MEMPELAJARI PENGGUNAAN AIR KELAPA SEBAGAI
.
MEDIA UTAMA DALAM PRODUKSI BAHAN AKTIF BIOJNSEKTISIDA DAM Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis
Oleh TEGUH PRIATNO
1999
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
TEGUH PRIATNO. F 31.0924. Mempelajari Penggunaan Air Kelapa Sebagai Media Dalam Produksi Bahan Aktif Bioinsektisida Dan BaciNus thuringiensis subsp. isruelensis. Di bawah bimbingan Khaswar Syamsu.
Penggunaan insektisida kimia dalam memberantas vektor pembawa penyakit, seperti nyamuk dan lalat hitam di negara tropis mempunyai efek yang tidak baik karena insektisida hmia bersifat tidak selektif dan menyebabkan terganggunya keseimbangan ekosistem. Sebagai alternatif lain adalah dip.akannya insektisida mikroba dari Bacillus thuringiensis yang bersifat selektif terhadap serangga tertentu. Indonesia termasuk negara yang banyak menghasilkan kelapa sehingga dengan demikian juga menghasilkan limbah berupa air kelapa. Air kelapa mengandung gula, protein, mineral, vitamin, dan zat turnbuh yang memungkinkan sebagai media dalam fermentasi mikroba. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kombinasi optimal antara air kelapa yang berkadar gula tertentu sebagai media utama dengan kedua jenis sumber nitrogen yang digunakan yaitu pupuk urea dan ekstrak kharnir dalam medium fermentasi untuk produksi bahan aktif bioinsektisida dari B. thuringiensis subsp. isruelensis dan untuk mengetahui toksisitas produk yang dihasilkan terhadap larva nyamuk Culex sp. Penelitian pendahuluan memberikan hasil bahwa air kelapa yang digunakan mempunyai kadar abu 0.466 persen, kadar protein 0.238 persen, dan kadar gula 1.77 persen. Untuk mencapai kadar pula optimum bagi pertumbuhan B.t.i. (sebesar 1.25 persen) maka air kelapa yang digunakan diencerkan hingga 70,5 persen. Air kelapa 100 persen digunakan sebagai pembanding untuk mengetahui mana yang lebih baik. Laju pertumbuhan tercepat terjadi pada kisaran jam ke-6 hingga jam ke-9 dimana air kelapa 70.5 persen menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih cepat daripada air kelapa 100 persen. Demikian pula sumber nitrogen urea memberikan laju perhmbuhan yang lebih cepat daripada sumber nitrogen ekstrak khamir. P e n m a n nilai pH terjadi mulai dari jam ke-0 hingga jam ke-9, setelah itu nilai pH naik kernbali. Semakin banyak gula yang dikandung di dalam cairan kultur (media) semakin besar rentang penurunan nilai pH yang dihasilkan. Konsentrasi nitrogen juga mempengaruhi penurunan nilai pH cairan kultur. Pembentukan spora dimulai pada kisaran jam ke-9 hingga jam ke-12 dan pembentukan spora secara cepat terjadi pada jam ke-12 hingga jam ke-30, kemudian mengalami perlambatan hingga jam ke-48. Berat kering biomassa (sel-spora-kristal) yang dihasilkan berkisar antara 2.791 sampai 6.362 g/l cairan kultur. Berat kering biomasa terbesar dihasilkan oleh media dengan sumber karbon air kelapa 70.5 persen dengan sumber nitrogen urea 1.5 persen yaitu sebesar 6.362 g/l cairan kultur.
Sumber karbon dan sumber nitrogen yang digunakan memberikan pengaruh yang nyata terhadap nilai total sel, jumlah spora hidup, dan berat kering yang dihasilkan, sedangkan konsentrasi sumber nitrogen tidak memberikan pengaruh yang nyata terhadap nilai total sel, jumlah spora hidup, dan berat kering yang dihasilkan. Produk dengan sumber nitrogen ekstrak khamir mempunyai daya bunuh (toksisitas) yang lebih besar daripada sumber nitrogen urea. Nilai berat kering biomassa atau jumlah spora hidup yang dihasilkan tidak mempengaruhi tingkat mortalitas larva Culex sp. oleh produk yang dihasilkan. Penggunaan sumber nitrogen urea dalam produksi bahan aktif bioinsektisida dari Bacillus tkuringiensis israelensis membutuhkan biaya yang jauh lebih murah daripada menggunakan sumber nitrogen ekstrak khamir. Untuk memproduksi satu liter produk dengan menggunakan sumber nitrogen urea akan menghemat biaya sebesar Rp. 11.900 daripada jika menggunakan sumber nitrogen ekstrak khamir.
MEMPELAJARI PENGGUNAAN AIR KELAPA SEBAGAI MEDIA DALAM PRODUKSI BAHAN AKTIF BIOINSEKTISIDA DARI Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis
Oleh TEGUH PRIATNO F 31.0924
SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Jumsan TEKNOLOGI MDUSTRI PERTANIAN, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
.--, ,-
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
O.-:
,
BOGOR
/.<.\"* dj. .< ,: .),..",a . >;\.,-, -. ,+ , . - '? v
,
\
..:.
..a
a \,*..,
i/'2- ;.,:. ,j2T .,.::-: * .. . I 1, -. !;\ ; -, , .. .?. ' ..# '"' i?/: .,$,
$1 l Z I,\
3
,:
,:.L,!a.,. ,-a- *#&:.I
.>.-. '~,:**; .,
.,,,,
&,
.., . >
,"9
r.
ij.';.
<-#>.j
-.- -../
. . , . ,
:#
','
,
---
<" . ._ -.-.-__I._ ..
?,
0,.
/>
.,
,
.'
i.
I
INSTITUT PERTANIAN BOGOR FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN MEMPELAJARI PENGGUNAAN AIR KELAPA SEBAGAI MEDIA DALAM PRODUKSI BAHAN AKTIF BIOINSEKTISDA DARI Raci1lu.s tl~uringiensissubsp. Isrue1en.si.s
SKRIPSI Sebagai salah satll syarat ut~tukniemperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada J U N STEKNOLOGI ~~ INDUATRI PERTANIAN, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor
Oleh TEGUH PRIATNO F 31.0924
Dilahirkan pada tanggal 26 Desember 1976 di Jakarta
+-T=-M
Tanggal Lulus : 14 Man,t 1949
%
'
osen Pembimbing
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, penulis memanjatkan puji dan syukur ice hadirat Allah SWT yang telah memberikan rahnlat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Pada keselnpatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Bapak (aim) dan Ibu, serta kakak-kakakku tercinta yang telah dengan tulus ikhlas memberikan kasih sayang, restu, dan dorongan spirituii seiaina ini sehingga tanpanya penulis tidak berarti apa-apa. 2. Dr. IT. Khaswar Syamsu, MSc.
sebagai dosen pembimbing yang teiah
memnberikan berbagai bimbingan, pengarahan, dan saran seiarna penelitiaii sampai penyusunan skripsi. 3. Dr. Ir. Tajuddin Bantacut, MSc. dan Drs. Chiiwan Panciji, Apth. MSc. sehagai
dosen penguji. 4. Zulfikar Muin, 'Dik Nova Fiiria Andyani, Dian Kusuma Hendrawati dan Martyasari Aziya, yang telah banyak memberikan saran, bantuan, dan persahabatannya. 5 . Mbak Peppy, Mbak Emi, Pak Alfi, Pak Jacksen, Vivi, Kristian, Arnanto,
Rifa'i, Jamal , Rairi, Devi, Ranti, Yennita, dan teman-ieman di Laboratoriuin Rekayasa Bioproses yang telah banyak lnembantu selama penulis melakukan penelitian.
6. Indriawan, Akri, Togar, Budi (TIN 16), Woro, Aboet, Ita yang teiah banyak membantu ljenuiis baik selbma peneiitian, penyusunan skripsi, hingga persiapan ujian sidang.
7. Teman-teman TN-15 atas segala ha1 yang telah kita laiui bersama sela~na kuiiah di Fateta-PB. 8. Tenian-temari satu kost Fitrian, Azis, Hendra, Akrie, Indri, Zakir, Priyo,
Yitno, Budi, Yogi, Rozal, Bang Dedi Naufal, Toha, dan Eka serta temanteinan kost di Wisma Sriwijaya lainnya yang telah meinberikan arti dan wanla kehidupan seiama.penulis menjaiani masa pendidikan di P B .
9. Semua pihak yang telah membantu penulis selama ini nalnun tidak dapat disebutkan satu-.persatu Penulis mengharapkan kritik clan saran yang ine~nbangundari senlua pihak berkaitan dengan skripsi ini. Akhirnya penulis berharap agar skripsi ini dapat membcrikan miinfakt bagi semua pihak yang memc~iukannya.
Penulis
DAFTAR IS1
Halaman
KATA PENGANT DAFTAR IS1 .... ................................. . .....
I
..
. ..... . . .
.. ..
.
.. ....
.iii
,
DAFTAR TABE DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... vii I. PENDAHULUAN
..................................... 1
A. LATAR BELAKAN
1
B. TUJUAN PENELITIAN ........................................................................ 3 C. RUANGLINGK Di. TEYJAUAN PUSTA
A. AIR KELAPA .............................. . . . .. . . . . . . .................................
3
4 4
B. PENGGUNAAN Bacillus thuring~ensisSEBAGAI BAHAN AKTIF INSEKTISIDA MIKROBA C. FEFSdENTASI B. :/zuringiensi
5 7
D. PENENTUAN AKTIVITAS TNSEKTISIDA MIKROBA ......................... 9
III. BAEAN DAN METOD
10
A. BAHAN DAN ALAT
10
B. METODE PENELITIAN
i1
..
1. Penelltlan Pendahuluan ..................................................................... 11
2. Penelitian Utam a. Persiapan Media Fermentasi
11 11
b. Persiapan Inokulum .........................................................................
12
c. Fermentasi
13
d. Penentuan Aktivitas Insektisida Mikroba .................................... 14 C. ANAiISA PARAMETEIi .....................................................................
15
D. PENGAMBLAN CONTOH (SAMPLING) ............................................ 16 E. RANCANGAN PERCOBAAN ............................................................. 17 1. Penentuan Jumlah Sel clan Spora Hidup.............................................. 17
2 . Penentuan Aktivitas Insektisida Mkroba (Bioassay)........................... 18
IV. HAS= DAN PEMBAHASAN .................................................................... 19 A . PENELITIAN PENDAHULUAN .........................................................
19
B . PERTUMBUKAN SEL Bacillus thuringiensis subsp. israelensis .......... 20 C . NILAIp
25
D. PEMBENTUKAN SPORA
27
E . BERAT KERING BIOMASSA (SEL-SPORA-KRISTAL) .................... 33 F. BIAYA BAHAN BAKU (SUMl3ER NITROGEN) ................................33 G. PENGUJIAN AKTIVITAS PRODUK PRIMER TEKHADAP MORTALITAS LARVA
.
V KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................................
35 38
A . KZSWIPULAN .....................
38
B. SARAlU ..........
40
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... LAMPm-
41
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Perubahan koinposisi air kelapa.............................................................. 5 Tabel 2. Komposisi nutrisi air ketapa.....................................................................
6
Tabel 3. Kandungan mineral air kelapa .................................................................6 Tabel 4 . Susunan medium fermentasi ..................................................................12 Tabel 5 . Kadar gula. nitrogen clan abu dari air kelapa yang digunakan ............... 18 Tabel 6. Berat kering biomassa (sel-spora-kristal) untuk berbagai konsentrasi sumber karbon clan sumber nitrogen................................. 34 Tabel 7. Dafiar harga sumber karbon dan sumber nitrogen ................................ 34 Tabel 8. Tingkat mortalitas larva Culex sp. untuk berbagai konsentrasi sumber karbon dan sumber nitrogen .......................................................
36
Tabel 9. Perbandingan Berat kering biomassa (sel.spora.krista1). log VSC. dan LC50 ..................................................................................
37
DAFTAR G M A R
Eaiaman Gambar 1. Diagram alir persiapan inoMum (Vandekar dan dulmage, 1982)...................................................................................................
13
Gambar 2. Diagram aiir proses fermentasi (Vandekar dan Dulmage, 1982)....... 14 Gambar 3. Diagram alir penentuan jum1ah spora hiciup (Mummigatti dan Raghunathan, 1990) ........................................................................... 16 Gambar 4. Grafi hubungan antara waktu dengan log total sel untuk sumber karbon air kelapa 100 persen dan 70.5 persen dengan sumber nitrogen ekstrak khamir (a) dan sumber nitrogen urea (b) ................. 22 Gambar 5. Grafik hubungan antara waktu dengan iog total sei untuk sumber karbon air kelapa 70.5 persen ............................................................ 23 Gainbar 6. Grafik hubungan antara waktu dengan nilai pH untuk sumber karbon air keiapa 100 persen (a) dan air kelapa 70.5 persen (bj........ 28 Gambar 7. Grafik hubungan antar waktu dengan log VSC untuk sumber karbon air kelapa dengan sumber nitrogen ekstrak khamir (a) dan urea (b).........................................................................................
31
Gambar 8. Grafik hubungan antara waktu dengan log VSC untuk sumber kariion air kelapa i 00 persen jaj dan air keiapa 70.5 persen (b) ........ 32
DAPTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Data log total sel Bacillus thuringiensis subsp. isruelensis selama fermentasi............................................................................. 45 Lampiran 2. Data laju pertumbuhan Bacillus thuringiensis subsp. isruelensis selama fermentasi............................................................................. 46 Lampiran 3. Data nilai pH cairan kultur selama fementasi ............................... 47 Lampiran 4 . Data log jumlah spora hidup (VSC) selama fermentasi ................. 48 Lampiran 5. Data berat kering bioinassa (sel-spora-kristal) selama fermentasi............................................................................49 Lampiran 6. Uji statistik untuk log total sel ........................................................
50
Lampiran 7. Uji statistik untuk log VSC .............................................................
52
Lampiran 8. Uji statistik untuk berat kering biomassa (sel-kristal-spora) .................................. Lampiran 9. Analisa kadar protein metode Lowry (Lowry. 1951) ..................... 56 Lampiran 10. Analisa kadar abu ...........................................................................
57
Lampiran 11. Analisa kadar gula total (metode fenol)......................................
58
Lampiran 12. Kuwa standar untuic uji kadar guia iota1........................................ 59
I.
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Insektisida kimia masih banyak digunakan di negara-negara tropis dalam usaha memberantas vektor pembawa penyakit, seperti nyamuk dan lalat hitam.
Namun ha1 tersebut kurang menguntungkan, karena penggunaan
insektisida kimia dengan dosis dan frekuensi yang tinggi meiljadikan serangga vektor p e n y k t menjadi resisten terhadap insektisida kimia tersebut, dan insektisida kimia bersifat tidak selektif sehingga menyebabkan terganggunya keseimbangan ekosistem (Philip, et. al., 1993). Penggunaan B. tlzuringiensis dalam memproduksi bioinsektisida telah dilakukan terutama sebagai pengendali hama pertanian dan serangga vektor beberapa penyakit pada hewan dan manusia (Hofte dan Whiteley, 1989). Adapun insektisida bakten yang paling banyak digunakan umumnya berasal dari genus Bacillus (Khachatourians,l989). Dengan ditenemukannya Bacillus tlzuringiensis subsp. isruelensis (Rucillz~stizuringiensis isruelensis) pada tahun 1976 membuka babak bam dalam pengendalian serangga vektor penyakit (Goldberg dan Margalit, 1977; Margalit dan Dean, 1985). Di Indonesia telah beredar produk berbahan aktif B. tlzuringiensis dengan merk dagang Turex WP, Florbac FG, Centuri G, Bactis S, Bactimos, Beempe, Teknar, Vectobas-AS, Bactospeine, Delfin, Dipel dan Thuricide (Komisi Pestisida, 1993). Namun bioinsektisida tersebut masih relatif mahal,
karena bioinsektisida bermerk yang ada di Indonesia di impor dari luar negeri. Hal ini kemungkinan dapat matasi jika bioinsektisida berbahan aktif B. thuringiensis dapat diproduksi sendiri.
Indonesia adalah urutan ketiga negara penghasil kelapa terbesar di dunia setelah Philipina dan India sebagai (Woodroof, 1979). Produksi kelapa di Indonesia pada tahun 1988 mencapai 2,143,978 ton kopra. Jika menggunakan angka konversi 5 buah kelapa perkilogram kopra dan 200 ml air kelapa per buah kelapa, maka didapatkan jumlah air kelapa yang dihasilkan pada tahun 1988 mencapai dua miliar liter (Badan Pusat Statistik, 1991). Air kelapa mengandung gula, vitamin, mineral, senyawa nitrogen dan zat-zat tumbuh seperti asam nikotinat, auksin, giberelin, piridoksin dan thiamin (Tuleckle, 1961). Komponen nutrisi yang lengkap dari air kelapa ini sangat cocok untuk pertumbuhan bakteri. Oleh karena itu dalam penelitian ini digunakan air kelapa sebagai media utama dalam memproduksi bahan aktif bioinsektisida dari B. tlzuringiensis. Galur H. rizuringie~sisdan medium fementasi yang digunakan sangat berpengaruh terhadap keberhasilan produksi bioinsektisida (Dulmage dan Rhodes, 1971). Demikian pula perlu diperhatikan faktor lingkungan yang mempengaruh proses fermentasi. Penelitian ini menggunakan air kelapa sebagai media utama dengan penambahan urea atau ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen.
Hal tersebut
dikarenakan mengingat masih banyaknya air kelapa yang masih belum termanfaatkan, maka dalam penelitian ini dico%apemanfaatan air kelapa sebagai
media pengganti dalam produksi bioinsektisida dari B. thuringiensis secara fermentasi terendam sehingga akan mengurangi biaya produksi.
Dengan
demikian kemungkinan harga jual pun dapat ditekan menjadi lebih murah.
B. TUJUAN PENELITIAN Tujuan umum penelitian ini adalah memanfaatkan air kelapa sebagai salah satu hasil sampingllimbah pertaniadindustri pertanian untuk menghasilkan produk yang mempunyai nilai tambah. Tujuan khusus penelitian ini adalah untuk mengetahui kombinasi optimal antara air kelapa yang berkadar gula tertenty sebagai media utama, dengan kedua jenis sumber nitrogen yang digunakan yaitu pupuk urea dan ekstrak khamir dalam medium fermentasi untuk produksi bahan aktif bioinsektisida dari B. thuringiensis isruelensis dan untuk mengetahui toksisitas produk yang dihasilkan terhadap larva nyamuk Culex sp.
C. RUANG LINGKUP Ruang lingkup penelitian adalah : 1. Mencari kombinasi optimal antara sumber karbon dan nitrogen untuk fermentasi B. thuringiensis israelensis. 2. Penentuan toksisitas insektisida mikroba.
II.
_
TINJAUAN PUSTAKA
Produksi kelapa di Indonesia pada tahun 1988 mencapai 2 143 987 ton
kopra. Dengan menggunakan angka konversi 5 buah kelapa perkilogram kopra dan 200 ml air kelapa per buah kelapa, maka jumlah air kelapa yang dihasilkan di Indonesia pada tahun 1988 mencapai dua milyar liter yang terbuang percurna (Badan Pusat Statistik, 1991).
Air kelapa adalah cairan jemih yang mengisi lebih kurang % bagian rongga sebelah dalam daging kelapa. Air kelapa di dalam buah mencapai jumlah maksimum pada waktu buah berumur 6 sampai 9 bulan (Freemond dan Ziller, 1966). Air kelapa mengandung gula yang terdiri dari sukrosa, glukosa, dan fiuktosa (Alaban, 1962). Kandungan gula air kelapa adalah sekitar
5 persen dengan nilai kalori
(Direktorat Gizi Depkes, 1988)
17.4 kalori per 100 gram bahan
Kandungan gula invert meningkat dan
mencapai maksimal ketika bemmur kira-kira 220 hari, setelah periode ini sukrosa mulai terbentuk clan konsentrasi total gula menurun [Thampan, 1982). Dengan bertambahnya umur buah kelapa, wama sabut berubah menjadi coklat dan jumlah aimya berkurang bersama-sama dengan turunnya kadar gula menjadi sekitar
2 persen dan setengahnya adalah gula
bukan pereduksi (Child, 1962). Perubahan beberapa komponen pokok dalam
Tabel 1. Pembahan komposisi air kelapa3 Komponen
Kelapa Muda (YO) Kelapa Tua (%)
Air 95.01 Protein 0.13 Lemak 0.12 Karbohidrat 4.11 Abu 0.63 *' Subrahmanyan dan Swaminathan (1959)
91.23 0.29 0.i5 7.27 1.06
Air kelapa memiliki pH yang beragam dari 4.8 sarnpai 5.3 (Thampan, 1982).
Adanya asam-asam organik dan anorganik dalam air kelapa
menyebabkan pH air kelapa agak rendah. Asam-asam tersebut antara lain asam amino, asam-asam organik non volatil, asam nukleat, asain shikinat dan asam kuinat (Tuleckle, 1961). Asam amino yang terdapat dalam air kelapa antara lain adalah alanin, arginin, sistein, dan serin (Woodroof, 1979). Nilai nutrisi yang dikandung air kelapa cukup lengkap, karena mengandung pula vitamin, mineral serta zat-zat tumbuh seperti terlihat pada Tabel 2. Zat-zat tumbuh tersebut antara lain asam nikotinat, auksin, giberelin, piridoksin dan thiamin (Tuieckle, 1961). Air kelapa mengandung 0.7 sampai 3.7 persen vitamin C dan sedikit vitamin B kompleks (Child, 1962). Air keiapa juga mengandung kalium, natrium, kalsium dan mineral-mineral lainnya seperti terlihat pada Tabel 3
B. PENGUNAAN Bacillus
thuringiettsis SEBAGAI BAHAN AKTIF
INSEKTISIDA MlKROBA
Bacillus thuringiensis adalah bakteri yang paling banyak digunakan
untuk produksi insektisida mikroha.
Secara komersial bioinsektisida
B. thuringiensis digunakan secara luas untuk mengendalikan larva serangga
hama (Quinlan dan Lisansky, 1985; Feitelson,
el. al., 1992). Penggunaan
B. thuringiensis sebagai insektisida mikroba diharapkan semakin meningkat
dan berkembang dengan ditemukannya galur-galur B. thuringiensis yang mempunyai aktivitas tinggi dan spektrum inang yang lebih luas (Rupar, et. al., 1991; Jhonson, el. al., 1993).
Tabel 2. Komposisi nutrisi air kelapaS) Komponen Jumlah Asam nikotinat 0.6 mgll Asam pantotenat 0.52 mg/l Biotin 0.02 mdl fiboflavin 0.01 mg/l Asam folat 0.003 mg/l Thiamin sedikit Piridoksin sedikit Auksin 0.07 mg/l Giberelin sedikit 1-3 difenil urea 5.8 mg!l Sorbitol 15.0 mg/l Mvoinositol 0.01mdl
Tabel 3. Kandungan rineral air kelapa') Mineral Kindungan (mg1100 ml) Kalium 312.00 Natrium Kalsium Magnesium Besi Teinbaga fosfor Belerang 24.00 " Ketaren (1978)
Bacillus thuringiensis adalah bakteri berbentuk batang, bersifat gram
positif dan berflagelum. Bakteri ini membentuk spora secara aerob dan selama spomlasi membentuk kristal protein para-spora yang bersifat
7
insektisida, yang disebut juga dengan 6 endotoksin (Shieh, 1994). Disamping endotoksin, B.
a eksotoksin,
P
thuringiensis juga
menghasilkan
eksotoksin, yaitu
eksotoksin d m faktor kutu yang bersifat sangat toksik
terhadap kutu mamalia (Bovicola sp.) (Dulmage, 1981). Proses reaksi kristai protein sebagai bahan aktif bioinsektisida dimulai dengan termakannya kristal protein oleh serangga yang akan dipecah oleh enzim protease pada kondisi basa dalam usus tengah serangga, dan akan melepaskan protein toksik yana disebut 6 endotoksin.
Toksin ini akan
berinteraksi dengan reseptor-reseptor pada sel-sel epitelium usus tengab larva serangga yang rentan. Setelah toksin ini bereaksi maka akan menyebabkan terbentuknya lubang-lubang pada membran sel, sehingga mengganggu keseimbangan osmotik. Akibatnya sel usus serangga yang rentan menjadi bengkak dan mengalami lisis. Karena tejadi pembengkakan maka larva berhenti makan dan akhirnya mati (Hofte dan Whiteley, 1989; Gill, el. a/., 1992).
Fennentasi untuk memproduksi bioinsektisida B. thuringiensis terdiri dari dua tipe yaitu fermentasi semi padat (semi solid fermentation) dan
fermentasi terendam (submerged ferntentation). Fermentasi terendam yaitu fermentas B. tlzuringiensis dimana biakan murni B.
thuringiensis
ditumbuhkan dalam medium cair dengan dispersi yang merata. Fermentasi skala kecil dalam labu kocok dilakukan dengan menggunakan labu ukuran 300 ml yang diisi 50 - 100 rnl medium (Krieg clan Miltenburger, 1984) atau
dengan menggunakan labu erlenmeyer ukuran 500 ml yang diisi 100 - 125 ml medium (Vandekar dan Dulmage, 1982; Mummigatti dan Raghunathan, 1990). Beberapa faktor sangat mempenganh fermentasi B. thuringiensis, diantaranya adalah komposisi medium dan kondisi untuk pertumbuhan mikroba seperti pH, oksigen dan temperatur (Dulmage dan Rhodes, 1971). Untuk pertumbuhannya mikroorganisme membutuhkan surnber air, sumber karbon, nitrogen, unsur mineral dan faktor pertumbuhan dalam medium pertumbuhannya (Vandekar dan Dulmage, 1982). Beberapa sumber karbon dapat digunakan untuk fermentasi B. thuringiensis secara terendam antara lain glukosa, simp jagung, tepung jagung, dekstrosa, sukrosa, laktosa, pati, minyak kedelai dan moiases dari bit dan tebu. Sumber nitrogen yang dapat digunakan adalah tepung kedelai, tepung biji kapas (proflo), corn steep, gluten jagung, ekstrak kharnir, pepton, kedelai, tepung ikan, tripton dan kasein (Dulmage dan Rhodes, 1971; Quinlan dan Lisansky, 1985). Garam-garam anorganik yang dibutuhkan untuk pertumbuhan miliroba nieliputi K, Mg, P, S, dan yang diperlukan daiam jumiah sedikit yaitu Ca, Zn, Fe, Co, Cu, Mo dan Mn (Dulmage dan Rhodes, 1971). Dalam medium fermentasi ditambahkan 0.3 g/l MgS04.7H20, 0.02 g/l ZnS04.7H20, 0.02 g/l FeS04.7H20dan 1.0 gfl CaC03 (Vandekar dan Dulmage, 1982). Fermentasi B. tlzuringiensis dalam labu kocok dilakukan pada suhu 28 - 32 OC, dengan pH awal medium diatur sekitar pH 6.8 - 7.2, agitasi 142 - 340 rpm dan dipanen pada waktu inkubasi 24 - 48 jam (Vandekar dan Dulmage, 1982; Mummigatti dan Raghunathan, 1990).
D. PENENTUAN AKTJMTAS INSEKTISIDA MlKROBA Insektisida mikroba ditentukan aktivitasnya dengan menghitung jumlah spora hidup, dan melalui bioassai untuk menentukan kadar letal (LCso) dan International Unit (IU) (Vandekar .. dan Dulmage, 1982) atau dosis letal (LDso), Diet Dilution Unit (DDU50) dan IU (Dulmage dan Rhodes, 1971). LC50, LD50, dan DDUSOsebenarnya hanya menunjukkan potensi relatif produk, karena dlpengamhi oleh spesies dan umur serangga. Oleh karena
it-, maka
disepakati potensi
produk
insektisida mdcroba
(B. tlzuringiensis)dinyatakan dalam satuan internasional (SI).
LC50 standnr
x poteosi standar (IUImg)
Potensi contoh uji (IUImg) =
LC50 contoh uji
A. BAHAN DAN ALAT Isolat Bacillus tlzuringiensis yang digunakan adalah E. tlzuringiensis israelensis yang diperoleh dari B. thuringiensis israelensis komersial
(Vectobac).
Media fementasi yang digunakan adalah air kelapa yang
didapatkan dari pasar Gunung Batu di daerah Bogor. Sumber nitrogen yang digunakan adalah pupuk urea dan ekstrak khamir. Bahan-bahan yang digunakan adalah nutrien broth (NB), HCl 1 N, NaOH 1 N, larutan garam fisiologis, medium nutrient agar (NA), napthol blue black, methanol 98 persen, air suling, asam asetat, basic fuchsin, ethanol 95 persen, fenol, air destilata, Na-K-Tartarat, larutan fenol 5 persen, Na~C03-anhidrat,H2S04 pekat, protein BSA, NaOH 0.1 N, CuS04.5H20, folin ciocalteu, larutan glukosa standar, produk komersial Vectobac, dan produk kimia Abate. Alat-alat yang digunakan adalah rotat-)? shaking incubator, otoklaf, pemanas berpengaduk, batang magnetik, pH meter, labu erlenmeyer, sentrifuse, loop inkubasi, tabung reaksi, pipet, lemari pendingin, oven, spektrofotometer, timbangan analitik, cawan petri, gelas kimia, gelas piala, kertas saring, bunsen, keranjang tabung, kertas serap, desikator, tanur dan eppendod
B. METODE PENELITIAN Penelitian ini terdiri dari dua bagian, yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama.
1.
Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan bertujuan untuk menganalisa komposisi awal air kelapa. Analisa komposisi kimia air kelapa yang dilakukan adalah analisa kadar protein (metoda L o w ) , kadar abu, kadar gula total (metoda fenol).
2.
Penelitian Utarna a.
Persiapan medium fermentasi Susunan medium fermentasi yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah air kelapa sebagai media utama dengan penambahan sumber karbon lain dan nitrogen seperti terlihat pada Tabel 4.
Susunan medium fermentasi tersebut dibuat 2 kali
ulangan. Jenis dan jumlah mineral sesuai dengan yang digunakan oleh Dulmage dan Rhodes (1971), yaitu 0.3 g MgS04.7H20, 0.02 g FeS04.7H20, 0.02 g ZnSO4.7H20, 0.02 MnS04H20 dan CaCO;.
1.0 g
12
Tabel 4. Susunan medium fermentasi
Adapun persiapan medium fermentasi adalab sebagai berikut : air kelapa dan CaC03 masing-masing dilamtkan dan disterilkan secara terpisah dari bahan-bahan media yang lain, seperti mineral dan sumber nitrogen, di dalam otoklaf. Bahan-bahan medium yang lain langsung dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan disterilkan di dalam otoklaf.
Setelah didinginkan sampai F 50°C, medium
campuran air kelapa dan CaC03 dibagi-bagi dalam beberapa labu erlenmeyer yang telah berisi bahan-bahan media lain kemudian pH medium disesuaikan menjadi sekitar pH 6.8
- 7.2.
Semua baban
disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dan 15 lbs selama i 5 menit.
b.
Persiapan Inokulum Inokulum (kultur bibit)
untuk menginokulasi
medium
fermentasi disiapkan secara bertahap mengikuti metode Vandekar
dan Dulinage (1982).
Persiapan inokuium dilakukan sebagai
berikut :
lup biakan R. tltur
+
Inokulasi dalam 50 rnl memum NB (labu pembibitan I) I
I
t Mcubasi dalam roluly shakifig incltbulot, 200 rpm, 30°C, 12jam
+
I
I
Kultur di,gmakan untuk inokulasi labu pembibitan II (5% dari volume mema kedua) Inkubasi pada kondisi yang sama daiam erlenmeyer 500 ml berisi 100 ml medium fermentasi, 12 jam Gambar 1. Diagram alir persiapan inokulum (Vandekar dan Dulmage, 1982)
c. Fermentasi Fermentasi dilakukan dalam beberapa iabu erlenmeyer 500 mi yang masing-masing berisi 125 mi medium fermentasi, dengan konsentrasi sumber kaioon dan nitrogen yang sesuai dengan perlakuan yang dicobakan (Tabel 2). Masing-masing labu tersebut diinokulasi dengan kultur inokulum dari labu pembibitan kedua sebanyak 2% secara aseptik. Kemudian diinkubasi dalam rotavy shaking incubator pada 200 rpm dan suhu 30" C selama 48 jam.
Selama inkubasi, biakan diamati pada interval waktu tertentu. Proses fermentasi secara lebih ringkas terlihat sebagai berikut :
Labu erlenmeyer 500 ml berisi 125 ml medium
I
Masing-masing labu diinokulasi dengan kuitur inoMum dari labu pembibitan I1 (2%)
I
Inkuljasi dalsuii rotary shaking incubator, 200 rpm, 30' C, 48 jam
I 1
I
5
~
Biakan diamati ~ a d interval a walctu tertentu
1
Gambar 2. Diagram alir proses fermentasi (Vandekar dan Dulmage, 1982) d. Penentuan Aktivitas Inseictisida Wkroba Penentuan aktivitas insektisida mikroba adalah sebagai berikut :
sampel cairan produk bahan aktif bioinsektisida
B. thuringiensis dari tiap-tiap perlakuan disuspensikan dalam air destiiata sebanyak 10 tingkat konsentrasi. Sebanyak 25 ekor larva nyamuk Culex sp. masing-masing dimasukkan ke &lam larutan bioinsektisida yang telah dibuat sebeiumnya. Sebagai pembanding dibuat pula lamtan bionsektisida dari produk komersiai Vectobac dan produk insektisida kimia Abate dengan konsentrasi yang sama. Setiap perlakuan diulang sebanyak dua kali. Setelah 24 jam, mortalitas iarva diamati. Nilai
LC50
produk untuk tiap perlakuan
ditentukan dengan menggunakan metode analisis probit program Quant
C. ANALISA PARAMETER
Analisa parameter dalam penelitian ini meliputi analisa pendahuluan (pra-fementasi), analisa fermentasi dan analisa pasca fermentasi. Analisa pendahuluan meliputi : (1) penentuan kadar protein, (2) kadar abu dan ( 3 ) kadar gula dari air kelapa yang digunakan. Analisa selama fennentasi meliputi pengamatan terhadap : (1 ) perturnbuhan sel bakteri dengan metode hitungan cawan, (2) pengukuran pH dengan pH meter, (3) pengamatan sporulasi, dan (4) pengukuran berat kering biomassa (Sel-spora-knstal). Analisa pasca fermentasi adalah dengan menguji bioinsektisida atau komplek spora kristal hasil fermentasi untuk semua jenis perlakuan, dengan menentukan jumlah spora yang terkandung dan toksisitasnya terhadap larva nyamuk yang dinyatakan dalam LCso. Metode penentuan jumlah spora hidup (viable spore count) adalah sebagai berikut : Larutan fermentasi diambil dan diencerkan di dalam tabung reaksi hingga pengenceran 10.' (tergantung pada julnlah koloni yang dapat dihitung). Lalu diberi rejatan panas pada suhu 65" C selama 15 menit untuk membunuh selsel vegetatif (Mummigatti dan Rashunathan, 1990). Selanjutnya sebanyak 0.05 mi dari pengenceran yang sesuai dicawankan dengan metode cawan sebar pada medium NA. Setelah diinkubasi pada suhu 30" C selama 24 jam, jumlah koloni masing-masing cawan diamati dan dihitung. Spora hidup yang terkandung dalam satnpel serbuk spora kristal, ditentukan dengan cara mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengencerannya. Secara lebih jelasnya penentuan jumlah spora hidup adalah sebagai berikut :
-, 1 ml produk
Diencerkan dalarn tabung reaksi hingga 1O9 (tergantung jurnlah koloni yang dapat terhitung)
+ I
I
Diberi rejatan panas 60' C, 15 rnenit
/
Diawankan pada media NA sebanyak 50 p1
I
lnkubasi 30 "C, 24 jam
I
(
Jurnlah koloni dihitung
I
Gambar 3. Diagram alir penentuan jumlah spora hiaup (Mummigatti dan Raghunathan, 1990)
Pengambiian contoh (satnpling) dilakukan sebanyak 9 kali dan dila'mkan pada saat inkubasi 0,3,6, 9, i2, i s , 24,30, dan 48 jam. Pengambilan contoh (sampiingj
ini
dilakukan
untuk
mengetahui
pertumbuhan
bakteri
B. Tizuringiensis dengan menggunakan hitungan cawan, pengukuran terhadap pH, pengukuran terhadap pembentukan spora dan mengukur berat kering biomassa (sel-spora-kristal).
E. RANCANGAN PERCOBAAN 1. Penentuan Jumlah Sel dan Spora Hidup Rancangan percobaan yang digunakan untuk menentukan jumlah sel dan spora hidup adalah eksperimen faktorial tersarang 2 x ?. Faktor pertama menunjukkan sumber karbon dengan 2 taraf faktor. Sedangkan faktor kedua menunjukkan sumber nitrogen yang terdiri atas 2 taraf faktor dengan konsentrasi yang terdiri dari 3 taraf faktor tersarang didalam sumber nitrogen yang digunakan, sehingga terdapat 12 unit percobaan dengan replikasi sebanyak 3 kali. Model yang digunakan untuk desain faktorial tersebut adalah :
Dengan i = 1,2
j = 1,2
k = 1,2,3 untuk semuaj ;dan 1 = 1,2,3
Y
=
Variabel respon dari hasil observasi ke-1 yang terjadi karena pengaruh bersama taraf ke-i faktor A dan taraf ke-J faktor B serta taraf ke-k faktor C yang tersarang di dalam faktor B
P
=
Rata-rata sebenamya
Ai
=
Sumber karbon ke-i
Bj
=
Sumber nitrogen ke-j
Ckgl
=
Konsentrasi ke-k tersarang dalam sumber nitrogen ke-j
ABii
=
Efek interaksi antara sumber karbon ke-i dan sumber nitrogen ke-j
18
ACiliti) = Efek interaksi antara sumber karbon ke-i dan konsentrasi ke-k tersarang dalarn surnber nitrogen ke-j ~l(ijk) =
Kekeliruan
2. Penentuan Aktivitas Insektisida Milcroba (Bioassay) Aktivitas insektisida mikroba terhadap serangga dinyatakan dengan LC50 (ietai concentration). Nilai LC50 merupakan nilai yang menunjukkan konsentrasi insektisida yang dapat mematikan separuh dari populasi larva setelah jangka waktu tertentu. Untuk menentukan aktivitas insektisida mikroba tersebut, data berat kering lamtan campuran spora kristal dan nilai log jurnlah spora hidup (Viable Spore Count/'KSC) yang diperoleh untuk masing-masing perlakuan dianalisa dengan analisis ragam uji F.
Apabila hasiinya
menunjukkan perbedaan nyata, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan's klultiple Range Test.
Ijntuk hasil pengujian toksisitas,
Iaruian cainpuran spora-kristai dari tiap periakuan ditentukan niiai LCjo-nya menggunakan analisis probit program Quunr.
Peneiitian pendahuluan dilakukan sebagai langkah awal u~kiuk ,.-Ae-
L-L..:
'ur;lqpauuz
haual
-.I-
gum,
-:&*-
ill~vgezserfa mineral yang terkandung di dalam
i
ualrarl - yaug digunakan. Dan penelitian pendahuluan ini, diketahui kadar gula,
L-~.
iiiii-"geii &ail ~ i i i ~ i e yiiiig ~ a ; ieikaiid-ui~gdi dalam air keiapa yang digunakan, seperti teriihat pada Tabel 5. Tabei 5. Kadar gula, nitrogen dan abu dari air kelapa y ang digunakanW)
g 1
Gula
I1 Protein
1
A ~ U
1
i i
i
I
1.770
iI
0.244
I
0.466
ii
I
Kadar gula pada bahan yang digunakan ini lebih kecil dari yang diiaporkan oieh Cniid (i962) bahwa kadar gula maksirnum 5 persen. Hal ini disebabkan karena air kelapa yang digunakan berasal dari kelapa yang sudah iua.
D ~ r ~ g ascrrrakir~ tl beriarrivaiu~yaumur kelapa, maka kadar gula di
dalamnya pun akan semakin berkurang hingga sekitar 2 persen dan setengahnya acialah gula bukan pereduksi (Child, 1962). Sedangkan kadar p~oteinair kelapa yang diguiiakan tidak jauh berbeda dengan kadar protein yang dilaporkan oieh Subrainanyan dan Swaminathan (1959), sehingga dapat dikatakan bahwa air ketapa yang digunakan masih termasuk air kelapa yang
- segar (tidak rusak) terutama kadar proteinnya.
"
Data didapat dari penelitian bersarna Teguh Priatno dengan Depi Arpita dan Ranthi Octavia.
20 Air kelapa banyak mengandung mineral, vitamin dan zat tumbuh, sehingga air kelapa baik untuk digunakan sebagai media pertumbuhan Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (l3.t.i.). Dengan banyaknya vitamin,
mineral dan zat tumbuh kemungkinan dapat mempengaruhi kualitas produk yang dihasilkan. Berdasarkan penelitian sebelumnya, konsentrasi sumber nitrogen yang optimum untuk perhmbuhan B.t.i. adalah 1.5 persen (Sukmadi, 1996). Dalam penelitian ini chgunakan konsentrasi sumber nitrogen 1.0, 1.5, dan 2.0 persen (bh). Berdasarkan penelitian sebelumnya, kadar gula yang optimum untuk perhmbuhan B.t.i. adalah 1.25 persen (Sukmadi, 1996). Dengan kadar guia pada air kelapa 1.77 persen, maka air kelapa yang digunakan perlu diencerkan hingga memiliki kadar gula 1.25 persen. Dengan demikian air kelapa yang digunakan sebanyak 70.62 ml atau sekitar 70.5 ml di dalam 100 mi media, atau dengan kata lain sebesar70.5 persen air kelapa. Namun demikian dalam penelitian digunakan juga 100 persen air kelapa sebagai pembanding.
B. PERTUMBUEAN SEE Bacillus tltzcrilzgieitsis subsp. Isrnelensis Penelitian terhadap pertumbuhan sel B.t.i menunjuicitan bahwa untuk tiap faktor yang diujikan (air kelapa dengan sumber nitrogemya) memperlihatkan pola pertumbuhan yang sama, yaitu fase lambat (fase lag) tejadi sangat pendek.
Hal ini terjadi karena kultur B.t.i. ditumbuhkan
terlebih dahulu di dalam media nutrien brotlz (sebagai inokulum pertama) dan kemudian ditumbuhkan lagi di dalam media fermentasi (sebagai inokulum kedua) sebeium ditumbuhkan pada media fermentasi utama.
Proses ini
21 menyebabkan kulixr dapat beradaptasi terhadap lingkungail pertumbuhan ketika mtumbuhkan pada media fermentasi utama. Seperti yang terlihat pada Gambar 1 dan Lampiran i, bahwa penggunaan media air kelapa 100 persen (tanpa penambahan air destilata) maupun air kelapa 70.5 persen (air keiapa 70.5 ml + air destilata 29.5 mi) dengan sumber nitrogen ekstrak khamir menghasilkan fase stasioner pada jam ke-12, sedangkan untuk sumber nitrogen urea fase stasioner terjadi pada jam ke-9. Hal ini disebabkan karena untuk berat yang sama, kandungan nitrogen urea lebih sedikit daripada ekstrak khamir sehingga jumlah nitrogen (urea) dalam media iebih cepat habis yang menyebabkan fase stasioner menjadi lebih cepat. Ekstrak khamir juga mengandung sumber karbon sehingga media yang menggunakan sumber nitrogen ekstrak khamir mengandung sumber karbon yang lebih banyak daripada media yang inenggunakan urea sebagai sumber karbon. Baik pada sumber nitrogen ekstrak khamir maupun urea, penggunaan sumber karbon air kelapa 70.5 persen menghasilkan nilai log total sel yang iebih tinggi daripada j i ~ ainenggunakan air kelapa 100 persen. Hal ini dapat terlihat jelas pada Gambar 2. Perbedaan yang sangat nyata ini juga diperkuat dengan uji analisa ragam untuk log total sei yang menghasilkan nilai F hitung sebesar 96.9341 dengan nilai F Tabel (a = 0.05) sebesar 4.75. Nilai ini menunjukkan bahwa konsentrasi sumber karbon memberikan efek yang sangat signifikan
Gambar 4. Grafik hubungan antara waktu dengan log total sel untuk sumber karbon air kelapa 100 persen dan 70.5 persen dengan sumber nitrogen ekstrak khamir (a) dan sumber nitrogen urea (b)
terhadap nilai log total sel yang dihasilkan. Lebih tingginya nilai log total sel yang dihasilkan pada media dengan sumber karbon air kelapa 70.5 persen daripada air kelapa 100 persen disebabkan karena air kelapa 100 persen mengandung kadar gula yang lebih tinggi sehingga setelah terjadi proses metabolisme dihasilkan asam-asam yang lebih banyak. Produksi asam yang lebih banyak pada air kelapa 100 persen menyebabkan penurunan nilai pH yang lebih besar pada saat proses fenentasi berlangsung sehingga pertumbuhan sel menjadi terhambat. Dengan menggunakan air kelapa 70.5 persen, pada dasamya penggunaan sumber nitrogen urea menghasilkan log total sel yang lebih tinggi daripada menggunakan sumber nitrogen ekstrak khamir.
Hasil ini
dapat terlihat nyata pada Gambar 2, dan diperkuat dengan pengolahan analisa ragam yang menghasilkan nilai F hitung sebesar 7.4696 dengan nilai F Tabel
Gambar 5. Grafik hubungan antara waktu dengan log total sel untuk sumber karbon air kelapa 70.5 persen
24 (a
=
0.05) sebesar 4.75 yang berarti penggunaan sumber nitrogen yang
berbeda memberikan efek yang signifikan terhadap log total sel yang dihasilkan. Lebih tingginya nilai log total sel yang dihasilkan pada media dengan sumber nitrogen urea daripada ekstrak kharnir dikarenakan pada awal fermentasi sampai dengan jam ke-6 selama fermentasi pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir terjadi p e n m a n nilai pH yang sangat tajam yaitu 1.2 - 1.43, sedangkan pada urea terjadi penurunan pH berkisar antara 0.19
-
0.43. Pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir nilai pH
terendah berkisar antara 5.75 - 5.84, sedangkan pada urea nilai pH terendah berkisar antara 6.67 - 6.81. Besarnya penurunan pH dan rendahnya nilai pH yang dihasilkan pada jam ke-6 pada ekstrak khamir menyebabkan pertumbuhan kultur menjadi terhambat. Namun demikian nilai pH ini tidak sampai menghentikan pertumbuhan kultur B.t.i. karena nilai pH ini masih dalam batas toleransi nilai pH minimum untuk pertumbuhan B.t.i. yaitu 5.6 - 5.8 (Vandekar dan Dulmage, 1982). Laju pertumbuhan kultur B.t.i. tercepat terjadi pada kisaran jam ke-6 hingga jam ke-9. Laju pertumbuhan B.t.i.. secara lengkap dapat dilihat pada Lampiran 2. Jika dibandingkan antara sumber karbon air kelapa 100 persen dengan air kelapa 70.5 persen, pada kisaran jam ke-6 atau jam ke-9 air kelapa 70.5 persen menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih tinggi daripada air kelapa 100 persen. Hal ini disebabkan pada air kelapa 100 persen terdapat kandungan gula yang lebih banyak daripada air kelapa 70.5 persen, sehingga setelah terjadi fermentasi air kelapa 100 persen menghasilkan asam yang lebih banyak yang menyebabkan nilai pH turun secara tajam. Tutunnya nilai
25
pH secara tajam ini menyebabkan terhambatnya pertumbuhan kultur sehingga laju pertumbuhan menjadi lebib lambat. Demikian pula halnya dengan sumber nitrogen, pada kisaran jam ke-6 atau jam ke-9 sumber nitrogen urea menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih tinggi daripada sumber nitrogen ekstrak khamir. Cepatnya laju pertumbuhan yang terjadi pada jam ke-6 atau terutama jam ke-9 dikarenakan pada kisaran waktu ini kadar gula pada media mulai habis sedangkan kultur masih menggunakan sumber nitrogen dalam proses metabolismenya. Penggunaan sumber nitrogen oleh kultur menyebabkan terbentuknya zat yang bersifat alkali. Sedikitnya gula menyebabkan asam yang dihasilkan tidak dapat menetralkan semua basa (zat yang bersifat alkali) yang terbentuk sehingga menyebabkan pH meningkat kembali menuju nilai pH yang normal untuk pertumbuhan E3.t.i. yaitu pada nilai pH mendekati 8.0 dimana pada nilai pH ini kultur mulai mengalami pertumbuhan yang stabil (fase stasioner) (Vandekar dan Dulmage, 1982). Namun demikian pada penelitian ini kultur sudah mengala~llifase stasioner walaupun nilai pH belum mencapai 8.0. Hal ini keinungkinan disebabkan karena pada media sumber karbon sudah mulai sedikit sehingga kultur sudah mulai kekurangan sumber makanan untuk pertumbuhannya dan pada fase ini biasanya kultur mulai memakan sel-sel yang lisis sehingga dikatakan laju pertumbuhan sama dengan laju kematian.
Pada media dengan sumber nitrogen ekstrak khamir, sumber karbon air kelapa 100 persen menghasilkan nilai pH terendah pada jam ke-9,
26 sedangkan pada air kelapa 70.5 persen menghasilkan nilai pH terendah pada jam ke-6.
Hal ini dapat disebabkan karena pada air kelapa 100 persen
terdapat kandungan gula yang lebih banyak daripada air kelapa 70.5 persen sehingga penggunaan sumber karbon (gula) untuk proses fermentasi menjadi lebih lama dan semakin banyak gula yang dikonsumsi oleh B.t.i. maka semakin banyak jumlah asam yang dihasilkan. Penurunan PI-I terbesar terjad pada air kelapa 100 persen dengan sumber nitrogen ekstrak khamir 1.0 persen yaitu 1.47. Hal ini disebabkan karena kadar nitrogen yang ada dalam media yang bersumber ekstrak khamir 1.0 persen lebih kecil daripada media yang bersumber nitrogen ekstrak khamir 1.5 dan 2.0 persen sehingga basa yang dihasilkan dari proses metabolisme tidak mampu menetralkan seinua asam yang dihasilkan dari proses fermentasi gula oleh kultur B.t.i. Untuk media dengan sumber nitrogen urea, baik sumber karbon air kelapa 100 persen maupun sumber air kelapa 70.5 persen menghasilkan nilai pH terendah pada jam ke-6 kecuali pada media dengan sumber air kelapa 100 persen dan urea 1.5 persen yang menghasilkan nilai pH terendah pada jam ke-
9. Penumnan pH terjadi karena pada jam ke-0 hingga jam ke-6 atau jam ke-9 yaitu pada fase eksponensial, B.t.i. menggunakan air kelapa (gula) sebagai sumber makanannya sehingga menghasilkan asam asetat serta asan~piruvat yang menyebabkan nilai pH kultur m e n m . Setelah jam ke-6 atau jam ke-9 nilai pH kembali meningkat karena pada kisaran jam ke-6 hingga jam ke-9 sumber karbon mulai meningkat sedangkan B.t.i. masih menggunakan sumber nitrogen dalam proses metabolismenya dan menghasilkan zat alkali yang bersifat basa.
Sedikitnya surnber karbon menyebabkan asam yang
27 dihasilkan sedikit sehingga tidak dapat menetralkan semua basa yang terbentuk. Pada dasarnya penurunan pH selaina proses fermentasi B.t.i. tergantung pada konsentrasi sumber nitrogen yang digunakan (Sukmadi et.
al., 1997). Keadaan ini terlihat jelas pada Gambar 3 dan Lampiran 3 bahwa penurunan pH pada media sumber nitrogen yang konsentrasinya lebih kecil menghasilkan nilai penurunan pH yang lebih besar daripada sumber nitrogen yang konsentrasinya lebih besar.
Hal ini disebabkan karena pada
metabolisme sumber nitrogen yang konsentrasinya lebih kecil akan dihasilkan zat alkali yang lebih sedikit daripada sumber nitrogen yang konsentrasinya lebih banyak.
Semakin banyak zat alkali yang dihasilkan dari proses
metabolisme maka semakin banyak asam yang dapat dinetralkan sehingga penurunan pH semakin kecil.
D. PEMBENTUKAN SPORA Proses pembentukan spora pada fermentasi B.t.i. dengan media air kelapa dimulai pada jam ke-9 atau jam ke-12 yaitu pada saat fase log mulai berakhir dengan jumlah spora hidup pada akhir fermentasi paling banyak dihasilkan pada media dengan sumber karbon air kelapa 70.5 persen dan sumber nitrogen ekstrak khamir 2.0 persen yaitu dengan jumlah log VSC sebesar 13.633.
i!
I--CE~IRl.O)b 1
w m (Jam+EKWVRRZ.Wb ~e)
--CEMRl.S% --0--UREA$.%
+UREA2.(Pb
1
i
Gambar 6. Grafik hubungan antara waktu dengan nilai pH untuk sumber karbon air kelapa 100 persen (a) dan air kelapa 70.5 persen (b)
29 Pada dasamya pembentukan spora ini mulai terlihat nyata pada saat fase log mulai berakhir yaitu pad* saat dimulainya fase stasioner (Sukmadi et. al., 1997). Pembentukan spora secara cepat tejadi pada jam ke-12 hingga jam ke-30, setelah itu pembentukan spora muiai mengalami perlambatan hingga jam ke-48.
.
Hal ini disebabkan karena seteiah sumber karbon difermentasi
menjah asam-asam yaitu asam laictat, asam piruvat, asam asetat dan asetain maka asam asetat yang dihasiikan digunaitan 1.agi untuk mensintesis poli-betahidroksibutirat (PHB) untuk proses spomlasi (Benoit et. al., 1990). Cepat atau lambatnya pembentukan spora tergantung pada kondisi lingkungan kultur. Biasanya spora akan tumbuh pada kondisi lingkungan di sekitar sel yang kurang sesuai bagi sel. Hal ini dapat disebabkan karena kultur yang pH yang ekstrim, suhu yang ekstrim dan kurangnya suplai inakanan bagi sel, atau kemungkinan lainnya yang dapat menyebabkan kondisi lingkungan tidak sesuai bagi sel sehingga sel membentuk spora. Sedangkan proses cepatnya pelepasan spora dari sel (lisis) tergantung pada konsentrasi gula yang digunakan yaitu semakin kecil konsentrasi gula yang digunakan maka seinakin cepat iejadi iisis sei yang meiepas spora dan kristai (Suionadi
el.
al., 1996). Demiiuan pula halnya dengan keberhasilan proses
sporuiasi dan pembentukan iaistal, tergantung pada keseimbangan antara konsentrasi sumber karbon clan konsentrasi sumber nitrogen. Semahn rendah konsentrasi sumber nitrogen maka sporulasi dan pembentukan kristal tejadi lebih cepat, namun jumlah spora dan kristal yang dihasilkan lebih sedikit sedangkan jika konsentrasi sumber nitrogen terlalu tinggi akan mengganggu proses sporulasi dan pembentukan kristal (Sukmadi et. al., 1997). Namun
-
30 demikian pada peneiitian ini konsentrasi nitrogen rertinggi tidak sampai mempengaruhi proses sporuiasi seperti terlihat dari uji analisa ragam yang memperlihatkan bahwa konsentrasi sumber nitrogen tidak memberikan efek yang signifikan terhadap nilai log spora hidup yang dihasilkan yaitu dengan nilai F hitung sebesar 0.279 dan nilai F Tabel (a= 0.05) sebesar 3.24. Pembentukan spora selama proses fermentasi berlangsung seperti terlihat pada Gambar 4 dan 5 menunjukkan bahwa pada dasamya baik pada media dengan sumber nitrogen urea atau ekstrak khamir
maupun pada
sumber karbon air kelapa 100 persen atau 70.5 persen didapatkan pertumbuhan spora yang tidak jauh befbeda. Namun dari uji analisa ragam terlihat bahwa sumbe: karbon dan interaksi antara sumber karbon dengan jenis sumber nitrogen memberikan efek yang signifikan terhadap jurnlah spora hidup yang dihasilkan. Untuk sumber karbon dihasilkan niiai F hitung dan F Tabel (a = 0.05) masing-masing sebesar 8.349 dan 4.75, sedangkan untuk interaksi antara sumher karbon dan jenis sumber nitrogen menghasiikan nilai F hitung dan F Tabel (a = 0.05) masing-masing sebesar 4.852 dan 4.75. Seteiah diiakukan uji Duncan's, hanya pada interaksi antara sumber karbon 70.5 persen dengan sumber nitrogen ekstrak khamir yang signifikan terhadap interaksi antara sumber karbon air kelapa 100 persen dengan sumber nitrogen ekstrak khamir.
W
W (Jana)
1
I
1-PXlWh EKl WA t M l W A EK1.596 --CPXlW EK209L I-O--~~~~AEK~.W--(~.--M~~~~EK~.~+IU(IO~,EKZ
Gambar 7. Grafik hubungan antara waktu dengan log VSC untuk sumber karbon air kelapa dengan sumber nitrogen ekstrak khamir (a) clan urea (b)
GRAnKHLIBUW;nNANTPRA W ~ L C G V S C (AIR W A IOSO/)
WPKN (JanKe)
/
+ E W R l . W 4LRA'.C%
i-
- C E W R I . % -O--m1.5?6
GRAnK H U B U W ANTAR4 WAKN D E W LCG VSC (AIR KELAPA 100%)
0 3 6 9 12151821242730333639424548
w m (Jan I(*) W
.
E C
-
-
~
P
(
.
~
R
(
U &E. I
-
J
X
&E.
W R Z . ~ d
Gambar 8. Grafik hubungan antara waktu dengan log VSC untuk sumber karbon air kelapa 100 persen (a) dan air kelapa 70.5
i3erat kering akhir (pada jam ke-48) yang diperoleh teriihat pada Tabel 6.
Dari Tabel tersebui dapat terlihat bahwa berat kering yang
dihasilkan berkisar antara 2.791 - 6.362 gl1 cairan kuitur. Hasil ini~tidakjauh berbeda dengan penelitian yang telah dilakukan oleh Sikdar et. uZ. (1991). Sikdar et. al. (1991) meneliti pengaruh mineral terhadap produksi 6 - endotoksin oleh i3.t.i. dan mendapatkan berat kering sel yang berkisar
antara 0.8 sampai 4.0 g/l cairan kultur. Dari Tabel 6 terlihat bahwa penggunaan sumber karbon 70.5 persen dengan sumber nitrogen urea 1.5 persen memberikan hasii berat kering terbesar yaiiu 6.362 gil cairan kultur.
Berdasafkan hasil analisa ragam,
sumber kaibon dan jenis sumber nitrogen memberikan efek yang sangat signifikan terhadap nilai log berat kering yang
dihasilkan ( a
=
0.05).
Demikian pula interaksi antara sumber karbon dengan jenis surnber nitrogen, untuk a
=
0.05 me~nberikanefek yang signifikan terhadap nilai log berat
kering yang dihasilkan. Sedangkan konsentrasi sumber nitrogen dan interaksi antara sumber karbon dengan konsentrasi sumber nitrogen tidak memberikan efek yang signifikan terhadap nilai berat kering yang dihasil~an( a = 0.05).
F. BAYA BAHAN BAKU (SUMBER NITROGEN) Media air keiapa 70.5 persen dengan sumber nitrogen urea 1.0 persen (bh) merupakan media yang sesuai untuk pertumbuhan B.t.i. Hal ini terlihat dengan besamya nilai berat kering yang dihasilkan. Dalam penelitian ini, penggunaan media dengan sumber nitrogen urea lebih baik daripada
ekstrak khamir, karena selain memberikan hasil yang lebih baik juga membutuhkan biaya yang lebih murah. Perincian harga tiap bahan yarlg digunakan terlihat dalarn Tabel 7. Tabel 6. Berat kering biomassa (sel-spora-kristal) untuk berbagai konsentrasi . neBerat kering (pa cairan knltur) Surnber Sumbe. Nitmgen Ulangan 1 Illangan Rata-rata karbon
1
II
-
I
i
Air kelapa 100 persen
I
1
I j
i
i
Ekstrak khamir persen Ekstrak kharnir persen Ekstrak khamir ersen Urea 1.0 persen Urea 1.5 persen Urea 2.0 persen Ekstrak khamir persen
4.041
1.0 2.612
'
2.904
2.678
3.950 5.102 2.792 4.179
4.387 4.566 3.547 4.201
I
2.0
1/ 1.0 1
i
persen Ekstrak khamir 2.0 persen I / Urea 1.0 persen 1 Urea 1.5 persen 1 Urea 2.0 persen
1
i
1
i
!
/
;
3.321
1.51
I
2.966 2.791
1
4.168 4.834 3.169 4.191
I
4.424
3.983
6.416 6.735 6.427
1 /
I
Air destilata
1 Rp. 300il
Ekstrak khamir
I Rp. 800 0001500 g I
1I Rp. 1500 / k g
I I
I
6.015 5.988 5.896
Tabel 7. Daftar barga sumber karbon dan sumber nitrogen Bahan I Harga I Rp. 2000 I20 1 Air kelapa
Urea
3.450
1 1
4.203 6.215 6.362 6.161
1
II
35 Untuk membuat i liter media dibutuhkan urea sebanyak 7.5 g, air kelapa 0.705 I, dan air destilata 0.295 1, maka dibutuhkan biaya sebesar Rp. 81.8385,- atau sekitar Rp. loo,-.
Sedangkan jika menggunakan sumber
nitrogen ekstrak khamir, dibutuhkan 7.5 g ekstrak kharnir, air kelapa 0.705 1, dan air destilata 0.295 1; maka dibutahkan biaya sebesar Rp. 12 000,-. Jadi terlihat jelas bahwa akan tejadi penghematan biaya yang sangat besar yaitu sekitar Rp. 11 900,- jika rnenggunakan sumber nitrogen urea untuk fermentasi B.t.i., dan keuntungan ini akan menjadi lebih besar lagi jika diperhltungkan perbedaan berat produk akhir yang didapatkan per liter rneda.
G. PENGUJLAN AKTNLTAS MORTALITAS LARVA
PRODUK
PRIMER
TERHADAP
Pengujian terhadap aktivitas produk primer terhadap iarva Culex sp dilakukan dengan memasukkan masing-masing 25 ekor larva Culex sp ke dalam sepuluh tingkat konsentrasi untuk tiap perlakuan. Tingkat mo~ialitas larva
Cu1e.x sp untuk tiap perlakuan ini terlihat pada Tabel 8. Dari Tabel terlihat bahwa air kelapa I00 persen dengan sumber
nitrogen ekstrak khamir 1.5 persen memiliki daya bunuh yang paling bark karena pada konsentrasi i0-" masih dapat membunuh larva Culex sp lebih dari 10 persen. Bardasarkan Tabel 8 tersebut maka dapat dihitung LCso-nya dengan menggunakan program Quant seperti teriihat pada Tabel 9. Dari Tabel 9 terlihat bahwa produk yang dihasilkan dengan surnber karbon air kelapa 100 persen dan surnber nitrogen ekstrak khamir 1.5 persen merupakan produk yang paling baik karena rnemiliki nilai LC50 yang paling kecil yaitu 0.5204 pdl. Nilai ini berarti untuk membunuh larva Culex sp
sebanyak 50 persen dari populasi yang ada diperlukan produk sebanyak
Tabel 8. Tingkat mortalitas larva Culex sp untuk berbagai konsentrasi sumber karbon dan sumber nitrogen. krrbon
1I
I
I
SumberHitmgen
IE.khamirl.Openen
10.'
i
10"
1
Mortalitas (%) pada konsentrasi 10" j 10" lo-= lo4 loa
/
100 persen
I I 0 9 I 0 9 96 I l I E khamirZ.0 p e n n 1 100 Il 100 iI 100 lI
i
{ Air kelapa 70.5 persen
1e Urea 1.0 persen
1
Urea 1.5 persen
/
196 196 192 152 128 124
Lh\amiii.5perseo Air kelapa
/
i
IOO(84
76
96
l l I36 1
I1 6 4 I1 2 4 I1 .1
52
/l
20
1
8
/
: :
32
16
12
/
16
‘/I8
I . - /
2
i1
/
Urea i . 0 pervert
j Urea 1.5 persen Produk komersinl Vectobac
44
/
1
64 28
/ /
48 16
/ i 0 0 / 9 6 / 6 0I / 2 0I / 1 2 1 S
i
i100i84i j ~ i 3 6 1 2 8 8
j
-
j -
-
1
-
-
/
32
8
32
I1
20
8
1
I
96
I
1
I
1
8
1 4
~ 9 6 1 8 8 ~ 8 0 1 1 6 ~ 1 6 1 8 1 2 ]8
/
8
I 16
/ /
1
4
/
4
/ /
8
1
8
/
S
/
8
8
4
j
4
4
j
terlihat bahwa air kelapa 100 persen menghasilkan kualitas produk yang lebih baik karena menghasilkan nilai LCso yang lebih kecil. Jika dibandingkan antara sumber nitrogen ekstrak khamir dengan urea, maka produk dengan sumber nitrogen ekstrak khamir mempunyai kualitas yang lebih baik karena mempunyai nilai LC50 yang lebih kecil, kecuali pada urea 2.0 persen. Hal ini menunjukkan kemungkinan komposisi sumber nitrogen mempengaruhi
I /I
l O
Ii
4
1 I
0
1
4
1
4
i
0
) 1 0 0 / 9 0 / 6 0 / 4 0 1 10
Jika dibandingkan antara air kelapa 100 persen dengan 70.5 persen
kualitas produk yang dihasilkan.
/
4
I
1
i
I
/
1 0 - ~ lo-'0
I4
I Urea 2.0 persen
/ E. khamir 1.5persen / 100 / 100 / 100 / / E. khamirZ.0 persen 1 100 100 / 96 /
/
1
-
i
Dan Tabel 9 terlihat tidak adanya hubungan antara berat kering biomassa atau jumlah spora terhadap nilai LC5o. Ini berarti berat kering biomassa atau jumlah spora yang dihasilkan tidak mempengaruhi tingkat mortalitas larva Culex sp oleh produk yang dihasilkan Tabel 9.
Berat kering biomassa (sel-spora-kristal) untuk berbagai konsentrasi sumber karbon dan sumber nitrogen. Berat kering (gn kultur) 3.450
Surnber Nitrogen
karbon
E. khamir 1.0 persen
/ E. kharnir 1.5 persen I E. khamir 2.0 persen
Air kelapa 100 persen
1.5 persen / Urea Urea 2.0 persen
1 Air kelapa 70.5 persen
i /
!
E 1&amir 1.0 persen E. kharnir 1.5 persen E. khamir 2.0 persen
Urea 1.5 persen
II
Urea 2.0 persen
1
Urea 1.0 persen
I
/
I
I
Log VSC (sporalml) 10.7340
Lcso ( p g L 94.4061
Potensi (IUlfig) 99.5698
V.
KESIMPULAN DAN SARAN
A. KESIMPULAN Penelitian pendahuluan memberikan hasil bahwa kadar protein dari air kelapa yang digunakan masih relatif besar yaitu 0.244 dan memiliki kadar gula sebesar 1.77 persen. Dengan kadar gula tersebut, maka untuk mencapai kadar gula optimum bagi pertumbuhan B.t.i. (sebesar 1.25 persen) air kelapa diencerkan hingga 70.5 persen. Penggunaan air kelapa 70.5 persen menghasilkan nilai log total sel yang lebih tinggi daripada sumber karbon air kelapa 100 persen. Berdasarkan uji ragam, konsentrasi surnber karbon memberikan efek yang signifikan terhadap nilai log total sel yang dihasilkan. Pada penggunaan air kelapa 70.5 persen dengan urea sebagai surnber nitrogen menghasilkan log total sel yang lebih tinggi daripada air kelapa 70.5 persen dengan ekstrak khamir sebagai sumber nitrogen. Berdasarkan uji analisa ragam, penggunaan sumber nitrogen yang berbeda memberikan efek yang signifikan terhadap log total sel yang dihasilkan. .
Laju pertumbuhan tercepat terjadi pada kisaran jam ke-6 hingga jam ke-9, dimana air kelapa 70.5 persen sebagai sumber karbon menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih cepat daripada air kelapa 100 persen. Demikian pula dengan urea sebagai sunber nitrogen menghasilkan laju pertumbuhan yang lebih cepat daripada ekstrak khainir sebagai sumber nitrogen. Penumnan nilai pH terjadi mulai dari jam ke-0 hingga pada kisaran jam ke-6 sampai jam ke-9. Setelah itu nilai pH naik"kemba1i. Semakin
.
39 banyak gula yang dikandung di dalam cairan kultur (media), semakin besar rentang penurunan nilai pH yang dihasilkan. Selain itu, konsentrasi nitrogen juga mempengamhi penurunan nilai pH cairan kultur. Pembentukan spora pada fermentasi B.t.i. dimulai pada kisaran jam ke-9 hingga jam ke-12 dan pembentukan spora secara cepat tejadi pada jamn ke-12 hingga jam ke-30, kemudian mengalami perlambatan hingga jam ke-48. Berdasarkan uji analisa ragam, konsentrasi sumber nitrogen tidak memberikan efek yang signifikan terhadap nilai log jumlah spora hidup yang dihasilkan. Tetapi sumber karbon dan interaksi antara
sumber karbon
dengan jenis sumber nitrogen memberikan efek yang signifikan terhadap log jumlah spora hidup yang dihasilkan. Berat kering yang dihasilkan pada fermentasi b.t.i. berkisar antara 2.791 sampai 6.362 gll cairan kultur.
Sumber karbon dan jenis sumber
.
nitrogen serta interaksi antara sumber karbon dengan jenis sumber nitrogen menghasilkan efek yang signifikan terhadap nilai berat kering yang dihasilkan. Sedangkan konsentrasi sumber nitrogen dan interaksi sumber karbon dengan konsentrasi sumber nitrogen tidak memberikan efek yang signifikan terhadap nilai berat kering yang dihasilkan. Produk dengan sumber nitrogen ekstrak khamir mempunyai daya bunuh yang lebih besar daripada sumber nitrogen urea. Nilai berat kering biomassa atau jumlah spora yang dihasilkan tidak mnempengaruhi tingkat mortalitas larva Culex sp. oleh produk yang dihasilkan.
B. SARAN Dari hasil penelitian yang telah dilakukan maka perlu dilakukan : (1) penelitian lebih lanjut mengenai konsentrasi air kelapa yang optimum untuk pertumbuhan B.t.i., (2) penelitian lebih lanjut mengenai kombinasi sumber nitrogen yang sesuai untuk sumber karbon air kelapa, (3) pengaruh konsentrasi nitrogen dan kandungan vitamin, asam amino dalaln media terhadap kualitas produk yang dihasilkan, clan (4) penelitian terhadap Mtivasi B.t.i. pada bioreaktor dengan pengontrolan pH.
DAFTAR PUSTAKA
Apriyantono, A. 1989. Analisis Pangan. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi-PB, Bogor. Alaban, C.A. 1962. Studies on Optimum Conditions for Nata De Coco Bacterium or Nata Formation In Coconut Water. Philipine Agric. 96(2j : 490 - 5i5. Badan Pusat Statistik. Jakarta.
1991.
Statistik Perkebunan. Badan Pusat Statistik,
Benoit, T.G. Wiison, dan C.L. Baugh. 1990. Fermentation During Growth and Sporulation of Bacillus thuringiensis HD-I. Lett. Appl. Microbial. (10) : 15 - 18. Di dalam Sukmadi, B., Haryanto, B., dan W n a , S.H. 1996. Pengaruh Konsentrasi Dekstrosa Pada Produksi Bahan Aktif Bioinsektisida Bacilius thuringiensis subsp. aizawai. Majaiah BPPTeknologi No. LXXII : 17 - 23. Child. 1962. Coconuts. Longrnans Green and. Co., London. Direktorat Gizi Departemen Kesehatan R.I. 1988. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Bharata Karya Aksara, Jakarta. Duimage, H.T. l98i. insecticidal Activity of Isolates of Bacilr'us tiiuringiensis and T'heir Potential for Pest Control, pp. 193-221. Di dalam H.D. Bueges, ed. Microbial Control of Pest and Plant Diseases. Acad. Press, New York. Dulmage, H.T. dan R.A. Rhodes. 1971. Production of Pathogens in Artificial Media, pp. 507-540. Di dalam H.D. Burges dan N.W. Eiussey, eds. Microbial Controi of insect and Mites. Acad. Press, New York. Feitelson, J.S., J. Fayne, dan L. Kim. 1992. Buciir'us tiiuringiensis : insects and Beyond Biotechnol. 10 : 271-275. Freemond, Y. dan R. Zilier. 1966. The Coconut Palm. International Potash Institute, Berne. Gill, S.S., E.A. Cowles, dan P.V. Pietrantonio. 1992. The Mode of Action of Bacillus tizuringiensis Endotoxins. Annu. Rev. Entomol. 37 : 615-636. Goldberg, L.H. dan J. Margaiit. 1977. A Bacterial Spore Demonstrating Rapid Larvicidal Activity Against Anopheles Sergentii, Uranoiaenia unguiculata, Culex univaffaius,Aedes aegypti and Culex pipiens. Mosq. News, 37 : 355-358.
Hofte, H. dan H.R. Whiteley. 1989. Insecticidal Crystal Proteins of Bacillus thuringiensis Iviicrobial. Rev. 53(2) : 242-255. Johnson, T.B., A.C. Slaney, W.P. Donovan, dan M.J. Rupar. 1993. Insecticidal Activity of EG4961, a Novel Strain of Bacillus tizuringhnsis Toxic to Larvae and Adults of Southern Corn Rootworm (Coleoptera : Chrysomelidae) and Colorado Potato Beetie (Coieoptera : Chrysomelidae). J. Econ. Entomol. 86(2) : 330-333. Ketaren, S. 1978. Daya Guna Hasil Kelapa. Dept. Teknologi hasil Pertanian, Fatemeta-IPB, Bogor. Khachatourians, G.G. 1989. Production and Use of Biological Pest Controi Agents. Tibtech, 5 : 120-124. Kimia Pestisida. 1993. Pestisida Untuk Pertanian dan Kehutanan. Departemen Pertanian, Jakarta. Krieg, A. dan H.G. Miltenburger. 1984. Bioinsecticides Bacillus thuringiensis. Advances in Biotechnoiogical Procesess. 3:273-290. Lowry, O.H., N.J. Rosenbrough, A.L. Farm, dan R.J. Randaii. 1951. Protein Measurement With Folin Phenol Reagent. J. Biochemistry. 193,265. Margalit, J. dan D. Dean. 1985. The Story of Bacillus tizuringiensis israeleiwis. Di dalam J. Am. Mosquitos Control Assessment, 1 : 1-7. Mummigatti, S.G. dan A.N. Raghunathan. 1990. Influence of Media Composition on The Production of 6-endotoxin by Bacillus thuringiensis var. tlzuringiensis. J. Inveriebr. Pathoi. 5 5 : 147-151. Philip, F.E., J.S. Cory, 1vl.J. Baiiey, dan S. Higgs. i993. Bacillus tizuringiensw, Ar, Envirormental Biopesiicide : Tiieon and Practice, pp. 148. Jo'nn Wiley and Sons, New York. Quinlan, R.J. dan S.G. Lisansky. 1985. Microbial Insecticides, pp. 233-254. 2 daiarn H. Dellweg, ed. Biotechnoiogy voi. 3. Veriag Chemis, Weinheim. Rupar, M.J., W.P. Donovan, R.G. Groat, A.C. Sianey, J.W. Mattison, T.B. Johnson, J.F. Charles, V.C. Dumanoir, dan H. de Barjac. 1991. Two Novel Strains of Bacillus tlzuringiensis Toxic to Coleopterans. App. Environ. Microbial. 57(11j : 3337-3344. I Shieh, T.R. 1994. Indification and Clasification of Bacilius tizuringiensis. Q & Kumpulan Makalah Seminar Bacillus thuringiensis. Komisi Pestisida Departemen Pertanian, Jakarta.
Sikdar, D.P., M.K. IvIajumdar, dan S.K. Majumdar. 1993. Optimization of Process for Production of Delta Endotoxin by Bacillus tizuringierzsis var. isruelensis in a Five Litre Fermentor. Biochemical Archive:. 9 : 119-123. Subrahmanyan, V. dan Swaminathan, D. 1959. Coconut in Food. Coconut Bull. 13, NO.5, 153 - 158. Sukmadi, B., Haryanto, B., dan Ratna, S.H. 1996. Penganih Konsentrasi Dekstrosa Pada Produksi Bahan Aktif Bioinsektisida Baciiius thuringiensis subsp. aizawai. Majalah BPP-Teknologi No. LXXU : 17 - 23. Sukmadi, B., Haryanto, B., dan Ratna, S.H. 1997. Pemanfaatan Sunber Nitrogen Lokal Untuk Produksi Bahan Aktif Bioinseictisida Baciiius thuringiensis subsp. aizawai. MajalahBPP-Teknologi No. L X X X : i09 - 118. Thampan, P.K. 1982. Handbook of Coconut Palm. axford and Ibid Publ. Co. Westport, New York. Tuieckle. 1961. Coconut. Longmans Green and. Co., London. Vandekar, M. dan H.T. Dulmage. 1982. Guidelines for Production of Baciiius thuringiensis H-14. Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases Genewa, Switzerland. Woodroof, J.G. 1979. Coconut : Production, Processing, Products. The kt7 Pubi. Co. Inc., Westport-Connecticut.
Lampiran 1. Data log total sel Bacillus thrtri~zgie~~sis subsp. israelensis selama fermenhsi
Jam Ke-
Log total sel/l/ml cairnrt kultur AlBl
AlB2
AIR3
A2Bl
A2B2
A2B3
AlCl
A1C2
A1C3
A2C1
A2C2
A2C3
0
8,9337 9,0459 8,7314 9,3665 9,3008 8,8064 8,6249 8,3865 8,3626 8,6439 8,3246 8,3104
3
9,3810 9,4169 9,2823 10,0658 10,1159 9,6946 9,1012 8,8662 8,9591 9,6408 9,5211 9,4380
6
9,7230 11,1807 11,0303 1 - m
9,5390 11,3455 11;0352 11,4346
-
p p
9
11,0599 10,6860 10,6091
12
11,4374 10,9794 10,9179 12,4326 12,3928 12,3867 11,3284 12,0094 10,1702 13,3161 13,5881 13,3195
18
11,5403 11,0509 10,9655 12,4345 12,4119 12,3908 11,3242 12,0153 10,2202 13,3890 13,6456 13,3146
24
11,5312 11,0567 10,9377 12,3931 12,4161 12,3699 11,3581 12,0233 10,2716 13,4207 13,6712 13,3385
10,1583 13,2646 13,5789 23,2862
.
I
_
_
I
_
_
_
_
_
_
_
_
_
_
-
-
11,0404 10,9342 12,2996 12,4442 12,3485 11,3463 12,0092 10,2313 13,4393 13,5392 13,3086 12,2032 11,1447 11,8002 10,1610 13,2153 13,3044 13,1070
-
Lampiran 4. Data log jumlah spora hidup (VSC) selama ferrnentasi
Jam I&-
Log l/SC/,?d cnirnrt kultuv
AlBl
A1B2
~ 1 8 3 A21H
A21i2
A2B3
AIC1
*)
A1C2
--
AlC3
A2CI - A252
A2~:3-
0
0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
3
0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0000 0,0000 0,0000 0,0000 ,2317 1,9731 2,3589 1,9243 3,2155 2,2240 2,8312 2,9106 5,7185 6,0327 6,0826 5,5447 ,1136 8,2379 7,6716 8,1745 9,7712 11,2957 10,1106 10,0120 11,9489 12,1562 12,1300 12,2123 L
Lampiran 5. Data berat kering biomassa (sel-spora-kristal) selamo fermentasi
Jam Ke-
BERAT KEIUNG (gd cairnti kulfur) *) AlBl
AlB21 A1B3
AlBl
A2B2
A2B3
AlCl
A1C2
A1C3
A2C1
A2C2
AZCT
0
0,934
1,046
0,731
1,366
1,301
0,806
1,609
1,367
1,343
1,644
1,304
1,290
3
1,381
1,417
1,282
2,066
2,116
1,695
2,093
1,854
1,949
2,641
2,519
2,435
,538
4,345
4,057
4,463
3,166
6,265
6,640
6,343
3,179
6,316
6,650
6,377
3,229
6,389
6,708
6,372
,282
6,421
6,734
6,5%
3,241
6,439
6,600
6,3z
3,169
6,215
6,362 --
6,161
Lampiran 6. Uji Statistik untuk log total sel Analisa Varian
Uii Duncan's Multiple Range
Ull
I ~ I I ~ L
D-B D-A D-C B-A B-C A-C
0.96 2.14 2.171.18 1.21 0.03-
Keterangan :
Ci
= Su~nber karbon
ke-i
Nj
= Jenis
Kk
= Konsentrasi
A
= Air
kelapa 100% dengan ekstrak kha~nir
B
= Air
kelapa 70.5% dengan ekstrak kharnir
C
=Air kelapa 100% dengan urea
D
= Air
sumber nitrogen Ice-j sumber nitrogen ke-k
kelapa 70.5% dengan urea
Lampiran 7. Uji statistik untulc log VSC Analisa Varian
Uii Duncan's Multiple Ranpe
Keterangan :
Ci
= Su~nberkarbon ke-i
Nj
= Jenis sumber nitrogen ke-j
Kk
= Konsentrasi sumber nitrogen ke-k
A
= Air kelapa 100% dengan ekstrak kljamir
B
= Air kelapa 70.5% dengan ekstrak khatnir
C
= Air kelapa 100% dengan urea
D
= Air
kelapa 70.5% dengan urea
Lampiran 8. Uji statistik untuk berat kering biomnssa (sel-kristal-spora) Analisa Varian
Uii Duncan's Multinle R a n ~ e
Keterangan :
Ci
= Sulnber karbon
ke-i
Nj
= Jenis
Kk
= Konsentrasi
A
= Air
kelapa 100% dengan ekstrak khamir
B
= Air
kelapa 70.5% dengan ekstrak khamir
C
= Air
kelapa 100% dengan urea
D
= Air
kelapa 70.5% dengan urea
surnber nitrogen ke-j sumber nitrogen ke-k
Lampiran 9. Analisa kadar protein rnetode Lowry (Lowry, 1951)
I ml sampel diencerkan
Ditambah 5 ml pereaksi C
i-J Dikocok dan dibiarkan selama 10 rnenit
I
1 1
Ditambah 0.5 ml pereaksi D
Dikocok dan dibiarkan 30 menit
I
I
Absorbansi diukur pada A = 500 nm
I
standar protein BSA yang mempunyai kandungan protein 50, 0.25, 0.167, 0.125, 0.1,0.083, dan 0.05,
Pereaksi Lowry yang digunakan adalah : 1. Pereaksi A : 2% Na2C03-anhidrat dalarn 0.1 N NaOH. 2. Pereaksi B : 0.5% CuS04.5H20 dalam larutan 1%garam rochele (Na-Ktartarat). 3. Pereaksi C : Larutan campuran yang terdiri dari 50 ml pereaksi A clan 1 ml pereaksi B. 4. Pereaksi D : Pereaksi Folin Ciocalteu dan air dengan perbandingan 1 : 1.
Lampiran 10. Analisa kadar abu
Cawan porselin dikeringkan
Cawan ditimbang
I dan ditimbang
Diabukan dalam tanur Suhu 450 - 500 O C , 2 jam Hingga semua sampel menjadi abu
I
-1
Didinginkan dan ditimbang
Kndar Abu (%) =
I
-
Keterangan: A
= berat
cawan + sampel setelah pengabuan
B
= berat
cawan setelah pengeringan
W = berat contoh setelah pengeringan
Lampiran 11. Analisa kadar gula total (metode fenol)
(2.5% PbO + 2.5% Pb-asetat)
sampai diperoleh cairan jernih
suhu 25 oC (set 10 menit)
Lampiran 12. Kurva standar untuk uji kadar gula total
/
Kadar Gula (mgll) 20
/
OD480 0.222
