Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Metodika 3: uvedení systému Jasco LC – 2000 do provozu (HPLC – High Performance Liquid Chromatography)
7
8
4 9
10
1
11
2 5
3
6
12
Popis sestavy: 1) Refraktometrický detektor – RI 2000, 2) detektor diodového pole – Jasco MD – 2018 Plus, 3) fluorescenční detektor – Jasco FP – 2020 Plus, 4) vakuový degasser – VD 020, 5) termostat kolon – Jasco CO – 2060 Plus, 6) mixer pro HPLC Sunchrom, 7 + 8) mobilní fáze A + mobilní fáze B, 9) 1 pumpa pro mobilní fázi A – Jasco PU – 2080 Plus, 10) 2 pumpa pro mobilní fázi B – Jasco PU – 2080 Plus, 11) autosampler – Jasco AS – 2059 Plus, 12) sběrná datová linka – Jasco LC-Net II/ADC.
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Postup spuštění systému Jasco: 1) zapněte kolíbky zásuvek do elektrické sítě, 2) zapněte kolíbky do polohy 1 u přístrojů viz popis sestavy, 3) ručně propláchněte (purchin) pumpy mobilními fázemi A a B, doba 5 minut, (nastavte flow = 3 ml/minutu, zmáčkněte pump 1 a pump 2, otevřete černé knoflíky),
4) do držáku kolonového termostatu upevněte kolonu a zapojte ji do systému,
flow
5) propláchněte celý systém včetně kolony mobilními fázemi A a B, doba 5 minut, (nastavte flow = 0,25 ml/minutu, zmáčněte pump 1 a pump 2, zavřete černé knoflíky) 6) autosampler uveďte do programu USER (viz metodika 5),
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
7) umístěte vialky s reagenty a vzorky do autosampleru (viz metodika 5),
reagent 1 a reagent 2
vialka se vzorkem
8) zapněte počítač start Chrom Nav
prázdná vialka určená pro derivatizaci
program Chrom Nav (plocha)
heslo - user1; enter,
Jasco HPLC,
project 1, 9) otevřete a zkontrolujte metodu na stanovení AMK (viz metodika 4): ‐
FILE
METHOD EDITOR
10) vytvořte novou sekvenci: ‐ FILE METHOD EDITOR
CONTROL METHOD
OPEN METHOD
ACQUISITION SEQUENCE
SAVE AS
AMK
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
11) otevřete vytvořenou sekvenci: ‐ FILE METHOD EDITOR
12) pusťte pumpy
ACQUISITION SEQUENCE
OPEN
PUMP, nechte cca 5 minut puštěné do ustálení tlaků,
13) klikněte na ikonu START, 14) průběh analýzy sledujte na CHROMATOGRAM MONITOR (aktuální stav).
Postup ukončení systému Jasco + ruční promývání systému: 1) pumpa 1 - 50 % H2O
pumpa 2 - 50 % mobilní fáze B
(flow 1 = 0,5 ml/minutu, flow 2 = 0,5 ml/minutu, start pump 1 i pump 2; 5 minut) 2) pumpa 1 – 80 % H2O
pumpa 2 – 20 % mobilní fáze B
(flow 1 = 0,8 ml/minutu, flow 2 = 0,2 ml/minutu, start pump 1 i pump 2; 10 minut) 3)
pumpa 2 – 100 % mobilní fáze B (flow 2 = 1 ml/minutu, stop pump 1, start pump 2; 5 minut)
‐
odpojit kolonu ze systému a systém propojit spojkou
4) pumpa 1 – 100 % H2O + metanol (3 díly +1 díl) (flow 1 = 1 ml/minutu, start pump 1, stop pump 2; 5 minut)
Vypněte kolíbky u všech přístrojů a centrální kolíbkou vypněte přístroje od zdroje elektrického napětí!!!
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Metodika 4: nastavení HPLC pro stanovení AMK Nastavení čerpadla: Stop Time
20.00 min
Flow
1.000 ml/min
Max. Pressure Limit 400 bar Min. Pressure Limit 0 bar Gradient:
Time [min]
mobilní fáze % B
0.00
2.0
0.40
2.0
15.00
57.0
15.20
100
17.20
100
17.40
2.0
Nastavení autosampleru:
poloha USER pro derivatizaci v autosampleru, poloha NORMAL pro manuální derivatizaci.
Změna programu NORMAL za USER a opačně: ‐
na autosampleru zmáčkněte ručně SHIFT 5,
‐
2: injection mode
‐
edit enter, šipky (nahoru či dolu),
‐
user program
‐
monit, monit.
edit enter, edit enter,
Použít kolonu: ZORBAX Eclipse XDB-C18, 4,6 x 50 mm, 1,8 μm
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Dle dostupnosti použít předklonu: ZORBAX Eclipse-AAA 4,6 x 12,5 mm, 5 μm Nastavení termostatu kolony: 40.00 °C Nastavení detektoru: Fluorescenční detektor: Ex / Em – 340 nm / 450 nm Detektor diodového pole: 338 nm
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Metodika 5: nastavení autosampleru pro stanovení AMK Derivatizace manuální (autosampler je v programu NORMAL) ‐
do 2 ml vialky odměřit borátový pufr (např. 1 ml),
‐
přidat roztok vzorku popř. standardu v 0,1N-HCl,
‐
směs promíchat,
‐
přidat roztok derivatizačního činidla OPA (objem shodný s objemem vzorku),
‐
směs promíchat a nechat zreagovat (např. 4 min).
Pozn.: reakční dobu je pro dobrou reprodukovatelnost výsledků nutno dodržovat stále stejnou Derivatizace v autosampleru (autosampler je v programu USER) ‐ krok 1
2
3 4 5 6
7 8 9
10 11
12 13 14 15 16
podle programu nástřiku (vialka 1 reagent – borátový pufr; vialka 2 reagent – OPA). STEP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31
Function Metering Init Port&NDL Flush Load Needle UP Draw Air Reagent # Needle DOWN Draw Vol Needle UP Draw Air Set Sam Load Draw Air MIX Sam#(+) Needle DOWN Eject Vol Needle UP Port&NDL Flush Draw Air Reagent # Needle DOWN Draw Vol Needle UP Draw Air MIX Sam#(+) Needle DOWN Eject Vol Needle UP Mix Air Wait Port&NDL Flush Ana Sam Load(+)
32 Sample Inject MONIT
funkce Value 016 017 3 4 024 5 020 1 5 022 120 4 024 5 025 20 024 5 021 1 5 023 153 4 017 024 5 020 2 5 022 20 4 024 5 021 1 5 023 32 4 027 N 3 28 4 017 026 1 H 0 1
poznámka
borát
120
vialka definovaná v sekvenci
opa
20
vialka definovaná v sekvenci
V 100
vialka definovaná v sekvenci objem definován v sekvenci
H1
Laboratorní cvičení
Katedra speciální zootechniky
Vložení vialek s reagentem 1 a 2 (4 ml vialky) do autosampleru: ‐
na autosamleru zmáčkněte ručně SHIFT 4,
‐
1: change rack
‐
change rack, exekute ok ? šipkami YES
‐
monit.
edit/enter, edit/enter,
