Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
TEKNIK PEMBUATAN DAN PENGUJIAN TUBERKULIN PPD (PURIFIED PROTEIN DERIVATIVE) BOVIN BUATAN BALITVET AGUS EFENDI DAN SUTARMA Balai Penelitian VeterinerX. R.E. Martadinata 30, Bogor 16114
RINGKASAN Tuberkulosis (TBC) sapi merupakan penyakit hewan menular yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium bovis . Tuberkulin adalah diagnostikum veteriner yang dipakai dilapangan untuk mendiagnosa kasus-kasus TBC pada sapi secara dini . Untuk membuat tuberkulin PPD bovin dipakai kuman M.bovis, galur standar AN5 , dan media yang digunakan adalah media sintetik Dorest Henley . Dari 1250 ml media yang mengandung pertumbuhan kuman M .bovis murni menghasilkan stok tuberkulin sebanyak 337,5 ml dengan kandungan proteinnya 5 mg/ml . Tuberkulin yang baik adalah pada uji sterilitas, hasilnya negatif terhadap kuman-kuman pencemar, sedangkan pada uji potensi terhadap sapi-sapi reaktor buatan positif TBC menunjukkan terjadinya kebengkakan disekitar suntikan .
PENDAHULUAN Tuberkulosis (TBC) sapi merupakan penyakit hewan menular yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium bovis, bersifat tahan asam, dan dapat menular pada manusia (zoonosis) . TBC sapi adalah penyakit hewan menular pertama yang diinstruksikan oleh Pemerintah Kolonial waktu itu untuk ditangani penelitiannya oleh Balai Penelitian Veteriner (Balitvet), yang didirikan pada tahun 1908 dan dahulu disebut Veeartsenijkundig Laboratorium (Hardjoutomo, 1988) . Untuk mendiagnosa penyakit ini digunakan tuberkulin . Tuberkulin merupakan diagnostikum veteriner yang dipakai di lapangan untuk mendiagnosa secara dini kasus-kasus TBC pada sapi, dan sejak itu kegiatan tuberkulinasi dilapangan di Indonesia tidak lagi memerlukan impor tuberkulin dari luar negeri . Sebagai konsequensinya, penelitian pengembangan tuberkulin buatan sendiri ini secara berlanjut terus dilanjutkan oleh Balitvet guna mendapatkan peningkatan mutu produk yang lebih baik lagi (Hardjoutomo dan Sutarma 1993) . Untuk menaikkan mutu produk tuberkulin dicoba dengan prosedur dari England (Anonym, 1984) yang dimodifikasi sesuai dengan fasilitas Weybridge, yang ada di Balitvet . peralatan Tujuan tulisan ini disajikan sebagai informasi dan mendokumentasikan cara pembuatan dan pengujian tuberkulin PPD bovin .
156
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
BAHAN DAN CARA KERJA Media Sintetik Untuk menumbuhkan dan memperbanyak kuman M .bovis galur standar AN 5 sebagai pokok kuman digunakan media sintetik Dorest Henley, yang sebagian besar komposisinya adalah bahan kimia anorganik (Anonym 1984) . Untuk membuat 1 liter media sintetik digunakan bahan sebagai berikut L . asparagin KH2PO4
Sodium sitrat 2H 20 MgSO4 . 7H20
Glukosa Glyserin Ferri sit rat Zn SO4. 7H2 0 CO(NO)2- 6H20
Ca C12 anhydrous Cu 504. 5H20
Air suling
12 gram 1,08 gram 0,90 gram 1,50 gram 10 gram 50 ml 0,30 gram 26,7 mg 1,34 mg 66,7 mg 2,67 mg 950 ml
Bahan-bahan yang sudah ditimbang dilarutkan dengan air suling, dipanaskan dalam penangas air suhu 80°C . Setelah larut homogen, diukur pH nya sehingga mencapai 6,8, kemudian media ini diisikan masing-masing 250 ml kedalam erlenmeyer yang kapasitasnya 500 ml, lalu disterilkan pada suhn 120°C, selama 15 menit dengan autoclave . Proses penyiapan stok tuberkulin PPD bovin (ANONYM 1984) M.bovis galur standar AN, yang digunakan sebagai pokok kuman diinokulasikan pada permukaan media Dorest Henley, sebanyak 6 buah erlelimeyer . Kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C, selama 10 minggu . Pertumbuhan kuman yang bagus ditandai dengan pembentukan suatu selaput (pelikel) yang mengapung di atas permukaan media, tebalnya antara 5-10 mm . Pertumbuhan pada media sintetik ini kemudian di cek kemurniannya pada media agar nutrien dan agar darah . Pupukan kemudian dibunuh dengan uap air panas (100°C) yang mengalir dengan alat KOCH selama 3 jam, lalu didinginkan . Dari semua pertumbuhan kuman yang murni disaring dengan kertas saring, dan hasil saringan (filtrat) diukur isinya . Untuk mengendapkan tuberkel proteinnya, 9 bagian saringan ditambah dengan 1 bagian larutan Tri chloroacetic acid (TCA) 40% . Campuran diaduk dengan pengaduk listrik selama 30 menit agar reaksi pengendapan protein sempurna . Campuran disimpan selama 2 jam pada suhu dingin supaya proteinnya mengendap . Cairan di atas (supernatan) dibuang, lalu endapan proteinnya dipindahkan ke dalam gelas ukur 1 liter, lalu suspensikan dengan larutan TCA I%, dan dibiarkan 2 jam pada
1 57
Lokakarya Fungsionat Non Peneliti 1999
suhu dingin, sehingga endapan protein isinya akan terukur (PV) dan stok tuberkulin yang akan diperoleh jumlahnya 5 kali endapan protein (PV) yang diperoleh . Endapan protein kemudian dicuci 3 kali dengan larutan TCA 1 % dengan cara endap tuang dan terakhir dicuci dengan larutan NaC1 10% . Endapan tuberkel protein kemudian dilarutkan dengan pelarut (solvent) Na2HPO4 '/ 30 M . Untuk setiap 1000 ml' media diperlukan 25 ml pelarut . Kemudian ditambahkan larutan buffer phosphat (BP) 5 x PV- pelarut M dengan jumlah : 10 ml Setelah itu tambahkan larutan anti bakterial (ABS), jumlahnya sama dengan jumlah endapan protein (PV) yang diperoleh . ABS adalah campuran NaCl, phenol dan glyserin dengan perbandingan 1 :1 :20 . Terakhir sisanya adalah air suling . Stok tuberkulin yang diperoleh disentrifuse pada 8000 putaran per menit (8000 rpm) dengan sentrifuse Backman Model J2 .21 selama 20 menit untuk mengendapkan sedimen dan koloid . Cairan jernih (supernatan) dipisahkan, kemudian ukur eksimasi proteinnya dengan metoda Biorad titertek . Protein yang dikehendaki sebagai tuberkulin PPD bovin yang digunakan mengandung 3 mg/ml, dan sebagai pengencer adalah larutan buffer phenol 0,5% . Kemudian diukur pH nya sampai mencapai 7 .0, lalu disaring dengan Seitz EK, selanjutnya diisikan kedalam ampul isi 2 ml, disimpan pada suhu dingin selama belum/tidak dipakai . Pengujian potensi dan keamanan tuberkulin Uji potensi dilakukan pada sapi-sapi reaktor buatan positif TBC dan sapi-sapi normal yang dipelihara dikandang Balitvet. Uji potensi dilakukan secara "single caudal fold test" (SCT), yaitu penyuntikan tunggal tuberkulin secara intradermal pada lipatan kulit dekat pangkal ekor bagian ventral dibagian kiri yang tidak berbulu sebagai tempat suntikannya, dengan dosis 0,1 ml tuberkulin per ekor (Lepper, dkk, 1977), disuntikan dibagian kiri . Sebagai pembanding disertakan tuberkulin PPD bovin standar buatan Central Serum Laboratory (CSL) Australia, disuntikan dibagian kanan . Jadi satu ekor sapi disuntik 2 macam tuberkulin, sebelah kiri suntikan PPD Balitvet, sebelah kanan tuberkulin PPD-CSL . Sapi yang digunakan terdiri dari 5 ekor sapi reaktor (No . 01-05) dan 2 ekor sapi normal sebagai kontrol, no 11 dan 14 ( Tabdl 1) . Reaksi dari uji ditafsirkan / dibaca hasilnya pada 72 jam paska tuberkulinasi (Lepper, dkk, 1977) . Sedangkan untuk pengujian keamanan produk dilakukan dengan membiakan sampel tuberkulin PPD bovin pada media agar nutrien dan agar darah, diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 24 jam . Dengan cara membiakan sampel akan dapat diketahui apakah produk yang diuji itu tercemar oleh kuman-kuman pencemar atau tidak .
1 58
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
HASIL DAN PEMBAHASAN Proses penyiapan stok tuberkulin Dari 6 erlenmeyer media yang digunakan untuk pertumbuhan setelah diuji kemurniannya, 1 erlenmeyer terkontaminasi sehingga yang bisa diproses untuk pembuatan tuberkulin hanya 5 erlenmeyer (asal media 1250 ml) . Dari 5 erlenmeyer diperoleh filtratnya 810 ml, sehingga untuk mengendapkan proteinnya diperlukan 90 ml TCA 40% . Isi endapan protein (PV) yang diperoleh 67, 50 ml, sehingga stok tuberkulin PPD bovin finalnya akan diperoleh hasil 5 x 67,50 ml = 337,50 ml, ini terdiri dari PV = 67,50m1 Pelarut (solvent) = 1250 x 25m1 = 31,25m1 1000 Buffer Phosphat (BP) '/ 3 M = 5 x PV- Pelarut = 337,50- 31,25 ml = 30,63 ml 10 10 Anti bakterial (ABS) = PV = 67,5 ml Air suling = 5 PV - (Pelarut + buffer + ABS + PV) ml = 337,50 ml - (31,25 + 30, 63 + 67,50 + 67,50) ml = 337,50 ml - 196,88 ml = 140,62 ml Dari 1250 ml media (5 erlenmeyer) menghasilkan stok tuberkulin PPD bovin sebanyak 337,50 ml dan setelah diukur eksimasi proteinnya mengandung 5 mg/ml, sehingga untuk memperoleh kandungan protein 3 mg/ml, tuberkulin stok harus diencerkan menjadi 5 /3 x 337,50 ml = 562 ;50 ml Pengecer tuberkulin adalah buffer phenol 0,5 % yaitu sebanyak 562,50 337,50 = 225m1 . Jadi dari 1250 ml media menghasilkan 562,5 ml tuberkulin PPD bovin siap pakai untuk 5625 dosis (sapi) . Pengujian potensi dan keamanan Hasil pengujian potensi tuberkulin baik produk Balitvet maupun produk CSL pada sapi-sapi reaktor buatan positif TBC, menunjukkan terjadinya reaksi kebengkakan dan kenaikkan suhu pada sekitar daerah bekas suntikan . Ketebalan kulit diukur dengan alat kutimeter . Kenaikan ketebalan kulit akibat tuberkulinasi dengan tuberkulin produk Balitvet pada sapi reaktor positif TBC berkisar antara 100-233%, sedangkan dengan tuberkulin produk CSL berkisar antara 105-225% . Kenaikan ketebalan kulit akibat tuberkulinasi dengan tuberkulin produk Balitvet pada sapi normal 10,8% dan 18,5%, sedangkan dengan tuberkulin produk CLS bertambah 14,3%dan 15,8% (Tabel 1) . Menurut Lepper, dkk 1977, sapi dikatakan positif TBC jika ketebalan kulit akibat tuberkulinasi bertambah diatas 60 % . Hasil reaksi tuberkulinasi antara produk Balitvet dan CSL Australia yang sudah standar adalah relatif sama, ketebalan kulit pada sapi reaktor akibat tuberkulinasi bertambah di atas 60 %, sedangkan pada sapi normal di
1 59
Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999
bawah 60 % . Ini membuktikan bahwa tuberkulin yang dibuat dapat mendeteksi sapi yang memang benar-benar positif TBC atau benar-benar negatif TBC, sehingga produk Balitvet ini bisa digunakan untuk uji lapangan . Tabel 1 . Hasil uji potensi (tuberkulinasi) pada sapi reaktor buatan positif TBC dan sapi normal (dibaca 72 Jam paska tuberkulinasi) Nonor sapi
1 02 03 04 05 11 14
Tebal Wit (nun) Sebelum Tuberkulinasi 6,0 4,2 4,4 6,3 4,5 6,5 5,4
Tubrkulin PPD - Balitvet Sesudah Kenaikan Tuberkulinasi 14,3 8,3 (138 %) 8,4 4,2(100%) 9,0 4,6(104%) 16,7 10,4 (165 %) 5,0 10,5 (233 %) 7 .2 0,7 (10,8 %) 6,4 1,0 (18,5 %)
Sebelum Tuberkulinasi 6,0 4,1 4,8 6,8 4,0 6,3 5,7
Tuberkulin PPD Sesudah Tuberkulinasi 17,4 8,4 10,0 16,1 13,0 7,2 6,6
- CSL Kenaikan 11,4(190%) 4,3(105 %) 5,2(108 %) 9,3(137 %) 9,0(225 %) 0,9(14,3%) 0,9 (15,8,%)
Pengujian keamanan/sterilitas dari produk tuberkulinasi PPD bovin buatan Balitvet tidak menunjukkan pertumbuhan bakteri pada media agar darah dan agar darah nutrien .
KESIMPULAN 1 . Kuman M.bovis galur standar AN, tumbuh subur pada media sintetik DORSET HENLEY . 2 . Kandungan tuberkel protein yang diperoleh di atas 3 mg/ml . 3 . Hasil uji potensi relatif sama dengan produk standar CSL Australia . 4 . Tuberkulin PPD bovin buatan Balitvet bisa dipakai untuk uji lapangan .
DAFTAR BACAAN ANONYMOUS 1984 . Instruction Manuals Tuberculin Section Central Veterinary Laboratory Weybridge England . HARDJOUTOMO S, 1988 . Tinjauan Penyakit Tuberkulosis di Indonesia Kurun Waktu 1901-1985 . Hemera Zoa 73(1) : 35-45 . HARDJOUTOMO S dan SUTARMA 1993 . Cara pembuatan dan pengujian Tuberkulin Glover SM, buatan Balitvet, Bogor . LEPPER A .W .D, DA . NEWTON-TABRETT, L .A, CORNER, M .T . CARPENTER, W .R . SCANLAN . J .O . WILLIAMS and D .M . HELWIG, 1977 . The use of Bovine PPD tuberculin in the single caudal fold test to detect tuberculosis in beef cattle Aust . Vet . J . Vol 53 : 203 - 213 .
1 60
