23
METODE PENELITIAN
Tempat Penelitian Pengambilan sampel daging sapi impor untuk penelitian ini dilakukan di Instalasi Karantina Produk Hewan (IKPH). Pengujian sampel dilakukan di laboratorium Balai Besar Karantina Pertanian (BBKP) Tanjung Priok, Balai Uji Terap Teknik dan Metode Karantina Pertanian (BUTTMKP), dan Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan (BPMPP).
Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juni 2011 sampai dengan bulan April 2012.
Bahan dan Alat Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daging sapi yang diimpor melalui pelabuhan Tanjung Priok, akuabides steril, alkohol, plastik sampel, mikropipet,
Kit
Premi®
test
(R-Biopharm
AG,
Jerman),
Bacillus
stearothermophilus ATCC 7953, larutan baku pembanding penisilin G, yeast extract, peptone, bacto agar, dextrose, Bacillus cereus ATCC 11778, larutan baku pembanding oksitetrasiklin hidroklorida, beef extract, Bacillus subtilis ATCC 6633, larutan baku pembanding kanamisin sulfat, Kocuria rizophila (Micrococcus luteus) ATCC 9341, larutan baku pembanding tilosin-tartrat, glucose, media cair Heart Infusion Broth (HIB), kalium hidrogen fosfat (KH2PO4), dinatrium hidrogen fosfat (Na2HPO4), asam fosfat (H3PO4), natrium hidroksida (NaOH), dikalium hidrogen fosfat (K2HPO4), asam klorida (HCl), natrium klorida (NaCl), kertas cakram 8 mm, tabung eppendorf, methanol, potasium phosfat, acetonitril.
24
Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah cawan Petri 100 x 12 mm, tabung reaksi ukuran 7 ml, 20 ml, 50 ml, tabung sentrifus ukuran 50 ml, labu ukur 50 ml, 100 ml, gelas ukur 100 ml, 500 ml, Erlenmeyer 250 ml, 500 ml, pipet volumetrik ukuran 10 ml, pengocok tabung, sentrifus, penangas air, homogenizer, autoklaf, refrigerator, freezer, timbangan analitik, inkubator, magnet pengaduk, pH meter, mikropipet 50-300 µl, jangka sorong, pinset, gunting, bunsen, ose.
Metode Pengambilan Sampel Sampel yang diambil berupa daging sapi tanpa tulang dan tanpa lemak. Jumlah sampel dihitung berdasarkan rumus deteksi penyakit (detect disease) yang ditetapkan oleh Martin et al. (1987): n = [1- (1-a) 1/D] [N-(D-1)/2] Keterangan : N = Jumlah populasi n = Ukuran sampel a = Tingkat kepercayaan (95%) D = Nilai dugaan populasi yang sakit (D=PxN, dengan asumsi P: 5%)
Perhitungan sampel berdasarkan jumlah daging sapi yang diimpor pada tahun 2010 (BBKP Tanjung Priok 2010) yaitu sebesar 99 281 690 kg dikonversi ke dalam boks dengan berat rata-rata setiap boks adalah 27.2 kg, maka jumlah komoditi menjadi sebesar 3 650 062 boks. Hasil perhitungan besaran sampel dengan perangkat Win Episcope 2.0 diperoleh sampel sebanyak 59 dan dibulatkan menjadi 70 sampel. Setiap sampel diambil sebanyak 20 g, dimasukkan ke dalam kantong plastik steril yang telah diberi label kode sampel, negara asal, tanggal pengambilan, serta nomor kontainer, kemudian disimpan pada suhu -20 °C. Sampel diambil secara purporsif yaitu terhadap kontainer setiap kali kedatangan, kemudian boks daging yang akan diambil ditentukan secara acak sederhana, hingga tercapai jumlah
25
sampel yang diinginkan. Sampel diuji menggunakan rapid test dan Bioassay, seperti yang ditampilkan pada Gambar 1.
SAMPEL golongan beta laktam golongan tetrasiklin RAPID TEST
BIOASSAY golongan makrolida golongan aminoglikosida
Gambar 1 Skema penelitian.
Pengujian Sampel Semua sampel daging diperiksa terhadap kandungan residu antibiotika menggunakan rapid test dan bioassay. Sebelum dilakukan pengujian, sampel diambil sebanyak 150 g, daging dipotong menjadi ukuran kecil dicampur hingga homogen, kemudian ditimbang sesuai kebutuhan masing-masing pengujian. Rapid Test Prinsip kerja rapid test adalah antibiotika akan menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus stearothermophilus. Tahapan pengujian rapid test disajikan dalam bagan pada Gambar 2.
26
3 g sampel daging dipotong dan dipres untuk mendapat kaldu daging yang ditampung dalam eppendorf 100 µl kaldu daging dimasukkan ke dalam ampul Premi® Test dan diinkubasi pada suhu ruangan selama 20 menit Kaldu daging dalam ampul Premi® Test dibuang dan dibilas 3 kali dengan akuabides steril, kemudian masing-masing ampul ditutup dengan plastik Ampul Premi® Test diinkubasi selama 3 jam dengan suhu 64 °C pada inkubator premi kit yang tersedia Pembacaan hasil dilakukan dengan melihat perubahan warna yang terjadi pada ampul yang disesuaikan dengan panduan dalam menginterpretasikan hasil pengujian Premi® Test
Gambar 2 Bagan tahapan pengujian rapid test.
Bioassay (Uji Tapis) Prinsip pengujian ini adalah residu antibiotika akan menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang ada pada media agar. Penghambatan dapat dilihat dengan terbentuknya daerah hambatan di sekitar kertas cakram. Pelaksanaan pengujian bioassay berdasarkan SNI 7424:2008 terdiri dari beberapa tahap, yaitu :
Pembuatan Larutan Dapar Larutan dapar fosfat nomor 1 dibuat dengan menimbang 7 g KH2PO4 dan 6 g Na2HPO4 yang dilarutkan dalam akuabides sampai 1 000 ml, dengan mengatur pH hingga menjadi 6.0 ± 0.1, lalu disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ± 1 ºC, 15 psi atau 1.03421 x 105 pascal selama 15 menit. Larutan dapar fosfat nomor 2 dibuat dengan menimbang 6.4 g KH2PO4 dan
27
18.9 g Na2HPO4 yang dilarutkan dalam akuabides sampai 1 000 ml, dengan mengatur pH hingga menjadi 7.0 ± 0.1, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 ± 1 ºC, dengan tekanan 15 psi atau 1.03421 x 105 pascal selama 15 menit. Larutan dapar fosfat nomor 3 dibuat dengan menimbang 3.5 g KH2PO4 dan 3 g Na2HPO4 yang dilarutkan dalam akuabides sampai 1 000 ml, dengan mengatur pH hingga menjadi 6.0 ± 0.1, kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 ± 1 ºC, dengan tekanan 15 psi atau 1.03421 x 105 pascal selama 15 menit.
Pembuatan Media Pembuatan media biakan Bacillus stearothermophilus untuk golongan penisilin dilakukan dengan menimbang peptone 5 g, yeast extract 12 g, bacto agar 15 g, dextrose 1 g dan akuabides 1 000 ml. Peptone, dextrose, dan yeast extract dilarutkan dalam sebagian akuabides, setelah tercampur rata ditambahkan bacto agar dan ditambahkan akuabides hingga volume keseluruhan menjadi 1 000 ml. Sesuaikan pada pH 5.7 ± 0.1 dan dididihkan sampai bacto agar terlarut. Media biakan Bacillus subtilis untuk golongan aminoglikosida dibuat dengan menimbang peptone 5 g, beef extract 3 g, bacto agar 15 g dan akuabides 1 000 ml. Peptone dan beef extract dilarutkan dalam sebagian akuabides kemudian ditambahkan bacto agar, selanjutnya ditambahkan akuabides hingga volume keseluruhan menjadi 1 000 ml. Sesuaikan pada pH 8.5 ± 0.1 dan dididihkan sampai bacto agar terlarut. Media biakan Bacillus cereus untuk golongan tetrasiklin dibuat dengan menimbang peptone 6 g, beef extract 1.5 g, yeast extract 3 g, KH2PO4 1.35 g, bacto agar 15 g dan akuabides 1 000 ml. Peptone, beef extract, yeast extract dan KH2PO4 dilarutkan dalam sebagian akuabides, kemudian ditambahkan bacto agar, selanjutnya ditambahkan akuabides hingga volume menjadi 1 000 ml. Sesuaikan pada pH 5.7 ± 0.1 dan dididihkan sampai bacto agar terlarut. Media biakan Micrococcus luteus (Kocuria rizophila) untuk golongan makrolida dibuat dengan menimbang peptone 6 g, beef extract 1.5 g, yeast extract 3 g, glucose 1 g, bacto agar 15 g, dan akuabides 1 000 ml. Peptone, beef extract, yeast extract dan glucose dilarutkan dalam sebagian akuabides, kemudian
28
ditambahkan bacto agar, selanjutnya ditambahkan akuabides hingga volume menjadi 1 000 ml. Sesuaikan pada pH 8.5 ± 0.1 dan dididihkan sampai bacto agar terlarut. Media biakan bakteri (media nomor 1) dibuat dengan menimbang peptone 10 g, beef extract 5 g, NaCl 2.5 g, bacto agar 20 g dan akuabides 1 000 ml. Peptone, beef extract dan NaCl dilarutkan dalam sebagian akuabides, kemudian ditambahkan bacto agar, selanjutnya ditambahkan akuabides hingga volume menjadi 1 000 ml. Sesuaikan pada pH 6.5 ± 0.1 dan dididihkan sampai bacto agar terlarut. Semua media biakan disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 ± 1 ºC, dengan tekanan 15 psi atau 1.03421 x 105 pascal selama 15 menit.
Pembuatan Larutan Stok Baku Pembanding Sebelum melakukan penimbangan, perlu diperhitungkan potensi dari masingmasing standar yang tertera pada label. Pembuatan larutan baku pembanding penisilin dilakukan dengan menimbang sejumlah baku penisilin G kemudian dilarutkan dalam dapar nomor 1 hingga didapatkan konsentrasi 1 000 IU/ml. Larutan baku pembanding oksitetrasiklin dibuat dengan menimbang sejumlah baku pembanding oksitetrasiklin hidroklorida kemudian dilarutkan dalam akuabides hingga diperoleh konsentrasi 1 000 µg/ml. Pembuatan larutan baku pembanding kanamisin dilakukan dengan menimbang sejumlah baku pembanding kanamisin sulfat kemudian dilarutkan dalam dapar nomor 3 hingga diperoleh konsentrasi 1 000 µg/ml. Larutan baku pembanding tilosin dibuat dengan menimbang sejumlah baku pembanding tilosin tartrat dilarutkan 10% methanol dalam akuabides hingga diperoleh konsentrasi 1 000 µg/ml.
Pembuatan Larutan Baku Kerja Pembuatan larutan baku kerja untuk penisilin dilakukan dengan mengambil 2 ml larutan stok penisilin G diencerkan sampai dengan 20 ml larutan dapar nomor 2, dikocok hingga homogen, maka diperoleh larutan baku kerja 100 IU/ml, selanjutnya dilakukan pengenceran serial 10 IU/ml, 1 IU/ml, 0.4 IU/ml, 0.04 IU/ml, 0.02 IU/ml, 0.01 IU/ml, 0.005 IU/ml dan 0.0025 IU/ml. Konsentrasi yang akan
29
digunakan sebagai larutan kurva baku adalah konsentrasi 0.04 IU/ml, 0.02 IU/ml, 0.01 IU/ml, 0.005 IU/ml, dan 0.0025 IU/ml. Pembuatan larutan baku kerja untuk oksitetrasiklin, kanamisin, dan tilosin dilakukan dengan cara yang sama yaitu masing-masing larutan stok baku diambil 2 ml, diencerkan dengan dapar nomor 2 sampai dengan 20 ml untuk memperoleh larutan baku kerja 100 µg/ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran serial dengan konsentrasi 10 µg/ml, 4 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml, 0.5 µg/ml, dan 0.25 µg/ml. Konsentrasi yang digunakan sebagai larutan kurva baku standar adalah konsentrasi 4 µg/ml, 2 µg/ml, 1 µg/ml, 0.5 µg/ml, dan 0.25 µg/ml.
Pembuatan Kurva Baku Media cair yang telah disiapkan ditambahkan 1 ml bakteri (dengan konsentrasi 1.1 × 108 cfu/ml) sesuai golongan antibiotika yang akan diuji, sebanyak 8 ml dituang ke dalam masing-masing cawan. Didiamkan pada suhu kamar hingga mengeras. Larutan baku kerja yang akan digunakan untuk setiap golongan antibiotika dan larutan dapar fosfat digunakan sebagai kontrol negatif, diteteskan masing-masing sebanyak 75 µl pada kertas cakram dengan diameter 8 mm, biarkan sampai meresap sebelum diletakkan pada media sesuai golongan antibiotika. Diinkubasi pada suhu 55 ± 1 ºC untuk penisilin, suhu 30 ± 1 ºC untuk oksitetrasiklin, suhu 36 ± 1 ºC untuk kanamisin dan tilosin. Inkubasi dilakukan selama 16-18 jam. Diameter daerah hambat diukur dengan menggunakan jangka sorong. Dari luas daerah hambat dibuat kurva yang menyatakan hubungan (linier regresi) antara konsentrasi antibiotika dengan daerah hambatan. Kurva baku digunakan sebagai dasar pengujian untuk memperkirakan konsentrasi residu yang terkandung dalam sampel yang diuji jika terbentuk daerah hambatan.
Persiapan Sampel Daging sebanyak 10 g dipotong kecil-kecil, kemudian pelarut dapar nomor 2 ditambahkan sebanyak 20 ml. Larutan tersebut dihomogenkan menggunakan homogenizer, kemudian disentrifus 3 000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan siap untuk dilakukan pengujian.
30
Persiapan Bakteri Uji Bakteri Bacillus cereus ATCC 11778 ditumbuhkan pada agar miring media nomor 1 dalam botol media (roux’s bottle) sebanyak 100 ml. Spora Bacillus cereus ATCC 11778 diinokulasikan ke dalam botol-botol yang telah diisi media nomor 1 tersebut dengan cara melakukan goresan dengan menggunakan ose, diinkubasi selama satu minggu pada suhu 30 ºC dan diamati pertumbuhannya setiap hari. Biakan yang telah membentuk koloni bakteri dipanen dengan cara mengerok permukaan media dengan ose steril dan dimasukkan dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml sebanyak 4 tabung, kemudian suspensi tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 ºC selama 30 menit. Suspensi kemudian disentrifus dengan kecepatan 3 000 rpm selama 30 menit, lalu supernatannya dibuang dan ditambahkan larutan NaCl fisiologis steril secukupnya, selanjutnya dihomogenkan dan dimasukkan dalam refrigerator dengan kisaran suhu 4-8 ºC selama 18-24 jam. Suspensi tersebut kemudian dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 ºC selama 30 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 1 000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Hasilnya disimpan sebagai bakteri dalam refrigerator dengan suhu maksimal 10 ºC.
31
Pelaksanaan Pengujian Tahapan pelaksanaan pengujian disajikan dalam bagan pada Gambar 3.
bakteri 1 ml (konsentrasi 1.1×108cfu/ml) untuk media pertumbuhan Bacillus stearothermophilus ditambahkan 2.5 % larutan dextrose 2 %
100 ml media
8 ml media dituang ke dalam cawan Petri steril yang telah diberi kode, didiamkan pada suhu kamar hingga mengental 8 ml media
cawan Petri 100 × 12 mm
Kertas cakram 8 mm ditetesi 75 µl sampel, ditempelkan di atas media agar yang telah disiapkan. Pada setiap pengujian diberi kontrol negatif (larutan dapar posfat 2) dan kontrol positif golongan beta laktam menggunakan standar konsentrasi 0.01 IU/ml, sedangkan golongan tetrasiklin, makrolida, dan aminoglikosida menggunakan standar konsentrasi 1 µg/ml
Biakan diinkubasi selama 16-18 jam golongan penisilin pada suhu 55 ± 1 ºC golongan makrolida dan aminoglikosida pada suhu 36 ± 1 ºC golongan tetrasiklin pada suhu 30 ± 1 ºC
Setelah diinkubasi, diamati dan diukur daerah hambatan pertumbuhan dari masing-masing bakteri uji yang terbentuk di sekeliling kertas cakram dengan menggunakan jangka sorong. Untuk memperkirakan konsentrasi residu, luas daerah hambat dimasukkan dalam kurva standar yang dibuat. Gambar 3 Bagan pengujian bioassay (BSN 2008).
32
Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisa secara deskriptif dengan menyajikan dalam bentuk tabel dan gambar (Mattjik & Sumertajaya 2002).
