1
METIL p-HIDROKSIBENZOAT DARI FRAKSI NONPOLAR EKSTRAK METANOL DAUN KETEPENG (Cassia alata)
SELVIA RAHMAWATI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
3
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Metil p-Hidroksibenzoat dari Fraksi Nonpolar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata) adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Desember 2013
Selvia Rahmawati NIM G44090017
5
ABSTRAK SELVIA RAHMAWATI. Metil p-Hidroksibenzoat dari Fraksi Nonpolar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata). Dibimbing oleh PURWANTININGSIH SUGITA dan BUDI ARIFIN. Ketepeng (Cassia alata) adalah tanaman perdu yang tumbuh berkelompok dan berguna bagi kesehatan. Daunnya secara tradisional digunakan untuk mengobati sembelit dan penyakit kulit di banyak negara seperti Indonesia. Penelitian secara khusus pada daun ketepeng belum banyak dilakukan di Indonesia, terutama mengenai informasi komponen kimia dalam daun tersebut. Dalam penelitian ini, metabolit sekunder daun ketepeng dari Tangerang, Provinsi Banten diisolasi menggunakan metode ekstraksi dan berbagai teknik kromatografi, seperti kromatografi cair vakum, kromatografi radial, dan kromatografi lapis tipis preparatif. Uji fitokimia ekstrak metanol menunjukkan kandungan senyawa steroid/triterpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, dan tanin. Sebanyak 4 subfraksi dari fraksi nonpolar ekstrak metanol dianalisis menggunakan spektrofotometer resonans magnet inti. Hasil analisis menunjukkan bahwa salah satu subfraksi dari fraksi n-heksana-etil asetat (8:2) merupakan senyawa metil p-hidroksibenzoat, sedangkan struktur molekul dari 3 subfraksi lainnya belum dapat ditentukan karena masih berupa campuran. Kata kunci: Cassia alata, ketepeng, kromatografi, metil p-hidroksibenzoat
ABSTRACT SELVIA RAHMAWATI. Methyl p-Hydroxybenzoate in Nonpolar Fraction of Ketepeng (Cassia alata)’s Leaves’ Methanol Extract. Supervised by PURWANTININGSIH SUGITA and BUDI ARIFIN. Ketepeng (Cassia alata) is a herbaceous plant that grows in clusters and beneficial for health. The leaves are traditionally used to treat constipation and skin diseases in some countries including Indonesia. Only a few studies specifically performed on ketepeng leaves have been done in Indonesia, particularly regarding information about the chemical constituents. In this study, secondary metabolites from the leaves from Tangerang, Banten Province were isolated by extraction and various chromatography methods, such as vacuum liquid chromatography, radial chromatography, and preparative thin layer chromatography. Phytochemical test revealed the presence of steroids/triterpenoids, flavonoids, alkaloids, saponins, and tannins. Four subfractions in nonpolar fractions of methanol extract were analyzed using nuclear magnetic resonance spectrophotometer. The result showed that subfraction of n-hexane-ethyl acetate (8:2) fraction contained methyl phydroxybenzoate, whereas the molecular structure in the other 3 subfractions had not yet been elucidated because they still contain mixture of compounds. Key words: Cassia alata, chromatography, ketepeng, methyl p-hydroxybenzoate
7
METIL p-HIDROKSIBENZOAT DARI FRAKSI NONPOLAR EKSTRAK METANOL DAUN KETEPENG (Cassia alata)
SELVIA RAHMAWATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
9
Judul Skripsi: Metil-p-Hidroksibenzoat dari Fraksi Nonpolar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata) Nama : Selvia Rahmawati NIM : G44090017
Disetujui oleh Pembimbing I
Pembimbing II
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Pembimbing I
Budi Arifin, SSi, MSi Pembimbing II
Diketahui oleh
Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
11
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul Metil p-Hidroksibenzoat dari Fraksi Nonpolar Ekstrak Metanol Daun Ketepeng (Cassia alata). Karya ilmiah ini disusun berdasarkan penelitian yang dilaksanakan pada bulan Januari hingga Oktober 2013 di Laboratorium Kimia Organik, Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai dari dana DIPA IPB BOPTN 2013 atas nama Dr Dra Gustini Syahbirin, MS dan Tim. Penulis mengucapkan terima kasih atas semua bimbingan, dukungan, dan kerja sama yang telah diberikan oleh Prof Dr Dra Purwantiningsih Sugita, MS selaku pembimbing I dan Budi Arifin SSi, MSi selaku pembimbing II. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Denar, Sigit, Wahyu, Ichsan, Fiya, dan Febrina atas segala diskusi dan saran berkaitan dengan penelitian. Terima kasih juga kepada Bapak Sabur, Ibu Yenni, Ibu Nia, dan teman-teman Kimia 46 atas bantuan yang telah diberikan selama penulis melakukan penelitian di Laboratorium Kimia Organik. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Ayah, Ibu, Kakak, Adik, Amar serta keluarga atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Terima kasih.
Bogor, Desember 2013 Selvia Rahmawati
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Metode Preparasi Daun C. alata Kadar Air Ekstraksi Uji Fitokimia Isolasi HASIL DAN PEMBAHASAN Kandungan Fitokimia Ekstrak Kasar Metanol Hasil Isolasi dan Pemurnian Komponen Hasil Penentuan Struktur Senyawa dalam Fraksi A2 dan A4 Metil p-hidroksibenzoat SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN
vii vii vii 1 2 2 3 3 3 3 3 4 5 5 6 121 12 15 15 15 15 189
vii
DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5
Fitokimia ekstrak kasar metanol daun C. alata 5 Rendemen fraksi-fraksi hasil KCV ekstrak EtOAc daun C. alata 7 Rendemen fraksi-fraksi hasil KLT preparatif fraksi A25 daun C. alata 7 Rendemen fraksi-fraksi hasil KR dari fraksi A4 9 1 13 Data geseran kimia H NMR dan C NMR senyawa kaemferol dalam pelarut CDCl3 12 1 13 6 Perbandingan nilai geseran kimia H NMR dan C NMR hasil penelitian dengan hasil perhitungan untuk metil p-hidroksibenzoat dan asam pmetoksibenzoat 14 7 Perbandingan nilai geseran kimia 1H dan 13C NMR metil p-hidroksibenzoat dengan pangkalan data spektrum di Jepang 14
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Tanaman C. alata Kromatogram KLT ekstrak kasar metanol, ekstrak metanol bebas-klorofil, tanin, dan ekstrak etil asetat bebas-tanin dari daun C. alata Kromatogram KLT fraksi-fraksi hasil KCV dari ekstrak EtOAc Kromatogram KLT fraksi A253 dalam 3 eluen berbeda Kromatogram KLT 2D fraksi A253 Kromatogram KLT fraksi hasil KR dari fraksi A4 Kromatogram KLT fraksi A45 Kromatogram KLT fraksi A411 dan A412 Kromatogram KLT 2D fraksi A412 Kromatogram KLT fraksi A412 dalam 3 eluen berbeda Kromatogram KLT fraksi A433 dalam 3 eluen berbeda Komponen kimia flavonoid dan asam lemak yang telaj dilaporkan pada C. alata Dugaan struktur dasar dalam fraksi A253 Dugaan senyawa dalam fraksi A253
1 6 7 8 8 9 9 10 10 10 11 12 13 13
DAFTAR LAMPIRAN 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Diagram alir isolasi komponen kimia dalam fraksi nonpolar daun C. alata Hasil determinasi tanaman C. alata Kadar air serbuk daun C. alata Spektrum 1H NMR fraksi A45 Spektrum 1H NMR fraksi A412 Spektrum 1H NMR fraksi A433 Spektrum 1H NMR fraksi A253 Spektrum 13C NMR fraksi A253 Perhitungan geseran kimia atom H dan C pada metil p-hidroksibenzoat dan asam p-metoksibenzoat
19 20 21 22 22 23 24 26 27
1
1
PENDAHULUAN Fabaceae adalah famili tanaman berbunga terbesar kedua, dengan 650 genus dan 18 000 spesies. Menurut Surjowinoto (2006), secara umum famili Fabaceae berbentuk herba, semak, atau pohon. Daunnya majemuk berdaun tiga (trifoliet), menyirip atau menyirip ganda, letaknya berseling atau berhadapan, dan ada stipula. Bunganya berada dalam tandan atau berlekatan, memiliki petal 5, benang sari biasanya 10, bakal buah menumpang, monokarp, dan bakal biji 1 sampai banyak. Buah berupa polong (legum), merekah atau tidak merekah, biji biasanya tanpa endosperma. Senyawa metabolit sekunder dari famili Fabaceae meliputi glukosinolat, amina, alkaloid, terpenoid, flavonoid, katekin, dan tanin. Farmakologi famili ini antara lain sebagai antioksidan, antimikrob, dan antijamur (Wink 2013). Beberapa tanaman dari famili Fabaceae antara lain ialah kacang polong, lentil, lupin, klover, alfalfa, kacang kedelai, dan tanaman dari genus Cassia (Anonim 2000). Genus Cassia berasal dari Asia Tenggara, Afrika, Australia Utara, dan Amerika Latin. Genus ini memiliki 500–600 spesies, sebagian besar dari Amerika (Sob et al. 2010). Beberapa spesies Cassia yang telah banyak diteliti antara lain C. alata, C. fistula, C. siamea, dan C. tora (Phongpaichit et al. 2004). Senyawa metabolit sekunder yang terdapat pada genus ini antara lain emodin, rein, krisofanol, aloe-emodin, dan parietin (Kuo et al. 2002, Hazrina et al. 2008, dan Hyun et al. 2009 diacu dalam Sob et al. 2010). Beberapa contoh kegunaan dari genus Cassia di antaranya daun dan bunga C. siamea dapat digunakan sebagai antibakteri (Bhadauria dan Singh 2011), sedangkan daun C. fistula digunakan sebagai antioksidan (Bahorun et al. 2005). Cassia alata (Gambar 1) adalah tanaman perdu yang banyak dikenal masyarakat dengan nama lain seperti ketepeng cina, tabankun, saya mara, kupangkupang, acon-acon, dan gelanggang (Damayanti 1999). Tanaman ini secara tradisional digunakan dalam pengobatan herbal untuk sembelit dan berbagai penyakit kulit, serta sebagai antiparasit, malaria, influenza, dan bronkitis di negara-negara seperti Indonesia, Bangladesh, Filipina, dan Jamaika (Kusmardi et al. 2007; Levy dan Carley 2012). Potensi C. alata sebagai antimikrob juga telah dilaporkan oleh Okwu dan Nnamdi (2011).
2
1 3
4
(a) (b) Gambar 1 Tanaman Cassia alata (a). Bagian-bagian tanaman: batang1, daun2, buah3, dan bunga4 (b) (Hennebelle et al. 2009) Beragam senyawa aktif telah diisolasi dari C. alata. Dari ekstrak etanol biji C. alata dari Nigeria berhasil diisolasi senyawa alkaloid, yaitu kanabinoid
2
dronabinol ((S)-3-butil amino-9-metil-10,10a-dihidro-7H-benzo [c] kromen-1-ol) (Okwu dan Nnamdi 2011). Di Bangladesh, ekstrak metanol dari daun C. alata mengandung senyawa tanin yang termasuk turunan dari asam elagat, yaitu asam 2,3,7-tri-O-metilelagat (Alam et al. 2003). Di Nigeria, daun C. alata mengandung senyawa flavonol (kaemferol dan kuersetin), dan senyawa flavon (kriseriol) (Panichayupakaranant dan Kaewsuwan 2004; Ogunwande et al. 2010). Ekstrak etanol daun C. alata mengandung flavonol glikosida, yaitu 5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-3-[(2S, 3R, 4S ,5S ,6R)-3,4,5-trihidroksi-6-(hidroksimetil)oksan-2-il] oksikromen-4-on (Saito et al. 2012a). Senyawa flavonoid kaemferol juga terdapat pada ekstrak metanol daun C. alata dari Jamaika (Levy dan Charley 2012). Menurut Saito et al. (2012b), daun C. alata yang berasal dari Brasil mengandung senyawa kuinon, yaitu emodin, aloe-emodin, krisofanol dan isokrisofanol, dan rein. Kandungan minyak atsiri hasil distilasi dari daun C. alata Nigeria ketika diidentifikasi dengan alat kromatografi gas dan kromatografi gas-spektrometer massa mengandung 1,8-sineol (39.8%), β-kariofilena (19.1%), kariofilena oksida (12.7%), limonena (5.2%), germakrena D (5.5%), dan α-selinena (5.4%) (Ogunwande et al. 2010). Selain itu, tanaman ini juga mengandung senyawa dari golongan saponin, steroid (Khare 2007; Fernand et al. 2008; Kayembe et al. 2010; Midawa et al. 2010; Levy dan Carley 2011; Odunbaku dan Ilusanya 2011; Saito et al. 2012b), dan asam lemak (Khare 2007; Ogunwande et al. 2010; Odunbaku dan Ilusanya 2011; Liu et al. 2009 diacu dalam Singh et al. 2012). Penelitian secara khusus pada daun C. alata di Indonesia belum banyak dilakukan, terutama mengenai informasi komponen kimia dalam daun. Perbedaan tempat tumbuh akan berpengaruh pada jenis dan jumlah komponen metabolit sekunder tanaman. Oleh sebab itu, penelitian ini bertujuan mencirikan komponen kimia dalam daun C. alata yang tumbuh di Indonesia. Isolasi dan pencirian dilakukan pada fraksi nonpolar dari ekstrak metanol daun.
BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain penguap putar, bejana elusi, kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi radial (KR), dan alat-alat kaca yang lazim di laboratorium. Spektrum resonans magnet inti (NMR) diperoleh dengan spektrometer JEOL ECA 500 yang bekerja pada frekuensi 500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C) di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Puspiptek Serpong dan Basic Science Centre A, Institut Teknologi Bandung. Bahan-bahan yang dipakai adalah daun ketepeng, metanol, etil asetat (EtOAc), kloroform-amonia, asam sulfat p.a, pereaksi Mayer, Dragendorf, Wagner, dietil eter, asam asetat glasial, akuades, serbuk Mg, HCl p.a, pereaksi FeCl3 1%, n-heksana, aseton, kloroform (CHCl3), diklorometana (MTC), silika gel Merck 60G untuk KCV dan kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif, silika gel Merck 60 PF254 untuk KR, silika gel 60 (0.2–0.5 mm) untuk impregnasi sampel KCV, dan KLT GF254 untuk KLT.
3
Metode Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu tahap preparasi ekstrak simplisia, uji fitokimia, isolasi dan pemurnian, serta pencirian komponen kimia. Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari hingga Oktober 2013 di Laboratorium Kimia Organik dan Laboratorium Bersama, Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor. Preparasi Daun C. alata Sampel daun C.alata diperoleh dari desa Cikasungka, Kecamatan Solear, Tangerang, Provinsi Banten dan sampel daun yang diambil berumur tua. Determinasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor. Sampel dikeringkan pada suhu ruang selama 3–5 hari, kemudian digiling dan dihomogenkan ukurannya sehingga diperoleh serbuk berukuran 60 mesh. Kadar Air (AOAC 950.46 (B) 2005) Cawan petri kosong dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105 °C selama 3 jam, lalu didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 2 g sampel ditimbang dan ditempatkan dalam cawan petri tersebut, kemudian diratakan menggunakan spatula dan dimasukkan kembali ke dalam oven bersuhu 105 oC. Setelah 3 jam, cawan beserta sampel dimasukkan ke dalam desikator hingga dingin, lalu ditimbang. Proses pengeringan dan penimbangan diulangi hingga bobotnya konstan. Uji ini dilakukan triplo. Ekstraksi Serbuk daun sebanyak 1 kg dimaserasi dengan 4 L metanol pada suhu ruang selama 24 jam. Maserat dipisahkan, kemudian residu dimaserasi kembali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Maserasi dilakukan sebanyak 3 ulangan. Semua maserat dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar. Ekstrak metanol diperoleh berwarna hijau tua dan dihitung rendemennya dengan kadar air sebagai faktor koreksi. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Alkaloid. Sebanyak 2 g sampel ekstrak daun dilarutkan dalam kloroform, kemudian ditambahkan 10 mL kloroform-amoniak dan disaring. Filtrat yang diperoleh ditetesi dengan H2SO4 2 M, kemudian dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam (tidak berwarna) dipipet ke dalam tabung reaksi kemudian larutan dibagi 3, masing-masing ditambahkan dengan beberapa tetes pereaksi Dragendorf, Mayer, dan Wagner. Uji akan positif alkaloid apabila berturut-turut dihasilkan endapan yang berwarna jingga, putih kekuningan, dan cokelat. Triterpenoid dan Steroid. Sebanyak 2 g sampel ditambahkan 25 mL etanol, lalu dipanaskan dan disaring. Filtrat diuapkan, kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter dipipet dan diuji pada lempeng tetes. Jika penambahan pereaksi Lieberman-Buchard sebanyak 3 tetes membentuk warna merah/ungu, maka sampel positif mengandung triterpenoid. Jika terbentuk warna hijau, maka sampel positif mengandung steroid.
4
Flavonoid dan Fenol. Sebanyak 2 g sampel ekstrak daun diekstraksi dengan beberapa mL metanol hingga terendam, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring. Kemudian filtrat dibagi 2, bagian pertama ditambahkan NaOH 10%. Bila dihasilkan warna merah, berarti positif terdapat senyawa fenol hidrokuinon. Bagian kedua digunakan untuk uji flavonoid: 5 mL filtrat dibagi ke dalam 3 tabung reaksi, lalu masing-masing ditambahkan 0.1 g serbuk Mg, 1 mL alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama), dan 5 mL amil alkohol, dan dikocok kuat-kuat. Hasil uji positif flavonoid ditunjukkan apabila terbentuk warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Saponin dan Tanin. Sebanyak 2–4 g sampel ekstrak daun diekstraksi dengan akuades panas, kemudian dipanaskan sampai mendidih dan disaring. Filtrat dibagi ke dalam 2 tabung reaksi. Bagian pertama untuk uji saponin: larutan dibiarkan agak dingin, kemudian dikocok secara tegak. Timbul busa setinggi lebih kurang 1 cm yang stabil selama 10 menit menandakan positif terdapat saponin. Pada tabung reaksi kedua, filtrat ditambahkan FeCl3 1%. Bila dihasilkan warna biru atau hujau tua, menandakan positif terdapat tanin. Isolasi (modifikasi Hermawati 2009) Proses isolasi dilakukan dalam 2 tahapan, yaitu fraksionasi dan pemurnian. Fraksionasi memisahkan senyawa berdasarkan kepolaran menjadi fraksi-fraksi yang lebih sederhana. Pemurnian dilakukan untuk menghilangkan pengotor dalam fraksi sehingga didapatkan senyawa murni. Sebanyak 100 g ekstrak kasar metanol dilarutkan dengan 1 L metanol-air (1:1) dan didiamkan semalam. Klorofil yang mengendap dipisahkan dan ditimbang bobotnya, kemudian ekstrak metanol bebasklorofil diekstraksi dengan etil asetat dan didiamkan sesaat hingga terbentuk 2 fase. Kedua fase tersebut dipisahkan: ekstrak air (fase bawah) merupakan tanin dan ekstrak etil asetat (fase atas) dipekatkan dengan penguap putar, kemudian difraksionasi menggunakan KCV. Fraksi nonpolar yang terkumpul dimurnikan dengan KR. Diagram alir proses isolasi daun ini dapat dilihat pada Lampiran 1. Ekstrak etil asetat difraksionasi menggunakan KCV. Eluen KCV ditentukan dengan cara menguji pola pemisahan KLT ekstrak tersebut pada eluen tunggal n˗heksana, kloroform, etil asetat, aseton, diklorometana, dan metanol. Eluen yang menahan pergerakan noda dan yang menggerakkan noda hingga mendekati garis batas pelarut digabungkan menjadi sistem eluen gradien berundak untuk KCV. Ekstrak etil asetat yang telah diimpregnasi kemudian dielusi dengan meningkatkan kepolaran sistem eluen tersebut. Eluat yg dihasilkan diuji pola pemisahannya pada sistem eluen terbaik, yaitu kombinasi 2 eluen yang menghasilkan jumlah noda terbanyak dan pola pemisahan terbaik. Eluat dengan pola pemisahan KLT yang sama digabungkan menjadi 1 fraksi. Pemurnian lebih lanjut menggunakan KR dengan campuran 2 eluen yang sama seperti KCV, tetapi dengan urutan peningkatan kepolaran yang berbeda. Eluat digabungkan menjadi 1 fraksi jika pola pemisahannya serupa, lalu setiap fraksi dianalisis kemurniannya. Fraksi dengan noda tunggal pada KLT dianalisis dengan spektrometer 1H dan 13C NMR.
5
HASIL DAN PEMBAHASAN Surat pernyataan hasil determinasi daun ketepeng yang diperoleh dari daerah Cikasungka, Kecamatan Solear, Tangerang ditunjukkan pada Lampiran 2. Daun tersebut diidentifikasi sebagai spesies Senna alata (L.) Roxb atau Cassia alata (L.) dengan famili Fabaceae. Kadar air serbuk daun C. alata kering diperoleh sebesar 5.81% (Lampiran 3). Kadar air suatu bahan berguna untuk mengoreksi rendemen ekstrak serta memperkirakan masa simpan bahan dan ketahanannya terhadap mikrob. Kadar air kurang dari 10% berarti serbuk daun dapat disimpan dalam jangka waktu yang cukup lama (Winarno 1992).
Kandungan Fitokimia Ekstrak Kasar Metanol Serbuk daun C. alata dimaserasi pada suhu ruang untuk mencegah rusaknya senyawa metabolit sekunder yang tidak tahan terhadap suhu tinggi. Pelarut metanol dipilih karena mampu melarutkan hampir semua komponen baik yang bersifat polar, semipolar, maupun nonpolar (Al-Ash’ary et al. 2010). Ekstrak kasar metanol setelah dipekatkan berjumlah 380 g dengan rendemen 40% berdasarkan bobot kering. Wujudnya pasta kental dengan warna hijau tua. Uji fitokimia ekstrak kasar metanol dilakukan untuk menentukan secara kualitatif golongan senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut. Hasil uji menunjukkan adanya senyawa golongan fenolik, flavonoid, steroid/triterpenoid, saponin, dan alkaloid (Tabel 1). Flavonoid dan steroid/triterpenoid juga teridentifikasi pada penelitian terdahulu, yaitu Soetjipto et al. (2007), Veerachari dan Bopaiah (2012). Fenolik dan saponin tidak ditemukan pada Veerachari dan Bopaiah (2012), sedangkan alkaloid tidak ditemukan pada Soetjipto et al. (2007). Di Bangladesh, senyawa asam 2,3,7-tri-O-metilelagat merupakan golongan fenolik yang berhasil diisolasi dari ekstrak metanol daun C. alata oleh Alam et al. (2003). Senyawa flavonoid kaemferol-3-O-gentiobiosida pada ekstrak metanol daun C. alata yang berasal dari Indonesia telah dilaporkan oleh Moriyama et al. (2003). Singh et al. (2012) melaporkan isolasi senyawa flavonoid kaemferol dan rein dari ekstrak air-metanol daun C. alata asal India. Dari ekstrak etanol biji C. alata asal Nigeria berhasil diisolasi senyawa alkaloid kanabinoid dronabinol ((S)3-butilamino-9-metil-10,10a-dihidro-7H-benzo[c]kromen-1-ol) (Okwu dan Nnamdi 2011). Perbedaan kandungan metabolit sekunder ini disebabkan oleh perbedaan umur dan tempat tumbuh tanaman. Tabel 1 Fitokimia ekstrak kasar metanol daun C. alata Golongan Senyawa
Ekstrak metanol (Penelitian ini)
Fenolik Flavonoid Steroid/Triterpenoid Saponin Alkaloid
+ + + + +
Veerachari dan Bopaiah (2012) (Bangalore, India) + + +
Soetjipto et al. (2007) (Salatiga, Indonesia) + + + + -
6
Hasil Isolasi dan Pemurnian Komponen Proses isolasi diawali dengan penghilangan klorofil dalam ekstrak kasar metanol. Klorofil yang terendapkan berjumlah 69 g (46%). Klorofil ini lengket (seperti gom) dan berwarna hijau tua. Hilangnya klorofil dalam ekstrak dibuktikan dengan hilangnya noda berwarna hijau di bawah sinar UV 254 nm dan noda warna merah muda di bawah sinar UV 366 nm. Warna noda ini khas untuk klorofil sebagaimana pernah dilaporkan oleh Khasanah et al. (2013). Filtrat bebas-klorofil yang berwarna cokelat tua kemudian diekstraksi dengan etil asetat untuk memisahkan sebagian tanin. Tanin dapat menyebabkan noda KLT mengekor sehingga mengganggu pemisahan komponen kimia. Ekstrak pekat etil asetat diperoleh sebanyak 26 g (31%), berwarna cokelat tua dan berbentuk seperti gom. Selebihnya merupakan tanin yang berada dalam fase air dengan bobot 57 g (69%). Ekstrak kasar metanol, ekstrak metanol bebas-klorofil, tanin, dan ekstrak etil asetat bebas-tanin kemudian dianalisis dengan KLT menggunakan eluen terbaik, yaitu n-heksana-EtOAc (4:6). Kromatogram KLT (Gambar 2) memperlihatkan bahwa komponen senyawa dalam ekstrak terpisahkan dengan lebih jelas setelah klorofil dan tanin dihilangkan. Masih tersisa noda tanin pada ekstrak etil asetat yang menandakan bahwa sebagian tanin belum terpisahkan ke fase cair. Klorofil
(a)
(b)
Gambar 2 Kromatogram KLT dalam eluen n-heksana-EtOAc (4:6), dari kiri ke kanan: ekstrak kasar metanol (EM), ekstrak metanol bebas-klorofil (EBK), tanin (Tn), dan ekstrak etil asetat bebas-tanin (EBT) dari daun C. alata, diamati di bawah sinar UV 254 nm (a) dan 366 nm (b) Ekstrak etil asetat diuji pola pemisahannya dengan beberapa eluen tunggal. Eluen n˗heksana menahan pergerakan noda, sedangkan etil asetat menggerakkan noda hingga mendekati garis batas pelarut. Campuran kedua eluen ini digunakan sebagai sistem elusi gradien berundak untuk fraksionasi kasar dengan metode KCV. Sebanyak 20.08 g ekstrak etil asetat difraksionasi dengan sistem eluen nheksana-EtOAc yang ditingkatkan kepolarannya, yaitu 1×200 mL n-heksana, 3×200 mL n-heksana-etil asetat 8:2, 3×200 mL 7:3, 3×200 mL 6:4, 3×200 mL 4:6, 2×200 mL 2:8, 2×200 mL 1:9 dan 2×200 mL etil asetat. Eluat-eluat yang dihasilkan kemudian dianalisis pola pemisahannya menggunakan KLT dengan eluen n-heksana-EtOAc (4:6). Eluat-eluat dengan pola pemisahan KLT yang relatif sama digabungkan menjadi 1 fraksi. Dihasilkan 8 fraksi (fraksi A1–A8). Pola pemisahan KLT setiap fraksi dengan eluen n-heksana-EtOAc (4:6) ditunjukkan pada Gambar 3. Rendemen setiap fraksi ditunjukkan pada Tabel 2.
7
(a) (b) Gambar 3 Kromatogram KLT fraksi-fraksi hasil KCV dari ekstrak EtOAc daun C. alata dalam eluen n-heksana-EtOAc (4:6) (dari kiri ke kanan: fraksi A1–A8), diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b) Tabel 2 Rendemen fraksi-fraksi hasil KCV ekstrak EtOAc daun C. alata Fraksi A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Nisbah n-heksana-EtOAc 10:0 8:2 7:3 6:4 4:6 3:7 (I) 3:7 (II) 1:9 MeOH
Bobot (mg) 27.2 68.3 120.6 326.2 388.4 374.3 361.5 5876.2
Rendemen (%) 0.13 0.34 0.60 1.60 1.93 1.86 1.79 29.25
Fraksi nonpolar hasil KCV ialah fraksi A1–A4. Fraksi A1 tidak difraksionasi karena tidak menghasilkan noda KLT dengan eluen n-heksana-EtOAc (4:6). Bobot yang dihasilkan agaknya disebabkan oleh pengotor yang tidak berpendar di bawah lampu UV. Fraksi A2 difraksionasi karena hanya menghasilkan 2 noda KLT dengan eluen CHCl3-metanol (0.5:9.5) dan bobotnya cukup besar. Sebanyak 68 mg fraksi A2 dimurnikan lebih lanjut menggunakan KR dengan sistem eluen nheksana-EtOAc yang ditingkatkan kepolarannya. Dihasilkan 8 fraksi, yaitu A21– A28. Fraksi A25 (9.40 mg) difraksionasi kembali menggunakan KLT preparatif dengan eluen n-heksana-CHCl3-EtOAc (7:1:2) dan diperoleh fraksi A251–A254 (Tabel 3). Uji KLT dengan sistem 3 eluen berbeda pada fraksi A253, yaitu dengan n-heksana-MTC (6:4), n-heksana-EtOAc (5:5), dan CHCl3-metanol (9.5:0.5), semuanya menghasilkan noda tunggal dengan Rf berturut-turut 0.01, 0.8, dan 0.06. Berdasarkan hasil ini, fraksi tersebut diduga sudah murni dengan 1 komponen senyawa (Gambar 4). Hasil ini didukung dengan hasil KLT 2-dimensi yang juga hanya menunjukkan 1 noda (Gambar 5). Tabel 3 Rendemen fraksi-fraksi hasil KLT preparatif fraksi A25 Fraksi A251 A252 A253 A254
Massa (mg) 2.4 2.9 3.2 1.3
Rendemen (%) 26 31 34 14
8
(a)
(b)
(c)
Gambar 4 Kromatogram KLT fraksi A253 dalam 3 eluen berbeda; n-heksanaMTC (5:5) (a), n-heksana-EtOAc (6:4) (b), dan CHCl3-metanol (0.5:9.5) (c), diamati di bawah lampu UV 254 nm B
A
kloroform-metanol (9.5:0.5)
(a)
Gambar 5
A
C
D
D
B
n-heksana-EtOac (7:3)
C
(b)
Kromatogram KLT 2D fraksi A253 dalam eluen CHCl3-metanol (9.5:0.5) (a) dan n-heksana-EtOAc (7:3) (b), diamati di bawah lampu UV 254 nm
Fraksi A3 tidak difraksionasi karena menghasilkan noda yang cukup banyak pada uji KLT dan bobotnya lebih kecil daripada fraksi A4 dan A5. Fraksi A4 yang jumlahnya lebih banyak daripada fraksi A2 dan masih tergolong nonpolar juga dipilih untuk dimurnikan menggunakan KR. Digunakan sistem eluen n-heksanaEtOAc yang ditingkatkan kepolarannya. Fraksi A5–A8 tidak dipilih karena kurang nonpolar sekalipun bobot yang dihasilkan lebih besar daripada fraksi A4. Fraksi A4 dimurnikan lebih lanjut menggunakan KR dengan sistem eluen n-heksanaEtOAc yang ditingkatkan kepolarannya. Diperoleh 5 fraksi, yaitu A41–A45, yang kemudian dianalisis KLT dengan eluen n-heksana-EtOAc (5:5) (Gambar 6). Massa setiap fraksi tersebut ditunjukkan pada Tabel 4.
9
(a)
Gambar 6
(b)
Kromatogram KLT ekstrak metanol (EM), ekstrak bebas-klorofil (EBK), ekstrak bebas-tanin (EBT), fraksi hasil KR dari fraksi A4 (A41–A45) dalam eluen n-heksana-EtOAc (5:5), diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b) Tabel 4 Rendemen fraksi-fraksi hasil KR dari fraksi A4 Fraksi A41 A42 A43 A44 A45
Massa (mg) 30.3 5.6 30.8 6.1 35.2
Rendemen (%) 12.9 2.4 13.1 2.6 14.9
Fraksi A45 yang bobotnya terbesar menunjukkan komponen tunggal senyawa dengan nilai Rf 0.63 pada uji KLT dengan eluen n-heksana-EtOAc-asam asetat (4:6:0.5) (Gambar 7). Penambahan asam asetat pada eluen ini bertujuan memperjelas bahwa noda tersebut tunggal dan bulat. Pendarannya kuat di bawah sinar UV 254 nm dan berbentuk minyak berwarna cokelat muda.
Rf ~ 0.63
Gambar 7
(a) (b) Kromatogram KLT fraksi A45 dalam eluen n-heksana-EtOAc-asam asetat (4:6:0.5) diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b)
Fraksi A41 dan A43 yang bobotnya cukup besar dan hampir sama masing-masing juga dimurnikan lebih lanjut menggunakan KR dengan sistem eluen n-heksanaEtOAc yang ditingkatkan kepolarannya. Kedua fraksi ini hanya menghasilkan 3 noda pada uji KLT, yang terpisahkan dengan baik. Fraksionasi fraksi A41 menghasilkan 2 fraksi, yaitu A411 yang memiliki 2 noda dengan Rf 0.95 dan 0.89, serta A412 yang memiliki noda tunggal dengan Rf 0.23 pada eluen nheksana-EtOAc (8:2) (Gambar 8). Massa setiap fraksi ditunjukkan pada Tabel 4. Fraksi A412 berpendar dengan warna kuning di bawah sinar UV 254 dan 366 nm, berbentuk serabut kristal dan berwarna kuning.
10
Rf ~ 0.95 Rf ~ 0.89
Rf ~ 0.23
(a) (b) Gambar 8 Kromatogram KLT fraksi A411 dan A412 dalam eluen n-heksanaEtOAc (8:2), diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b) Serabut kristal ini kemudian dicuci dengan n-heksana dan diuji kemurniannya dengan KLT 2D (Gambar 9) dan KLT dengan 3 sistem eluen berbeda, yaitu CHCl3-aseton (9:1), n-heksana-EtOAc (7:3), dan n-heksana-CHCl3 (1:9) (Gambar 10). Kromatogram KLT 2D menunjukkan noda tunggal, demikian pula 3 sistem eluen berbeda menghasilkan nilai Rf berturut-turut 0.80, 0.43, dan 0.05. Berdasarkan hasil ini, fraksi A412 diduga telah murni. B
A
kloroform-metanol (9.5:0.5)
Gambar 9
A
C
D
D kloroform-aseton (9:1)
B
C
Kromatogram KLT 2D fraksi A412 dalam eluen CHCl3-metanol (9.5:0.5) (a) dan CHCl3-aseton (9:1) (b), diamati di bawah lampu UV 254 nm
(1) (2) (3)
(1) (2) (3)
(b) (a) Gambar 10 Kromatogram KLT fraksi A412 dalam 3 eluen berbeda: CHCl3-aseton (9:1) (1), n-heksana-EtOAc (7:3) (2), dan n-heksana-CHCl3 (1:9) (3), diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b) Fraksionasi fraksi A43 menghasilkan 6 fraksi, yaitu A431–A436, lebih banyak daripada fraksi-fraksi dari fraksi A41. Pola pemisahan KLT dengan eluen nheksana-EtOAc (5:5) menunjukkan hanya fraksi A433 (3.3 mg) yang menghasilkan noda tunggal. Uji kemurnian fraksi A433 dengan KLT pada sistem 3 eluen berbeda, yaitu n-heksana-EtOAc (8:2), MTC-EtOAc (8:2), dan CHCl3-EtOAc (9:1)
11
semuanya menghasilkan noda tunggal dengan Rf berturut-turut 0.26, 0.72, dan 0.33 (Gambar 11).
(1) (2) (3) (1) (2) (3)
(a) (b) Gambar 11 Kromatogram KLT fraksi A433 dalam 3 eluen berbeda: n-heksanaEtOAc (8:2) (1), MTC-EtOAc (8:2) (2), dan CHCl3-EtOAc (9:1) (3), diamati di bawah lampu UV 254 nm (a) dan 366 nm (b)
Hasil Penentuan Struktur Senyawa dalam Fraksi A2 dan A4 Berdasarkan hasil pencirian dengan 1H NMR, fraksi A45 belum murni (Lampiran 4). Senyawa golongan asam lemak diduga membentuk sinyal-sinyal di daerah alifatik, sementara keberadaan sinyal proton vinilik di 5.5 dan 6.6 ppm belum diketahui sumbernya. Spektrum 1H NMR fraksi A412 (Lampiran 5) juga menunjukkan bahwa fraksi ini belum murni. Diduga masih terkandung 2 senyawa, yaitu golongan asam lemak (sinyal-sinyal di daerah alifatik) dan flavonoid (sinyal-sinyal di daerah aromatik). Spektrum 1H NMR fraksi A433 tidak menunjukkan sinyal-sinyal yang jelas di daerah aromatik, agaknya disebabkan oleh sampel yang berjumlah sedikit sehingga larutan uji sangat encer, sementara sinyal-sinyal alifatik kemungkinan berasal dari golongan asam lemak (Lampiran 6). Senyawa flavonoid yang telah diisolasi dari ekstrak metanol daun C. alata asal Thailand adalah 3,5,7-trihidroksi-2-(4-hidroksifenil)-4H-kromen-4-on (kaemferol) (Panichayupakaranant dan Kaewsuwan 2004) (Gambar 12). Data geseran kimia 1 H dan 13C NMR senyawa tersebut ditunjukkan pada Tabel 5. Sementara asam lemak yang telah dilaporkan terkandung dalam daun C. alata adalah asam stearat dan asam palmitat (Oguwande et al. 2010) (Gambar 12).
12
Kaemferol (Panichayupakaranant dan Kaewsuwan 2004)
Asam heksadekanoat (asam palmitat) (Ogunwande et al. 2011)
Asam oktadekanoat (asam stearat) (Ogunwande et al. 2011) Gambar 12 Komponen kimia flavonoid dan asam lemak yang telah dilaporkan pada C. alata Tabel 5
Data geseran kimia 1H dan 13C NMR senyawa kaemferol dalam pelarut CDCl3 (Panichayupakaranant dan Kaewsuwan 2004) Atom C/H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1’ 2’/6’ 3’/5 4’
H 500 MHz (ppm) (multiplisitas, J dalam Hz, jumlah H) 6.18 (1H, 1.9, d) 6.38 (1H, 1.9, d) 8.07 (2H, 9.0, d) 6.90 (2H, 9.0, d) -
C 125 MHz (ppm) 158.27 137.12 177.67 162.50 99.29 165.57 94.49 160.54 104.56 123.75 130.67 116.31 158.27
Metil p-Hidroksibenzoat (Metil Paraben) Fraksi A253 berbentuk gom berwarna hijau muda dengan Rf 0.78 pada eluen n-heksana-EtOAc (6:4). Jumlah yang diperoleh sebanyak 3.2 mg dengan rendemen 34% dari fraksi A25. Spektrum 1H dan 13C NMR fraksi A253 (Lampiran 8 dan 9) dianalisis sebagai berikut. Sinyal singlet (3H) di 3.90 ppm diidentifikasi sebagai gugus metoksi. Dua sinyal doblet (2H) di 6.85 dan 7.95 ppm dengan tetapan kopling sama menunjukkan struktur cincin aromatik benzena
13
terdisubstitusi para (Gambar 13). Salah satu sinyal yang berada di medan atas (upfield) (6.85 ppm), menunjukkan adanya sumbangan-elektron dari substituen di posisi orto. Substituen penyumbang-elektron tersebut diduga adalah gugus – OCH3 atau –OH. Sinyal lainnya di 7.95 ppm berada di medan bawah (downfield), menunjukkan adanya substituen penarik-elektron di posisi orto. Kemungkinan substituen penarik-elektron tersebut adalah –CO2H atau –CO2R. Geseran kimia proton aromatik tanpa substituen lazimnya di sekitar 7.4 ppm. Spektrum ini pun masih memperlihatkan sedikit pengotor yang diduga berupa asam lemak di daerah 1–2 ppm.
Gambar 13 Dugaan struktur dalam dari fraksi A253 benzena terdisubstitusi para dengan substituen: penarik-elektron (X) dan penyumbang-elektron (Y) Spektrum 13C NMR menunjukkan 6 sinyal yang berasal dari 8 karbon. Sinyal di 167.00 ppm merupakan sinyal khas gugus karbonil asam karboksilat atau ester (160-180 ppm). Dua sinyal karbon sp2 di 132.09 dan 115.35 ppm memiliki intensitas 2 kali lebih tinggi, menunjukkan bahwa masing-masing mewakili 2 atom karbon yang ekuivalen (homotopik). Sinyal di 52.09 ppm sesuai dengan gugus metoksi. Sinyal karbon sp2 di 122.98 ppm dan 159.92 ppm memiliki intensitas yang rendah dan hampir sama dengan intensitas derau (noise). Kedua sinyal ini dianalisis berasal dari C-kuaterner. Sinyal yang lebih ke medan bawah (159.92 ppm) menunjukkan bahwa atom C-kuaterner tersebut mengikat substituen penarik-elektron yang lebih kuat. Analisis spektrum 1H dan 13C NMR ini menghasilkan 2 kemungkinan senyawa, yaitu metil p-hidroksibenzoat atau asam p-metoksibenzoat (Gambar 14).
(a) (b) Gambar 14 Dugaan senyawa dalam fraksi A253: metil p-hidroksibenzoat (a) atau asam p-metoksi benzoat (b)
14
Untuk memastikan dugaan senyawa dalam fraksi A253, maka dibandingkan data spektrum 1H dan 13C NMR hasil penelitian dibedakan dengan hasil perhitungan geseran kimia berdasarkan Silverstein et al. (2005) (Lampiran 9). Hasil perbandingan (Tabel 6) menunjukkan bahwa nilai geseran kimia hasil penelitian memiliki nilai lebih mendekati perhitungan nilai geseran kimia untuk senyawa metil p-hidroksibenzoat daripada senyawa asam p-metoksibenzoat. Jadi, fraksi A253 hasil pencirian ini diduga senyawa metil p-hidroksibenzoat. Tabel 6
Perbandingan nilai geseran kimia 1H dan 13C NMR hasil penelitian dengan hasil perhitungan berdasarkan Silverstein et al. (2005) untuk metil p-hidroksibenzoat dan asam p-metoksibenzoat Metil phidroksibenzoat (Perhitungan geseran kimia)
Asam pmetoksibenzoat (Perhitungan geseran kimia)
C 125 MHz (ppm)
H (ppm)
C (ppm)
H (ppm)
C (ppm)
122.98 132.09 115.35 159.92 52.09 167.00 -
7.90 6.91 -
123.20 131.30 115.70 159.90 -
8.06 7.02 -
123.70 130.80 114.50 164.20 -
Fraksi A253 (CDCl3)
Atom C/H 1 2/6 3/5 4 OCH3 C=O OH
H 500 MHz (ppm) (multiplisitas, J dalam Hz, jumlah H) 7.95 (d, 8.43, 2H) 6.85 (d, 8.43, 2H) 3.90 (s, 3H) -
Dugaan ini diperkuat dengan membandingkan data spektrum 1H dan 13C NMR hasil penelitian dengan pangkalan data spektrum untuk metil-phidroksibenzoat (SDBS). Hasil pembandingan (Tabel 7) nilai geseran kimia yang tidak berbeda jauh. Oleh karena itu, senyawa dalam fraksi A253 disimpulkan sebagai metil p-hidroksibenzoat. Tabel 7
Perbandingan nilai geseran kimia 1H dan 13C NMR metil phidroksibenzoat dengan pangkalan data spektrum di Jepang (SDBS)
Atom C/H 1 2/6 3/5 4 OCH3 C=O OH
Metil p-hidroksibenzoat hasil isolasi (CDCl3) H 500 MHz (ppm) C 125 (multiplisitas, J MHz dalam Hz, (ppm) jumlah H) 122.98 7.95 (d, 8.43, 2H) 132.09 6.85 (d, 8.43, 2H) 115.35 159.92 3.9 (s, 3H) 52.09 167.00 -
Metil p-hidroksibenzoat (SDBS) H (ppm)
C (ppm)
7.84 6.88 3.80 -
122.11 131.98 115.39 160.62 52.12 167.72 -
Metil p-hidroksibenzoat belum pernah dilaporkan dari hasil isolasi daun C. alata maupun pada genus Cassia dan famili Fabaceae (Wink 2013), tetapi pernah
15
dilaporkan dari tanaman famili lain. Di antaranya, senyawa ini dilaporkan telah diisolasi dari daun Nerium oleander yang berasal dari Shambat (Almahy dan Khalid 2006), tanaman Stocksia brahuica di Pakistan (Ali et al. 1998), dari akar Oxalis teburosa (Bais et al. 2003), dan ekstrak metanol kulit akar Zanthoxylum ailanthoides asal Taiwan (Cheng et al. 2003).
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Hasil uji fitokimia ekstrak metanol daun C. alata menunjukkan kandungan senyawa steroid/triterpenoid, flavonoid, alkaloid, saponin, dan tanin. Subfraksi A253 dalam fraksi n-heksana-etil asetat (8:2) dari ekstrak metanol daun C. alata diidentifikasi sebagai metil p-hidroksibenzoat. Senyawa dalam 3 subfraksi lainnya belum dapat ditentukan strukturnya karena masih berupa campuran.
Saran Diperlukan perbanyakan jumlah sampel agar fraksi A412 dapat difraksionasi lebih lanjut dan dapat diidentifikasi struktur flavonoid yang ada di dalamnya. Selain itu, komponen nonpolar seperti asam lemak perlu dihilangkan dengan nheksana terlebih dahulu agar tidak mengganggu analisis spektroskopi. Studi kandungan kimia juga perlu dilanjutkan ke fraksi semipolar dan fraksi polar.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2005. Official Methods of Analysis of AOAC International. AOAC 950.46 (B) 2005. Maryland (US): AOAC. [Anonim]. 2000. Familly Fabaceae. [Internet]. [diunduh 2013 Jul 24]. Tersedia pada:http://www.freewebs.com/arl_ipb_2006/deskripsi/climber_fabaceae. pdf. Al-Ashary MN, Supriyanti FMT, Zackiyah. 2010. Penentuan pelarut terbaik dalam mengekstraksi senyawa bioaktif dari kulit batang Artocarpus heterophyllus. J Sains Teknol Kim. 1(2):150-158. Alam A, Mamedov VA, Gubaidullin AT, Kalita D, Tsuboi S. 2003. Isolation and identification of 2,3,7-tri-O-methylellagic acid from Cassia alata leaves. J Nat Med. 57(2):73. Ali Z, Viqar UA, Muhammad Z, Rasool BT. 1998. Benzoic acid derivatives from Stocksia brahuica. Phytochemistry. 8(2):1271-1273. Almahy AH, Khalid EH. 2006. Chemical examination of the leaves of Nerium oleander. Int J Trop Med. 1(2):58-61.
16
Bahorun T, Neergheen VS, Aruoma OI. 2005. Phytochemical constituents of Cassia fistula. J African Biotechnol. 4(13):1530-1540. Bais HP, Ramarao V, Orge MV. 2003. Root specific elicitation and exudation of fluorescent β-carbolinesin transformed root cultures of Oxalis tuberosa. Plant Physiol Biochem. 41(4):345–353. Bhadauria S, Singh H. 2011. Bioactive nature of flavonoids from Cassia siamea and Lantana camara. Indian Fundamental Appl Life Sci. 1(2):107-110. Cheng Mj, Tsai IL, Chen IS. 2003. Chemical constituents from the root bark of Formosan Zanthoxylum ailanthoides. J Chinese Chem Soc. 50(6):12411246. Damayanti EK. 1999. Kajian tumbuhan obat berdasarkan kelompok penyakit penting pada berbagai etnis di Indonesia [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Fernand VE, Dinh DT, Washington SJ, Fakayode SO, Losso JN, Ravenswaay RIO, Warner IM. 2008. Determination of pharmacologically active compounds in root extracts of Cassia alata L. by use of high performance liquid chromatography. Talanta. 74(4):896-902. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Bandung (ID): Penerbit ITB Hennebelle T, Bernard W, Henry J, Sevser S, Francois B. 2009. Senna alata. Fitoterapia 80(7):385-393. Hermawati E. 2009. Metabolit sekunder dari salah satu tumbuhan obat Indonesia: daun Desmodium triquentrum Linn. (Farbaceae) [skripsi]. Bandung (ID): Institut Teknologi Bandung. Kayembe J R, Taba KM, Ntumba K, Tshiongo MTC, Kazadi TK. 2010. In vitro antimalarial activity of 20 quinones isolated from four plants used by traditional healers in The Democratic Republic of Congo. J Med Plant Res. 4(11):991-994. Khare CP. 2007. Indian Medicinal Plants: An Illustrated Dictionary. London (GB): Springer-Verlag. Khasanah N, Wuryanti, Suci N. 2013. Isolasi dan penentuan aktivitas spesifik klorofilase dari daun mahoni (Swietenia mahagoni). Chem Info. 1(1):386392. Kusmardi, Kumala S, Triana EE. 2007. Efek imunomodulator ekstrak daun ketepeng cina (Cassia alata L.) terhadap aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag. Makara Kesehatan. 11(2):50-53. Levy AS, Carley SK. 2012. Cytotoxic activity of hexane extracts of Psidium guajava L (Myrtaceae) and Cassia alata L (Caesalpineaceae) in Kasumi-1 and OV2008 cancer cell lines. Trop Pharmaceut Res. 11(2):201-207. Midawa SM, Ali BD, Mshelia BZ, Johnson J. 2010. Cutaneous wound healing activity of the ethanolic extracts of the leaf of Senna alata L (Fabaceae). Biol Sci Bioconserv. 2:63-68. Moriyama H, Toru I, Masahiro N, Yoshimi M. 2003. HPLC quantification of kaempferol-3-O-gentiobioside in Cassia alata. Fitoterapia. 74(5):425-430. doi:10.1016/S0367-326X(03)00058-3. Odunbaku OA, Ilusanya OAF. 2011. Synergistic effects of etanol leaf extracts of Senna alata and antimicrobial drugs on some pathogenic microbes. Adv Environ Biol. 5(8):2162-2165.
17
Ogunwande I A, Flamini G, Cioni PL, Omikorede O, Azeez RA, Ayodele AA, Kamil YO. 2010. Aromatic plants growing in Nigeria: essential oil constituents of Cassia alata (Linn.) Roxb. and Helianthus annuus L. Rev Nat Prod. 4(4):211-217. Okwu DE, Nnamdi FU. 2011. Cannabinoid dronabinol alkaloid with antimicrobial activity from Cassia alata Linn. Der Chemica Sinica. 2(2):247-254. Phanichayupakaranant P, Kaewsuwan S. 2004. Bioassay-guided isolation of the antioxidant constituent from Cassia alata L. leaves. J Sci Technool. 26(1):103-107. Phongpaichit S, Pujenjob N, Rukachaisirikul V, Ongsakul M. 2004. Antifungal activity from leaf extracts of Cassia alata L., Cassia fistula L. and Cassia tora L. Songklanakarin J Sci Technol. 26(5):741-748. [SDBS] Spectral Database for Organic Compounds. Anisic acid. [Internet] [diunduh 2013 Nov 21]. Tersedia pada: http://www.chemspider.com/ Datasource Details. [SDBS] Spectral Database for Organic Compounds. Methyl Paraben. [Internet] [diunduh 2013 Nov 21]. Tersedia pada: http://www.chemspider.com/ Datasource Details. Saito ST, Silva G, Santos RX, Gosmann G, Pungartnik C, Brendel M. 2012. Astragalin from Cassia alata induces DNA adducts in vitro and repairable DNA damage in the yeast Sacharomyces cerevisiae. Int J Mol Sci. 13(3): 2846-2862. doi:10.3390/ijms13032846. Saito ST, Trentin DS, Macendo AJ, Pungartnik C, Gosmann G, Silveira JDS, Guecheva TN, Henriques JAP, Brendel M. 2012. Bio-guided fractionation shows Cassia alata extract to inhibit Staphylococus epidermis and Pseudomonas aeruginosa growth and biofilm formation. Evidence-Based 20(12) :1-13. Complementary and Alternative Medicin. doi:10.1155/2012/867103. Silverstein RM, Webster FX, Kiemle DJ. 2005. Spectrometic Identification of Organic Compounds. ed. ke-7. New Jersey (US): Wiley. Singh B, Nadkarni JR, Vishwakarma RA, Bharate SB, Nivsarkar M, Anandjiwala S. 2012. The hydroalcoholic extract of Cassia alata (Linn.) leaves and its major compound rhein exhibits antiallergic activity via mast cell stabilization and lipoxygenase inhibition. J Ethnopharmacol. 141(1):469473. doi: 10.1016/j.jep.2012.03.012. Sob SVT, Wabo HK, Tchinda AT, Tane P, Ngadjui BT, Ye Y. 2010. Anthraquinones, sterols, triterpenoids and xanthones from Cassia obtusifolia. Biochem Syst Ecol. 38(3):342-345. doi :10.1016/j.bse.2010. 02.002 Soetjipto H, Kristijanto AI, Asmarowati RS. 2007. Toksisitas ekstrak kasar dan daun ketepeng cina (Sena alata L Roxb.) terhadap larva udang Artemia Salina Leach. Biota. 12(2):78-82. Surjowinoto M. 2006. Flora. Jakarta (ID): Pradnya Paramita. Veerachari U, Bopaiah AK. 2012. Phytochemical investigation of the ethanolic, methanolic, and ethyl acetate extracts of the leaves of six Cassia spesies. J Chem Pharm Res. 3(5):574-583. Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta (ID): Gramedia.
18
Wink M. 2013. Evolution of secondary metabolites in legumes (Fabaceae). South African Botany. 51(8):1026-1034.
19
Lampiran 1 Diagram alir isolasi daun C. alata
Serbuk daun C. alata (1000.39 g) - Dimaserasi (MeOH) 3×24 jam - Disaring - Dipekatkan
Residu
Ekstrak kasar MeOH (380.48 g)
Ekstrak kasar MeOH sisa (228.91 g)
Ekstrak kasar MeOH (151.58 g) -Dilarutkan (MeOH-air = 1:1) -Disaring
Klorofil (69.13 g)
Filtrat MeOH-air -Diekstraksi EtOAc (3x) -Dipekatkan Ekstrak EtOAc (25.25 g)
Tanin (56.81 g)
-KCV
Fraksi nonpolar
A1 (27.20 mg)
A2 (68.30 mg)
A3 (120.60 mg)
Fraksi polar
Fraksi semipolar
A5 (388.40 mg)
A4 (326.20 mg)
A6 (374.30 mg)
A8 (5876.30 mg)
KR
KR
A7 (361.50 mg) A41……A45
A21……A211
A251..A254
KLTP
A25
A41 (30.30 mg)
A43 (30.0 mg) KR
KR A253 (3.3 mg) -KLT 2D -NMR Metil p-hidroksibenzoat
A431….A435 A411 (2.00 mg) -KLT 2D -NMR Campuran senyawa
A412 (5.00 mg)
A433 (3.3 mg)
NMR Campuran senyawa
A45 (35.20 mg) NMR Campuran senyawa
20
Lampiran 2 Hasil determinasi tanaman C. alata
21
Lampiran 3 Kadar air serbuk daun C. alata
Ulangan
Bobot serbuk (g)
1 2 3
2.0099 2.0075 2.0039
Bobot serbuk jam ke-5 (g) 1.8960 1.8956 1.8910 Rerata
Bobot serbuk jam ke-6 (g) 1.8931 1.8912 1.8853
Contoh perhitungan: Ulangan 1 o ot a al – o ot kering Kadar air (%) = o ot a al =
2 0099 g 1.8931 g
2.0099 g = 5.81%
erata
100%
5.81% 5.79% 5.92% 5.84 % 3
Bobot serbuk jam ke-7 (g) 1.8994 1.8983 1.8926
100%
Kadar Air (%) 5.81 5.79 5.92 5.84
22
Lampiran 4 Spektrum 1H NMR fraksi A45
K e l i m p a h a n
δ (ppm)
23
Lampiran 5 Spektrum 1H NMR fraksi A412
K e l i m p a h a n
Asam Lemak
Flavonoid
δ (ppm)
24
Lampiran 6 Spektrum 1H NMR fraksi A433
K e l i m p a h a n
δ (ppm)
25
Lampiran 7 Spektrum 1H fraksi A253
K e l i m p a h a n
Pengotor
δ (ppm)
26
Lampiran 8 Spektrum 13C NMR fraksi A253
K e l i m p a h a n
δ (ppm)
27
Lampiran 9
Perhitungan geseran kimia atom H dan C pada metil p-hidroksi benzoat dan asam p-metoksibenzoat
Efek substituen pada geseran kimia karbon benzena (128.5 ppm) (Silverstein et al. 2005) Substituen -OH -(C=O)OCH3 -OCH3 -COOH
C-1 (ppm) 26.6 2.0 35.7 -7.7
C-2 (ppm) -12.7 1.2 -14.0 1.0
C-3 (ppm) 1.6 -0.1 2.3 -14.4
C-4 (ppm) -7.3 4.8 -4.8 31.4
Perhitungan geseran kimia:
C 1 2 3 4
δ (ppm) -5.3 2.8 -12.8 31.4
C 1 2 3 4
δ (ppm) 2.0 1.2 -0.1 4.8
C 4 3 2 1
δ (ppm) -7.3 1.6 -12.7 26.6
C1 = 128.5 + 2.0 + (–7.3) = 123.2 ppm C2/6 = 128.5 + 1.2 + 1.6 = 131.3 ppm C3/5 = 128.5 + (– 0.1) + (–12.7) = 115.7 ppm C4 = 128.5 + 4.8 + 26.6 = 159.9 ppm
C 1 2 3 4
δ (ppm) -4.8 2.3 -14.4 31.4
C 1 2 3 4
δ (ppm) 2.9 1.3 0.4 4.3
C 4 3 2 1
δ (ppm) -7.7 1.0 -14.4 31.4
C1 = 128.5 + 2.9 + (–7.7) = 123.7 ppm C2/6 = 128.5 + 1.3 + 1.0 = 130.8 ppm C3/5 = 128.5 + ( 0.4) + (–14.4) = 114.5 ppm C4 = 128.5 + 4.3 + 31.4 = 164.2 ppm
(a) Perhitungan geseran kimia atom karbon
Efek substituen pada geseran kimia proton benzena (7.36 ppm) (Silverstein et al. 2005) Substituen -OH -(C=O)OCH3 -OCH3 -COOH
Zorto -0.53 0.68 -0.45 0.77
Perhitungan geseran kimia: H = 7.36 + Zorto + Zmeta + Zpara H2/6 = 7.36 + 0.68 + (–0.14) = 7.90 ppm H3/5 = 7.36 + (–0.53) + 0.08 = 6.91 ppm
Zmeta -0.14 0.08 -0.07 0.11
Zpara -0.43 0.19 -0.41 -0.25
H = 7.36 + Zorto + Zmeta + Zpara H2/6 = 7.36 + 0.77 + (–0.07) = 8.06 ppm H3/5 = 7.36 + (–0.45) + 0.11 = 7.02 ppm
(b) Perhitungan geseran kimia atom hidrogen
28
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 8 Januari 1991, merupakan anak kedua dari 3 bersaudara dari pasangan Mad Hasyim dan Siti Mulyati. Penulis menyelesaikan pendidikan di SMAN 6 Bogor pada tahun 2009. Pada bulan Juli 2009, penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif di Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) IPB pada tahun 2010–2012 sebagai staf Departemen Peningkatan Kualitas dan Keprofesian Mahasiswa (PK2M), dan Bina Desa (Bindes) FMIPA pada tahun 2010–2011. Selama 2 tahun penulis diamanahkan mengajar les privat di bimbingan belajar K-Nia dan Alumni. Selain itu, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia TPB pada tahun ajaran 2010/2011, Kimia Organik Layanan S1 Biokimia pada tahun 2011/2012, Kimia Fisik Layanan S1 ITP 2012/2013, dan Praktikum Kimia Organik Berbasis Kompetensi 2012/2013. Bulan Juli–Agustus 2012, penulis berkesempatan melaksanakan praktik lapangan di Balai Besar Pascapanen Pertanian (BB Pascapanen Pertanian) dengan judul laporan “Pengaruh Konsentrasi EDTA Dan Asam Tartarat Terhadap Kualitas Minyak Nilam”. Penulis juga mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa Penelitian (PKMP) pada tahun 2011–2012 uang berjudul “Aplikasi Teknologi Membran Ultrafiltrasi dari Limbah Bonggol Nanas yang Mampu Menyerap Logam Berat untuk Pengolahan Virgin Coconut Oil (VCO) yang Kaya Kandungan Asam Laurat (Lauric Acid)”. Pada tahun 2012–2013, penulis kembali mengikuti PKM dengsn judul “Analisis Potensi Tanaman Mata Lele (Lemna sp.) sebagai Adsorben Logam erat Cr dan P ” dan ”Hubungan Kadar Logam Kuku Siswa Sekolah Dasar dan Pendapatan Orang Tua, Solusi Pendeteksian Dini Tingkat Kecukupan Gizi”. Ditahun yang sama, penulis juga mengikuti PKM kewirausahaan yang berjudul “Manihot Rainbow Burger (Manihot Rainger): Burger Sehat dengan Tampilan Unik yang Kaya Karbohidrat, Protein, dan Mikroelemen (Fe, Zn, dan Vitamin A) sebagai Pemanfaatan dan Komersialisasi Singkong (Manihot esculenta Crantz sin.)”. Sejak tahun 2012 sampai saat ini, penulis juga diamanahkan menjadi guru produktif di salah satu Sekolah Menengah Kejuruan Kimia Industri Pandu Tama Bogor.
