et al.: How accurate are assays for 25-hydroxyvitamin D? Data from the international vitamin D external quality assessment scheme. Clin Chem. 2004 Nov;50(11):2195-7.
Srovnání Architect / RIA IDS 180 160 140
N = 100 ARCHITECT
120 100 80 60
y = 1,9426 + 1,0081 x Intercept A 1,9426 95% CI -1,4445 to 5,4244 Slope B 1,0081 95% CI 0,9452 to 1,0793
40 20 0 0
50
Cusum test for linearity No significant deviation from linearity (P>0.10)
100 RIA
150
200
Srovnání Roche I / RIA IDS 120
100
80
ROCHE
N=23
60
40
20 20
y = 22,2027 + 0,6337 x
40
60
80
100
120
RIA2
Intercept A 22,2027 95% CI 17,3468 to 26,8355 Slope B 0,6337 95% CI 0,5368 to 0,7605 Cusum test for linearity No significant deviation from linearity (P>0.10)
Srovnání Liaison / RIA IDS 180 160 140 120
Liaison
N= 40
100 80 60 40
y = -8,0442 + 1,2330 x
20
Intercept A -8,0442 0 95% CI -21,1318 to 0,3627 0 Slope B 1,2330 95% CI 1,0461 to 1,5271 Cusum test for linearity No significant deviation from linearity (P>0.10)
50
100 RIA3
150
EHK SEKK Kostní metabolismus
Deqas : http://www.deqas.org/ to ensure the analytical reliability of 25 hydroxyvitamin D (25OHD) and 1,25 dihydroxyvitamin D (1,25(OH)2D) assays Liquid serum pools (5) are distributed quarterly (January, April, July, October) at ambient temperature
200
Referenční hodnoty 25 OH vit. D nmol/L návod Architect (2,5-97,5 percentil)
ng/mL
23,75
138,75
návod Architect ženy
23,5
147,75
návod Architect muži
23,5
131
návod Architect léto
39,25
150,75
návod Architect zima
22
115,75
8,8
46,3
návod Architect target value
75
30
citlivost/nejnižší hodnota Architect
20
8
Clin. Chemistry, Bishop
55
105
22
42
Euromedlab 2009
70
120
28
48
Euromedlab 2009 insuficience (grey zone)
40
70
20
0
40
0
Článek česky Nichols institute děti
75
175
30
70
Článek česky Nichols institute léto
50
300
20
120
Článek česky Nichols institute zima
25
125
10
50
41,6
192,4
16,64
76,96
Tietz moderare deficiency
25
60
10
24
Tietz optimal
61
200
24,4
80
Lothar Thomas 7. pac. do 50 let
50
175
20
70
Lothar Thomas 7. pac. nad 50 let
63
175
25,2
70
Lothar Thomas 7. stillzeit
75
175
30
70
Euromedlab 2009 deficience
Článek česky Nichols institute zdraví léto 95% Tietz severe deficiency
pod 25
9,5
55,5
9,4
59,1
9,4
52,4
15,7
60,3
40 16
pod 10
A mnoho dalších zdrojů………“Know What's a Normal Vitamin D Level so You’ll
Know More than Your Doctor“
Referenční hodnoty 1,25vit.D pmol/l Návod RIA citlivost/nejnižší hodnota Clin. Chemistry Bishop Článek česky Nichols institute dospělí
Tietz Lothar Thomas 7. dospělí Lothar Thomas 7. dospělí nad 50 Lothar Thomas 7. schwangere Lothar Thomas 7. děti
43
pg/ml
168
5
18,06
70,56
2,1
72
127,2
30
53
50
200
21
84
42
169
16
65
75
200
30
80
63
125
25
60
100
325
40
130
100
250
40
100
Kalkulátory???
http://mpkb.org/home/tests/vitdinterpretation Vitamin D metabolite calculator Marshallův protokol Zadání výsledku hladiny 1,25 OH vit. D a 25 OH vit. D
Nikdo se ale neptá na metodu stanovení
